CN103495162A

CN103495162A - 一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法

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Publication number: CN103495162A
Application number: CN201310426537.XA
Authority: CN
Inventors: 李阳; 闫艳丽; 刘雪; 王二先; 徐晓艳; 盛璐丝
Original assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG MIBOLERONE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2013-09-18
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2033-09-18
Also published as: CN103495162B

Abstract

一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，属于兽用生物制品技术领域。其包括以下步骤：1）种细胞的培养；2）制苗用细胞的悬浮培养；3）病毒的培养与收获；4）猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗制备。采用本方法制备疫苗，其特点是可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，所制备的病毒滴度高，所制备的疫苗批间差异小，产品质量稳定高效，副反应小，可全面提高疫苗质量。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道症状的疾病。PRRS难以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬细胞为靶细胞，具有抗体依赖性增强作用（ADE）造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不断的发生着变异，并且PRRS没有有效的治疗药物，当前，疫苗免疫被认为是预防和控制PRRS的重要手段。同时与其他控制手段相比，疫苗免疫也是各种规模猪场（大、中、小型猪场）的最经济的选择。自蓝耳病疫苗广泛应用以来，该病的传播和蔓延势头有所减缓。目前我国用于预防猪蓝耳病的疫苗共有三种类型：猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（包括进口美洲经典毒株和国内经典毒株）、高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗；与灭活疫苗相比，弱毒疫苗诱导的免疫反应持续时间长且更有效，能激活细胞免疫和体液免疫。弱毒疫苗可在猪体内复制，能引发更好的免疫效果，可以持续刺激猪体的免疫应答，以抵御病毒入侵，所以保护时间长，同时弱毒疫苗的免疫量要比灭活疫苗低，在减少副反应的同时也降低了生产成本。研究证明弱毒疫苗的交叉保护能力要优于灭活疫苗，目前在暂时没有更好替代方法防控PRRS的情况下，PRRS弱毒疫苗对于防控PRRS爆发有积极的作用。因此，国内外研究机构均在蓝耳病弱毒疫苗上寻求积极的突破，试图研制出更加优质的蓝耳病活疫苗。

尽管如此，活疫苗的使用仍存在疑问。目前大家主要关注的是活疫苗的安全性和疫苗株病毒因基因突变和或者与野毒株重组变异而使其毒力返强的可能性。实验室和田间研究均报道了作为活疫苗的疫苗株可导致病毒血症、毒力返强、可垂直和水平传播（可在本场和临场中未免疫的猪体内检测到疫苗毒）。毒力返强的疫苗毒株可在妊娠后期经胎盘进行传播，从而导致死胎和木乃伊胎数量增加。感染疫苗毒的母猪所产仔猪会携带PRRSV，排泄疫苗毒感染其他仔猪。此外，仔猪免疫活疫苗可导致临床上的呼吸道症状以及对其生长性能产生不良影响。这些免疫活疫苗的仔猪可导致病毒血症，并至少在4周内持续地传染疫苗毒给其他仔猪。因此，养殖户在首次使用活疫苗时有可能导致猪只生产性能下降，比如增加晚期流产率，死胎和木乃伊胎数量增加等。另外，最新研究表明，活疫苗的使用可干扰猪肺炎支原体疫苗的保护效力。

灭活疫苗的主要优点是安全，疫苗株不会传染给其他猪只，同时其毒力也不会返强。田间试验研究表明，灭活疫苗的使用不会导致经产母猪和后备母猪的繁殖失败。目前蓝耳病灭活疫苗主要采用油包水剂型的油乳剂疫苗。油包水型疫苗具有较好的缓释作用，免疫后持续刺激机体达到免疫保护方面表现尤为突出。但油包水剂型的疫苗往往所需较高的抗原浓度来提高疫苗的效力。为提高PRRS灭活疫苗的效力，需要在确保疫苗病毒株免疫原性的前提下尽量提高疫苗在灭活前的病毒含量。研究表明，自1996年报道PRRS以来，国内许多学者先后分离到PRRSV，但各地方分离株的滴度都呈现出较低的状态：（1）台湾分离株，为美洲型毒株，毒价为10⁶TCID₅₀/0.1ml（台湾养猪科学研究所）；（2）CH-1a、CH-1b、CH-1c、CH-1d株，为美洲型毒株，毒价为10⁶TCID₅₀/0.1ml（哈尔滨兽医研究所）。因此为了提高病毒含量，通常的做法是通过浓缩蓝耳病抗原十几倍甚至几十倍，如此以来不仅增加了生产成本，同时在浓缩过程中蓝耳病病毒的免疫原性会有所降低。

