BR102013001893B1 - Antígenos recombinantes do porcine circovirus 2 (pcv-2) para formulações vacinais, kit de diagnóstico e uso - Google Patents
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Abstract
ANTÍGENOS RECOMBINANTES DO PORCINE CIRCOVIRUS 2 (PCV-2) PARA FOR-MULAÇÕES VACINAIS, KIT DE DIAGNÓSTICO E USO. A presente invenção se refe-re à obtenção do antígeno recombinante do capsídeo viral do Porcine circovirus 2 (PCV-2) e suas modificações, mediante expressão em sistema procariótico, purifica-ção na forma monomérica, recuperação de partículas semelhantes a vírus (VLPs) e sua utilização em formulações vacinais, kits de diagnóstico e num sistema de quantifi-cação nas partidas vacinais do antígeno do PCV-2 por meio de um ELISA de captura. Os antígenos e as formulações vacinais podem ser empregados na imunização de animais em programas de controle das doenças associadas ao PCV-2 nos sistemas de produção de suínos convencionais e representam alternativas às vacinas disponí-veis no mercado. O kit de ELISA pode ser empregado para testes de qualidade em vacinas comerciais e/ou experimentais contra o PCV-2.
Description
O primeiro objeto deste pedido de patente trata-se da proteína recombinante purificada do capsídeo do PCV-2 produzida em E. coli como antígeno vacinai e antígeno de diagnóstico. O segundo objeto de patente trata-se das partículas semelhantes a vírus (VLPs) do PCV2 produzidas por E. coli como antígeno vacinai ou antígeno de diagnóstico. O terceiro objeto deste pedido trata- se de uma vacina recombinante contra o PCV-2, contendo antígenos purificados ou VLPs recombinantes do PCV2 produzidos em E. coli, adicionado de hidróxido de alumínio como adjuvante. O quarto objeto de pedido de patente trata-se de um Kit de ELISA de captura para quantificação de antígenos vacinais do PCV-2. Os antígenos vacinais (objetos 1 e 2) e a vacina (objeto 3) aqui descritos, podem ser empregados na imunização de animais em programas de controle das doenças associadas ao PCV-2 nos sistemas de produção de suínos convencionais e representam alternativas às vacinas disponíveis no mercado. O Kit de ELISA (objeto 4) pode ser empregado para testes de qualidade em vacinas comerciais e/ou experimentais contra o PCV-2. Estes produtos mencionados acima poderão ser utilizados em indústrias farmacêuticas ou da área de sanidade animal.
Em 1974, foi identificado pela primeira vez o Porcine circovirus (PCV), como um contaminante persistente presente em um cultivo de células de rim de origem suína. Entretanto, esse vírus foi associado a uma patogenicidade em suínos somente no fim da década de 90. Tratava-se da Síndrome do definhamento pós-desmame, do inglês post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a qual foi descrita pela primeira vez no Canadá. Devido às diferenças genéticas e imunológicas entre este novo PCV isolado nos animais com sintomas da PMWS e daqueles contaminantes das células de laboratório, esses dois vírus foram nomeados, respectivamente, como Porcine circovirus-2 (PCV-2) e Porcine circovirus-1 (PCV-1) (Silva Júnior, A., Carvalho, O.V., Bulos, L.H.S., Fietto, J.L.R., Moraes, M.P., Almeida, M.R. Porcine circovirus 2: immunopathogenesis and recent developments in vaccines. World journal vaccine, v. 2, p. 96-104, 2012).
Como o PCV-2 está associado a um conjunto de diferentes sindromes em suínos além da PMWS, o termo Porcine circovirus associated disease (PCVAD) foi apresentado em 2006, pela American Association of SwineVeterinarians (AASV), para agrupar todas essas sindromes. Nelas estão incluídas ententes, falhas reprodutivas, dermatites e nefropatias que acometem suínos, principalmente, nas fases de recria e terminação. Mais recentemente, em 2011, foi descrita uma nova síndrome caracterizada por um edema pulmonar agudo que acomete animais jovens e vacinados contra o PCV-2, levando a uma taxa de mortalidade de cerca de 20% (Cino-Ozuna, A.G., Henry, S., Hesse, R., Nietfeld, J.C., Bai, J., Scott, H.M., Rowland, R.R.R. Characterizationof a new disease syndrome associated with porcine circovirus type 2 in previously vaccinated herds. Journal of clinical Microbiology, v.49, p.2012-2016, 2011). Atualmente, o PCV-2 possui uma distribuição mundial e as PCVAD são endêmicas na maioria dos países produtores.
Nem todos os animais infectados pelo PCV-2 apresentam os sinais clínicos aparentes dessas enfermidades. Assim, para se realizar o diagnóstico preciso faz- se necessário observar a presença de sinais clínicos compatíveis e a presença de lesões microscópicas características, além da detecção do vírus no animal por técnicas laboratoriais, como Polymerase Chain Reaction (PCR), imunohistoquímica (IHC) e entre outras (Silva Júnior, A., Carvalho, O.V., Bulos, L.H.S., Fietto, J.L.R., Moraes, M.P., Almeida, M.R. Porcine circovirus 2: immunopathogenesis and recent developments in vaccines. World journal vaccine, v. 2, p. 96-104, 2012).
Como os animais doentes usualmente apresentam um quadro de linfopenia, infecções secundárias por patógenos oportunistas são frequentes, o que aumenta a importância do controle das PCVAD. Neste sentido, estudos vêm sugerindo que o desenvolvimento das PCVAD está diretamente relacionado à interação do vírus, bem como de outros agentes infecciosos oportunistas, com o sistema imune do animal, demonstrando o caráter multifatorial dessas enfermidades (Silva Júnior, A., Carvalho, O.V., Bulos, L.H.S., Fietto, J.L.R., Moraes, M.P., Almeida, M.R. Porcine circovirus 2: immunopathogenesis and recent developments in vaccines. World journal vaccine, v. 2, p. 96-104, 2012).
