KR0179947B1 - 돼지 유행성 설사병과 전염성 위장염 바이러스 혼합 사독 유성백신의 제조방법 - Google Patents

돼지 유행성 설사병과 전염성 위장염 바이러스 혼합 사독 유성백신의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 유행성 설사(Porcine Epidemic Diarrhea:PED) 바이러스와 돼지 전염성 위장염(Transmissible Gastroenteritis:TEG) 바이러스 감염으로 일어나는 자돈의 설사 및 폐사를 예방하기 위한 불활화 혼합 유성백신의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 원숭이 콩팥 세포주(Vero cell) 단층세포에 PED 바이러스를 접종하고 트립신이 함유된 배지를 이용하여 고역가의 PED 바이러스를 증식시키고 여기에다 돼지 고환 세포주(ST cell)에 증식시킨 TGE 바이러스를 혼합시킨후 이들 바이러스의 항원성을 안전하게 보존시킬수 있는 불활화제를 사용하여 바이러스를 비동화 시킨것이고 또한 특수 유성 면역증강제를 혼합하여 백신의 면역원성을 증강케 하는 새로운 백신의 제조방법에 관한 것이며, 이와 같은 본 발명은 돼지 유행성 설사병(PED) 바이러스와 전염성 위장염(TGE) 바이러스를 각각 증식시켜 채독한 다음 BEI 으로 불활화 시키고 이들 두 바이러스를 혼합시킨 혼합 배양액에 특유의 유성 면역증강제를 혼합하여 자돈 바이러스성 설사병을 예방함을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병 바이러스와 전염성 위장염 바이러스 혼합 사독 유성 백신의 제조방법이며, 이상과 같이 제조된 백신은 질병의 특성상 임신모돈의 분만 3-4주에 1회 접종하고 1차접종 2주후에 2차접종하여 분만모돈에 고역가의 항체를 초유를 통해 자돈에 전달시키게 함으로 신생자돈의 폐사를 막게함을 목적으로 한다.
또한 이유전후 자돈의 만성형 설사를 위해 이유전 자돈의 백신접종 또한 이용될 수 있다.

