CN1852735A - 包含水包油乳液的疫苗制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了水包油型(O/W)乳液，在细菌或病毒悬液尤其是那些浓缩的和非纯化的或弱纯化的细菌或病毒悬液存在下具有提高的稳定性。本发明的乳液可以作为递送包括至少一种免疫原的药物组合物的载体，特别地，免疫原选自灭活病原体、减毒病原体、亚单位、重组表达载体和质粒或其组合。一实施方案中，本发明提供了可注射的水包油型(O/W)乳液，包括：(1)含有免疫原的水溶液，所述免疫原选自灭活的猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae)细菌、灭活的猪环状病毒2型(PCV－2)病毒或其组合；(2)矿物油；(3)非离子亲脂性表面活性剂；和(4)具有低HLB值的非离子亲水性表面活性剂，其包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯(通常具有11至13的HLB值)；(5)具有13至40的高HLB值的非离子亲水性表面活性剂。

Description

包含水包油乳液的疫苗制剂

本申请要求2003年7月24日提交的US临时申请No.60/490,345的优先权，其内容以其整体引入作为参考。

                       发明领域

本发明涉及水包油型乳液、及其作为佐剂的用途和含有其的药物、免疫或疫苗组合物。

                    相关技术的描述

在疫苗中使用佐剂是公知的。佐剂是这样的化合物：当与疫苗抗原组合时，与疫苗抗原单独诱导的应答相比较，提高了对疫苗抗原的免疫应答。促进抗原免疫原性的策略中有使疫苗抗原成为颗粒的那些，聚合或乳化疫苗抗原的那些，封装疫苗抗原的方法，提高宿主先天细胞因子应答的方法，以及使疫苗抗原靶向抗原呈递细胞的方法( Nossal，1999，Fundamental Immunology.Paul(编辑)，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa，； Vogel和Powel，1995，Vaccine Design.The subunit and Adjuvant Approach. Powell 和Newman(编辑)，Plenum Press，NY，N.Y.p.141)。由于佐剂在提高疫苗抗原免疫原性中的实质性作用，在疫苗配制中使用佐剂实际上已是普遍的了(Nossal，1999，上文； Vogel和Powel，1995， 上文；以及参见PCT公开WO97/18837，其教导在此引入作为参考)。本领域公知的常用佐剂，性质上是多种多样的。例如，它们可以由水不溶性无机盐、脂质体、胶束或乳液组成，即弗氏佐剂。其它佐剂可在 Vogel 和Powel，1995，提及的上文中找到。尽管不存在佐剂作用的单一机理，一个基本特征是与疫苗抗原单独诱导的应答相比较，它们显著提高对疫苗抗原的免疫应答的能力，( Nossal，1999，上文； Vogel和 Powel，1995，上文)。在这点上，一些佐剂对增进体液免疫应答更有效；其它佐剂对提高细胞介导的免疫应答更有效( Vogel和Powel，1995，上文)；以及另一组佐剂同时提高了对抗疫苗抗原的体液和细胞介导的免疫应答( Vogel和Powel，1995，上文)。

通常，疫苗制剂中所用的乳液包括油、水溶液和表面活性剂的混合物。一些乳液掺入了亲脂性表面活性剂如Span 80^和亲水性表面活性剂如吐温80^。这些乳液还可含有已知具有离子表面活性剂特性的化合物如卵磷脂或皂苷。

然而，观察到乳液用作疫苗佐剂的稳定性问题，尤其是在储存或运输过程中。当这些组合物含有浓缩的免疫原，尤其是非纯化的浓缩免疫原时，这尤其真实。通常，这是将佐剂用于灭活(死)疫苗中的情况。多价疫苗组合物中这问题甚至更显著，因为免疫原在相同体积的稀释液中更浓缩。

使用佐剂的另一问题是与不良事件如毒性或注射部位局部炎症的风险相关。例如，注射后可导致局部炎症反应和/或肉芽肿。为了限制这样的不良反应，可减少乳液中的表面活性剂和其它成分；然而，这种减少然后可能导致疫苗组合物稳定性的下降。因此，存在对新的佐剂和含有该佐剂的安全性和稳定性提高的疫苗组合物的需要。

                      发明概述

本发明的第一个实施方案中提供了新的水包油型(O/W)乳液，在细菌或病毒悬液尤其是那些浓缩的和非纯化的或弱纯化的细菌或病毒悬液存在下具有提高的稳定性。

本发明的另一实施方案提供了稳定的、安全的和容易给药的，尤其是可注射的O/W乳液，作为包括至少一种活性成分的药物组合物的递送载体，活性成分可更特别地是免疫原。

本发明的另一实施方案提供了稳定的、安全的和可注射的O/W乳液，作为佐剂来提高免疫原诱导的免疫应答。特别地，本发明提供了新的佐剂，当其用于含有免疫原的疫苗组合物中时，提高了接种者对免疫原的细胞免疫应答、体液免疫应答，或优选两种应答。

本发明的另一实施方案提供了稳定的、安全的并包括O/W乳液的免疫原性组合物或疫苗。

本发明的再一实施方案提供了使用本发明的佐剂制备疫苗组合物的方法；所获得的疫苗组合物；及其使用方法。

本发明的再一实施方案提供了一种试剂盒，包括第一个小瓶中的免疫原或其它药品，和第二个小瓶中的根据本发明制得的佐剂，将佐剂设计成在使用前与免疫原或其它疫苗产品混合。

一优选实施方案中，本发明提供了可注射的水包油型(O/W)乳液，包括：

(1)含有免疫原的水溶液；

(2)矿物油；

(3)非离子亲脂性表面活性剂；

(4)具有低HLB值的非离子亲水性表面活性剂，其包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯(通常具有11至13的HLB值)。

另一优选实施方案中，本发明提供了可注射的水包油型(O/W)乳液，包括：

(1)含有免疫原的水溶液；

(2)具有大于13且低于40的高亲水-亲脂平衡(HLB)值的非离子亲水性表面活性剂，尤其是HLB≥13.5，优选HLB≥14；

(3)矿物油；

(4)非离子亲脂性表面活性剂；

(5)具有低HLB值(约9至约13的HLB值)的非离子亲水性表面活性剂。

再一优选实施方案中，本发明提供了包括新乳液的疫苗组合物，含有至少一种适于引发接种者免疫应答的免疫原。本发明进一步提供了这样的组合物，其中乳液作为佐剂来提高由免疫原诱导的免疫应答，尤其是，提高细胞应答、体液应答，或优选提高两者。

本发明另一优选实施方案中，本发明提供了制备疫苗组合物的方法，其中将免疫原尤其是冻干形式的或水溶液中的免疫原与根据本发明的佐剂混合。免疫原可以选自：灭活病原体、减毒病原体、亚单位抗原、包括质粒的重组表达载体，等等。病原体可以是细菌、病毒、原生动物或真菌来源的或免疫原可以构成抗毒素。

另一优选实施方案中，本发明提供了诱导接种者对抗病原体的免疫应答的方法，包括将本发明的疫苗组合物给药于接种者。

另一优选实施方案中，本发明提供了包括至少两个小瓶的试剂盒，第一个小瓶中是免疫原，尤其是冻干形式的或含水介质溶液中的免疫原，第二个小瓶中是根据本发明的佐剂或乳液。

注意到本说明书尤其是权利要求中，术语如包含(“comprises”、“comprised”、“comprising”)等等可具有美国专利法中归属于这样术语的含意；例如，它们可以意思是“包括”(“includes”、“included”、“including”)，等等；以及术语如：“基本上由……组成”(“consisting essentially of”和“consists essentiallyof”)具有美国专利法归于它们的含意，例如，它们允许未明确引述的要素，但是排除现有技术中发现的要素或影响本发明基础的或新的特征的要素。

公开了这些和其它实施方案或从以下的详述这些和其他实施方案是显而易见的且这些和其他实施方案包括于以下的详述中。

                          附图简述

对本领域技术人员，本发明的完整和使其能实施的公开，包括其最佳方式，更具体地列于说明书的剩余部分，包括对附图的参照，其中：

图1说明了根据实施例3接种疫苗后28天攻击小猪的肺损害分值。通过十字显示平均值，通过方框表示下四分位数和上四分位数，通过方框中的水平线表示统计学中值，通过垂直线表示最小至最大的值。

图2说明了根据实施例4接种疫苗后20周攻击小猪的肺损害分值。通过十字显示平均值，通过方框表示下四分位数和上四分位数，通过方框中的水平线表示统计学中值，通过垂直线表示最小至最大的值。

图3提供了临床疾病进展的图示，通过根据实施例6攻击后的临床分值来示例。

图4描绘了现场效力测试的结果，其中在生产前接种一次根据本发明制得的PCV-2疫苗组合物的母猪产下的小猪(n＝889只小猪)显示了由于断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡率显著降低(降低75％)，与未接种疫苗的母猪产下的对照小猪相比较(n＝713)。