目前为止，蓝耳病疫苗生产主要还是通过转瓶培养单层细胞，接种蓝耳病病毒后获得病毒悬液，进而制备成蓝耳病疫苗。因转瓶培养法劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制等很大程度上影响了蓝耳病疫苗的产量，同时也导致了疫苗批次之间的不稳定性。为了克服现有PRRS弱毒疫苗生产技术所存在的缺陷，寻找简便、高效的病毒株以及其合适的生长培养条件对提高疫苗质量、降低生产成本具有重大意义。

近年来，生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。与传统转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术有着巨大的优势：首先单位体积内有效工作细胞数量增加；其次全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响；再者生物反应器容积的扩大，提高了产品的均一性，也提高了产品的产量和质量；最后生产疫苗所用的成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。我国的生物反应器悬浮培养技术起步较晚，但近几年该技术的在国内的发展非常快。目前国内已有部分发明专利采用不同生物反应器系统和不同类型微载体进行蓝耳病疫苗的研制，但应用激流灌注式生物反应器-聚酯纤维纸片载体生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH-1a株），尚未见报道。

水包油包水乳化佐剂具有铝胶佐剂、水包油佐剂和油包水佐剂的特点，与油包水乳化佐剂相比，其制备疫苗所需要的抗原浓度大大降低，另外因其具有水包油佐剂的特性，使得其可以添加水溶性的免疫增强剂、中药多糖和镇痛剂（维生素），在疫苗免疫机体时可以缓解疼痛，减少动物应激，同时免疫增强剂、中药多糖还具有提高免疫效果，预防疾病等功能。

多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化的能力。

维生素是机体代谢中必不可少的有机化合物。机体犹如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。

黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。

法氏囊素(bursin，BS) 是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa of fabricius) 中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-Lys-His-Gly-NH2。研究表明，BS能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B细胞产生和分泌抗体能力加强。

本发明基于上述技术背景，提出一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗（CH-1a株）的制备方法，该疫苗主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活抗原，加适量含免疫增强剂制成，剂型为水包油包水型。通过该方法制备的复合灭活疫苗，因其拥有水包油，油包水两种特性，使得水溶性的维生素、中药多糖、法氏囊素、中药黄酮等免疫增强剂与镇痛剂易于溶解，利于动物机体吸收，免疫时可降低动物应激，减少动物痛苦，可提高动物福利；同时免疫增强剂可大大提高活疫苗的体液免疫，产生较高的中和抗体，大幅提高保护率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法的技术方案，采用本方法制备疫苗，其特点是可以缩短生产周期，降低人员配置，污染几率低，占地面积小，所制备的病毒滴度高，所制备的疫苗批间差异小，产品质量稳定高效，副反应小，可全面提高疫苗质量。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）种细胞的培养：用细胞生长液培养种子细胞；

2）制苗用细胞的悬浮培养：将步骤1）中培养好的种子细胞悬液接种至已验证的灌注袋中，吸附后在激流灌注式生物反应器中加入细胞生长液进行培养；

3）病毒的培养与收获：当细胞培养4～6天，将蓝耳病病毒CH-1a株悬液接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养，接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近0时，即开始收获病毒，收获病毒后，反复冻融灌注袋，收获全悬病毒液，测定毒价；

4）猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗制备：将步骤3）中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭活检验合格后，在每1000ml灭活检验合格的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原液中加入1～2份免疫增强剂混合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按3:2（V:V）进行乳化分装制成猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中种细胞为细胞MA104或细胞Marc145。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中培养条件为温度36～37℃，pH7.2～7.4，DO 30%～60%，循环转速按40rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm梯度提高，种子细胞接种量为3×10⁹个细胞。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤3）培养条件为温度36～37℃，pH7.5～7.6，DO 30%～50%，循环速度100～150rpm，蓝耳病病毒CH-1R株接种量为0.5～1.0MOI。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2～7.4、DO为30%～60%，含糖4.0g/L，维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4～7.6、DO为30%～50%，含糖4.0g/L。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中每份免疫增强剂含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素组合6～10g和法氏囊素2～16mg。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

a、按桑白皮10～30份，生地10～30份，黄芪20～40份，车前子10～20份，茯苓10～30份，穿心莲20～30份，芦根10～30份，生地10～30份，生甘草10～20份，贝母10～30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯化水，水浴至90℃，并保持在90℃，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次；

b、弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

c、将b中上清进行醇沉，沉淀即为粗制中药多糖，上清即得粗制中药黄酮；

d、用灭菌纯化水洗涤c中粗制中药多糖，洗涤后用20倍量的42℃灭菌纯化水进行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4℃吸附过夜，吸附后经10000rpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清；

e、将d中上清经0.22um滤膜过滤除菌后，进行10倍浓缩，制得中药多糖浓缩液；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖；

g、将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。

所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合中含有维生B1 15～35%、维生素C 40～70%和维生素E 10～30%。