Description

돼지 유행성 설사병(PED)과 전염성 위장염(TGE) 바이러스 혼합사독 유성백신의 제조방법
본 발명은 돼지 유행성 설사(Porcine Epidemic Diarrhea:PED) 바이러스와 돼지 전염성 위장염(Transmissible Gastroenteritis:TGE) 바이러스 감염으로 일어나는 자돈의 설사 및 폐사를 예방하기 위한 불활화 혼합 유성백신의 제조방법에 관한 것이다.
돼지 유행성 설사증 바이러스(PED)의 감염은 설사증은 미국에서는 발생이 보고되지 않았으나 유럽등지에서 많이 발생하여 왔다.
우리나라에서는 돼지유행성 설사 바이러스는 본원 출원인이 대표로 있는 (주)중앙가축전염병연구소와 전남대학교 수의과대학이 공동으로 1992년 11월 전남지역의 가검물에서 분리동정한 바이러스이다.
본 바이러스의 성상 및 감염돼지에서의 임상증상등이 기존 TGE와 아주 유사하므로 많은 혼돈을 주고 있다.
PED 바이러스 감염증은 TGE 병과 유사하게 급성의 경우 심한 수양성 설사, 구토로 어린자돈에서 50% 이상의 폐사를 보인다.
돼지 전염성 위장염(TGE) 바이러스는 우리나라에서 오래전부터 발생되어 왔으므로 양돈농가에 많이 알려져 있으며 현재 우리나라의 많은 양돈장에서 TGE 급성형 또는 만성형의 경과를 보이고 있다.
따라서 TGE 약독 바이러스를 이용한 생독백신이 이미 사용되고 있다.
그러나 생독백신의 경우 접종전 항체를 보유한 돼지에서는 효력을 보지 못하므로 방역상 문제점을 보이고 있다.
이를 보완하기 위해 수입된 TGE 사독 백신이 일부 농가에서 사용되고 있다.
이들 PED와 TGE 바이러스는 코로나 바이러스과에 속하며 전자현미경상 서로 유사하고 임상증상 및 병리조직학적 소견 또한 유사하여 감별이 어렵다.
다만 바이러스의 증식 및 혈청학적 검사에서 서로 다른 성상을 보이므로 실험실에서만 구별이 가능하다.
일단 발병된 양돈장에서는 정확한 진단이 어려울뿐더러 한종류의 바이러스 감염후 회복된 돼지일지라도 다른 한종의 바이러스 감염을 방어하지 못한다.
따라서 이들 두종의 바이러스 감염을 함께 방지할 수 있는 혼합백신의 개발이 절실히 요망된다.
본 병을 동시에 예방할 수 있는 혼합백신은 아직 세계적으로 개발되어 사용한 바 없으며 다만 TGE 단독의 생독 또는 사독백신만이 우리나라를 비롯하여 여러나라에서 사용되어지고 있다.
본 발명은 원숭이 콩팥 세포주(Vero cell) 단층세포에 PED 바이러스를 접종하고 트립신이 함유된 배지를 이용하여 고역가의 PED 바이러스를 증식시키고 여기에다 돼지 고환 세포주(ST cell)에 증식시킨 TGE 바이러스를 혼합시킨후 이들 바이러스의 항원성을 안전하게 보존시킬수 있는 불활화제를 사용하여 바이러스를 비동화 시킨것이고 또한 특수 유성 면역증강제를 혼합하여 백신의 면역원성을 증강케하는 새로운 백신의 제조방법에 관한 것이다.
이상과 같이 제조된 백신은 질병의 특성상 임신모돈의 분만 3-4주에 1회 접종하고 1차접종 2주후에 2차접종하여 분만모돈에 고역가의 항체를 초유를 통해 자돈에 전달시키게 함으로 신생자돈의 폐사를 막게함을 목적으로 한다.
또한 이유전후 자돈의 만성형 설사를 위해 이유전 자돈의 백신접종 또한 이용될 수 있다.
이하 본 발명의 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
가. 종자 바이러스의 계대와 보존
PED 바이러스 국내(전남지역) 분리주(PED-K 주로 명명)는 (주)중앙가축전염병연구소와 전남대학교 수의과 대학의 공동 연구로 가검물에서 분리동정 확인된 바이러스주 이다.
종독의 제조를 위해서는 Vero 주화세로를 37℃에서 1-2일간 증식용 배지(부기 1)를 사용하여 단층세포를 만들고 난 다음 증식용 배지를 제거한 후 본 바이러스를 적정량 접종하고 37℃에서 1시간 동안 흡착시킨 후 유지용 배지(부기 2)를 넣어 37℃에서 2-3일간 정치 또는 회전 배양한다.
이때 PED 바이러스 특유의 세포변성이 80% 정도 일어났을때 감염배양액 및 세포를 동결융회 1-2회 시킨 후 채독한다.
TGE 바이러스의 종독은 국내분리주(평택주)를 사용하였으며 2-3일령의 ST 주화세포에 감염시키고 2-3% 송아지 혈청이 포함된 증식용 배지를 넣은 다음 37℃에서 3-4일간 배양시킨 다음 80% 이상 세포변성이 일어났을때 1-2회 동결 융해에 하여 채독한다.
이상과 같은 종자 바이러스는 소량으로 소분하여 -80℃에 보존하고 각각 바이러스의 감염가를 측정한다.
(부기 1) 증식용 배지 Eagle MEM
Fetalbovine serum. . . . . . . . 100㎖
Tryptose phosphate broth. . . .30㎖
Fungizone(50㎎/병). . . . . . . . 5.0㎖
Penicillin G-Na. . . . . . . . 200IU/㎖
Streptomycin. . . . . . . . . . . 0.2㎎/㎖
(부기 2) 유지용 배지 Eagle MEM
Tryptose phosphate broth. . . .30㎖
Yeast Extract. . . . . . . . . . . . .2.0㎖
Fungizone(50㎎/병). . . . . . . . .5.0㎖
Trypsin(Difco 1:250). . . . . 10㎎/㎖
Penicillin G-Na. . . . . . . . .200IU/㎖
Streptomycin. . . . . . . . . . . .0.2㎎/㎖
나. 백신바이러스의 증식
상기 종자독을 이용하여 PED 및 TGE 바이러스를 각각 Vero 및 ST 주화세포에 접종하고 종자바이러스 계대법과 동일하게 배양하여 채독한다.
이때 채독 바이러스는 TGE 바이러스 105.5TCID50/㎖, PED 바이러스 104.5TCID50/㎖가 되도록하여 각 바이러스를 동량씩 혼합한 다음 불활화 과정에 들어간다.
다. 바이러스의 불활화
먼저 Binary ethylenimine(BEI)를 만들기 위해 2-bromoethylamine hydrobromide(BEA)를 0.2N NaOH에 타서 1M 용액이 되도록한 후 37℃ 항온수에 1시간동안 교반 정치시킨다.
이와 같은 상태에서 BEA는 BEI로 변하게 되며 BEI를 바이러스 용액에 1%가 되도록 가한후 (최종농도 1.10M) 다시 37℃ 항온수에 1일간 동안 교반 정치시킨다.
이때 바이러스 용액을 1N NaHO를 2% 넣어 pH8.5가 되도록 한 후 BEI를 최종농도 0.01M이 되도록 하여 37℃ 항온수에 1-2일간 정치하는 방법을 사용해도 무방하다.
이와 같은 불활화 과정을 멈추게 하기 위해서는 차게한 Sodium thiosulfate를 최종농도 2%가 되도록 가한다.
이상의 방법은 Bahnemann이 Arch Virol 47:47-56(1975)에 발표한 내용과 동일하다.
라. 유성 면역증강제 제조
일반적인 면역증강제로 알루미니움 겔을 사용하지만 면역증강 효과가 높은 유성면역 증강제를 사용하였다.
최적의 면역 증강제 제조를 위해 유화제 Span 85와 Tween 85를 각각 54㎖와 46㎖의 비율로 혼합제조한 현탁촉진제 10㎖와 광물성 기름(Mineral Oil) 90㎖를 1:9의 비율로 재차 혼합하여 만든다.
마. PED/TGE 바이러스 불활화 유성백신 제조
상기 (나)의 바이러스 혼합액을 (다)의 방법으로 불활화시키고 (라)의 면역증 강제를 동량씩 혼합한 후 초음파 발생기 등을 이용하여 장기간 보관후에도 분리층이 생기지 않도록 균일한 현탁액을 만든다.
[실시예 1]
시험 백신을 표 1에 기재된 세균 배지에 접종하고 37℃ 및 22℃에 각 7일간 배양하면서 잡균의 혼입 여부를 조사하였던바 잡균의 혼입이 인정되지 않았다.
이들 시험백신에 대한 실험동물 접종법에 의한 안전성을 조사하였던 바 표 2와 같이 안전함이 증명되었다.
안전성 검사를 위해 각 시험백신을 성숙 마우스(15gm) 6마리를 선정하여 각각 0.5㎖씩 피하에 접종하고 기니픽(350gm) 6마리에는 2.0㎖씩 근육 접종하여 10일간 임상관찰을 실시하였던 바 이상 없이 내과생존 하였다.
[실시예 2]
본 시험백신을 접종전 TGE 바이러스에 대한 항체가 서로 다른 이유자돈에 각각 2주 간격으로 2회 접종한 후 혈중 중화항체 형성 상태를 조사하였던 바 표 3과 같이 양호한 성적을 얻었다.
특이한 사항은 TGE-gel 불활화 백신의 경우 접종전 항체가 있는 돼지에서는 항체 형성이 되지 않은 반면에 본 시험백신 접종 돼지들은 접종전 항체 유무에 불구하고 우수한 항체반응을 보였다.
[실시예 3]
PED와 TGE 바이러스에 대한 항체가 없는 임신모돈의 분만 4주전 및 2주전에 시험백신(2㎖ 근육주사)을 접종하고 이들 모돈으로부터 분만된 3일령 자돈에 각각 PED 또는 TGE 바이러스를 경구감염 시킨후 14일후까지 설사, 구토등의 임상증상을 관찰하고 폐사두수를 기록하였다.
표 4에서 보는 바와 같이 시험백신을 접종한 모돈으로부터의 자돈에서는 복당 1-2두가 경미한 설사를 보였으나 폐사는 없었다.
반면에 대조군의 자돈에서는 공격후 100% 임상증상을 보였으며 PED 투여군에서는 50% 폐사, TGE 투여군에서는 89% 폐사를 보여서 백신접종에 의한 효력이 입증되었다.
상술한 바와 같은 본 발명은 돼지유행성 설사병(PED) 바이러스와 전염성 위장염(TGE) 바이러스를 각각 증식시켜 채독한 다음 BEI로 불활화시키고 이들 두 바이러스를 혼합시킨 혼합배양액에 특유의 유성 면역증강제를 혼합하여 자돈 바이러스성 설사병을 예방함에 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병 바이러스와 전염성 위장염 바이러스 혼합 사독 유성백신의 제조방법이며, 이상과 같이 제조된 백신은 질병의 특성상 임신모돈의 분만 3-4에 1회 접종하고 1차접종 2주후에 2차접종하여 분만모돈에 고역가의 항체를 초유를 통해 자돈에 전달시키게 함으로 신생자돈의 폐사를 막아주는 효과가 있는 것이며, 또한 이유전후 자돈의 만성형 설사를 위해 이유전 자돈의 백신접종으로도 이용할 수가 있는 것이다.