                       发明详述

本发明的其它目的、特征和方面描述于以下的详述中或从以下的详述变得显而易见。本领域技术人员可以理解本讨论是仅仅示例性实施方案的描述并不是来限制本发明的较宽方面，其较宽方面在实例构建中体现。实际上，本领域技术人员清楚对本发明可以作出各种改进和改变而没有脱离本发明的范围或精神。例如，作为一实施方案的一部分说明或描述的特征可以用于另一实施方案中来产生再一实施方案。预期的是本发明涵盖这样的改进和改变落在所附权利要求及其等同方案范围之内。贯穿本申请所引用的所有参考文献、公开专利和专利的内容在此以其整体引入作为参考。

为了方便，在此集中说明书、实施例和所附权利要求中所用的特定术语。

如在此所用的，术语“动物”包括所有脊椎动物，包括人。还包括所有发育阶段中的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。特别地，术语“脊椎动物”包括，但不限于，人、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)；马科动物(例如，马)、牛族动物(例如，牛)、猪类动物(例如，猪)，以及鸟类。如在此所用的术语“鸟类”指的是分类学类别ava的任何物种或亚种，如，但不限于，鸡(育种鸡、烤子鸡和产蛋鸡)、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、小雀类、鹰、乌鸦和包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡的平胸类鸟。

如在此所用的，术语“猪”或“小猪”意思是猪起源的动物，而“母猪”指的是生殖年龄和能力的雌性。

如在此所用的，术语“致病性强的”意思是保留其在动物宿主中感染能力的分离株。

如在此所用的，术语“灭活疫苗”意思是含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物。病原体可以是细菌、病毒、原生动物或真菌来源的。可通过各种方法包括冻融、化学处理(例如，用硫柳汞或福尔马林处理)、声处理、照射、热或任何其它足以阻止生物体复制或生长的常用方法来实现灭活而维持其免疫原性。

如在此所用的，术语“免疫原性”意思是能够在宿主动物中产生对抗抗原的免疫应答。该免疫应答形成由疫苗引发的对抗特定感染性生物体的保护性免疫的基础。

如在此所用的，术语“免疫应答”指的是动物中引发的应答。免疫应答可以指细胞免疫(CMI)；体液免疫或可以包括两者。本发明还涉及限于免疫系统一部分的应答。例如，本发明的疫苗组合物可以特异性地诱导提高的γ干扰素应答。

如在此所说的，术语“抗原”或“免疫原”意思是诱导宿主动物中特异性免疫应答的物质。抗原可以包括整个生物体，杀灭的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分；含有具有免疫原性插入片段的重组载体；呈递给宿主动物时能诱导免疫应答的DNA碎片或片段；蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可以包括毒素或抗毒素。

如在此所用的，术语“多价”意思是含有多于一种抗原的疫苗，不管是来自相同的物种(即，猪肺炎枝原体(Mycoplasmahyopneumoniae)的不同分离株)或来自不同的物种(即，来自溶血巴斯德氏菌(Pasteurella hemolytica)和多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)的分离株)，或含有来自不同属的抗原组合的疫苗(例如，包括来自多杀巴斯德氏菌、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、睡眠嗜血菌(Haemophilus somnus)和梭菌(Clostridium)的抗原的疫苗)。

如在此所用的，术语“佐剂”意思是加入疫苗来提高疫苗免疫原性的物质。佐剂怎样运作的机理不是十分清楚。相信一些佐剂通过缓慢释放抗原来提高免疫应答，而其它佐剂其自己是强免疫原性的并据信可协同作用。已知的疫苗佐剂包括，但不限于，油和水乳液(例如，完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)，卡介苗、氢氧化铝、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、Bacto-佐剂、特定合成聚合物如聚氨基酸和氨基酸的共聚物、皂苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga.)、“AVRIDINE”(N，N-二(十八烷基)-N’，N’-双(2-羟乙基)-丙二胺)、石蜡油、胞壁酰二肽等等。

如在此所用的，术语“药物学上可接受的载体(carrier)”和“药物学上可接受的载体(vehicle)”可互换使用且指的是用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而无不良作用的流体载体。本领域已知的合适的药物学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲溶液。载体还可以包括助剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂(即，糖和氨基酸)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂、增粘添加剂、色素等等。

如在此所用的，术语“疫苗组合物”包括药物学上可接受载体中的至少一种用于在宿主中诱导免疫应答的抗原或免疫原。可以以剂量和通过医药或兽医领域技术人员公知的技术给药疫苗组合物，考虑这样的因素如年龄、性别、体重、物种和接受动物的状况，以及给药途径。给药途径可以是经皮的，通过粘膜给药(例如，口腔、鼻、肛门、阴道)或通过非肠道途径(皮内、肌内、皮下、静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独给药，或可以与其它治疗剂或疗法共同给药或按次序给药。给药的形式可包括悬液、糖浆或酏剂，以及用于非肠道、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如，可注射的给药)的制剂如无菌悬液或乳液。疫苗组合物可以作为喷雾剂给药或混合于食品和/或水中或与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等等混合递送。根据给药的途径和所需的制剂，组合物可以含有辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、色素，等等。可以参考标准的药物教科书，如“Remington’sPharmaceutical Science，”，1990来制备合适的制剂，而不需要过度的实验。

本发明提供了新的水包油型(O/W)佐剂或乳液，包括：

(1)含有能够诱导宿主中免疫应答的疫苗抗原或免疫原的水溶液；

(2)具有高于13且低于40(HLB＞13，尤其是≥13.5，优选HLB≥14)亲水-亲脂平衡(HLB)值的非离子亲水性表面活性剂；

(3)矿物油；

(4)非离子亲脂性表面活性剂；和

(5)具有低HLB值(9至13的HLB值)的非离子亲水性表面活性剂。

根据本发明所制得的乳液是基于选自三个不同组表面活性剂成员的至少3种表面活性剂的组合，且其可能使用属于每组中的一种或多种表面活性剂。

优选实施方案中，乳液(在本说明书中这意味着包括所有成分的最终乳液，除非另外指出)中非离子亲水性表面活性剂(5)的浓度为1％至8％，尤其是1.5％至6％，优选2％至5％，更优选2.5％至4％，以乳液的重量体积百分比(w/v)表示。

这组表面活性剂包括具有低HLB值(9至13的HLB值)的非离子亲水性表面活性剂。这组包括但不限于乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯(尤其是5个乙氧基)(例如，乙氧基化失水山梨醇单油酸酯如吐温81^)、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯(尤其是20个乙氧基)(例如，乙氧基化失水山梨醇三油酸酯如吐温85^、乙氧基化失水山梨醇三硬脂酸酯如吐温65^)、乙氧基化脂肪醇(尤其是5-10个乙氧基)(例如，Brij76^、Brij56^、Brij96^)、乙氧基化脂肪酸(尤其是5-10个乙氧基)(例如，Simulsol 2599^、Myrj45^)、乙氧基化蓖麻油(尤其是25-35个乙氧基)(例如，Arlatone650^、Arlatone G^)及其组合。

优选乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯和乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯，以及这两种的组合。脂肪酸优选选自油酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、月桂酸及其组合。优选的乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯包括乙氧基化失水山梨醇三油酸酯如吐温85^，或乙氧基化失水山梨醇三硬脂酸酯如吐温65^。

优选的实施方案中，非离子亲水性表面活性剂(2)的浓度通常为0.1％至1.5％，尤其是0.2％至1.4％，优选0.3％至1.3％，更优选0.4％至1.2％，以乳液的重量体积百分比(w/v)表示。

这第二组表面活性剂包括具有高亲水-亲脂平衡(HLB)值(HLB＞13，尤其是HLB≥13.5，和优选HLB≥14)的非离子亲水性表面活性剂。这组包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯(尤其是20个乙氧基)(例如，乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯如吐温20^、乙氧基化失水山梨醇单棕榈酸酯如吐温40^、乙氧基化失水山梨醇单硬脂酸酯如吐温60乙氧基化失水山梨醇单油酸酯如吐温80^)、乙氧基化脂肪醇(尤其是15-30个乙氧基)(例如，Brij78^、Brij98^、Brij721^)、乙氧基化脂肪酸(尤其是15-30个乙氧基)(例如，Myrj49^、Myrj51^、Myrj52^、Myrj53^)、非离子嵌段共聚物(例如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(POE-POP)，如Lutrol F127^、Lutrol F68^)及其组合。

对于非离子嵌段共聚物，百分比可以较低，尤其是0.1至0.5％，更优选0.2％至0.4％(乳液的重量体积比(w/v))。

优选的表面活性剂(2)包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯，如上述的那些。

优选的实施方案中，非离子亲脂性表面活性剂(4)的浓度通常为0.1％至2.5％，尤其是0.2％至2％，优选0.2％至1.5％，更优选0.2％至1.2％，以乳液的重量体积百分比(w/v)表示。