本发明中桑米特家畜水包油包水佐剂由珠海国年生物科技有限公司生产销售。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明中种细胞培养采用微型反应器，减少操作程序，缩短了种细胞培养时间。

2.本发明在接种细胞时采用梯度升高循环转速法，提高了细胞在微载体上的贴壁率。

3.本发明在培养细胞和病毒时根据糖耗情况随时补加营养，确保细胞的密度和病毒的滴度。

4.本发明采用了先进的悬浮培养设备与技术：（1）激流灌注式生物反应器，聚酯纤维纸片为微载体；（2）以糖耗为技术指标以及先进的控制系统；（3）在细胞培养方面增加了细胞密度；（4）在培养病毒时提高了病毒滴度；（5）使疫苗的效价大大提高，同时降低了疫苗的副反应。（6）采用了连续、完全封闭的细胞与病毒培养方式，完善了生产过程中的可控性，确保疫苗质量的稳定性，同时降低了疫苗生产的安全隐患。

5.本发明采用了新的疫苗佐剂，所制备的疫苗具有油包水、水包油双重特性，兼具了疫苗的缓释作用以及水溶性免疫增强剂、中药多糖、镇痛剂等共同作用的优点。

6.本发明采用了有效的免疫增强剂，大幅度提高了机体的免疫力，提高体液免疫能力，刺激机体产生高效的中和抗体，提高了机体预防疾病的能力。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1 用激流灌注式反应器AP20C型生产猪繁殖与呼吸综合征病病毒（CH-1a株），包括如下步骤：

（1）生物反应器的选择：激流式反应器AP-20C型，体积为10L。

（2）疫苗毒株的选择：选用猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株。

（3）种细胞的培养：利用T175方瓶繁殖Marc-145细胞或MA104细胞，一般按1:3～1:5传代，待细胞长满单层后消化、计数，将细胞悬液接种至转管中，每管接种细胞约3×10⁷个细胞，置微型反应器中进行培养，反应器温度设置为37℃，转速设置为42rpm。

（4）制苗用细胞的悬浮培养：首先准备生物反应器：检漏激流袋和灌注袋；采用灭菌PBS浸泡微载体过夜；校正温度电极、pH电极和溶氧电极并进行高压灭菌；组装生物反应器，注入培养液，循环24小时进行系统的无菌检验。验证合格后，将步骤（3）中培养好的种子细胞消化、计数，无菌条件下接种至灌注袋中，以40rpm、60rpm、90rpm、120rpm各循环30min，使细胞贴壁，然后开始150rpm循环，培养条件为温度36～37℃，pH7.2～7.4，DO 30%～60%。培养过程中适时测定糖耗，当残糖量至2g/L时，进行补糖或补加培养液。

（5）所述步骤（3）和步骤（4）细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，细胞生长液的pH为7.2～7.4，DO为30%～60%，含糖约4.0g/L。

（6）病毒的培养与收获：当细胞培养4～6天，当糖耗达到最大时，将蓝耳病病毒CH-1a株悬液按0.5～1.0MOI的接种量接种于激流灌注式生物反应器中，换用维持液进行培养，培养条件为温度36～37℃，pH7.5～7.6，DO30%～50%,循环速度100～150rpm。接毒后实时监测糖耗情况，当糖耗接近0时，即开始收获病毒。收获病毒后，反复冻融灌注袋内细胞，收获全悬病毒液。

（7）所述步骤（6）中的细胞维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，维持液的pH为7.4～7.6，DO为30%～50%，含糖约4.0g/L。

（8）病毒液的检测

无菌检验：按《中国兽药典》进行，应无细菌生长。

病毒含量测定：用2%胎牛血清的DMEM维持液将病毒的细胞培养物样品做10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-9三个滴度，每个滴度接种96孔细胞板上生长良好的Marc-145细胞单层8孔，每孔0.1ml。同时设病毒对照和细胞对照孔，置37℃、5%CO₂培养箱继续培养，观察7日，记录细胞病变情况，根据Reed-Muench法计算TCID₅₀，病毒含量应≥10^8.0TCID₅₀/0.1ml。