O PCV-2 pode ser disseminado no ambiente por secreções orais e nasais, fezes e sangue. A transmissão do vírus acontece pelas vias nasal, oral, fecal e pelo trato urinário. A partícula virai infecciosa é resistente a fatores físicos e químicos, e é capaz de suportar ambientes ácidos (pH 3), inativação por calor (120 °C por 30 minutos), congelamento e exposição à luz ultravioleta. Desinfetantes à base de monopersulfato de potássio, ácido peracético com peróxido de hidrogênio, compostos contendo sais de amónio quaternário, hipoclorito de sódio ou hidróxido de sódio são efetivos na diminuição do número partículas infecciosas. Por outro lado, produtos contendo iodo ou compostos fenólicos não são capazes de reduzir a infectividade do vírus in vitro. Devido ao caráter multifatorial das PCVAD, o seu controle deve ser feito através de uma combinação de fatores, como as boas práticas de manejo, recomendadas pelo conhecido “20 pontos de Madec”, a diminuição do estresse dos animais, a redução na mistura de lotes, a adoção de vazios sanitários, além de vacinação e vigilância sorológica do rebanho, tem se mostrado eficientes (Madec, F., Rose, N., Grasland, B., Cariolet, R., Jestin, A. Post-weaning multisystemic wasting syndrome and other PCV2-related problems in pigs: a 12-year experience. Transboundary and Emerging Diseases, v.55, p.273-283, 2008).
Desde o surgimento da PMWS e da confirmação do PCV-2 como seu agente causal, pesquisadores do mundo inteiro têm se dedicado ao desenvolvimento de formas de controle dessa enfermidade, especialmente por meio de vacinas. Diversas estratégias foram empregadas com o intuito de desenvolver imunógenos. Dentre elas, destacam-se as vacinas de vírus inativados crescidos em cultivo celular, as vacinas de DNA e as vacinas de subunidade, contendo a proteína do capsídeo virai produzida em células de inseto modificadas (Silva Júnior, A., Carvalho, O.V., Bulos, L.H.S., Fietto, J.L.R., Moraes, M.P., Almeida, M.R. Porcine circovirus 2: immunopathogenesis and recent developments in vaccines. World journal vaccine, v. 2, p. 96-104, 2012).
A proteína estrutural do capsídeo do circovirus, SEQ ID N 04, é codificada pela ORF2, SEQ ID 03, e possui uma massa molecular aproximada de 28 kDa e ponto isoelétrico (PI) teórico de cerca de 10,7. Por interagir especificamente com receptores na superfície celular essa é a proteína de maior relevância envolvida na resposta imune do hospedeiro. Ela possui um sinal de localização nuclear na sua porção aminoterminal (primeiros 41 resíduos de aminoácidos) com grande número de resíduos de aminoácidos carregados positivamente, onde aproximadamente 40% são resíduos de arginina. Estudos mostraram a presença de três epitopos imunogênicos na proteína do capsídeo do PCV-2 são capazes de gerar anticorpos neutralizantes. Estes compreendem as sequências de aminoácidos de 47 a 57, de 165 a 200 e os quatro últimos resíduos de aminoácidos da extremidade C-terminal (Lekcharoensuk, P., Morozov, I., Paul, P.S., Thangthumniyom, N., Wajjawalku, W., Meng, X.J. Epitope mapping of the major capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) by using chimeric PCV1 and PCV2. Jounal of Virology, v.78, p.8135-8145, 2004).
A proteína do capsídeo viral do PCV-2 foi produzida pela primeira vez em Escherichia coli em 2001 por Liu e colaboradores, como uma cadeia polipeptídica fusionada à proteína de ligação à maltose (MBP) e a uma cauda de histidina - (MBP)-Hisδ (Liu, Q., Tikoo S.K., Babiuk, L.A. Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type 2. Virology, v.285, p.91-99, 2001). Essa proteína recombinante, purificada por cromatografia de afinidade, reagiu especificamente, tanto com o soro policlonal de coelho previamente imunizado com PCV-2, quanto com o soro de suínos infectados pelo vírus.
Existe uma dificuldade em expressar grandes quantidades da proteína do capsídeo do PCV-2 em células de Escherichia co//devido à grande quantidade de resíduos de arginina no sinal de localização nuclear e a presença de outros resíduos de aminoácidos sintetizados a partir de códons raros para esse organismo. Outra forma de contornar o problema da baixa expressão da da proteína do capsídeo do PCV-2 é utilizando linhagens bacterianas que superexpressam t-RNAs de códons raros, como por exemplo a BL21-codon plus- DE3-RIL. A vantagem é a manutenção de todos os resíduos de aminoácidos da proteína (estrutura primária preservada), o que garante a possibilidade da geração de anticorpos produzidos a partir de epítopos presentes na região do sinal de localização nuclear. Entretanto, outros sistemas bacterianos, comercializados por companhias ou desenvolvidos, podem ser utilizados para a expressão.
Atualmente, expressão da Cap-PCV-2 recombinante é feita, principalmente, em dois sistemas: o primeiro utiliza células de inseto infectadas por baculovírus recombinantes, enquanto que o outro consiste na indução da proteína recombinante em sistemas bacterianos transformados. Neste último, o sistema de expressão usualmente está sujeito ao controle do operador lac, de forma que a sua indução é comumente feita mediante adição de Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG) ao meio de crescimento. Entretanto, existem diversos vetores para expressão em sistemas bacterianos comercializados por diferentes empresas. Dessa forma, outros promotores, homólogos ou heterólogos, também podem ser utilizados, como os promotores sujeitos à modulação por arabinose. Partículas semelhantes a vírus (VLPs) são proteínas estruturais do capsídeo virai que se arranjam em uma estrutura semelhante à partícula virai selvagem formando um capsídeo desprovido do material genético no seu interior. Essas partículas não infecciosas possuem alta imunogenicidade por apresentarem a forma estrutural dos virions (partícula virai infecciosa). Logo, a utilização de VLPs em vacinas recombinantes aumentam a eficiência dessas vacinas por estimularem o sistema imune de forma semelhante à partícula virai selvagem. Já foi demonstrada a capacidade de formação de VLPs pela proteína do capsídeo do PCV-2, tanto em sistemas eucarióticos de expressão (Bucarey, S.A., Noriega, J., Reyes, P., Tapia, C., Saenz, L, Zuniga, A., Tobar, J.A. The optimized capsid gene of porcine circovirus type 2 expressed in yeast forms viruslike particles and elicits antibody responses in mice fed with recombinant yeast extracts. Vaccine, v.27, p.5781-5790, 2009), quanto em sistemas procarióticos (Lou, Z.Z., Li, Z.Y., Wang, G., Li, J.Q., Lan, X., Li, X. R., Yin, X. P„ Liu, J.X. Liu, S.D. Prokaryotic expression and potential application of the truncated PCV-2 capsid protein. Virologica Sinica, v.25, p.86-97, 2010).