这组的表面活性剂包括失水山梨醇的脂肪酸酯(例如，失水山梨醇单月桂酸酯如Span 20^、失水山梨醇单棕榈酸酯如Span 40^、失水山梨醇单硬脂酸酯如Span 60^、失水山梨醇三硬脂酸酯如Span 65^、失水山梨醇单油酸酯如Span 80^、失水山梨醇三油酸酯如Span 85^、失水山梨醇单异硬脂酸酯如Arlacel 987^、失水山梨醇异硬脂酸酯如Crill 6^)、二缩甘露醇脂肪酸酯(例如，Montanide 80^、二缩甘露醇单油酸酯(如Arlacel A^)、二缩甘露醇二油酸酯、二缩甘露醇三油酸酯、二缩甘露醇四油酸酯)、二缩甘露醇乙氧基化脂肪酸酯(2、3或4个乙氧基)(例如，Montanide 888^、Montanide 103^、乙氧基化二缩甘露醇单油酸酯、乙氧基化二缩甘露醇二油酸酯、乙氧基化二缩甘露醇三油酸酯、乙氧基化二缩甘露醇四油酸酯)及其组合。

脂肪酸优选选自油酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、月桂酸及其组合。

优选的表面活性剂(4)包括失水山梨醇脂肪酸酯，尤其是上述的那些，及其组合。

本发明的表面活性剂可以含有来自动物或植物来源的脂肪酸。可以简单进行一个来源至另一个的改变(例如动物吐温80^至植物吐温80^)，在乳液配制中只作较小调整。

根据本发明的乳液可以具有的表面活性剂总浓度为，1.2％至10％，尤其是2％至8％，优选3％至7％，更优选4％至6％，乳液的重量体积比。

通常，根据本发明的乳液可以具有≥33℃的相转变温度(PIT)，尤其是33℃至65℃，更特别是36℃至60℃，优选37℃至55℃，更优选38℃至50℃。

PIT是油包水型乳液变成水包油型乳液或脱相(de-phase)(乳液破坏且2个相分离)的温度。可以通过各种方法测量PIT值，例如通过外观(例如，参见实施例2)或通过电导率。将乳液放置于低于乳液PIT的温度，例如约25℃的水浴中。逐渐提高温度。与对照乳液相比较，观察乳液外观特征的改变，尤其是流动性、粘度、两相的分离、由于油相至表面的迁移表面特征的改变。观察到该外观特征改变的温度是乳液的PIT值。或者，通过放置于乳液中接近其表面的探针测得电导率值从约5-8毫西门子/厘米(mS/cm)(水包油型乳液)快速变成约0mS/cm的值(油包水型乳液)来测定PIT。观察到转变的温度是乳液的PIT值。为了生产根据本发明的乳液，尤其是具有上述限定范围内PIT值的乳液，本领域技术人员能够确定表面活性剂和油的组合，包括它们各自的浓度，而不需要过度的实验。

本发明的特定实施方案中，在此所述的乳液不含有任何离子表面活性剂和任何已知具有离子表面活性剂特性的化合物，如卵磷脂或皂苷。通常，根据本发明的乳液，以乳液的体积体积比，可以含有3％至55％的油，尤其是5％至50％的油，优选10％至40％的油，更优选，20％至40％的油。根据定义，本说明书中值的范围总是包括范围的限值，除非另外指出。

所用的油可以是矿物油，包括但不限于，石蜡油如异构烷烃油和/或naphtenic oil、角鲨烷、姥鲛烷、聚异丁烯油、氢化聚异丁烯油、聚癸烯油、聚异戊二烯油、聚异丙稀油等等。用于本发明中的一种有利矿物油可以包括这样的油，该油含有碳原子数多于15个的直链或支链碳链，优选15至32，且无芳族化合物。这样的油例如是以名称“MARCOL 52^”或“MARCOL 82^”(Esso生产，France)或“DRAKEOL6VR^”(Penreco生产，USA)销售的那些。

油还可以是含有至少两种选自在此所述的油且以任何比例的油混合物。油混合物还可以包括至少一种选自上述的油和至少一种植物油，且该植物油占油相的约0.1％至约33％，优选约10％至约25％v/v。这些植物油是富含油酸的生物可降解不饱和油且优选在存放温度(约+4℃)是液体或至少使乳液在该温度是液体。例如植物油可以是花生油、坚果油、向日葵油、红花油、大豆油、onager油等等。

优选实施方案中，亲水性表面活性剂(2)和(5)优选包括具有相同分子亲水部分的表面活性剂。例如，对于每种亲水性表面活性剂(2)和(5)使用乙氧基化失水山梨醇脂肪酸酯。例如，如果选择吐温85^作为具有低HLB值的非离子亲水性表面活性剂，具有高HLB值的非离子亲水性表面活性剂将有利地含有由乙氧基化失水山梨醇构成的亲水性部分，如吐温80^。

通常，本发明设想使用含有合适的兽医或药物学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的水溶液，包括但不限于，无菌水、生理盐水、葡萄糖、缓冲液等等。载体、赋形剂或稀释剂还可以包括多元醇、glucids或pH缓冲剂。例如载体、赋形剂或稀释剂还可以包括氨基酸、肽、抗氧化剂、杀菌剂、抑菌化合物。将水溶液加入油和表面活性剂中来获得100％体积的根据本发明的乳液。

乳液的亲水-亲脂平衡(HLB)可允许估计表面活性剂的亲水或亲脂力。两性分子的HLB通常如下计算：

HLB可以具有0(最亲脂分子)至20(最亲水分子)的值。根据表面活性剂的化学组成(特别地例如乙氧基或烯氧化物的加入)，这种估算可改变且HLB值的范围可提高(例如，Lutrol F68^具有29的HLB)。对于表面活性剂的混合物，混合物的HLB是每种表面活性剂HLB的相加，通过其重量比来平衡：

根据本发明制得的乳液的一实施方案中，乳液的最终HLB为约9至约12，优选约9.5至约11.5，更优选约10至约11.5。

本发明设想一种乳液，包括石蜡油(特别地浓度为约10％至约40％，优选约20％至约40％，以乳液的体积体积比表示(v/v))；失水山梨醇脂肪酸单酯(作为非离子亲脂性表面活性剂)、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯(作为具有低HLB值的非离子亲水性表面活性剂)；和乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯(作为具有高HLB值的非离子亲水性表面活性剂)。特别地失水山梨醇脂肪酸单酯是失水山梨醇单油酸酯(特别地浓度为0.2％至1.5％，优选0.2％至1.2％，以乳液的重量体积比表示(w/v))，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯是乙氧基化失水山梨醇三油酸酯(特别地浓度为2％至5％，优选2.5％至4％w/v)，和乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯是乙氧基化失水山梨醇单油酸酯(特别地浓度为0.3％至1.3％，优选0.4％至1.2％w/v)。例如，乳液包括约29.3％乳液体积体积比的石蜡油，0.6％乳液重量体积比的失水山梨醇单油酸酯，3.4％乳液重量体积比的乙氧基化失水山梨醇三油酸酯，和0.75％乳液重量体积比的乙氧基化失水山梨醇单油酸酯。

根据本发明的第二个实施方案中，乳液包括石蜡油(特别地浓度为约10％至约40％，优选20％至40％(v/v))，失水山梨醇脂肪酸单酯(作为非离子亲脂性表面活性剂)，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯(作为具有低HLB值的非离子亲水性表面活性剂)，和非离子嵌段共聚物(作为具有高HLB值的非离子亲水性表面活性剂)。特别地失水山梨醇脂肪酸单酯是失水山梨醇单油酸酯(特别地浓度为0.2％至1.5％，优选0.2％至1.2％w/v)，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯是乙氧基化失水山梨醇三油酸酯(特别地浓度为2％至5％，优选2.5％至4％w/v)和非离子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(POE-POP)(特别地浓度为0.1％至0.5％，优选0.2％至0.4％w/v)。例如，乳液包括约29.3％v/v的石蜡油，0.6％w/v的失水山梨醇单油酸酯，3.4％w/v的乙氧基化失水山梨醇三油酸酯，和0.25％w/v的乙氧基化失水山梨醇单油酸酯。

一特定实施方案中，本发明设想可注射的水包油型(O/W)乳液，包括：

(1)含有活性成分如药物或免疫原优选免疫原的水溶液；

(2)矿物油

(3)非离子亲脂型表面活性剂；和

(4)具有低HLB值的非离子亲水型表面活性剂，其包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯(其可具有11至13的HLB值)。

根据该实施方案的乳液包括含有多至20个乙氧基的乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯。脂肪酸可以来自动物或植物来源且可以选自油酸、棕榈酸、硬脂酸、异硬脂酸、月桂酸及其组合。一实施方案中，乙氧基化脂肪酸优选为油酸。其他成分以及乳液的一般特性如PIT，可以具有与上述那些相同的特征。

