CN109295007B - Ndrv弱毒株的选育方法及其在制备ndrv活疫苗中的应用 - Google Patents

Ndrv弱毒株的选育方法及其在制备ndrv活疫苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NDRV弱毒株的选育方法及其在制备NDRV活疫苗中的应用。本发明首次将新型鸭呼肠孤病毒株NDRV‑JM85接种SPF鸭胚成纤维细胞(DEF)在5.0％CO2、32℃和37℃条件下连续交替传代至170代后，选育获得一株遗传性状稳定、安全性好、免疫原性强的NDRV弱毒株，将其命名为NDRV S株，NDRV S株的保藏编号为CCTCC NO：V201850。并应用NDRV S株接种鸭胚成纤维细胞转瓶培养，收获细胞毒加冻干保护剂，冷冻真空干燥，研制成NDRV活疫苗。通过实验证明：本发明的NDRV活疫苗安全，且具有较好的免疫效果和遗传稳定性，可有效预防新型鸭呼肠孤病毒病。

Description

NDRV弱毒株的选育方法及其在制备NDRV活疫苗中的应用
技术领域
本发明涉及新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)弱毒疫苗株的选育方法及其在研制活疫 苗中的应用，属于兽用生物制品学领域。
背景技术
2005年以来，在中国福建、广东、江苏、山东和渐江等省(地)的番鸭、半番鸭、 樱桃谷鸭和麻鸭群发生一种以肝脏不规则坏死和出血混杂为主要特征的疫病(俗称“鸭 出血坏死性肝炎”)，该病无明显季节性，各品种鸭(如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京 鸭等)均可发生，并有逐年增加的趋势；发病日龄约为3～25日龄，其中以5～l0日 龄居多，病程为5～7天，发病率为5～20％，死亡率为2～15％，日龄愈小或并发感 染时其发病率和死亡率愈高；由于病原不明，给养鸭业造成较大的经济损失。
为有效防控该病，福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒研究室开展了病原、 诊断和防控技术研究，对分离毒株进行了全面系统鉴定，从病毒理化生物学、动物回归试验、基因组特性及分子水平上首次证实鸭出血坏死性肝炎的病原是一种有别于番 鸭呼肠孤病毒(MDRV)和禽呼肠孤病毒(ARV)的一种新型鸭呼肠孤病毒(Novel DuckReovirus，NDRV)(陈少莺等，病毒学报，2010)，并建立了能快速准确诊断该病的 RT-PCR方法(王劭等)。在此基础上开展弱毒株选育及其应用研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工致弱新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)获得弱毒疫苗株 的方法及其在研制NDRV活疫苗中的应用。
第一方面，本发明保护一种新型鸭呼肠孤病毒弱毒株的选育方法。
本发明提供的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株的选育方法包括将新型鸭呼肠孤病毒在温 度甲的条件下和温度乙的条件下连续交替传代培养的步骤；
所述温度甲可为37.0-37.5℃；所述温度乙可为32.0-32.5℃。
上述方法中，所述连续交替传代培养的方法如下：
1)将所述新型鸭呼肠孤病毒株接种至细胞中，在所述温度甲的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，冻融，收集细胞毒株，并将其记作毒株1；
2)将所述毒株1接种至细胞中，在所述温度乙的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，收集细胞毒株，冻融，并将其记作毒株2；
3)将所述毒株2接种至细胞中，在所述温度甲的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，收集细胞毒株，冻融，并将其记作毒株3；
4)将所述毒株3接种至细胞中，在所述温度乙的条件下进行传代培养，当细胞病变达到75-80％时，冻融，收集细胞毒株，并将其记作毒株4；
5)按照上述方法连续交替传代培养，直至得到遗传性状稳定、安全性好且免疫原性强的新型鸭呼肠孤病毒株，即为所述新型鸭呼肠孤病毒弱毒株。
上述方法中，所述温度甲具体可为37℃；所述温度乙具体可为32℃。
上述方法中，病毒株的遗传性状稳定性、安全性和免疫原性均可通过现有技术中的常规方法进行测定。
在本发明中，将新型鸭呼肠孤病毒株接种至细胞中在32℃和37℃连续交替传代至170代后，选育获得一株遗传性状稳定、安全性好、免疫原性强的新型鸭呼肠孤病毒 弱毒株，并将其命名为新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株，已于2018年8月16日保藏 于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC， 地址为中国武汉市武汉大学)，保藏编号：CCTCC NO：V201850。
所述遗传性状稳定具体体现在将不同代次的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株的病毒原液接种雏鸭，在雏鸭体内盲传5代均未见毒力返强现象；