A metodologia adotada na presente invenção utiliza o sistema bacteriano. Esta é capaz de gerar quantidades de antígenos na escala de dezenas a centenas de miligramas por litro de meio induzido em poucas horas de indução. Já o sistema de expressão em células de inseto, necessita de dias para a produção do mesmo. Outra vantagem são os custos associados a sua produção. O sistema bacteriano utiliza meios de indução mais baratos do que o de células de inseto. Entretanto, os sistemas que utilizam células de inseto não necessitam de passos subsequentes à expressão para a concentração e purificação do antígeno. Contudo, na presente invenção, os antígenos recombinantes são recuperados por meio de técnicas menos onerosas para posterior aplicação.
Outra possível desvantagem do sistema bacteriano seria a falta de modificações pós-traducionais na proteína do capsídeo, uma vez que se trata de um sistema procariótico. Entretanto, a presente invenção, demonstra que a proteína do capsídeo virai, quando expressa em um sistema bacteriano é capaz de se auto-montar e de promover geração de VLPs não infecciosas com forma e tamanho similares às partículas virais selvagens, de forma semelhante ao observado para a sua expressão em sistemas eucarióticos.
Outra dificuldade encontrada na produção de um composto vacinai contendo a proteína do capsídeo virai do PCV-2 é a sua quantificação na formulação vacinai. As vacinas recombinantes no mercado usualmente utilizam a tecnologia de quantificação por densitometria em gel de poliacrilamida, utilizando como referência uma proteína padrão, como a soro albumina bovina (BSA). Neste pedido, utilizam-se anticorpos anti-PCV-2 para a quantificação da proteína imunogênica. Tais anticorpos interagem especificamente com a proteína do capsídeo do PCV-2 presentes em uma determinada amostra, e, devido a marcações específicas nos anticorpos, há a geração de um sinal (cor, radioatividade, etc.) proporcional à quantidade de antígeno presente na amostra. Dessa forma, a quantificação se dá mediante a leitura desse sinal produzido e por meio de uma comparação com uma amostra contendo a proteína recombinante purificada.
Diversos potencializadores das respostas imunes estão descritos na literatura, e, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados conjuntamente com as formulações aqui descritas. Adjuvantes aquosos como o hidróxido de alumínio ou polímeros de carbono, como a carboximetil celulose, são preferíveis devido à geração de menor inflamação e dor, do que os adjuvantes oleosos.
Os compostos vacinais desenvolvidos com a presente invenção podem ser administrados em qualquer das vias descritas na literatura, preferivelmente, intramuscular.
Na busca feita em bancos de patentes foram encontrados documentos de patentes na área de processos de produção de imunógenos para suínos, porém nenhuma destas patentes utiliza produtos ou processos relacionados ao objeto desta patente. Nesta busca foi encontrado o documento de patente PI 0412855-9 de 26/07/2004, de título: FORMULAÇÕES DE VACINA, que se refere a “uma nova emulsão óleo-água com estabilidade aumentada na presença de suspenções bacterianas ou virais, especialmente aquelas concentradas e não purificadas ou fracamente purificadas”, onde se descreve uma solução contendo o PCV-2 inativado. O objeto do presente pedido de patente é diferente da patente descrita, pois foca na utilização da proteína recombinante produzida em sistema bacteriano, além de propor novos procedimentos específicos para recuperação e quantificação desse antígeno.
Outro depósito encontrado foi o de número PI0615862-5 de 08/09/2006, intitulada: VACINA CONTRA PCV-2, E, MÉTODO PARA A MANUFATURA DE UMA VACINA, que trata de “uma vacina contra o circovirus porcino (pcv-2) e a um método para manufatura de tal vacina, para proteger leitões contra infecção por pcv”, onde os inventores desenvolveram um processo para a produção de antígenos recombinantes, preferencialmente em sistema eucariótico (células de inseto), a fim de contornar o problema da baixa recuperação de partículas virais em cultura de células. Similarmente a esta patente, em 29 de dezembro de 2005, foi depositada no banco de patentes dos Estados Unidos, a patente US 770028, que possui o título: "PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions”, onde descreve-se um método melhorado para a recuperação da proteína recombinante do capsídeo do PCV-2 no sobrenadante das células induzidas, iniciando aproximadamente 5 dias após a infecção. Diferentemente, a presente invenção prevê a produção de dezenas a centenas de miligramas de proteínas em poucas horas de indução, após a lise e recuperação da proteína recombinante.
Outro depósito encontrado no banco de patentes dos Estados Unidos é o US 8008001, de 11 de dezembro de 2009, cujo título é “PCV-2 VACCINE”, o qual versa sobre uma vacina e um método para proteger leitões contra a infecção do PCV-2, por meio da administração de uma vacina contendo, pelo menos 20 microgramas/dose da proteína do capsídeo do PCV-2. Tal patente descreve o uso preferencial do sistema de expressão eucariótico (células de inseto inoculadas com baculovírus recombinante). Esse sistema difere do proposto na presente invenção, uma vez que aqui é descrito o uso de sistemas bacterianos, com novas metodologias para a recuperação e quantificação do antígeno.
Também foi encontrado no banco de patentes dos Estados Unidos, a patente US 6287856, de 12/03/1999, intitulada: “Vaccines against circovirus infections”, que trata de composições vacinais que são protetoras contra infecções do PCV. Elas são baseadas em vetores de ácidos nucléicos contendo a sequência codificadora para um polipeptídeo do PCV, onde o ácido nucléico é desprovido de uma origem de replicação virai, tratando-se, portanto de vacinas de DNA, diferente do presente pedido que produz o antígeno em E. coli.
O primeiro objeto deste pedido de patente trata-se da proteína recombinante purificada do capsídeo do PCV-2 produzida em E. coli geneticamente modificadas como antígeno vacinai e antígeno de diagnóstico. O segundo objeto de patente trata-se das partículas semelhantes a vírus (VLPs) do PCV2 produzidas por E. coli geneticamente modificadas como antígeno vacinai. Ambos os objetos podem ser utilizados em programas de controle e prevenção da infecção causada pelo PCV-2. O terceiro objeto deste pedido trata-se de uma vacina recombinante contra o PCV-2, contendo antígenos purificados ou VLPs recombinantes do PCV2, ou de suas variantes, produzidos em E. coli geneticamente modificados, adicionado de hidróxido de alumínio como adjuvante. Também a ser utilizado em programas de controle e prevenção da infecção causada pelo PCV-2.
