CN105722528A - 用于卵内禽类接种的佐剂疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供组合物，其包含至少一种矿物油、具有表征为HLB值等于12的亲水性质的表面活性剂和二价无机盐，该组合物预期在用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物中用作佐剂，其特征在于该组合物是水包油乳剂或微乳。

Description

用于卵内禽类接种的佐剂疫苗

本发明涉及佐剂在配制疫苗组合物中的用途，该疫苗组合物预期用于预防禽类疾病，且预期通过卵内施用(注入卵内)应用，该佐剂包含至少一种油相和至少一种可药用二价无机盐。

疫苗佐剂是放大针对与之组合的疫苗抗原的免疫学反应的赋形剂。这些佐剂性质多样。它们可以同等地由脂质体、含有至少一种油相和至少一种水相的乳剂(如“弗氏”佐剂)、生物来源的佐剂(细胞因子、寡核苷酸等)或水不溶性无机盐组成。在用作疫苗组合物佐剂的无机盐中，可以提到例如非常常用的氢氧化铝。对于含有灭活抗原且预期用于注射禽类物种的疫苗组合物的配制，主要使用油包水乳剂类型的佐剂。

在疫苗组合物中使用佐剂尤其使得可能：

-提高一剂疫苗所赋予的保护性反应的强度，使得可能提供更好的保护水平；

-延长一剂疫苗所赋予的保护的持续时间，提供农场动物(animalsonfarms)在其整个生长期内，持续时间更长的保护；

-以较低抗原剂量获得等同于在无佐剂情况下使用的完整剂量所赋予的功效。因此，疫苗生产实体能够以同样的生产能力生产大量疫苗剂量。同样，可以建议现有条件用于接种更大数量的动物；

-减少提供疫苗保护所需的免疫次数。

预防病毒、细菌或寄生虫来源的传染性禽类疾病对支持家禽生产的发展极其重要。接种是用于预防禽类物种大量疾病(如新城疫、禽流感、传染性法氏囊病(Gumborodisease)、马立克氏病、球虫病、传染性支气管炎、禽霍乱等)的推荐方法。肉鸡(broilerchicken)至多生活几个月，并在其一生尤其是在其第一天中接受多种疫苗。

禽类疫苗可以通过小鸡或成鸡中的皮下或肌内注射、黏膜(口服、鼻内、眼内)、通过大量施用(雾化吸入法或在饮用水中施用)、或通过在胚胎达到受精后18或19天时注入卵(卵内施用)来施用。

经可注射途径的接种常规用于施用禽类疫苗。但是，由于在集约农业条件下接种非常大数量的动物代表高人工成本，最近发展了新方法。卵内接种因此是越来越提倡的疫苗施用方法，因为它可直接应用于养殖场所(孵化场)，且允许大幅减少用于接种的成本和时间。

用于禽类疫苗组合物的抗原可以由灭活病原体(灭活疫苗)、毒力降低的活病原体(活减毒疫苗)、重组免疫原性蛋白质(亚单位疫苗)或重组活载体(载体疫苗)组成。活减毒疫苗和载体疫苗一般足够有效而无需佐剂的系统加入，虽然可能用描述于例如美国专利申请WO2011/117507中的适宜佐剂放大活疫苗的功效。相反，灭活和亚单位疫苗的配制一般需要加入免疫佐剂，以达到所需的疫苗功效。

目前卵内施用的市售疫苗是不含佐剂的活减毒疫苗。由于活减毒疫苗可具有毒力回复风险，发展用于卵内接种的灭活或亚单位疫苗是有利的。但是，广泛用于在小鸡或成鸡中通过注射施用的，包含灭活或亚单位抗原和油包水型油性佐剂的禽类疫苗组合物不能就这样用于卵内施用。这是因为广泛用于接种小鸡和成鸡的油性佐剂对卵中胚胎的发育具有毒性。因此需要发展允许卵内使用灭活抗原的特异性佐剂。