优选，表面活性剂(4)包括乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯，如乙氧基化失水山梨醇二油酸酯、乙氧基化失水山梨醇二硬脂酸酯或乙氧基化失水山梨醇二异硬脂酸酯、乙氧基失水山梨醇二棕榈酸酯、乙氧基失水山梨醇二月桂酸酯，及其组合。

可以任选将其他化合物作为共佐剂加入乳液中，包括但不限于，明矾；CpG寡核苷酸(ODN)，尤其是ODN 2006，2007，2059或2135( Pontarollo R.A.等，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84：43-59；Wernette C.M.等，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84：223-236；Mutwiri.G.等，Vet.Immunol.Immunopath，2003，91：89-103)；多A-多聚U(“Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach”，Michael F.Powell和Mark J.Newman编辑，PharmaceuticalBiotechnology，6：03)；溴化二甲基二(十八烷基)铵(DDA)(“VaccineDesign The Subunit and Adjuvant Approach”，Michael F.Powell和Mark J.Newman编辑，Pharmaceutical Biotechnology，6：157)，N，N-二(十八烷基)-N’，N’-双(2-羟乙基)丙二胺(如Avridine^)(Ibid，p.148)，卡波姆，壳聚糖(例如参见US专利系列No.5,980,912)。

本发明还提供了制备疫苗组合物或免疫组合物的方法，该疫苗组合物或免疫组合物包括至少一种抗原或免疫原和根据本发明制得的佐剂或乳液。可以在乳液形成过程中掺入免疫原，或者在可替换的实施方案中，可在之后向乳液中加入免疫原，例如，就在使用前。

所用水溶液的全部量可以存在于最初制得的乳液中。或只有该水溶液的一部分用于形成乳液，在掺入免疫原后将剩余量的水溶液加入。免疫原或抗原可以是冻干形式或以一些其他合适固体形式存在，然后与乳液混合，或者，抗原可以在溶液中，尤其是水溶液，并将该溶液与乳液混合。

根据溶解性优选将表面活性剂加入油或水溶液中。例如，根据本发明将非离子亲脂性表面活性剂加入油中，而将具有高HLB值的非离子亲水性表面活性剂加入水溶液中。

可根据本领域技术人员已知的常规方法来进行乳化。例如，本发明一实施方案中，在低于乳液PIT的温度尤其是室温例如约25℃来制得乳液。通过机械搅拌将水相和油相混合在一起，例如，使用装备有转子-定子的能够形成高剪切力的涡轮机。优选搅拌开始时转速较低并通常随着油中水溶液的逐渐加入而缓慢提高转速。优选将水溶液逐渐加入油中。调整油/水溶液比例来获得油包水型(W/O)乳液，例如，浓度为约40％至约55％的油(v/v)。当停止搅拌时，乳液逐渐变为O/W乳液(相变)。相变后并如果需要，通过加入水溶液将乳液稀释来获得所需浓度的油进入最终乳液中。可以将乳液存储于约5℃。

另一实施方案中，可以在高于乳液PIT的温度制得乳液。第一步中，在高于乳液PIT的温度将水相和油相混合在一起。优选将水溶液逐渐加入油中。调整油/水溶液的比例来获得油包水型(W/O)乳液，例如，浓度为约40％至约55％的油(v/v)。通过低或无剪切力的搅拌来进行乳化，例如使用静态混合机或船用螺旋或非常低转速的涡轮机。获得的乳液是油包水型(W/O)乳液。第二步中，将乳液逐渐冷却至低于PIT。在该步骤的过程中，乳液变成O/W乳液(相变)。相变后并如果需要，通过加入水溶液将乳液稀释来获得所需浓度的油进入最终乳液中。可以将乳液存储于约5℃。

乳液中液滴的大小可以为约100nm至约500nm。例如，可以将乳液用作配制疫苗组合物或药物组合物的佐剂。乳液还可以用作溶剂来溶解干产品，尤其是冻干产品，例如含有减毒微生物或活重组载体的产品。

特定实施方案中，只用一部分水溶液制得预制-乳液。通过加入活性成分如药物或免疫原优选免疫原的悬液来稀释这预制-乳液，来获得最终的组合物。或者，预制-乳液用水溶液稀释并用于溶解干产品如冻干产品。

适用于本发明中的免疫原或抗原可以选自灭活病原体、减毒病原体、免疫原性亚单位(例如，蛋白质、多肽、肽、表位、半抗原)，或重组表达载体，包括具有免疫原性插入片段的质粒。本发明一实施方案中，免疫原是灭活或死微生物。本发明的另一实施方案中，疫苗组合物包括选自鸟病原体的免疫原，包括但不限于，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、产蛋综合征(egg drop Syndrome)病毒(EDS)或传染性粘液囊疾病病毒(IBDV)、鸟流感病毒等等，及其组合。

或者，疫苗组合物包括选自猫科动物病原体的免疫原，如但不限于，猫疱疹病毒(FHV)、猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒等等，及其组合。

再一实施方案中，本发明的疫苗组合物包括选自犬病原体的免疫原，包括但不限于，狂犬病病毒、犬疱疹病毒(CHV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、出血黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorragiae)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)等等，及其组合。

本发明再一实施方案中，组合物包括选自马病原体的免疫原，如马疱疹病毒(1型或4型)、马流感病毒、破伤风、西尼罗河病毒等等或其组合。

本发明再一实施方案中，组合物包括选自牛病原体的免疫原，如狂犬病病毒、牛轮状病毒、牛副流感病毒3型(bPIV-3)、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、感染性牛鼻气管炎病毒(IBR)、大肠杆菌(Escherichia coli)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)等等及其组合。

本发明再一实施方案中，组合物包括选自猪病原体的免疫原，如但不限于，猪流感病毒(SIV)、猪环状病毒2型(PCV-2)、猪再生性呼吸综合征病毒(PRRS)、假性狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、FMDV、猪肺炎枝原体、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、大肠杆菌(Escherichia coli)等等及其组合。

本发明的优选实施方案提供了疫苗组合物，包括药物学上可接受载体中的至少一种免疫原和乳液。包括病毒、细菌、真菌等等的免疫原，可以通过使用合适培养基或宿主细胞系的体外培养方法和本领域技术人员公知的常规方法制得。例如，可以在合适的细胞系如MA-104细胞系中培养PRRS(特别参见US专利系列No.5,587,164；5,866,401；5,840,563；6,251,404)。同样，可以使用PK-15细胞系来培养PCV-2(参见US专利系列No.6,391,314)；可以在蛋上培养SIV(US专利系列No.6,048,537)；和可以在合适的培养基中培养猪肺炎枝原体(US系列No.5,968,525；US 5,338,543； Rose R.F.等，Am.J.Vet.Res.，1984，45：1899-1905)。

为了获得灭活的免疫组合物或疫苗组合物，优选将病原体在收集后灭活且任选地接受澄清净化，通过化学处理使用例如福尔马林或甲醛、β-丙内酯、乙撑亚胺、二元乙撑亚胺(BEI)、硫柳汞等等，和/或物理处理(例如热处理或声处理)。灭活的方法是本领域技术人员公知的。例如，通过β-丙内酯( Plana-Duran等，Vet.Microbiol.，1997，55：361-370)或通过BEI处理(US专利系列No.5,587,164)将PRRS病毒灭活；使用乙撑亚胺处理或通过β-丙内酯处理来实现PCV-2病毒的灭活(US专利系列No.6,391,314)；可以使用去污剂如Triton，或用甲醛处理(US专利系列No.6,048,573)来灭活猪流感病毒；可以通过甲醛处理( Ross R.F.上文)，通过乙撑亚胺或BEI处理(参见WO91/18627)，或通过硫柳汞处理(US专利系列No.5,968,525和5,338,543)灭活猪肺炎枝原体细菌。

通过常规浓缩技术尤其是通过超滤将灭活的病原体浓缩，和/或通过常规纯化方法来纯化，尤其是使用柱色谱技术，包括但不限于，凝胶过滤、蔗糖梯度超离心或选择性沉淀，尤其是在聚乙二醇(PEG)存在下。

用于根据本发明的疫苗组合物中的免疫原还包括表达载体。这样的载体包括但不限于体内重组表达载体如多核苷酸载体或质粒(EP-A2-1001025； Chaudhuri P，Res.Vet.Sci，2001，70：255-6)，病毒载体如但不限于腺病毒载体、痘病毒载体如禽痘(US专利系列No.5,174,993；5,505,941；和5,766,599)或金丝雀痘载体(US专利系列No.5,756,103)或细菌载体(大肠杆菌或沙门氏菌)。

本发明还包括多价免疫组合物或组合疫苗组合物的制剂。例如，用于根据本发明制得的组合牛菌苗中的抗原包括但不限于，牛枝原体，巴斯德氏菌，尤其是多杀巴斯德氏菌和溶血巴斯德氏菌，嗜血菌，尤其是睡眠嗜血菌，梭菌，沙门氏菌，棒杆菌，链球菌，葡萄球菌，莫拉氏菌，大肠杆菌等等。