É objeto também da presente invenção produzir um Kit de ELISA de captura por meio da proteína recombinante produzida, para posterior quantificação em formulações vacinais. Essa técnica possui como vantagens principais a sua facilidade de execução e automação, precisão, adaptabilidade e baixo custo. Além disso, a principal vantagem do ELISA de captura proposto é que as amostras não precisam estar purificadas e nem estar em altas concentrações para serem analisadas, uma vez que o antígeno é fixado através de anticorpos específicos, fazendo com que esta ligação seja proporcional à concentração das proteínas presentes, resultando em uma maior reprodutibilidade nos resultados, onde a quantificação é requerida. Quantidades muito baixas, como 50 microgramas da proteína, podem ser detectadas quando diluídas em um litro de solução. Dessa forma, devido aos seus benefícios e facilidades, esse ensaio apresenta-se como um forte candidato para ser utilizado como referência em testes de segurança e ensaios de dose-resposta para verificação da potência vacinai, exigidos para a liberação de diferentes vacinas comerciais, com as devidas adaptações.
O desenvolvimento de compostos imunogênicos capazes de gerar proteção contra a infecção do PCV-2 tem sido alvo de busca no âmbito geral de pesquisas de controle das PCVAD. A proteína recombinante do capsídeo do PCV-2, produzida em sistema bacteriano e recuperada da forma como descrito acima aponta como um imunógeno em potencial. Além disso, a substituição de técnicas laboriosas para a detecção e quantificação do PCV-2 como método de diagnóstico, é algo de interesse da indústria de diagnóstico veterinário. Desse modo, o investimento na produção e na recuperação dos antígenos recombinantes aqui descritos, como alvo para produção compostos vacinais e para fins de diagnóstico, bem como para as outras aplicações, é muito promissor.
A figura 01 mostra a análise em gel de agarose 1% dos produtos da PCR. M: Marcador de DNA Ladder 100 pb; 1, 2, 3 e 4: DNA correspondente a ORF2 do PCV-2 amplificado; C-: controle negativo (DNA extraído de células SK6 livres de PCV-2).
A figura 02 mostra a análise em gel de agarose 1% das reações de clivagem dos plasmídeos com EcoRI, evidenciando as bandas de 400 e 316 pb provenientes da clivagem da ORF2. M: Marcador de DNA Ladder 100 pb; 1.1,1.2, 1.4, 1.6 e 1.8: colônias brancas escolhidas aleatoriamente; 1.9, 1.10 e 1.11: controle negativo (colônias azuis).
A figura 03 mostra a análise em gel de agarose 1% das reações de clivagem do plasmídeo recombinante pCap-PCV2 com as enzimas EcoRI (canaleta 1) e com Xbai (canaleta 2). M: Marcador de DNA Ladder 100 pb.
A figura 04 apresenta a confirmação da expressão da rCap-PCV-2. Gel SDS-PAGE 15% (à esquerda) e membrana de nitrocelulose obtida pela técnica de Western blotting (à direita). M: marcador de massa molecular; C-: controle negativo (fração solúvel do extrato de E. coli transformado com o plasmídeo de expressão bacteriano vazio e induzido com IPTG); e 2: amostra (fração solúvel do extrato de E. coli transformado com o pCap-rPCV2 e induzido com IPTG). A seta indica a banda de aproximadamente 30 kDa correspondente à rCap-PCV-2.
A figura 05 apresenta o perfil proteico obtido no processo de purificação a partir da fração solúvel. M: marcador de massa molecular; 1: fração solúvel do extrato de E. coli induzido; 2: volume não-interagido; 3: lavagem com 10% de tampão de eluição; 4: lavagem com 20% de tampão de eluição; 5: Eluição com 100% de tampão de eluição. A seta indica a rCap-PCV-2 purificada.
A figura 06 apresenta os perfis proteicos das frações resultantes do processo de precipitação da fração solúvel com diferentes níveis de saturação com sulfato de amónio. M: marcador de massa molecular; 1: Fração Solúvel, 2: Fração 0-20%, 3: Fração 20-40%, 4: Fração 40-60%, 5: Fração 60-80%, 6: rCap Purificada. A seta indica a rCap-PCV-2
As figuras 07 A, B e C mostram micrografias eletrônicas: formação de partículas semelhantes a vírus (VLPs) pela rCap-PCV-2. Aumento de 140000X (A e B). Aumento de 250000X (C). As amostras foram analisadas em Microscópio Eletrônico de Transmissão, sendo utilizadas grades de 200 mesh cobertas com formvar/carbono. VLPs podem ser visualizadas pelas setas.
A figura 08 apresenta as diluições das amostras: rCap-PCV-2: diluições 10mg/L a 0,004883 mg/L. Candidato vacinai: diluições 1:50 a 1:103200. Lisado de E. coli negativo: diluições 1:50 a 1:103200. A equação obtida é y = 0,875x + 0,196 (R2 = 0,996), onde y é a DO 492 nm e x é a concentração da proteína a ser detectada.
A Figura 09 apresenta a resposta humoral específica induzida pela rCap- PCV-2 em camundongos antes e após a vacinação medido por ELISA Indireto. Os animais foram inoculados nos dias 0 e 14 e desafiados no dia 35. Os animais inoculados com o candidato vacinai apresentaram quantidades significativas de anticorpos, principalmente após a segunda inoculação.
A figura 10 apresenta avaliação da viremia dos animais vacinados com a vacina comercial 1 nos tempos de coleta. No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63, 105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representado pela fórmula y - 5E+10e°,1847x. Não houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 = 0,1195).
A figura 11 apresenta avaliação da viremia dos animais vacinados com a vacina comercial 2 nos tempos de coleta. No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63, 105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representada pela fórmula y = 2E+13e’1,323x. Não houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 = 0,5703).
A figura 12 apresenta avaliação da viremia nos tempos da coleta dos animais vacinados com o candidato vacinai com uma dose na concentração de 50 μg. No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63, 105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representada pela fórmula y = 2E+12e’0,766x. Houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 - 0,9696).
A figura 13 apresenta avaliação da viremia nos tempos da coleta dos animais vacinados com o candidato vacinai com duas doses na concentração de 50 μg. No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63,105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representada pela fórmula y = 1E+12e‘0,79x. Houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 = 0,9418).
A figura 14 apresenta avaliação da viremia nos tempos da coleta dos animais vacinados com o candidato vacinai com uma dose na concentração de 150 μg. No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63, 105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representada pela fórmula y = 2E+17e’4,106x. Não houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 = 0,7912).
A figura 15 apresenta avaliação da viremia nos tempos da coleta dos animais vacinados com o candidato vacinai com duas doses na concentração de 150 μg. No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63,105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representada pela fórmula y = 4E+13e'1,594x. Não houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 = 0,6673).