预期卵内施用的佐剂因此必须具有以下具体特征：

-对禽类胚胎的发育无毒性；

-与活减毒(非杀病毒)疫苗相容；

-按照前述方式提高由疫苗抗原赋予的保护。

已针对卵内接种测试了多种佐剂技术，如氢氧化铝盐，卡波姆型(carbomertype)聚合物，生物来源的佐剂如CPG、细胞因子和趋化因子，及皂苷。但是，没有一致性，仍有必要以与卵内接种相容的成本，发展新的有效的佐剂制剂。

对于可在小鸡或成鸡中注射的禽类疫苗，最有效的佐剂技术是由水相和基于矿物油的油相组成的油包水乳剂。但是，迄今未发现基于油性乳剂的佐剂对卵内接种有效，尤其是由于毒性问题。

之前已显示水包油乳剂或微乳类型的佐剂与活疫苗相容，且可以用作用于活疫苗的免疫佐剂(专利申请WO2011/117507)。但是，在这些技术中，已显示此家族的大多数佐剂对卵中胚胎发育有毒性。

因此，需要使用包含水包油乳剂的佐剂，该水包油乳剂具有所需特征，如：

-对鸡胚发育无毒性；

-能够提高由卵内施用的用于禽类接种的亚单位抗原所提供的保护。

因此，本发明的主题是预期在用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物中用作佐剂的，包含至少一种矿物油、具有表征为HLB值等于12的亲水性质的表面活性剂及二价无机盐的组合物，其特征在于该组合物是水包油乳剂或微乳。

此外，本发明的实施方案可以包含一种或多种以下特征：

上文定义的组合物，其包含(对于其重量的100％)：

-50％至97％的水，更尤其是70％至97％的水，甚至更尤其是80％至97％的水；

-1％至45％的油性佐剂，更尤其是1％至30％的油性佐剂，甚至更尤其是2％至10％的油性佐剂；

-0.1％至10％的至少一种二价无机盐，更尤其是0.1％至8％的至少一种二价无机盐，甚至更尤其是0.2％至3％的至少一种二价无机盐；

-0％至10％的至少一种络合剂(complexingagent)，更尤其是0％至8％的至少一种络合剂，甚至更尤其是0％至3％的至少一种络合剂。

上文定义的组合物，其特征在于该油性佐剂包含(对于其重量的100％)：

-40％至95％的至少一种矿物油，更尤其是50％至95％的至少一种矿物油，甚至更尤其是50％至90％的至少一种矿物油；

-5％至60％的至少一种表面活性剂，更尤其是5％至50％的至少一种表面活性剂，甚至更尤其是10％至50％的至少一种表面活性剂。

上文定义的组合物，其特征在于该至少一种二价无机盐选自葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、天冬氨酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸亚铁和氯化钙。

上文定义的组合物，其特征在于该至少一种络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾和聚丙烯酸钠。

上文定义的组合物，其特征在于该表面活性剂是乙氧基化糖酯。

上文定义的组合物，其特征在于该矿物油是可注射质量的白色液体石油膏(petroleumjelly)。

根据另一方面，本发明的主题是预期用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物，其包含至少一种抗原和上文定义的免疫佐剂组合物。

此外，本发明的实施方案可以包含一种或多种以下特征：

上文定义的组合物，其特征在于该抗原包含至少一种重组亚单位蛋白质。

上文定义的组合物，其特征在于对于防止禽球虫病的目的，该亚单位蛋白质是来自艾美球虫属(Eimeria)的蛋白质，更尤其是来自堆型艾美球虫(Eimeriaacervulina)的蛋白质，且更尤其是抑制蛋白3-1E。

上文定义的组合物，其特征在于对于防止坏死性肠炎的目的，该亚单位蛋白质是来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的蛋白质，更尤其是NetB毒素、或α毒素、或蛋白质丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFO)、或延伸因子Tu(EF-Tu)。