本发明进一步提供了诱导宿主例如动物的免疫应答的方法，包括将根据本发明的免疫组合物或疫苗组合物给药于宿主。以该方式引发的免疫应答特别地是抗体和/或细胞免疫应答，且尤其是γ-干扰素应答。

特别地，本发明提供了免疫对抗、或防止或减轻动物感染致病生物体(例如，病毒、细菌、真菌或原生动物寄生虫感染)引起的症状的方法。本发明的方法可用于脊椎动物中，包括但不限于人、犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)；马科动物(例如，马)、牛族动物(例如，牛)和猪类动物(例如，猪)，以及鸟类包括但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉、鹦鹉、小雀类、鹰、乌鸦和平胸鸟(鸵鸟、鸸鹋、食火鸡，等等)。

本发明的特定方面中，这些方法包括在分娩之前给怀孕的雌性接种疫苗，通过给药根据本发明制得的疫苗组合物。这些方法进一步包括通过接种方案引发的保护性抗体的诱导，并将这些保护性抗体从接种疫苗的怀孕雌性转移至它们的后代。这样母体抗体的转移随后防止了后代患上疾病。

根据本发明制得的疫苗组合物的剂量将取决于待接种疫苗动物的物种、饲养、年龄、大小、接种史和健康状况。其他因素如抗原浓度、其他的疫苗成分和给药途径(即，皮下、皮内、口服、肌内或静脉内给药)也将影响有效剂量。基于疫苗的抗原浓度、给药途径和待接种疫苗动物的年龄和状况，给药的疫苗剂量是容易确定的。可以将每批抗原单独标准化。或者，可以使用不同剂量的方法免疫原性测试以及LD₅₀研究和其他筛选方法来确定根据本发明的疫苗组合物的有效剂量，而不需要过度实验。从以下所示的实施例，使用在此所述疫苗组合物的合适的大致剂量和大致体积是显而易见的。关键因素是剂量提供对抗天然感染的至少部分保护性效果，如通过死亡率降低和与天然感染相关发病率的降低来证明。本领域技术人员同样容易确定合适的体积。例如，鸟物种的剂量体积为约0.1ml至约0.5ml，优选，约0.3ml至约0.5ml。对于犬、猫和马物种，剂量体积为约0.2ml至约3.0ml，优选，约0.3ml至约2.0ml，更优选，约0.5ml至约1.0ml。对于牛和猪物种，剂量体积为约0.2ml至约5.0ml，优选约0.3ml至约3.0ml，更优选0.5ml至约2.0ml。

优选在定期的时间间隔重复疫苗接种来提高原始的免疫应答或从最后一剂已经过去很长时间时。本发明一实施方案中，将疫苗组合物作为非肠道注射(即，皮下、皮内或肌内)给药。可以以一个剂量给药组合物，或在可替换的实施方案中，以约两周至约六周优选约两周至约五周的给定间隔重复给药约两剂至约五剂。然而，本领域技术人员将认识到剂量的数目和接种疫苗之间的时间间隔取决于多种因素，包括但不限于，接种动物的年龄；动物的状况；免疫的途径；每剂可获得的抗原量；等等。对于初次接种疫苗，时间段通常长于一周并优选约两周至约五周。对于之前接种过的动物，在怀孕之前或之中，加强接种约每年进行。

本发明还设想使用无针注射器如Pigjet^、Avijet^、Dermojet^或Biojector^(Biojiect，Oregon，USA)来给药疫苗组合物。本领域技术人员能相对于因素根据需要来调整注射器的规格，如待接种疫苗的动物物种；动物的年龄和体重；等等，而不需要过度实验。

本发明一实施方案中，该方法包括与根据本发明的乳液一起配制的疫苗组合物的单次给药。例如，一实施方案中，疫苗组合物是灭活的猪肺炎枝原体疫苗，而可替换的实施方案提供了含有灭活PCV2病毒组合物的疫苗。适用于单剂给药方案的其他免疫组合物或疫苗包括但不限于灭活PRRS和SIV。特别地，对于猪肺炎枝原体疫苗组合物，可以在猪出生和屠宰之间，尤其在约3至约56天的年龄，优选约10天至约35天的年龄，更优选约15至约30天的年龄，给药单剂量。还可以在预先存在的抗体存在下给药疫苗。

本发明进一步涉及治疗宿主例如动物的方法，包括将根据本发明制得的并包括至少一种免疫原的药物组合物给药于宿主，免疫原选自蛋白质或肽、抗体、过敏原、CpG ODN、生长因子、细胞因子或抗体，尤其是CpG ODN或细胞因子。这些药物组合物可以用于提高动物如鸡、猪或牛的生长特性。

本发明进一步涉及一种试剂盒，包括含有成分如免疫原或药物组合物的第一个小瓶，和含有根据本发明制得的乳液的第二个小瓶。免疫原可以是冻干形式、干型或在水溶液中，如在此所述的。

现在将通过以下非限制性实施例来进一步描述本发明。

               实施例1：乳液制造方法

如下所述的在两步中制得乳液：

第一步：使用高剪切转子-定子Silverson乳化器(具有10mm直径粉碎头的L4RT型)来生产制剂。为了生产乳液，将一体积油相和一体积水相#1在25℃乳化。在搅拌下将水相加入油相中，5000rpm(每分钟的转数)1分钟。随着体积的增加逐渐将转速在1分钟内提高至8300rpm。在该步骤的过程中，乳液是油包水型乳液。对于TS6乳液，相的组成如下：

油相(120ml)：

-失水山梨醇单油酸酯(Span 80)             ：1.8％w/v

-失水山梨醇三油酸酯(20OE)(吐温85)        ：10.2％w/v

-石蜡油(Marcol 82)                       ：88％v/v

水相#1(120ml)：

-20％(w/v)失水山梨醇单油酸酯的溶液(20OE)(吐温80)：11.25％w/v

-磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)               ：85.75％v/v

-水中1％的邻乙汞硫基苯酸钠(柳硫汞)              ：1.5％v/v

将失水山梨醇单油酸酯(Span 80)和失水山梨醇三油酸酯(20OE)(吐温85)引入油相中。失水山梨醇单油酸酯(20OE)(吐温80)在石蜡油中不混溶。在与疫苗相同的缓冲液例如磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)中制得吐温80的20％(w/v)溶液。邻乙汞硫基苯酸钠作为防腐剂且对于乳液不是必要的。

当停止搅拌时，乳液变成水包油型乳液。将乳液放入5℃的冷室中至少4小时。在这阶段，乳液是含有50％油相的预制-乳液。

第二步：用120ml磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)和免疫原(灭活猪肺炎枝原体免疫原，或PCV-2免疫原，如以下所述的)制得水相#2。将第一步中制得的预制-乳液冷却至约5℃，通过加入相同温度的一半体积的水相#2来稀释，并通过磁棒搅拌来混合1分钟。TS6乳液中最终的表面活性剂浓度为4.75％(w/v)。

如在此所制得的，TS6疫苗在5℃可稳定至少一年。

使用相同的制备方法，可以获得如下的其他乳液：

TS7乳液

TS7乳液是含有33％油相的O/W乳液。油相(120ml)含有88％v/v的Marcol 82、1.8％w/v的Span 80和10.2％w/v的吐温85。水相#1(120ml)含有97.75％v/v的磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)、1.5％v/v的水中1％的柳硫汞和0.75％w/v的Lutrol F127。水相#2(120ml)由磷酸盐二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)构成，任选地含有免疫原。TS7乳液中最终的表面活性剂浓度为4.25％w/v。

TS8乳液

TS8乳液是含有50％油相的O/W乳液。油相(160ml)含有92％v/v的Marcol 82、1.8％w/v的Span 85和6.2％w/v的Brij 96。水相#1(160ml)含有98.5％v/v的磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)、1.0％v/v的水中1％的柳硫汞和0.5％w/v的Lutrol F127，任选地含有免疫原。TS8乳液中最终的表面活性剂浓度为4.25％w/v。

TS9乳液

TS9乳液是含有10％油相的O/W乳液。油相(120ml)含有60％v/v的Marcol 82、17.2％w/v的Span 40和22.8％w/v的Arlatone 650。水相#1(120ml)含有97.5％v/v的磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)和2.5％v/v的吐温20。水相#2(120ml)由400ml磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液pH7.8制得，任选地含有免疫原。用400ml水相#2稀释100ml预制-乳液来获得TS9乳液。TS9乳液中最终的表面活性剂浓度为4.25％w/v。

        实施例2：乳液相转变温度(PIT)的测定

将10ml的TS6乳液放入约25℃水浴的玻璃管中。TS6乳液是白色均质的乳液。逐渐提高水浴温度。视觉上观察到乳液的改变(由于黄-棕色油相移至表面，乳液变成两个分离的相)。该改变是乳液破坏所特征性的。观察到该改变的温度是乳液的PIT值。对于TS6乳液，PIT是40-45℃，而对于TS7乳液，PIT是44-49℃。