A figura 16 apresenta avaliação da viremia nos tempos da coleta dos animais não vacinados (controle negativo). No eixo vertical é apresentado a carga viral, no eixo horizontal é apresentado as 4 etapas de coleta: 21, 63, 105 e 154 dias de idade dos suínos. A regressão linear é representada pela fórmula y = 2E+13e‘1,304x. Não houve redução significativa na carga viral no período após a vacinação (R2 = 0,7425).
O DNA do Porcine circovirus 2 (PCV-2), utilizado na amplificação da região codificante da proteína do capsídeo (ORF2), SEQ ID N 03, foi isolado a partir de amostras de tecidos de suínos acometidos com PCV-2, provenientes da região de Ponte Nova, MG. A ORF2 foi amplificada por meio da técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR), utilizando o oligonucleotídeo direto 5’- CGCCATATGACGTATCCAAGGAGG-3’ (Forward), que insere um sítio de restrição para a enzima Nde\ na extremidade 5’ e o oligonucleotídeo reverso 5’- CCCTCGAGTTAGGGTTTAAGTGGG-3’ (Reverse), que cria um sítio para Xhol no final da região codificante. Esses oligonucleotídeos foram construídos a partir da sequência do genoma do isolado brasileiro de PCV-2 (DQ364650) depositada no GenBank. A amplificação dos fragmentos de DNA foi conduzida em um termociclador, com uso de Taq DNA Polimerase 5 U/μL. As amostras amplificadas foram armazenadas a -4°C e analisadas por eletroforese horizontal em gel de agarose a 1%. O DNA, fragmento de 716 pb, foi evidenciado no gel com brometo de etídio 0,4 μg/mL, sob luz ultravioleta, como demonstrado na Figura 01.
O produto da PCR foi então purificado do gel de agarose. Em seguida, a ORF2 do PCV-2 purificada foi clonada em um vetor de amplificação (pGEM®-T Easy Vector System - PROMEGA). A mistura de ligação obtida, como indicada pelo fabricante do kit, foi adicionada a aproximadamente 100 μL de solução contendo bactérias E. coli DH5a, previamente tornadas competentes (Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A laboratory manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), e realizada uma incubação por 30 min no gelo. Em seguida, a mistura de células e DNA plasmidial foi submetida a um choque térmico, em banho-maria, a 42 °C por 1 minuto, e novamente no gelo por 2 minutos. Posteriormente, 900 μL de meio LB-Líquido (1% triptona; 0,5 % extrato de levedura; 1%NaCI; pH 7,5) sem antibiótico foram adicionados e as células incubadas a 37 °C por 2 horas a 250 rpm em agitador orbital. Essa mistura foi plaqueada em meio sólido LB-Agar (1% triptona; 0,5 % extrato de levedura; 1%NaCI; 1,5% select Agar; pH 7,5) contendo ampicilina (5 a 10 mg/mL) e incubadas por 12 a 14 h a 37 °C.
Os clones resistentes a ampicilina foram recuperados e utilizados para confirmação da presença do plasmídeo contendo o gene de interesse por meio da PCR e de ensaio enzimático a partir do plasmídeo extraído por mini preparação plasmidial (Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A laboratory manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001). O ensaio enzimático foi realizado com a enzima de restrição EcoRI e posteriormente a reação de clivagem analisada por eletroforese em gel de agarose 1% (Figura 02). A PCR de colônia foi realizada da mesma forma que a PCR descrita anteriormente, porém, no lugar do DNA genômico de tecidos infectados, foi adicionado uma alíquota das colônias transformantes com o auxílio de palitos estéreis. Os produtos da PCR também foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%.
As amostras plasmidiais obtidas contendo o DNA virai, confirmadas por ensaio enzimático e PCR de colônia, foram purificadas utilizando-se kit de purificação de produto de PCR e então enviadas ao Laboratório de Genômica, BIOAGRO/UFV para sequenciamento e posterior confirmação da montagem correta do vetor. As reações de sequenciamento foram baseadas na técnica de terminação de cadeia por dideoxinucleotídeos (ddNTPs) (Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.74, p.5463-5467, 1977). As sequências geradas foram editadas e montadas em “contigs” utilizando programas de bioinformática e, posteriormente, comparadas entre si e com as sequências já depositadas no GENBANK, utilizando-se o programa BLAST. A sequência traduzida da ORF2 encontra-se descrita na SEQ ID N 04. Os clones que continham a construção foram estocados em meio LB-líquido em tubos de microcentrífuga com 20% de glicerol e mantidos a -80 °C.
Após a verificação da sequência correta do insecto no vetor, a amostra do DNA plasmidial pCapPCV-2, SEQ ID N 03, (vetor de amplificação) foi submetida a um ensaio enzimático onde sítios específicos de restrição foram utilizados para inserir o gene da ORF2 num vetor de expressão bacteriano (pET-16b - NOVAGEN), o qual é controlado pelo promotor T7 lac e possui uma sequência que codifica para uma cauda de 10 histidinas N-terminal (utilizada para purificação através de afinidade com resina contendo Níquel). A sequência da ORF2 no pCapPCV-2 foi digerida com Nde\ e Xho\, assim como o vetor de expressão bacteriano. Após as clivagens, os produtos (vetor de expressão bacteriano digerido e inserto ORF2 retirado do vetor de amplificação) foram ligados utilizando a enzima T4 DNA ligase. A reação de ligação foi então usada para transformar E. coli DH5a; como descrito anteriormente. Os clones transformantes foram selecionados aleatoriamente dentre as colônias para identificação dos plasm ídeos com o inserto. Para a confirmação da clonagem foram realizadas PCRs de colônias, mostrando que a clonagem sítio dirigida funcionou como esperado para os dois grupos de colônias escolhidas aleatoriamente, dando origem a um fragmento de 716 pb. As colônias positivas foram escolhidas e cada colônia foi submetida à PCR separadamente. Para a colônia que apresentou o plasmídeo recombinante, com o tamanho aproximado de 716 pb, foram realizadas reações de clivagens do plasmídeo pCap-rPCV-2, SEQ ID N 01, para confirmar sua orientação correta. Assim, foram observadas as bandas de tamanho esperado de 718 pb e 472 pb, provenientes da digestão com EcoR\ e Xba\, respectivamente e um fragmento de alto peso molecular correspondente ao restante do plasmídeo (Figura 03). Os plasmídeos recombinantes encontrados foram denominados de pCap-rPCV2 e estocados em tubos de microcentrífuga, contendo 15 a 30% de glicerol, e mantidos a temperatura de -70 °C.