上文定义的组合物，其特征在于对于防止禽球虫病和禽坏死性肠炎的目的，该抗原包含至少一种来自产气荚膜梭菌的蛋白质，更尤其是NetB毒素、或α毒素、或蛋白质丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFO)、或延伸因子Tu(EF-Tu)，及来自艾美球虫属的蛋白质，更尤其是来自堆型艾美球虫的蛋白质，且更尤其是抑制蛋白3-1E。

上文定义的组合物，其包含至少一种球虫病的抗寄生虫活抗原。

上文定义的组合物，其包含至少一种用于禽类接种的活抗原。

术语“微乳”理解为意指通过一种(或多种)表面活性剂稳定的两种不溶混液体的热动力学稳定分散体。这些分散体通常是透明的，因为中间相的典型大小小于光的波长，通常为纳米级。

通过由表明活性剂稳定的小油滴的水性分散体来提供实例。由于其直径(几十纳米)，它们裸眼及甚至在显微镜下不可见。它们的大小可以通过显微技术如小角度辐射散射来测量。

作为本发明主题的乳剂或微乳在宏观尺度上具有从浅蓝色至白色范围内的颜色。

用于制备油性佐剂的矿物油选自通过石油蒸馏和通过实施后续加工步骤而获得的矿物油、烃，该后续处理步骤例如脱硫、脱沥青、芳香族化合物提取和蜡提取步骤，及其他精加工步骤(可以提到例如Marcol52、Marcol82、Drakeol5、Drakeol6、Eolane170等类型的油)。

存在于油性佐剂中的表面活性剂是具有表征为8至15之间的HLB值的亲水性质的乳化表面活性剂。优选地，它的HLB值等于12。这种表面活性剂可以由以下组成：烷基多葡糖苷或烷基多葡糖苷的混合物；皂苷；卵磷脂；聚乙氧基化链烷醇；包含聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段的聚合物；通过脂肪酸(有利地，在20℃为液体的脂肪酸)与糖、山梨醇、甘露醇或甘油缩合而获得的酯。该糖可以由葡萄糖或蔗糖或优选甘露醇组成。作为优选的酯，可以提到脂肪酸例如油酸、硬脂酸、棕榈酸或月桂酸及山梨醇或甘露醇的酯，其通过用山梨醇或甘露醇酯化脂肪酸、或通过用源自在1-4位或在2-6位环化的山梨醇或甘露醇的多羟基链的脱水的产物酯化、或通过用山梨醇或甘露醇及用源自在1-4位或在2-6位环化的山梨醇或甘露醇的多羟基链的脱水的产物酯化而获得。作为尤其优选的甘露醇酯，可以提到甘露醇油酸酯，一缩甘露醇油酸酯，包含5mol或10mol或15mol或20mol环氧乙烷的乙氧基化甘露醇油酸酯，及包含5mol或10mol或15mol或20mol环氧乙烷的乙氧基化一缩甘露醇油酸酯。还可以使用聚乙二醇、山梨醇或甘油糖酯衍生物。优选的表面活性剂的其他类型有乙氧基化植物油组成，例如具有3mol至40mol之间的环氧乙烷的乙氧基化玉米油，具有3mol至40mol之间的环氧乙烷的乙氧基化菜籽油，或具有3mol至60mol之间的环氧乙烷的乙氧基化蓖麻油。

本发明将从后文实施例和附图的观点得到更清晰的理解。

实施例

实施例1：佐剂与禽类胚胎发育的相容性

为了测量佐剂与卵内接种鸡胚的相容性，将与多种活减毒疫苗相容的多种水包油乳剂类型的佐剂配制为安慰剂疫苗(水相：PBS)。用Intelliject注射器(Avitech)和17.5cm、18号针头在18天受精卵的羊膜腔中注射0.1ml这些安慰剂制剂的每一种。

毒性测量为用有佐剂的安慰剂疫苗注射后孵化的小鸡数目，与用0.1ml无佐剂的PBS注射后孵化的小鸡数目相比较。为了比较，将用于接种成鸡的基于油包水乳剂类型的参考禽类佐剂的安慰剂包括在测试中。进行了两个试验系列，结果显示在下文中。