所述安全性好具体体现在将不同代次的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株制备的 NDRV活疫苗免疫雏鸭后，雏鸭各器官均无肉眼病变，且精神、饮食欲、生长发育均 未发现异常；
所述免疫原性强具体体现在将不同代次的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株制备的NDRV活疫苗免疫雏鸭并进行攻毒后，雏鸭各器官总病变率均为0，保护率均为100％。
上述方法中，所述细胞可为鸭胚成纤维细胞(DEF)、番鸭胚成纤维细胞(MDEF)、 鸡胚成纤维细胞(CEF)等原代细胞，也可为Marc145、VERO、ST、MDCK等传代 单层细胞。在本发明的具体实施例中，所述细胞为鸭胚成纤维细胞。
上述方法中，可用于传代培养的细胞培养液或细胞培养基可为现有技术中的用于细胞培养的常规细胞培养液或细胞培养基，如含有4％(体积分数)胎牛血清的0.5％ 乳汉液、含有4％(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基等。
上述方法中，所述新型鸭呼肠孤病毒株具体为NDRV-JM85病毒株。所述 NDRV-JM85病毒株是在鸭胚成纤维细胞(DEF)中传代适应了85代后获得的毒株， 虽然其对一日龄雏鸭失去致病力，但还不能满足弱毒疫苗株的要求。
第二方面，本发明保护上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株。
第三方面，本发明保护一株新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株。
本发明保护的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株已于2018年8月16日保藏于中国 典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址为 中国武汉市武汉大学)，保藏编号：CCTCC NO：V201850。
第四方面，本发明保护上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株或新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株CCTCC NO：V201850的新用途。
本发明首先保护上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株或新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株CCTCC NO：V201850在制备新型鸭呼肠孤病毒活疫苗中的应用。
本发明还保护上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株或新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株CCTCC NO：V201850在预防新型鸭呼肠孤病毒病中的应用。
本发明最后保护上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株或新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株CCTCC NO：V201850在制备预防新型鸭呼肠孤病毒病的产品中的应用。
第五方面，本发明保护一种新型鸭呼肠孤病毒活疫苗。
本发明提供的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗的活性成分为上述方法获得的新型鸭呼肠 孤病毒弱毒株或新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株。
进一步的，所述疫苗还可包括冻干保护剂。
更进一步的，所述疫苗还可包括青霉素和链霉素。
第六方面，本发明保护上述疫苗的制备方法。
本发明提供的上述疫苗的制备方法包括如下步骤：将上述方法获得的新型鸭呼肠孤病毒弱毒株或新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株CCTCC NO：V201850接种至细胞中 进行培养，当细胞病变达到75-80％时，冻融，收获细胞病毒液；将所述细胞病毒液 与冻干保护剂混匀，冷冻，真空干燥，制成所述疫苗。
进一步的，所述细胞病毒液与所述冻干保护剂为等量混匀。
所述细胞可为鸭胚成纤维细胞(DEF)、番鸭胚成纤维细胞(MDEF)、鸡胚成纤 维细胞(CEF)等原代细胞，也可为Marc145、VERO、ST、MDCK等传代单层细胞。 在本发明的具体实施例中，所述细胞为鸭胚成纤维细胞(DEF)。
所述冻干保护剂也可为常规的用于病毒液冻干的保护剂，如7％蔗糖脱脂乳等。
更进一步的，与冻干保护剂混匀后还可包括加入青霉素和链霉素的步骤。
本发明制备的NDRV活疫苗的每羽份病毒含量不低于103.0TCID50。
本发明首次将新型鸭呼肠孤病毒株NDRV-JM85接种至SPF鸭胚成纤维细胞 (DEF)在5.0％CO2、32℃和37℃条件下连续交替传代至170代后，选育获得一株遗 传性状稳定、安全性好、免疫原性强的NDRV弱毒株，将其命名为NDRV S株，NDRV S株的保藏编号为CCTCCNO：V201850。并应用NDRV S株接种鸭胚成纤维细胞转 瓶培养，收获细胞病毒液，然后与冻干保护剂混合，冷冻真空干燥，研制成NDRV活 疫苗。通过实验证明：本发明的NDRV活疫苗安全，且具有较好的免疫效果和遗传稳 定性，可有效预防新型鸭呼肠孤病毒病(俗称“鸭出血坏死性肝炎”)。