A expressão total das proteínas recombinantes foi feita em média escala, em 1000 mL de TB (12 g/L de triptona, 24 g/L de extrato de levedura, 4 ml_ de glicerol, 2,31 g/L de fosfato de potássio monobásico e 12,54 g/L de fosfato de potássio dibásico). Para isso, bactérias competentes, da linhagem E. coli BL21- DE3- RIL códon plus, foram transformadas com a construção pCap-rPCV2, de modo análogo ao realizado com o vetor de amplificação. Assim, aproximadamente 20 nanogramas do plasmídeo recombinante pCap-rPCV2 foram adicionados a 100 μL de células competentes e a mistura foi incubada no gelo por 30 min. Em seguida, a mistura de células e DNA plasmidial foi submetida a um choque térmico, em banho-maria, a 42 °C por 1 minuto, e novamente no gelo por 2 minutos. Posteriormente, 900 μL de meio LB (10 g/L de bacto-triptona; 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de cloreto de sódio) sem antibiótico foram adicionados e as células incubadas a 37 °C por 2 horas a 250 rpm. As células foram diluídas cem vezes (1:100) em meio LB contendo 50 μg/mL de ampicilina e incubadas a 37 °C e 200 rpm por 12 horas (pré-inóculo). Um cultivo do controle negativo (bactéria BL21 não transformada) também foi realizado em LB líquido, pH 7,0, com cloranfenicol 17 μg/mL. As células foram então diluídas 1:100 em meio TB líquido, pH 7,0, com 100 μg/mL de ampicilina e a cultura foi crescida a 30°C/250 rpm por aproximadamente 3 horas até atingir a densidade óptica (D06OO) de 0,6-0,8. Procedeu-se igualmente para o controle negativo, utilizando cloranfenicol 17 μg/mL. Depois de atingido a DO, alíquotas da cultura foram transferidas para novos tubos onde foram feitas induções por 1, 2, 3, 4 e 5 horas para se saber qual o melhor tempo de indução. As concentrações de IPTG testadas foram 0,1; 0,5 e 1 mM e as temperaturas utilizadas foram 30°C e 37°C, sempre sob vigorosa agitação e suficiente aeração. Com o controle negativo foi realizado o mesmo procedimento. Amostras de 1 mL em cada condição foram coletadas, centrifugadas a 10000 x g por 1 min, o sobrenadante descartado e o precipitado de células estocados a -20°C para análise em SDS-PAGE.
Para a purificação, foi observado o melhor tempo de produção (4 horas), temperatura (30 °C) e concentração de IPTG (0,25 mM) durante a indução e, assim, 1 litro de cultivo de colônias contendo o plasmídeo recombinante pCap- rPCV2 foi induzido. Após a indução nas condições ótimas, a amostra foi centrifugada a 10000 g por 20 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células foi estocado a -20°C.
O precipitado oriundo de um volume de 100 mL do meio induzido foi descongelado e ressuspendido com tampão de lise (20 mM NaHzPO4; 300 mMNaCI; 5 mMImidazol; pH 8,0) para um volume final de aproximadamente 2,5 mL. A esse tampão foi adicionado lisozima a 1 mg/mL e, em seguida, a amostra foi incubada a 0 °C por 30 min. O processo de lise das células foi realizado com 6 ciclos de sonicação de 10 s a 200-300 Watts cada, com intervalos de 10 s e com os tubos no gelo para evitar aquecimento da amostra. Os restos celulares e os corpos de inclusão foram precipitados por centrifugação a 15.000 x g por 30 min, a 4 °C. O sobrenadante (fração solúvel) foi coletado em um novo tubo e utilizado para a purificação da proteína recombinante do capsídeo do PCV-2, denominada rCap-PCV-2 (SEQ ID N 02).
As amostras (incluindo controle negativo) foram analisadas em gel de poliacrilamida 15% (Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A laboratory manual,. 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001). Após a corrida, o gel foi revelado com solução corante (0,1% Coomassie Brilliant Blue R- 250; 9% ácido acético; 45% etanol). A corrida de eletroforese confirmou a presença de uma banda de aproximadamente 30 kDa, presente na amostra induzida. Essa massa correspondente à da proteína codificada pela ORF2 do PCV-2 somada à cauda de histidina. A confirmação da expressão se deu por meio da técnica de Western blotting (Figura 04).
A proteína recombinante do capsídeo viral do PCV-2 foi purificada a partir da fração solúvel por meio de cromatografia de afinidade em resina de níquel imobilizado em agarose. A técnica utilizada foi a "Fast performance liquid chromatography” (FPLC), com coluna cromatográfica carregada com níquel para purificação de proteínas recombinantes fusionadas a caudas de histidina. A purificação foi padronizada por meio da análise de diversos parâmetros como: fluxo linear, volumes de lavagem e eluição e concentrações de imidazol e ureia. Após a purificação, a solução contendo a proteína foi dialisada três vezes em 50 volumes de tampão carbonato 50 mM pH 7,2 contendo 300 mM de NaCI, em um total de nove horas (três horas cada diálise). As amostras de todos os passos da purificação foram analisadas em gel de poliacrilamida 15%, como descrito anteriormente. A proteína foi purificada com sucesso e pode ser visualizada na Figura 05.
A quantidade da proteína recombinante do capsídeo viral do PCV-2 purificada e dialisada podem ser determinadas utilizando a metodologia descrita por Bradford (Bradford, M.M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindyebinding. Analytical biochemistry, v.72, p.248-254,1976). O cálculo se deu por meio de regressão linear onde a equação y= 0,0108x + 0,3267, foi obtida a partir do melhor ajuste aos valores de densidade óptica para as diluições de BSA testadas.
Para isso, à fração solúvel contendo a rCap-PCV-2 foi adicionada uma quantidade de NazSO4 suficiente para 20% de saturação (para 0°C) e, posteriormente, a amostra foi incubada no gelo, a 100 rpm, por 30 minutos. Em seguida, o extrato proteico foi centrifugado a 15.000 x g por 20 minutos, a 0 °C. Ao final da centrifugação, o sobrenadante foi coletado e o precipitado ressuspendido em mesmo volume inicial de tampão carbonato pH 7,0, contendo 300 mM de NaCI (fração proteica de 0-20% de sulfato de amónio). Ao sobrenadante foi adicionada uma quantidade de Na2SO4 suficiente para 40% de saturação, partindo-se de uma solução inicial de 20% de saturação deste sal. Em seguida, os passos de incubação e agitação no gelo e de centrifugação foram repetidos para se obter as frações de 20-40%, 40-60% e 60-80% de saturação de sulfato de amónio. As frações foram dialisadas em tampão carbonato pH 7,0 contendo 300 mM de NaCI e, então, armazenadas a 4 °C por, no máximo, dois dias para serem analisadas por SDS-PAGE (Figura 06), Western blotting e ELISA de Captura. Foi utilizado por dose de vacina 1 mL do adjuvante Gel hidróxido de alumínio (OMEGA - Produtos Químicos Ltda).