实施例2 中药多糖的制备，包括以下步骤：

c、将b中上清进行醇沉，沉淀得到粗制中药多糖；

f、将e中中药多糖浓缩液进行真空冷冻干燥即得到中药多糖。

实施例3 中药黄酮的制备，包括以下步骤：

c、将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮；

d、将c中上清进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到中药黄酮。

实施例4 法氏囊素的制备，包括以下步骤：

a、取健康法氏囊组织，将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净。

b、称量法氏囊重量，按1：1（W：V）比例加入pH 7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆。

c、匀浆液中加入2.5%的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀。

d、上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液即为法氏囊素粗提液。

e、将d中粗提液通过0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到法氏囊素。

实施例5 免疫增强剂制备，包含以下组分：称取中药多糖60g、中药黄酮50g、维生素组合10g（其中维生素B1 2.2 g，维生素C 5.2g，维生素E 2.6g）、法氏囊素16mg；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药多糖由按照实施例2的步骤制得，中药黄酮按照实施例3的步骤制得，法氏囊素按照实施例4的步骤制得。

实施例6 免疫增强剂制备，包含以下组分：称取中药多糖100g、中药黄酮60g、维生素组合6g（其中维生素B1 2.1g，维生素C 2.4g，维生素E 1.5g）、法氏囊素2mg；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药多糖由按照实施例2的步骤制得，中药黄酮按照实施例3的步骤制得，法氏囊素按照实施例4的步骤制得。

实施例7 免疫增强剂制备，包含以下组分：称取中药多糖30g、中药黄酮20g、维生素组合8g（其中维生素B1 2g，维生素C 4g，维生素E 2g）、法氏囊素10mg；将上述各组分混合均匀作为一份计量使用。其中中药多糖由按照实施例2的步骤制得，中药黄酮按照实施例3的步骤制得，法氏囊素按照实施例4的步骤制得。

实施例8 一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗（CH-1a株）的制备方法，包括以下步骤：

a、无菌条件下，将猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活后抗原液按每1000ml加入实施例5、6或7中制备的免疫增强剂1或2份，混合均匀，使免疫增强剂完全溶解。

b、将3份量的含免疫增强剂的猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活抗原液加入乳化器中，调节乳化器转子转速为1500rpm，将2份量的桑米特水油水佐剂缓缓加入搅拌中的抗原液。

c、当油相加完时，调节转子转速为3000rpm，继续搅拌3-5分钟。

d、乳化完全后，将乳化后疫苗无菌分装制成猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗。

f、成品检验

（1）检验结果

按照“猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗（CH-1a株）制造及检验试行规程”和《中华人民共和国兽药典》（2010版）相关要求对成品进行相关检验，检验结果见表1：

表1 成品检验结果

（2）疫苗免疫效果比较

取10头蓝耳病抗体阴性健康仔猪，分为两组，实验组和对照组。实验组免疫本发明复合灭活疫苗，对照组免疫不添加复合免疫增强剂的普通灭活疫苗，免疫后3天起采血检测其中和抗体效价。

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）种细胞的培养：用细胞生长液培养种子细胞；

2.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中种细胞为细胞MA104或细胞Marc145。

3.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中培养条件为温度36～37℃，pH7.2～7.4，DO 30%～60%，循环转速按40rpm、60rpm、90rpm、120rpm、150rpm梯度提高，种子细胞接种量为3×10⁹个细胞。

4.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤3）培养条件为温度36～37℃，pH7.5～7.6，DO 30%～50%，循环速度100～150rpm，蓝耳病病毒CH-1R株接种量为0.5～1.0MOI。

5.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的细胞生长液含90%DMEM、10%胎牛血清，其pH为7.2～7.4、DO为30%～60%，含糖4.0g/L，维持液含98%DMEM、2%胎牛血清，其pH为7.4～7.6、DO为30%～50%，含糖4.0g/L。

6.如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤4）中每份免疫增强剂含有中药多糖30～100g、中药黄酮20～60g、维生素组合6～10g和法氏囊素2～16mg。

7.如权利要求6所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药多糖和中药黄酮通过以下步骤制得：

8.如权利要求6所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的法氏囊素通过以下步骤制得：将法氏囊组织剔除筋膜和脂肪组织，pH7.2灭菌冷PBS洗净,按1：1比例加入pH7.2灭菌冷PBS，在组织匀浆机中进行高速匀浆,匀浆液中加入占2.5%重量的胰蛋白酶，反复冻融3次，12000rpm离心20min，弃沉淀，上清用1000da截留分子量的超滤膜进行超滤，膜下液经0.22um滤膜过滤除菌，滤过液即为法氏囊素粗提液，粗提液经冷冻真空干燥得到法氏囊素。

9.如权利要求6所述的一种猪繁殖与呼吸综合征复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的维生素组合中含有维生B1 15～35%、维生素C 40～70%和维生素E 10～30%。