保藏说明
病毒名称：新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：中国武汉市武汉大学
保藏日期：2018年8月16日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：V201850
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。
实施例1、NDRV弱毒株的制备方法及保藏
一、NDRV弱毒株的制备方法
1、实验材料
NDRV-JM85病毒株：保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for TypeCulture Collection，简称CCTCC，中国武汉市武汉大学)，保藏日：2011年7月29日， 保藏编号：CCTCC NO：V201127。NDRV-JM85病毒株是在鸭胚成纤维细胞(DEF) 中传代适应了85代后获得的毒株，虽然其对一日龄雏鸭失去致病力，但还不能满足弱 毒疫苗株的要求。
2、致弱方法
(1)将NDRV-JM85病毒株接种DEF单层细胞(细胞培养液为含有4％(体积分 数)胎牛血清的0.5％乳汉液或含有4％(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基，均是 GIBCO公司的产品)中，置5.0％CO2、37℃条件下培养，每日观察。当细胞病变(CPE) (病变细胞表现为单层细胞聚集成团，形成大量的合胞体，细胞拉网，部分脱落漂浮 在培养液中)达到75％时，冻融三次，收获细胞毒株，将其记作JM85株C86。
(2)完成步骤(1)后，将JM85株C86接种DEF单层细胞，置5.0％CO2、32℃ 条件下培养，每日观察。当细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞毒株， 将其记作JM85株C87。
(3)完成步骤(2)后，将JM86株C87再接种DEF单层细胞，置5.0％CO2、 37℃培养，每日观察。当细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞毒株， 将其记作JM85株C88。
(4)完成步骤(3)后，将JM85株C88再接种DEF单层细胞，置5.0％CO2、 32℃条件下培养，每日观察。当细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞 毒株，将其记作JM85株C89。
(5)完成步骤(4)后，将JM88株C89接种DEF单层细胞，置5.0％CO2、37℃ 培养，每日观察。当细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞毒株，将其 记作JM85株C90。
按上述方法在DEF细胞中在5.0％CO2、32℃和37℃条件下连续交替传代培养， 直到病毒遗传性状稳定，且仍保留良好的免疫原性。最终NDRV-JM85株经5.0％CO2、 32℃和37℃连续交替传代至C170代后，获得遗传性状稳定、安全性好、免疫原性强、 适于研制弱毒活疫苗的NDRV弱毒株，并将其记作NDRV S株。
3、病毒培养
将NDRV S株接种DEF单层细胞转瓶，置5.0％CO2、37℃培养，每日观察。当 细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞毒株，将其记作NDRV S株d1(S d1)。
将NDRV S株d1(S d1)接种DEF单层细胞转瓶，置5.0％CO2、37℃培养，每 日观察。当细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞毒株，将其记作NDRV S株d1(S d2)。
按上述方法连续传代培养，制备不同代次的NDRV S株病毒，分别记作S d3、S d4、S d5……、S d40。
4、病毒含量测定
在96孔微量细胞培养板上进行病毒含量测定。具体步骤如下：将不同代次病毒经Hank's液10倍系列连续稀释后，接种番鸭胚成纤维细胞(MDEF)单层细胞，每一稀 释度接种4孔，0.1mL/孔，置5.0％CO2、37℃条件下培养，观察细胞病变至5天，按 Karber氏法计算TCID50。
结果如表1所示，随着传代代数的增加，病毒对MDEF细胞的TCID50逐渐升高， 至170代稳定在10-6.5/0.1mL左右(表1)。
表1、不同代次细胞毒对MDEF的TCID50效价(-lg10/0.1mL)
病毒代号 C85(JM85) C100 C120 C150 C160
TCID<sub>50</sub> 5.5 6.0 6.0 6.0 6.25
病毒代号 C170(S) S d10 S d20 S d30 S d40
TCID<sub>50</sub> 6.5 6.5 6.5 6.5 6.25
二、NDRV弱毒株的保藏
步骤一获得的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株已于2018年8月16日保藏于中国典 型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC，地址为中 国武汉市武汉大学)，保藏编号：CCTCC NO：V201850。
实施例2、NDRV活疫苗的制备及其主要免疫指标测定