     实施例3：猪肺炎枝原体疫苗组合物和异种攻击

材料与方法：配制含有如实施例1中所述制得的TS6乳液和浓度为每ml疫苗8.7log10CCU(颜色改变单位)的灭活猪肺炎枝原体BQ14菌株( Kobisch M.等，Ann.Inst.Pasteur Immunol.，1987，138：693-705)的疫苗组合物。二十二(22)只小猪，三周大并具有母体抗体(出生自对猪肺炎枝原体血清反应阳性的母猪)，随机分成两组。一组十(10)只小猪在0天通过肌内注射2ml疫苗组合物来接种，而对照组十二(12)只小猪没有接种疫苗。

在实验过程中选定的时间间隔(第0、27、42和56天)，从两组小猪中取鼻拭子并通过ELISA测定抗-BQ14分泌抗体。第27天，对小猪抽血并将获得的外周血单核细胞(PBMN)来测定外周血中的IFNγ水平。第28天，用含有约6.6log10CCU/ml的猪肺炎枝原体Mp88c菌株(从丹麦病猪中分离的菌株并如 Kobisch和Friis在Rev.Sci.Tech.Off.Int.Epiz.，1996，15：1569-1605中所述的来培养)的溶液鼻内攻击所有小猪，每个鼻孔约用5mL。24小时后重复攻击。处死小猪并在尸检时收集肺。通过估计七个肺叶中每个的损害表面积(以整个肺叶表面的百分比来表示)来确定肺分值。如下指定分值：

每个肺叶的肺损害表面	分值
		0％	0
1-25％	1
		26-50％	2
51-75％	3
		＞75％	4

通过将每个肺各叶获得的分值相加来计算总的分值，每只动物最大的分值为28。

结果：接种TS6疫苗制剂的猪呈现强烈的细胞应答，且显著高于对照组，如通过5×10⁵P外周血单核细胞(PBMN)分泌IFNγ的点数所证明。接种组的猪平均为139个点(标准偏差25)，与未接种对照组的11点相比较(标准偏差5)。

组	5×105PBMNC的点数
		TS6疫苗组合物	139(25)
未处理的对照	11(5)

接种者和对照的抗BQ14分泌抗体的含量总结于下表中，结果显示了与未处理的对照相比较，接种的猪在攻击后两至三周具有显著更高水平的分泌抗体：

组	抗BQ14分泌抗体(光密度(OD)值)
					D0(接种前)	D27(攻击测试前)	D42(攻击测试后14天)	D56(攻击测试后28天)
	TS6	0.026±0.001	0.033±0.002	0.201±0.089					0.264±0.043
对照					0.030±0.001	0.031±0.001	0.107±0.028	0.075±0.011

现在参照图1，与具有7.8±4.1平均肺分值的未处理对照相比较，接种TS6疫苗组合物的动物呈现2.1±1.9(平均值±标准偏差)的平均肺分值。这些结果显示与未接种的对照相比较，对于接种疫苗组合物的猪，肺损害显著降低。

实施例4：对抗猪肺炎枝原体异种攻击的保护持续时间

材料和方法：三十八(38)只小猪，三周大并具有母体抗体(出生自对猪肺炎枝原体血清反应阳性的母猪)，随机分成如下三组：

1组(12只小猪)在第0天通过肌内途径接种如实施例3中所述的2ml疫苗组合物。

2组(12只小猪)在第0天肌内注射接种2ml商业猪肺炎枝原体灭活疫苗。

3组(14只小猪)作为未接种的对照。

所有小猪在接种后20周如上所述用约5ml/每鼻孔猪肺炎枝原体Mp88c攻击菌株(6.6log10CCU/ml)鼻内攻击。24小时后重复攻击。如上所述从所有组中采血并将所获得的外周血单核细胞(PBMN)来测定IFNγ含量。在第138天测定每组的抗BQ14 IgA和IgG1血清抗体。尸检后，如以上实施例3中所述的计算肺分值(平均值±标准偏差)。

结果：现在参照图2，接种TS6疫苗组合物的1组小猪证明平均肺分值为0.4±0.9，统计学上显著低于接种商业疫苗的小猪(4.0±5.1)或未接种疫苗对照(6.1±5.8)的肺分值。

在第138天从每组收集的血清中抗-BQ14 IgA和IgG1循环抗体的平均结果(±标准偏差)总结如下：

组	抗-BQ14 IgG(滴度)	抗-BQ14 IgA
			TS6疫苗	4.38±0.14	0.56±0.06
商业疫苗	3.09±0.11	0.09±0.01
			对照	2.73±0.08	0.09±0.01

下表总结了外周血中5×10⁵外周血单核细胞(PBMN)分泌干扰素(IFNγ)点数的平均结果(±标准偏差)：

组	D28	D138	D152
				TS6疫苗	81±20	9±2	28±7
商业疫苗	5±2	3±1	6±1
				对照	6±3	2±2	11±8*

*如果排除表达异常高点数(109)的小猪，对照组平均值为4±1。

如使用灭活疫苗时所预期的，在接种疫苗后第138天可检测到的抗BQ14 IFNγ分泌T-细胞的频率比第28天的低得多。有趣的是，大多数接种TS6的小猪在第138天仍然是阳性的，表明该组中保持了细胞应答。在第152天循环的抗BQ14 IFNγ分泌T-细胞的频率在三个组中非常不同。与其他组相反，接种TS6的组产生非常高的细胞应答。该结果表明攻击有效地召回(recall)TS6疫苗诱导的免疫记忆。

实施例5：给药一剂TS6乳液作佐剂的PCV-2疫苗后的血清学结果

材料和方法：十只无特殊病原体(SPF)小猪，2-3个月大，随机分成两组。一组5只小猪通过肌内途径接种(在第0天)2ml含有6.8log10CCID₅₀每剂的灭活PCV-2(imp1010菌株)的疫苗(接种组)。对照组5只小猪没有接种疫苗。在接种后D0、D7、D14、D21和D28采血样，通过ELISA滴定PCV-2 ORF2抗体。

结果：如下表中所证明的，所有接种者从接种疫苗后7至40天显示了显著的抗PCV2 ORF2抗体应答：

组	ELISA(log10)	D0	D7	D14	D21	D28
							接种的	平均值标准偏差	1.000.00	2.530.89	3.500.79	3.450.84	3.880.37
对照	平均值标准偏差	1.000.00	1.000.00	1.000.00	1.000.00	1.271.24

实施例6：由TS6乳液作佐剂的PCV-2疫苗所引发的对抗攻击的保护

材料和方法：十六(16)只SPF小猪，4-5天大，如下随机分成2组：一组8只小猪在第0天和第21天通过肌内注射2ml含有7.55log10CCID₅₀每剂的灭活PCV-2(imp1010菌株)的疫苗来接种两次(接种组)，而对照组8只小猪没有接种。所有小猪在第35天用约5mL的含有约5.5log10CCID₅₀/ml PCV-2 Imp1011-48285菌株(保藏于ECACC，保藏号为V98011608)应用至每个鼻孔来鼻内攻击。进行ELISA和血清中和(SN)研究并如下确定每只小猪的临床分值：

分值	0	1	2
				衰竭	无	中度	高度
呼吸困难	无	中度	高度
				贫血(小猪肤色)	粉色	白色	黄色
咳嗽	无	有
				厌食	无	有
呕吐	无	有
				直肠温度	t＜40℃	39.9℃＜t＜41℃	t＞40.9℃
在n周内的体重增加优于n-1周内的体重增加	是	否，但＞100g/天	否，且＜101g/天
				死亡	否	是*

*在死亡的情况中，所用的分值对应于死亡前一天的值。

尸检后，如下计算损害分值：

分值	0	1	2	3
					肥胖	正常	瘦	非常瘦	佝偻病
胴体特征	正常	白色	黄色
					粘膜	正常	白色	黄色
皮下结缔组织	正常	透明	黄色
					浅表淋巴神经节	正常	1fat和/或白色和/或充血	＞1fat和/或白色和/或充血	＞1非常fat和/或白色和/或充血
胸排出物	无	透明胸腔	明显存在
					心脏	无损害	损害
肺	无损害	损害
					胸膜	无损害	小损害	大损害
纵隔淋巴神经节	正常	1fat和/或白色和/或充血	＞1fat和/或白色和/或充血	＞1非常fat和/或白色和/或充血
					腹腔	正常	透明	明显腹水
腹膜	无损害	损害
					胃	无损害	损害	溃疡
小肠	无损害	损害
					肠	无损害	损害
肠系膜淋巴神经节	正常	1fat和/或白色和/或充血	＞1fat和/或白色和/或充血	＞1非常fat和/或白色和/或充血
					集合淋巴结	不明显	只在一个肠节段明显	数个肠节段明显	数个肠节段明显且非常重要
肝	无损害	损害
					肾	无损害	损害
膀胱	无损害	损害