Para verificação de VLPs, as frações provenientes do gradiente de CsCI que apresentaram resultado positivo no Westem-blotting foram dialisadas separadamente contra 500 mL de tampão carbonato (300 mM de NaCI, 50mM de carbonato, pH 7,0) 2 vezes por 4 horas cada. Aproximadamente 10 μL de cada fração foram adicionados às grades de 200 mesh cobertas com formvar/carbono e deixadas em repouso por 1 minuto em temperatura ambiente. Em seguida, o excesso de amostra foi retirado com papel filtro e uma gota de acetato de uranila 2% foi acrescentada em cada grade e deixada agir por 1 minuto. O excesso desse contrastante foi retirado com papel filtro e as grades foram deixadas em dessecador por 2 dias. A análise foi realizada em microscópio eletrônico de transmissão e as imagens foram fotografadas (Figuras 07 A, B e C).
Nesse ensaio de ELISA, anticorpos anti-rCap-PCV-2 produzidos em coelho foram precipitados e utilizados como anticorpos de captura e de detecção, sendo este último conjugado com peroxidase. Na padronização, a concentração ótima de antígeno foi de 0,625 μg/mL, a diluição ótima do anticorpo de captura foi de 15 μg/mL e do anticorpo de detecção conjugado com peroxidase foi de 1:800. Todos os procedimentos foram realizados de acordo como método de Checkerboard (Crowther, J.R. ELISA. Theory and practice. Methods in Molecular Biology, v.42, p. 1-223, 1995). Após a otimização das condições de trabalho do ELISA de captura, as concentrações da rCap-PCV-2 foram utilizadas para a construção de uma curva-padrão (y - 0,875x + 0,196) por meio de regressão linear (Figura 08). A construção da curva padrão foi realizada pelo cálculo da média dos valores das absorbâncias obtidas a partir da diluição seriada, na base 2, da proteína, iniciando na concentração de 5 mg/L até 0,0048 mg/L, dentro de uma microplaca de 96 poços sensibilizadas com o anticorpo de captura na concentração 0,625 μg/mL. A faixa de trabalho do ensaio foi definida como a região linear da curva com um coeficiente de correlação R2 - 0,996. Assim, os sete pontos de calibração foram de 0,625 a 0,0391 mg/L de rCap-PCV-2 correspondentes ao resultado da análise de regressão linear.
Para a quantificação da proteína no composto vacinai, foram utilizados 0,6g do precipitado, equivalente a 100 mL de meio induzido de células de E. coli transformadas com o plasmídeo recombinante pCap-rPCV-2 contendo o gene correspondente à ORF2 do PCV-2 e induzidas com IPTG para a produção da proteína recombinante. Como amostra negativa, utilizou-se a mesma quantidade do extrato de células transformadas com o vetor de expressão bacteriano vazio. Os precipitados dessas células foram descongelados e ressuspendidos em 2 mL de tampão de lise (NaH2PO4 20 mM; NaCI 300 mM; Imidazol 5 mM; pH 8,0). Ao tampão de lise foram adicionados lisozima 1 mg/mL, PMSF 1 mM e, em seguida, incubados no gelo por 30 minutos. O processo de lise das células foi realizado com 6 ciclos de sonicação de 10 segundos a 200-300 W cada, com intervalos de 10 segundos e com os tubos no gelo para evitar o aquecimento das amostras. A concentração desconhecida da rCap-PCV-2 no candidato vacinai foi determinada segundo Holden e colaboradores (Holden, L, Faeste, C.K., Egaas, E. Quantitative sandwich ELISA for the determination of lupine-lupinus spp. in foods. Journal of Agriculture Food Chemistry, v.53, p.5866-5871, 2005), onde diluições seriadas da vacina foram realizadas e a diluição na qual o valor de DO 492 nm mais próximo do ponto médio da parte linear da curva padrão, foi utilizada para o cálculo da concentração da proteína na vacina. Assim, a concentração de rCap-PCV-2 (SEQ ID N 02) no candidato vacinai, após o cálculo do fator de diluição da amostra, foi de 0,73 mg/mL.
Camundongos fêmeas com cinco semanas de idade foram divididos em quatro grupos de cinco animais da seguinte forma: um grupo para o candidato vacinai desenvolvido (precipitado de proteínas de 0-40% de sulfato de amónio dialisado); um grupo com a rCap-PCV-2 purificada; um grupo inoculado com tampão fosfato, PBS, (controle negativo); e um grupo inoculado com a vacina comercial contra circovirose suína (controle positivo). Nos grupos vacinados com o candidato vacinai, com proteína purificada e grupo inoculado com PBS foi adicionado o hidróxido de alumínio no qual utilizado como adjuvante, exceto nos animais inoculados com a vacina comercial. Os animais foram vacinados duas vezes (duas doses) por via intraperitoneal, com intervalo de 14 dias entre as doses. A quantidade de rCap-PCV-2 inoculada no grupo do candidato vacinai e no grupo inoculado com a proteína purificada foi de 30 μg para a primeira dose e de 15 μg para a segunda. Amostras sanguíneas foram coletadas via punção no plexo ocular nos tempos 0, 14, 28 e 35 dias pós-vacinação para as análises sorológicas. Os animais sofreram eutanásia 14 dias após o desafio. Todos os princípios éticos na experimentação animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) foram seguidos (Certificado de Ética para Uso de Animais (CEUA) / UFV, processo n° 054/2011).
A avaliação da resposta imune humoral foi feita pela técnica de ELISA indireto. As concentrações ótimas de trabalho do antígeno rCap-PCV-2 e a melhor diluição do soro (anticorpo primário) foram avaliadas pela titulação Checkerboard, (Crowther, J.R. ELISA. Theory and practice. Methods in Molecular Biology, v.42, p. 1-223, 1995). Foi determinada como sendo a concentração ótima de antígeno (rCap-PCV-2) 0,156 pg/poço e 1:4.000, respectivamente, utilizando para isso um soro de camundongo positivo para o PCV-2.
Os camundongos inoculados com o candidato vacinai apresentaram níveis similares àqueles obtidos para os camundongos inoculados com a vacina comercial, principalmente após a segunda dose da vacina (figura 09), possivelmente devido à existência de VLPs (figura 07), e também a concentração de adjuvante utilizadas.