一、NDRV活疫苗的制备
将新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株接种DEF单层细胞转瓶，置37℃条件下培养， 当细胞病变(CPE)达到75％时，冻融三次，收获细胞病毒液(病毒效价为 107.25TCID50/mL)。然后将细胞病毒液与冻干保护剂(7％蔗糖脱脂乳，即7g蔗糖+100 mL脱脂乳)等量混合，并加入青霉素和链霉素，使其最终含量每亳升分别为100单 位和100微克。混匀后分装，在冻干机中进行冷冻，真空干燥，制成NDRV活疫苗(每 羽份病毒含量不低于103.0TCID50)。
按照上述方法取不同代次的NDRV S株病毒制备活疫苗，分别制备得到不同代次的NDRV活疫苗。
二、疫苗最小免疫剂量测定
将NDRV S株d20制备的NDRV活疫苗稀释成每0.2mL含500、1000、1500、2000 TCID50，腿肌注射0.2mL/羽，于免疫后7天连同健康对照鸭10羽攻击NDRV强毒， 0.5mL/羽，免疫剂量如表2所示，并于攻毒后第5天和第10天每组随机各剖杀5羽， 观察并记录心、肝、脾、胰等器官的病变情况。
结果如表2所示。攻毒对照组的肝脾呈现典型的出血坏死病变，肝脾总病变率为10/10；不同剂量免疫攻毒组的肝脾总病变率为0/10～5/10，其中100TCID50组的肝脾 病变率为6/10，500TCID50组的肝脾病变率为1/10；免疫剂量1000TCID50以上即可 获完全保护。表明NDRV S株d20的最小免疫剂量为500TCID50，且免疫剂量与攻毒 保护效果关系密切。
表2、NDRV活疫苗不同免疫剂量对1d雏鸭的免疫保护
Figure BDA0001804837150000061
三、疫苗免疫效力测定
取不同代次弱毒制备的NDRV活疫苗适当稀释后，腿肌注射0.2mL/羽(病毒含量1500TCID50/羽)，每组各10羽，于免疫后7天连同健康对照鸭10羽攻击NDRV强毒， 0.5mL/羽，并于攻毒后第5天和第10天每组随机各剖杀5羽，观察并记录心、肝、脾、 胰等各器官的病变情况。
结果如表3所示，攻毒对照组的肝脾呈现典型的出血坏死病变，肝脾总病变率为10/10；免疫攻毒组肝脾总病变率为0/10。表明以不同代次NDRV S株制备的NDRV 活疫苗免疫2日龄雏番鸭后7天，均能有效抵抗强毒的攻击，免疫原性良好。
表3、不同代次NDRV弱毒制备的NDRV活疫苗对雏番鸭免疫保护结果
Figure BDA0001804837150000071
四、疫苗安全性测定
将不同代次弱毒制备的NDRV活疫苗分别腿肌注射2日龄番鸭各20羽，原液 0.5mL/羽(病毒含量≥5×106.25TCID50)，于PI 5d和PI 8d各剖杀5羽，观察并记录心、 肝、脾、胰等各器官的病变情况；另10羽观察20天，记录精神、饮食欲、生长发育、 发病和死亡等情况。
结果如表4所示，各代次弱毒接种后PI 5d和PI 8d剖杀，试验鸭肝、脾、心、肾、 胰等各器官均无肉眼病变，且观察至20日免疫鸭的精神、饮食欲、生长发育等均未发 现异常，表明不同代次弱毒制备的NDRV活疫苗对雏鸭均具有良好的安全性。
表4、不同代次弱毒制备的NDRV活疫苗对雏番鸭安全性结果
Figure BDA0001804837150000072
五、遗传稳定性测定
取NDRV S株基础代次细胞毒原液接种1-2d雏鸭9羽，每羽腿肌接种0.5mL，于 接种后5d扑杀3羽，取肝脾等组织制成20％匀浆，冻融3次，8000rpm离心10min， 取上清液接种1d番鸭9羽同上继续传代，同时取上清液进行病毒分离和RT-PCR检测； 其余鸭继续观察精神状态、采食饮水和生长发育，如此连续在雏鸭体内盲传5代。
结果表明：各代次匀浆毒接种雏鸭后均未见毒力返强现象，NDRV S株的遗传稳 定性良好，符合制备弱毒活疫苗的要求。

Claims (4)

1.一株新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株，其保藏编号为CCTCC NO：V201850。
2.权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株 CCTCC NO：V201850在制备新型鸭呼肠孤病毒活疫苗中的应用；
或，权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株 CCTCC NO：V201850在制备预防新型鸭呼肠孤病毒病的产品中的应用。
3.一种新型鸭呼肠孤病毒活疫苗，其活性成分为权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S株 CCTCC NO：V201850。
4.权利要求3所述的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒NDRV S 株 CCTCC NO：V201850接种至细胞中进行培养，当细胞病变达到75-80 %时，冻融，收获细胞病毒液；将所述细胞病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻，真空干燥，制成所述疫苗。
CN201811093038.2A 2018-09-19 2018-09-19 Ndrv弱毒株的选育方法及其在制备ndrv活疫苗中的应用 Active CN109295007B (zh)

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