CN105263515A - 用于疫苗制剂、诊断试剂盒的重组猪圆环病毒2(pcv-2)的抗原及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备猪圆环病毒2(PCV-2)病毒衣壳的重组抗原及其修饰形式，在原核系统中表达，以单体形式纯化，回收病毒样颗粒(VLP)，以及它们使用在疫苗制剂、诊断试剂盒及借助于捕获ELISA测定法在疫苗批次中定量PCV-2抗原的系统中。抗原和疫苗制剂可在常规猪育种体系中用于防治PCV-2相关疾病的规划中的动物的免疫，并且代表了对商用疫苗的替代。ELISA试剂盒可用于测试针对PCV-2的商业疫苗和/或实验疫苗的质量。

Description

用于疫苗制剂、诊断试剂盒的重组猪圆环病毒2(PCV-2)的抗原及其使用
技术领域
本专利申请的第一目的涉及在大肠杆菌(E.coli)中产生的纯化PCV-2重组衣壳蛋白作为疫苗抗原和诊断抗原。本专利申请的第二目的涉及由大肠杆菌产生的PCV2病毒样颗粒(VLP)作为疫苗抗原或诊断抗原。本专利申请的第三目的涉及抗PCV-2的重组疫苗，它含有大肠杆菌中产生的PCV2的纯化抗原或重组VLP抗原，添加至氢氧化铝作为佐剂。本专利申请的第四目的涉及用于量化PCV-2的疫苗抗原的捕获ELISA试剂盒。本文所述的疫苗抗原(目的1和2)和疫苗(目的3)可用于动物免疫，用在常规猪养殖体系的PCV-2相关疾病的防治规划中，并且代表市场上可获得的疫苗的替代物。ELISA试剂盒(目的4)可用于抗PCV-2的商业疫苗和/或实验疫苗的质量检验。上文提到的这些产品可用于制药或动物卫生领域。
背景技术
在1974年，猪圆环病毒(PCV)被首次识别/确定为存在于猪源性肾细胞培养中的持久污染物。不过，该病毒在二十世纪90年代后期仅与猪的致病性相关。它是首次披露于加拿大的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)。由于在具有PMWS症状的动物中隔离出的该新型PCV和来自实验室细胞的那些污染物之间的遗传差异和免疫差异，这两种病毒分别被命名为猪圆环病毒-2(PCV-2)和猪圆环病毒-1(PCV-1)(SilvaJunior,A.,Carvalho,O.V.,Bulos,L.H.S.,Fietto,J.L.R.,Moraes,M.P.,Almeida,M.R.Porcinecircovirus2:immunopathogenesisandrecentdevelopmentsinvaccines；Worldjournalvaccine，v.2，p.96-104，2012)。
由于PCV-2与猪中除PMWS之外的不同的症状群相关，术语猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)在2006年由美国猪兽医协会(AASV)引入，来分类所有的这些综合症。其中包括侵袭猪的肠炎、繁殖失败、皮炎和肾病，主要在生长期和肥育期。最近，在2011年，披露了以急性肺水肿为特征的新综合症，影响幼龄动物并且针对PCV-2接种疫苗，导致约20％的死亡率(Cino-OzunaA.G.,HenryS.,Hesse,R.,Nietfeld,J.C.,Bai,J.,Scott,H.M.,Rowland,R.R.R.Characterizationofanewdiseasesyndromeassociatedwithporcinecircovirustype2inpreviouslyvaccinatedherds.JournalofClinicalMicrobiology，V49，p.2012-2016，2011)。目前，PCV-2呈全球分布并且PCVAD在大多数养殖国家呈地方性流行。
并非所有受PCV-2感染的动物都表现这些疾病的明显临床症状。因此，为了进行准确的诊断，除了通过实验室技术如聚合酶链反应(PCR)、免疫组织化学(IHC)以及其它技术检测动物中的病毒外，还需要观察相容性临床症状的存在和特征性显微病变的存在(SilvaJunior,A.,Carvalho,O.V.,Bulos,L.H.S.,Fietto,J.L.R.,Moraes,M.P.,Almeida,M.R.Porcinecircovirus2:immunopathogenesisandrecentdevelopmentsinvaccines；Worldjournalvaccine，v.2，p.96-104，2012)。
由于患病的动物通常出现淋巴细胞减少，通过条件性病原体所致的继发性感染是时常发生的，这增加了PCVAD控制的重要性。从这个意义上说，研究提出PCVAD的形成与病毒相互作用以及其它条件性传染因子直接相关，其中动物的免疫系统证实了这些疾病的多因素性质(SilvaJunior,A.,Carvalho,O.V.,Bulos,L.H.S.,Fietto,J.L.R.,Moraes,M.P.,Almeida,M.R.Porcinecircovirus2:immunopathogenesisandrecentdevelopmentsinvaccines；Worldjournalvaccine，v.2，p.96-104，2012)。