试验1：

2至5组使用乳剂1至4。在这些组合物中，非水级分最终在所制备的疫苗中代表从6％至12％范围内的百分比(油+表面活性剂+盐)。表面活性剂1属于乙氧基化糖酯家族。表面活性剂2属于乙氧基化脂肪醇家族。矿物油1和2是可注射质量的白色液体石油膏(例如：来自Exxon的Marcol)。二价盐是锰盐或钙盐。标准配方方案是向代表10％的基底(矿物油+表面活性剂HLB12)中加入适量含2％盐的水溶液至100％。这些制备物使得可能获得与在无佐剂(1组)情况下注射的组没有显著不同的出生率，表明良好的耐受。具有相似的定性和定量组成的6至8组诱导高死亡率(出生率在46％和62％之间)。这些配方仅基于油+表面活性剂的混合物。

表2：

观察：1至3组的孵化小鸡数相等。5组的孵化小鸡数显著更少。

在此试验中，确认了2和3类型的乳剂与卵内接种相容，因为它们未诱导死亡率；W/O乳剂诱导高死亡率，在测试条件下与此应用不相容。

这两个试验显示，只有包含乳剂和可药用二价盐的佐剂与禽类胚胎发育相容。

实施例2：第1功效试验：针对球虫病的重组卵内疫苗模型

然后在卵内注射的针对球虫病的亚单位疫苗模型上，测试了在无害性测试后选择的佐剂的功效。球虫病是由艾美球虫属的寄生虫引起的肠道寄生虫禽类疾病。

之前显示，通过用亚单位疫苗注射小鸡来接种，使得可能诱导针对堆型艾美球虫的同源保护及针对造成球虫病的另外2个艾美球虫属品系(巨型艾美球虫(E.maxima)、柔嫩艾美球虫(E.tenella))的交叉保护，该亚单位疫苗用油包水佐剂辅助，且包含重组堆型艾美球虫抑制蛋白3-1E作为抗原。

在这种情况下，抗原单独的免疫原性不足以诱导保护，需要加入佐剂[参见S.I.Jang、H.S.Lillehoj、S.H.Lee、K.W.Lee、E.P.Lillehoj、F.Bertrand、L.Dupuis、S.Deville.Montanide^TM ISA71VGadjuvantenhances antibodyandcell-mediatedimmuneresponsestoprofilinsubunitantigen vaccinationandpromotesprotectionagainstEimeriaacervulinaandEimeria tenella.ExperimentalParasitology127(2011)178–183；以及S.I.Jang、D.K.Kim、H.S.Lillehoj、S.H.Lee、K.W.Lee、F.Bertrand、L.Dupuis、S.Deville、J.BenArous、E.P.LillehojEvaluationofMontanideTMISA71VG AdjuvantduringProfilinVaccinationagainstExperimentalCoccidiosis.PLoSONE8(4)(2013)e59786]。

因此将堆型艾美球虫3-1E抗原(50μg/剂量)与在前一步骤中选择的佐剂组合用于卵内注射。

下文显示接种组。用Intelliject注射器(Avitech)和17.5cm、18号针头将0.1ml这些疫苗的每一种注入18天受精卵的羊膜腔。

观察：1至5组的孵化小鸡数相等。

孵化后，通过在食管中接种10000个堆型艾美球虫孢子形成的卵母细胞(sporulatedoocyte)，来在接种后18天(孵化后15天)对卵内接种的小鸡进行感染攻击。通过记录注射后的增重、计数排泄的(excreted)卵母细胞、测量肠损伤和血清学抗抑制蛋白3-1E反应，来测量对感染的抗性。