Suínos de uma granja comercial padrão de vinte e um dias de idade foram vacinados com o candidato vacinai e comparado as vacinas comerciais. Foi avaliado o potencial antigênico do composto vacinai contendo a proteína recombinante do capsídeo viral do PCV-2 (rCap-PCV-2) em suínos. Para isso, foram utilizados 140 suínos com aproximadamente 21 dias de idade provenientes de uma granja comercial da região de Ponte Nova - MG. A experimentação foi realizada respeitando o manejo adotado pela granja. Esse estudo a campo foi realizado seguindo as Normas de Conduta para o uso de Animais no Ensino, Pesquisa e Extensão do Departamento de Medicina Veterinária DVT/UFV, número de registro 37/2012.
Os animais foram divididos em 7 grupos de 20 animais. Os grupos 1, 2 foram vacinados com vacinas comerciais de acordo com as recomendações dos fabricantes. Os grupos 3 e 4 foram vacinados com o candidato comercial contendo 50 μg da proteína recombinante, sendo que os animais do grupo 3 receberam uma dose aos 21 dias de idade e os animais do grupo 4 receberam duas doses com 21 e 35 dias de idade. Já os grupos 5 e 6 foram vacinados com o candidato vacinai contendo 150 μg da proteína recombinante, utilizando uma e duas doses, respectivamente no mesmo esquema vacinai do grupo 3 e 4. O grupo 7, grupo controle, foi vacinado com tampão fosfato (PBS). Todas as vacinações foram realizadas por via intramuscular. Amostras de sangue foram coletadas desde a fase de adaptação inicial até o dia do abate para quantificação da carga viral. As amostras de sangue foram coletadas nos 21, 63,105 e 154 dias de vida dos animais. A extração de DNA total foi realizada utilizando kit de extração comercial. A quantificação da carga viral do PCV-2 no soro coletado foi realizada pela técnica de PCR em tempo real de acordo com protocolo descrito por Silva e colaboradores (Silva, F.M.F., Silva Júnior, A., Vidigal, P.M., Oliveira, C.R., Viana, V.W., Silva, C.H.O., Vargas, M. I., Fietto, J.L.R., Almeida, M.R. Porcine Circovirus-2 Viral Load versus Lesions in Pigs: Perspectives for Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome. Journal of Comparative Pathology, V.144, p.296-302, 2011.) As reações foram realizadas em triplicate e todos os Ct (threshold cycle) analisados representam a média do Ct de cada amostra, assim, a partir da média do Ct de cada amostra foi calculado a média e o desvio padrão por grupo e coleta. As médias encontradas foram utilizadas para a avaliação de tendência da diminuição da carga virai através da análise de regressão exponencial. Estaticamente não foi observada tendência de redução da carga virai nas vacinas comercias 1 e 2 (Figura 10 e 11). Uma redução na carga virai foi estaticamente demonstrada nos grupos 3 e 4 (50 μg rCap-PCV2, uma e duas doses) R2= 0,96, e R2= 0,94 respectivamente (figuras 12 e 13), onde houve uma tendência de queda a partir da 3a semana de análise. O grupo 5 e 6 (150 μg rCap- PCV2, uma e duas doses) não demonstrou uma tendência de diminuição da carga virai estaticamente admissível (R2 = 0,7184 e R2 = 0,638, respectivamente - figuras 14 e 15). O grupo controle negativo, não apresentou estatisticamente uma tendência de redução da carga virai (figura 16).
Atualmente no mercado veterinário as vacinas comerciais contra o PCV-2 são comercializadas por empresas estrangeiras, sendo que as mesmas são produzidas fora do Brasil, havendo desta forma custo de importação sobre as partidas vacinais. Os antígenos vacinais poderão ser empregados na vacinação de animais em programas de controle das doenças associadas ao PCV-2 nos sistemas de produção de suínos convencionais e representam alternativas às vacinas disponíveis no mercado. O Kit de ELISA pode ser empregado em 5 quantificação de antígenos vacinais do PCV-2, o qual pode ser empregado para testes de qualidade em vacinais comerciais e/ou experimentais.
Claims (8)
1. ANTÍGENO RECOMBINANTE DO PORCINE CIRCOVIRUS 2 caracterizado por ser a SEQ ID N 02.
2. ANTÍGENO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender 10 resíduos de histidina posicionados na região aminoterminal da proteína recombinante do capsídeo do PCV-2.
3. ANTÍGENO RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por compreender o produto da oligomerização da SEQ ID N 02 na forma de partículas semelhantes a vírus (VLPS) do pcv-2.
4. FORMULAÇÕES VACINAIS caracterizadas por compreenderem o antígeno recuperado, definido nas reivindicações 1 e 2, ou as VLPs, definidas na reivindicação 3, associados a adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, preferencialmente o hidróxido de alumínio;
5. KIT DE DIAGNÓSTICO DO TIPO ELISA DE CAPTURA caracterizado por compreender a SEQ ID N 02, definida nas reivindicações 1 e 2, e anticorpos anti-SEQ ID N 02.
6. USOS DOS ANTÍGENOS, definidos nas reivindicações 1, 2 e 3, caracterizados por serem aplicados na produção de kits de diagnósticos e na produção de compostos vacinais.
7. USO DO KIT DE DIAGNÓSTICO definido na reinvindicação 5, caracterizado por ser para quantificação da proteína do capsídeo do PCV-2, mais especificamente em formulações vacinais.
8. Processo de recuperação dos antígenos e partículas semelhantes a vírus, de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por compreender as seguintes etapas: • Adição de sulfato de amônio (NH4)2SO4 à fração solúvel contendo a rCap-PCV-2 suficiente para 0-20% de saturação, seguido de incubação da amostra a 0°C, a 100 rpm, por 30 minutos; • Centrifugação do extrato proteico a 15.000 x g por 20 minutos, a 0 °C, com a coleta do sobrenadante e ressuspensão do precipitado no mesmo volume inicial de tampão carbonato pH 7,0, contendo 300 mM de cloreto de sódio (NaCl); • Adição ao sobrenadante de uma quantidade de sulfato de amônio suficiente para 40% de saturação, partindo-se de uma solução inicial de 20% de saturação deste sal; • Repetição dos passos de incubação e agitação no gelo e de centrifugação para se obter as frações de 20-40%, 40-60% e 60-80% de saturação de sulfato de amônio; • Diálise das frações em tampão carbonato pH 7,0 contendo 300 mM de NaCl, obtendo-se o antígeno recuperado; • Armazenamento do antígeno recuperado a 4 °C.
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