PCV-2可以通过口腔和鼻腔分泌物、排泄物和血液在环境中传播。病毒传播借助鼻、口、排泄物途径和尿路发生。感染性病毒颗粒对物理和化学因素有抵抗力，并且能够经受酸性环境(pH3)、热灭活(120℃达30分钟)、冷冻和暴露于紫外光。基于过硫酸氢钾的消毒剂、过乙酸与过氧化氢、含有季铵盐的化合物、次氯酸钠或氢氧化钠可有效降低感染性颗粒的数量。在另一方面，含有碘或酚类化合物的产品不能降低在体外的病毒的传染性。由于PCVAD的多因素性质，应当通过多种因素/因子的组合来进行控制，例如由众所周知的“Madec’s20points”推荐的良好管理实践，减少动物应激，减少混批、采用健康差距以及兽群的接种和血液学监测已证明是有效的(Madec,F.,Rose,N.,Grasland,B.,Cariolet,R.,Jestin,A.Post-weaningmultisystemicwastingsyndromeandotherPCV2-relatedproblemsinpigs:a12-yearexperience.TransboundaryandEmergingDiseases，v.55，p.273-283，2008)。
自从涌现PMWS并确认PCV-2及其致病因子以来，全世界的研究人员已经致力于开发控制该疾病特别是通过疫苗控制该疾病的多种方式。已经采用了几种策略，以便开发免疫原。其中，细胞培养中生长的灭活病毒疫苗、DNA疫苗和含有在改性的昆虫细胞中产生的病毒衣壳蛋白的亚单位疫苗引人注目(SilvaJunior,A.,Carvalho,O.V.,Bulos,L.H.S.,Fietto,J.L.R.,Moraes,M.P.,Almeida,M.R.Porcinecircovirus2:immunopathogenesisandrecentdevelopmentsinvaccines；Worldjournalvaccine，v.2，p.96-104，2012)。
圆环病毒衣壳的结构蛋白SEQIDNO:04由ORF2,SEQIDNO:03编码，并且近似分子量为28kDa和理论等电点(PI)为约10.7。通过与细胞表面上的受体的特异性相互作用，它是参与宿主免疫反应的最相关蛋白。它在其氨基末端部分(前41个氨基酸残基)具有核定位信号，具有大量的带正电荷的氨基酸残基，其中约40％是精氨酸残基。研究显示PCV-2的衣壳蛋白上存在的三个免疫原性表位能够产生中和抗体。这些包括第47至57位氨基酸序列、第165至200位氨基酸序列和从C末端数最后4个氨基酸残基(Lekcharoensuk,P.,Morozov,I.,Marsh,P.S.,Thangthumniyom,N.,Wajjawalku,W.,Meng,X.J.Epitopemappingofthemajorcapsidproteinoftype2porcinecircovirus(PCV2)byusingchimericPCV1andPCV2.JournalofVirology，V.78，p.8135-8145，2004)。
2001年由Liu和同事首次在大肠杆菌(Escherichiacoli)中生成PCV-2的病毒衣壳蛋白作为多肽链，与麦芽糖结合蛋白(MBP)和组氨酸尾-(MBP)-His8融合(Liu,Q.,Tikoo,S.K.,Babiuk,L.A.NuclearlocalizationoftheORF2proteinencodedbyporcinecircovirustype2，Virology，v.285，p.91-99，2001)。通过亲和色谱法纯化的这种重组蛋白与在先用PCV-2免疫的兔多克隆血清和来自被病毒感染的猪的血清特异性反应。
难以在大肠杆菌细胞中表达大量的PCV-2衣壳蛋白，这是由于核定位信号中的大量的精氨酸残基和存在从该有机体的稀有密码子合成的其它氨基酸残基。另一种规避PCV-2衣壳蛋白的低表达问题的方式是使用过量表达稀有密码子的t-RNA的细菌菌株，如BL21密码子-plus-DE3-RIL。优点是维持蛋白质的全部氨基酸残基(一级结构保守)，这确保了由核定位信号区中存在的表位产生抗体生成的可能性。不过，由多家企业销售或开发的其它细菌系统可用于表达。