结果：在第30天和63天通过ELISA和血清中和抗体滴度进行的血清学结果显示接种疫苗小猪的含量比未处理对照中观察到的高。下表总结了由粪便化验样本和神经节组织的PCV-2病毒分离结果以及显示了接种者和对照组的平均临床和损害分值。结果表明与对照相比较，接种者中循环抗体和SN滴度这两者的水平都较高。接种小猪的临床分值和肺损害也显著降低。攻击后临床分值的演变显示于图3中。

组	接种者	对照
			D30的血清学ELISA(log10)	4.1+/-0.70	2.8+/-0.50
D63的血清学ELISA(log10)	5.2+/-0.28	3.4+/-0.67
			D30的血清学SN(log10)	3.4+/-0.25	1.6+/-0.23
D63的血清学SN(log10)	3.7+/-0.31	2.2+/-0.53
			粪便中的PCV-2(％阳性)	40	61
纵隔神经节中的PCV-2(％阳性)	25	100
			临床分值	14	31
损害分值	9.8	18.8

实施例7：接种一剂TS6作佐剂的灭活PCV-2疫苗后的现场效力结果

疫苗组合物：如实施例1中所述的制得TS6佐剂。将PCV-2病毒生长于PK/15细胞上并如US专利系列No.6,517,843中所述的进行病毒繁殖( Ellis等；其内容在此以其整体引入作为参考)。简要地，在病毒培养的最后，收集感染的细胞，裂解，并用常规方法将病毒收集物灭活。例如，可以使用0.1％乙撑亚胺在+37℃ 18小时；用0.5％β-丙内酯+28℃ 24小时；或用0.2％和0.1％β-丙内酯+4℃ 24小时来实现灭活。如果在灭活前病毒滴度不足，使用150-300kDa截留膜通过超滤来浓缩病毒悬液。在配制疫苗前将灭活病毒悬液保存于+5℃。疫苗的抗原含量设定在2.1log10抗原单位每剂。基于该含量，通过ELISA方法通过定量终产品中的活性成分测定的疫苗活性任意地设定在100ELISA单位每剂的最小值。

接种方案：为了测试疫苗组合物在现场条件下的效力，选择通常呈现小猪中由PCV-2感染引起的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)地方病爆发的农场。将母猪分成两组，接种者在产小猪前两至三周接受一剂肌内注射(2ml剂量)TS6作佐剂的PCV-2灭活疫苗。第二组没有接种并作为对照。使母猪产下小猪，并监测接种母猪(n＝889)和对照母猪(n＝713)产下的小猪至屠宰年龄的死亡率。

结果：图4显示了直至屠宰时小猪中PMWS病例百分比的图表。如从图表中可看到的，与未接种对照产出的小猪中的病例数相比较，接种母猪产出的小猪中PMWS病例数目减少75％。这些结果表明与PCV-2感染相关的临床疾病显著降低并证明在产小猪之前不久母猪接种TS6作佐剂的灭活PCV2疫苗来防止小猪中与PCV2感染相关的死亡率和发病率的可行性。这些结果进一步证明只使用一剂根据本发明的疫苗组合物就可以获得实际的现场条件下小猪中PMWS的显著降低。

                  实施例8：LF2乳液

使用以上实施例1中的方法，制得含有10％油相乳液并称为LF2的水包油型(O/W)乳液。油相(100ml)含有88％v/v的Marcol 82，1.8％w/v的Span 80和10.2％w/v的吐温85。水相#1(100ml)含有88.5％v/v的磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)和11.55％w/v的20％(w/v)的吐温80溶液。水相#2(400ml)由磷酸二钠一钾0.02M等渗缓冲液(pH7.8)构成，任选地含有免疫原，用400ml水相#2稀释100ml预制-乳液来获得LF2乳液。LF2乳液中最终的表面活性剂浓度为1.43％w/v。LF2乳液的PIT＞45℃，通过电导率测定。

实施例9：施用LF2乳液作佐剂的猪流感疫苗后的血清学分析

材料和方法：十五(15)只小猪，约10周大，随机分成3组。第一组(接种)5只小猪(第0天和第28天)通过肌内注射2ml 7.7log10CCID₅₀每剂的重组猪流感疫苗来接种两次(在第0天和第28天)。该重组表达载体疫苗含有编码和表达H1N1猪流感病毒的核蛋白(NP)和血球凝集素(HA)的金丝雀痘载体。第二组5只小猪接种两次(在第0天和第28天肌内注射)用LF2乳液作佐剂的2ml重组猪流感疫苗(7.7log10CCID₅₀每剂)(LF2接种组)。留下五只小猪没有接种(对照组)。在接种后D0、D14、D28、D42和D56采血样，用于测定血球凝集抑制(HI)滴度。

结果：如下表所总结的，与未处理对照相比较，所有接种者显示了从接种疫苗后42至56天显著的抗猪流感抗体应答(ANOVA，p＜0.0001)。然而，与接受无佐剂重组疫苗的小猪相比较，接种LF2作佐剂的疫苗的小猪显示在接种后42至56天抗体应答显著提高(ANOVA，p＜0.0001)。

组	HI(log10)	D0	D14	D28	D42	D56
							接种	平均值标准偏差	0.90.00	0.90.00	0.90.00	1.20.37	1.20.21
LF2接种	平均值标准偏差	0.90.00	0.90.00	0.90.00	2.040.33	1.920.16
							对照	平均值标准偏差	0.90.00	0.90.00	0.90.00	0.90.00	0.90.00

如这些结果所证明的，与无佐剂的疫苗相比较，LF2乳液的佐剂效应使得疫苗诱导了更高的对抗猪流感病毒的抗体应答。

实施例10：LF2乳液作佐剂的Mannheimia haemolytica疫苗诱导

                      的保护

材料和方法：二十(20)只小牛，五个月大，阴性或具有低的Mannheimia haemolytica白细胞毒素抗体滴度，随机分成两组，每组10只小牛。如以上实施例8中所述的制得LF2乳液并配制含有约60至70ELISA单位(对应于约0.34mL至1.1mL的粗制未浓缩细菌培养物)每剂疫苗的灭活Mannheimia haemolytica(A1菌株)的疫苗并用LF2乳液作佐剂。一组10只小牛在第0天通过皮下注射接种2ml LF2疫苗组合物，而对照组10只小牛没有接种。从接种日(D0)至攻击日(D20)，定期检测所有接种小牛对接种的全身反应和局部反应。临床检查包括全身反应(如淡漠、厌食、呼吸急促、流涎、发抖)的评估、记录直肠温度和注射部位局部反应的测定。没有小牛对接种呈现任何全身反应。总结于下表中的直肠温度(℃，平均值+/-标准偏差)显示了接种组中观察到短暂和轻微的体温过高期，接种后24小时内达到峰值。

	D0	D0+4h	D1	D2	D3	D7	D14	D20
									接种的	39.3+/-0.3	39.6+/-0.4	39.5+/-0.3	39.2+/-0.3	39.0+/-0.2	39.0+/-0.2	39.1+/-0.3	38.7+/-0.3
对照	39.3+/-0.2	39.3+/-0.2	39.1+/-0.2	39.1+/-0.2	38.9+/-0.2	39.0+/-0.2	38.9+/-0.1	38.7+/-0.3

接种小牛中的局部反应(以cm²表面积测量，平均值+/-标准偏差)显示了所有接种动物在接种后约24至48小时出现了强烈的局部反应，然后到D14快速减小至约3cm²的大小。到D20这些反应几乎消失。反应总结如下：

	D0	D0+4h	D1	D2	D3	D7	D14	D20
									接种的	0.9+/-0.4	9.2+/-12.4	71.3+/-25.8	72.5+/-29.3	56.9+/-18.0	15.9+/-8.0	2.6+/-2.6	2.0+/-1.2

在不同的时间间隔(D0、D7、D14、D20和D28)从所有动物获得血样并通过ELISA(以log10OD₅₀表示的滴度)测定对抗Mannheimiahaemolytica A1白细胞毒素的抗体水平。结果显示所有小牛在接种之前是阴性的。到D20，单次接种后，十只接种者中的八只发生了血清转化，而所有对照小牛从D0至D20保持阴性。ELISA结果总结如下：

组	ELISA(log10)	D0	D7	D14	D21	D28
							接种的	平均值	＜0.78	1.11	1.70	1.86	4.00
	标准偏差	0.00	0.65	0.90	0.84	0.26
							对照	平均值	＜0.78	＜0.78	＜0.78	＜0.78	1.39
	标准偏差	0.00	0.00	0.00	0.00	1.00