通过ANOVA分析来对结果进行统计学分析。P<0.05认为差异显著。两个显著不同的值通过不同字母表示。

结果：

1-增重：

在感染当天和感染后10天之间测量增重：

2-肠损伤：

由球虫病引起的特异性肠损伤的分值代表由三个独立观察者给出的分值的平均值。损伤以损伤严重度递增顺序从1至4分级。

3-卵母细胞的粪便排泄：

在感染后第6天和第10天之间收集各组的粪便，并计数注射后排泄的艾美球虫属卵母细胞。

4-抗3-1E血清抗体：

通过在免疫后18天感染前取血样并进行ELISA分析来测量抗抑制蛋白3-1E的特异性血清抗体。结果显示在图1中。

第1功效试验的结论：

所获得的结果显示，包含可以络合或不络合的二价盐的水包油乳剂类型的佐剂与卵内接种相容，并提高由亚单位抗原赋予的针对球虫病的保护。佐剂组动物在感染后显示更高的增重，及与用无佐剂抗原接种的动物相比减少的寄生虫排泄和肠损伤。它们还显示高于用无佐剂抗原接种的动物的抗原特异性血清抗体效价。无佐剂疫苗不允许任何针对球虫病的保护。

实施例3：第2功效试验：针对球虫病和坏死性肠炎的二价重组卵内疫苗模型

其次，在卵内注射的针对球虫病和坏死性肠炎的二价亚单位疫苗模型上测试了所选择的佐剂的功效。

球虫病是由艾美球虫属的寄生虫引起的肠道寄生虫禽类疾病。

坏死性肠炎是细菌性肠道禽类疾病，其由产气荚膜梭菌引起，并由艾美球虫属预感染的存在增强。

之前显示，通过用包含重组产气荚膜梭菌NetB毒素作为抗原的佐剂亚单位疫苗注射小鸡来接种，可能诱导针对产气荚膜梭菌感染的保护。

NetB抗原单独的免疫原性不足以诱导保护，需要加入佐剂[参见S.I.Jang、H.S.Lillehoj、S.H.Lee、K.W.Lee、E.P.Lillehoj、Y.H.Hong、D.J.An、W.Jeong、J.E.Chun、F.Bertrand、L.Dupuis、S.Deville、J.BenArous-VaccinationwithClostridiumperfringensrecombinantproteinsincombinationwithMontanide^TMISA71VGadjuvantincreasesprotectionagainstexperimentalnecroticenteritisincommercialbroilerchickens.Vaccine30(2012)5401-5406]。

因此将堆型艾美球虫3-1E抗原(50μg/剂量)和产气荚膜梭菌NetB抗原(50μg/剂量)与所选择的佐剂组合用于卵内注射。

下文显示接种组。用Intelliject注射器(Avitech)和17.5cm、18号针头将0.1ml这些疫苗的每一种注入18天受精卵的羊膜腔。

观察：认为所有组的孵化小鸡数相同。

孵化后，通过在食管中接种10000个堆型艾美球虫孢子形成的卵母细胞，来在接种后18天(孵化后15天)对卵内接种的小鸡(5只小鸡/组)进行感染攻击，然后在3天后(接种后21天)用10⁹CFU产气荚膜梭菌进行感染。