Claims (1)

  1. 돼지 유행성설사병(PED) 바이러스와 전염성 위장염(TGE) 바이러스를 각각 증식시켜 채독한 다음 불활화제인 BEI(Binary ethylenimine)로 불활화시키고, 이들 두 바이러스를 혼합시킨 혼합배양액에 유화제 Span 85와 Tween 85를 각각 54㎖와 46㎖의 비율로 혼합제조한 현탁촉진제 10㎖와 광물성 기름 90㎖를 1:9의 비율로 재차혼합시켜 만든 유성 면역증강제를 혼합하여 자돈의 바이러스성 설사병을 예방하고 분만된 신생자돈의 폐사를 막아주는 것을 특징으로 하는 돼지 유행성 설사병(PED)과 전염성 위장염(TGE) 바이러스 혼합사독 유성백신의 제조방법.
KR1019940010071A 1994-05-06 1994-05-06 돼지 유행성 설사병과 전염성 위장염 바이러스 혼합 사독 유성백신의 제조방법 KR0179947B1 (ko)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100622399B1 (ko) * 2004-01-14 2006-09-18 대한민국 불활화시킨 ｔｇｅｖ 및 ｐｅｄｖ을 함유하는 혼합불활화백신 및 그 제조방법
KR101430224B1 (ko) * 2012-03-06 2014-10-15 농업회사법인 제이비솔루션 주식회사 돼지 유행성 설사병 바이러스 증식용 배지 및 돼지 유행성 설사병 바이러스를 증식시키는 방법
US9950061B2 (en) 2014-04-03 2018-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine epidemic diarrhea virus vaccine

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