攻击实验方案：在第20天通过气管内给药30ml含有约9.2log10CFU/ml(每ml的菌落形成单位)Mannheimia haemolytica A1菌株的攻击剂来攻击所有小牛。24小时后重复攻击。从攻击那天至研究结束，每日检查所有小牛的总体临床征象，包括呼吸窘迫。监测的体征包括一般状况、厌食、直肠温度、流鼻涕、咳嗽、呼吸率和呼吸困难。

根据以下公式计算总体临床分值且部分分值列于下表中：

总体临床分值＝∑(部分分值×系数)/14

	0	1	2	系数
					一般状况	正常	低落	衰竭	×2
食物	正常	减少	厌食	×3
					咳嗽	无	剧烈，偶尔	弱，经常	×1
鼻涕	无	严重	粘液脓性	×2
					呼吸率	＜35/min	30-50/min	＞50/min	×3
直肠温度	＜39.5℃	39.5℃-40.5℃	＞40.5℃	×3

对于死亡的动物，使用最大个体每日临床分值2。

还使用以下公式测定了每只小牛的肺损害分值(以百分比表示)：

肺损害分值＝∑(肺叶上损害的表面积/整个肺叶的表面积×100×LRM)

其中LRM是肺相对质量，值为：

对于右前叶和右中前叶为0.11

对于右中后叶为0.07

对于右后叶为0.35

对于左前叶为0.05

对于左中叶为0.06

对于左后叶为0.32，和

对于右肺尖叶为0.04

攻击的结果：呈现于下表的每组总体临床分值显示与未处理的对照相比较，接种组证明了总体临床分值显著降低，(p＝0.046，ANOVA)。

		D20	D21	D22	D23	D24	D25	D26	D27	累积分值
											接种	平均值	0.0	0.7	0.7	0.6	0.6	0.5	0.5	0.5	4.0
标准偏差	0.1	0.4	0.5	0.6	0.8	0.8	0.8	0.8	4.5
										对照		平均值	0.1	0.9	1.1	1.0	1.1	1.2	1.2	1.3	8.0
标准偏差	0.1	0.5	0.6	0.8	0.9	0.8	0.8	0.7	4.5

所有死于攻击的动物呈现其60％或更多的肺受影响。接种动物比对照组中的那些存在较低肺损害的统计学趋向(p＝0.08)。每组中具有多于三分之一肺受影响的动物数，对于接种者为2/10(20％)，对于对照动物为7/10(70％)。接种组中超过三分之一肺受影响的动物数显著较低(p＝0.03，Fischer’s Exact检验，一尾)。肺损害分值的结果总结于下表：

接种者中个体肺损害百分比	74.8*	对照中个体肺损害百分比	64.5*
				10.6	7.0
	10.1		78.6*
				10.5	63.1*
	66.4*		44.7
				6.2	60.9
	6.9		48.2
				32.9	0.8
	25.4		59.5*
				8.0	32.9
	平均值+/-标准偏差		25.2+/-25.5			平均值+/-标准偏差	46.0+/-25.5

*死于攻击的动物

在总体临床分值和肺损害百分比之间存在高度显著(p＜0.001)和强的相关性(R²＝0.86)。尽管所有接种动物在接种后呈现轻微的高温，但没有观察到对接种的其他全身反应。接种后观察到强烈的局部反应，但是很快就减小至非常可接受的大小并在尸检中未观察到显著损害。这些结果证明LF2乳液作佐剂的疫苗的安全性。

该实验的结果，显示了与对照相比较，接种者的平均临床分值和肺损害分值都显著降低，证明单次注射LF2乳液作佐剂的Mannheimiahaemolytica疫苗保护自然(na

ve)小牛来对抗Mannheimiahaemolytica攻击。

由此已经详述了本发明的优选实施方案，应当理解通过上述段落定义的本发明不受上述说明中所列特定细节的限制，因为其各种明显的改变是可能的，而没有脱离本发明的精神和范围。

Claims (30)

1.疫苗组合物，包含可注射水包油型(O/W)乳液，其包括：

(i)含有至少一种免疫原的水溶液；

(ii)矿物油；

(iii)非离子亲脂性表面活性剂；

(iiii)具有13至40的高亲水亲脂平衡(HLB)值的非离子亲水性表面活性剂；和；

(iv)具有9至13的低亲水亲脂平衡(HLB)值的非离子亲水性表面活性剂。

2.权利要求1的组合物，其中高HLB非离子亲水性表面活性剂以0.1-1.5％的浓度存在，以乳液的重量体积比(w/v)表示。

3.权利要求2的组合物，其中表面活性剂的百分比为约4％至约6％重量/体积。

4，权利要求1的组合物，其中低HLB非离子亲水性表面活性剂以1％至8％的浓度存在，以乳液的重量体积比(w/v)表示。

5.权利要求1的组合物，其中非离子亲脂性表面活性剂以0.1％至2.5％的浓度存在，以乳液的重量体积比(w/v)表示。

6.权利要求1的组合物，其中矿物油以20％至40％(v/v)的浓度存在。

7.权利要求1的组合物，其中乳液具有33-66℃的相转变温度(PIT)。

8.权利要求1的组合物，其中低HLB非离子亲水性表面活性剂选自乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸二酯、乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化蓖麻油及其组合。

9.权利要求8的组合物，其中所述乙氧基化脂肪酸酯的酯选自油酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、异硬脂酸酯、月桂酸酯及其组合。

10.权利要求1的组合物，其中非离子亲脂性表面活性剂选自失水山梨醇脂肪酸酯、二缩甘露醇脂肪酸酯、二乙氧基化二缩甘露醇脂肪酸酯、三乙氧基化二缩甘露醇脂肪酸酯、四乙氧基化二缩甘露醇脂肪酸酯及其组合。

11.权利要求10的组合物，其中脂肪酸酯的酯选自油酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、异硬脂酸酯、月桂酸酯及其组合。

12.权利要求1的组合物，其中高HLB非离子亲水表面活性剂选自乙氧基化失水山梨醇脂肪酸单酯、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化脂肪酸、非离子嵌段共聚物及其组合。

13.权利要求12的组合物，其中乙氧基化失水山梨醇单酯选自乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯、乙氧基化失水山梨醇单棕榈酸酯、乙氧基化失水山梨醇单硬脂酸酯、乙氧基化失水山梨醇单油酸酯及其组合。

14.权利要求1的组合物，其中矿物油选自石蜡油、角鲨烷、姥鲛烷、聚异丁烯油、氢化聚异丁烯油、聚癸烯油、聚异戊二烯油、聚异丙烯油及其组合。

15.权利要求1的组合物，其包括石蜡油、作为非离子亲脂性表面活性剂的失水山梨醇脂肪酸单酯、作为低HLB非离子亲水性表面活性剂的乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯和作为高HLB非离子亲水性表面活性剂的非离子嵌段共聚物。

16.权利要求15的组合物，其中失水山梨醇脂肪酸单酯是失水山梨醇单油酸酯，乙氧基化失水山梨醇脂肪酸三酯是乙氧基化失水山梨醇三油酸酯和非离子嵌段共聚物是聚氧乙烯/聚氧丙烯聚合物(POE-POP)。

17.权利要求16的组合物，其中石蜡油以10％至40％v/v的浓度存在，失水山梨醇单油酸酯以0.2％至1.5％w/v的浓度存在，乙氧基化失水山梨醇三油酸酯以2％至5％w/v的浓度存在和POE-POP以0.1％至0.5％w/v的浓度存在。

18.权利要求16的组合物，其中石蜡油以29.3％v/v的浓度存在，失水山梨醇单油酸酯以0.6％w/v的浓度存在，乙氧基化失水山梨醇三油酸酯以3.4％w/v的浓度存在和POE-POP以0.25％w/v的浓度存在。

19.权利要求1的组合物，其中免疫原选自灭活病原体、减毒病原体、亚单位、重组表达载体和质粒或其组合。

20.权利要求19的组合物，其中病原体选自病毒、细菌、真菌、原生动物寄生虫或其组合。

21.权利要求19的组合物，其中免疫原是灭活病毒。

22.权利要求21的组合物，其中免疫原是灭活的猪环状病毒2型(PCV-2)病毒。

23.权利要求19的组合物，其中免疫原是灭活的猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae)细菌。

24.诱导动物对抗病原体的免疫应答的方法，包括将根据权利要求19的疫苗组合物给药于所述动物。

25.权利要求24的方法，其中免疫原选自灭活病原体、减毒病原体、亚单位、重组表达载体和质粒或其组合。

26.根据权利要求25的方法，其中免疫原选自灭活的猪肺炎枝原体细菌、灭活的猪环状病毒2型(PCV-2)病毒或其组合。

27.根据权利要求25的方法，其中以一次完成的方案来给药疫苗组合物。

28.根据权利要求24的方法，其中动物选自牛、猪、马、狗、猫、鸡、鸭和火鸡。

29.权利要求27的方法，其中给药是肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射。

30.权利要求29的方法，其中使用无针注射器进行给药。

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