通过记录注射后的增重、测量肠损伤、抗NetB毒素血清学反应和用NetB毒素再刺激后的脾细胞增殖来测量对感染的抗性。

通过ANOVA分析来对结果进行统计学分析。p<0.05认为差异显著。两个显著不同的值通过不同字母表示。

结果：

1-增重：

在用艾美球虫属感染当天(接种后d18)和用梭菌属感染后2天(接种后d23)之间测量增重：

2-肠损伤：

特异性肠损伤的分值代表由三个独立观察者给出的分值的平均值。损伤以损伤严重度递增顺序从1至4分级。

3-抗NetB血清抗体：

通过在接种后d18用堆型艾美球虫和产气荚膜梭菌感染前取血样并进行ELISA分析，来测量抗NetB毒素的特异性血清抗体。结果显示在图2中。

4-用NetB再刺激的脾细胞的特异性增殖：

通过NetB存在下脾淋巴细胞的再增殖来测量由接种诱导的细胞反应。

对于2动物/组，免疫后16天(感染前)取出脾。分离脾细胞，然后在NetB存在下再刺激48小时。通过刺激指数来显示再增殖。结果显示在图3中。

第2功效试验的结论

所获得的结果显示，作为本发明主题的包含可以络合或不络合的二价盐的水包油乳剂类型的佐剂与卵内接种相容，并提高由亚单位抗原赋予的针对坏死性肠炎的保护。与用无佐剂抗原接种的动物相比，佐剂组动物在感染后显示更高的增重，及减少的肠损伤。它们还显示高于用无佐剂抗原接种的动物的抗原特异性血清抗体效价及抗原特异性淋巴细胞再刺激指数。在这种情况下，无佐剂疫苗未使得可能获得任何针对产气荚膜梭菌感染的保护。

Claims (14)

1.组合物，其包含至少一种矿物油、具有表征为HLB值等于12的亲水性质的表面活性剂和二价无机盐，所述组合物预期在用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物中用作佐剂，其特征在于所述组合物是水包油乳剂或微乳。

2.前述权利要求的组合物，对于其重量的100％，其包含：

-50％至97％的水，更尤其是70％至97％的水，甚至更尤其是80％至97％的水；

-1％至45％的油性佐剂，更尤其是1％至30％的油性佐剂，甚至更尤其是2％至10％的油性佐剂；

-0.1％至10％的至少一种二价无机盐，更尤其是0.1％至8％的至少一种二价无机盐，甚至更尤其是0.2％至3％的至少一种二价无机盐；

-0％至10％的至少一种络合剂，更尤其是0％至8％的至少一种络合剂，甚至更尤其是0％至3％的至少一种络合剂。

3.前述权利要求的组合物，其特征在于对于其重量的100％，所述油性佐剂包含：

-40％至95％的至少一种矿物油，更尤其是50％至95％的至少一种矿物油，甚至更尤其是50％至90％的至少一种矿物油；

-5％至60％的至少一种表面活性剂，更尤其是5％至50％的至少一种表面活性剂，甚至更尤其是10％至50％的至少一种表面活性剂。

4.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于所述至少一种二价无机盐选自葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、天冬氨酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸亚铁和氯化钙。

5.权利要求2至4中任一项的组合物，其特征在于所述至少一种络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾和聚丙烯酸钠。

6.权利要求3至5中任一项的组合物，其特征在于所述表面活性剂是乙氧基化糖酯。

7.前述权利要求中任一项的组合物，其特征在于所述矿物油是可注射质量的白色液体石油膏。

8.预期用于卵内接种禽类物种的疫苗组合物，其包含至少一种抗原和权利要求1至7中所定义的免疫佐剂组合物。

9.权利要求8的组合物，其特征在于所述抗原包含至少一种重组亚单位蛋白质。

10.权利要求9的组合物，其特征在于对于防止禽球虫病的目的，所述亚单位蛋白质是来自艾美球虫属的蛋白质，更尤其是来自堆型艾美球虫的蛋白质，且更尤其是抑制蛋白3-1E。

11.权利要求9的组合物，其特征在于对于防止坏死性肠炎的目的，所述亚单位蛋白质是来自产气荚膜梭菌的蛋白质，更尤其是NetB毒素、或α毒素、或蛋白质丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFO)、或延伸因子Tu(EF-Tu)。

12.权利要求9的组合物，其特征在于对于防止禽球虫病和禽坏死性肠炎的目的，所述抗原包含至少一种来自产气荚膜梭菌的蛋白质，更尤其是NetB毒素、或α毒素、或蛋白质丙酮酸盐:铁氧还蛋白氧化还原酶(PFO)、或延伸因子Tu(EF-Tu)，及来自艾美球虫属的蛋白质，更尤其是来自堆型艾美球虫的蛋白质，且更尤其是抑制蛋白3-1E。

13.权利要求12的组合物，其包含至少一种球虫病的抗寄生虫活抗原。

14.权利要求13的组合物，其包含至少一种用于禽类接种的活抗原。