目前，主要在两种系统中进行重组Cap-PCV-2表达：第一种使用重组杆状病毒感染的昆虫细胞，而另一种由转化的细菌系统中重组蛋白诱导组成。在后一种系统中，表达系统通常受到lac操纵基因的控制，从而其诱导通常通过添加异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至培养基进行。不过，存在几种由不同的企业销售的用于在细菌系统中表达的载体。因此，其它同源或异源启动子也可用作受阿拉伯糖调制的启动子。病毒样颗粒(VLP)是病毒衣壳的结构蛋白，以类似于野生型病毒颗粒的结构排列，形成其中缺少遗传物质的衣壳。这些非传染性颗粒由于存在病毒颗粒(病毒感染颗粒)的结构形式而具有高度免疫原性。因此，通过以类似于野生型病毒颗粒的方式刺激免疫系统，VLP在重组疫苗中的使用提高了所述疫苗的功效。已经在真核表达系统中(BucareyS.A.,Noriega,J.,Reyes,P.,Tapia,C.,Saenz,L.Zuniga,A.Tobar,J.A.Theoptimizedcapsidgeneofporcinecircovirustype2expressedinyeastformsvirus-likeparticlesandelicitsantibodyresponsesinmicefedwithrecombinantyeastextracts，Vaccine，v.27，p.5781-5790，2009)和在原核系统中(Lou,Z.Z.,Li,Z.Y.,Wang,G.,Li,J.Q.,Lan,X.,Li,X.R.,Yin,X.P.,Liu,J.X.,LiuS.D.ProkaryoticexpressionandpotentialapplicationofthetruncatedPCV-2capsidprotein.VirologicalSinica,v.25，p.86-97，2010)展示了PCV-2衣壳蛋白的形成VLP的能力。
本发明所使用的方法使用细菌系统。这能够在几小时的诱导中诱导的培养基产生每升数十毫克至数百毫克范围内的抗原量。不过，昆虫细胞中的表达系统需要数日以产生相同的量。另一个优点是与其生产相关的成本。细菌系统使用比昆虫细胞更廉价的诱导手段。然而，采用昆虫细胞的系统不需要表达浓缩和纯化抗原的后续步骤。不过，在本发明中，借助比较便宜的技术回收重组抗原供以后使用。
细菌系统的另一个可能的缺点是一旦采用原核系统，则衣壳蛋白中缺少转译后修饰/改性。然而，本发明显示当在细菌系统中表达时，病毒衣壳蛋白能够自我装配并促进生成形状和尺寸类似于野生型病毒颗粒的非传染性VLP，类似于对于真核系统中表达所观察到的情况。
另一个在产生含有PCV-2病毒衣壳蛋白的接种化合物中遭遇的难点是其在疫苗制剂中的量化。市场上的重组疫苗通常使用通过聚丙烯酰胺凝胶中密度测定法的量化技术，将标准蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)用作参照。在本申请中，利用抗PCV-2抗体对免疫原性蛋白进行量化。所述抗体与特定样品中存在的PCV-2衣壳蛋白特异性相互作用，并且由于抗体上的特定标记，出现与样品中存在的抗原的量成比例的信号生成(颜色、放射性活度等)。因此，在读取该产生的信号并通过与含有纯化重组蛋白的样品进行比较后进行量化。
在文献中描述了几种免疫反应的增强剂，并且根据本发明，可与本文所述的配方结合使用。优选水性佐剂如氢氧化铝或碳聚合物，如羧甲基纤维素，原因在于产生比油性佐剂更少的炎症和疼痛。
本发明开发的疫苗化合物可以按文献中描述的任何途径施用，优选地肌内给药施用。
在多个专利库内进行的检索中，找到了用于猪的免疫原产生过程领域的专利文献，不过这些专利均不使用与本专利的目的相关的产品或方法。在这项检索中，找到了2004年7月26日的发明名称为“VACCINEFORMULATIONS”的专利文献PI0412855-9，其涉及“在存在细菌悬液或病毒悬液的情况下(尤其对于浓缩及非纯化或弱纯化)具有增大的稳定性的新型油水乳剂”，其中描述了含有灭活PCV-2的溶液。本专利申请的目的不同于所述的专利，因为它聚焦于使用在细菌系统中产生的重组蛋白，此外还提出用于回收和量化该抗原的特别的新方法。
找到的另一篇申请是2006年9月8日的BRPI0615862-5，发明名称为“VACCINEPCV-2,AND,METHODFORMANUFACTURINGAVACCINE”，该申请是“一种抗猪圆环病毒(PCV-2)的疫苗和一种用于制造所述疫苗以使猪免遭PCV感染的方法”，其中发明人已开发了一种用于产生重组抗原的方法，优选在真核系统(昆虫细胞)中，以便规避病毒颗粒在培养的细胞中低回收的问题。与该专利相似，2005年12月29日的美国专利770028，发明名称为“PCV2immunogeniccompositionsandmethodsofproducingsuchcompositions”，描述了一种用于在诱导的细胞的上清液中改进的回收PCV-2重组衣壳蛋白的方法，在感染后约5天开始。相比之下，本发明提供了在几小时的诱导中产生数十毫克至数百毫克的蛋白质，在溶解并回收重组蛋白后。
在美国专利数据库中找到的另一文献是2009年12月11日的US8008001，发明名称为“PCV-2VACCINE”，其涉及一种通过施用含有至少20微克/剂量的PCV-2衣壳蛋白的疫苗使猪崽免受PCV-2感染的疫苗和方法。所述专利披露了真核表达系统(重组杆状病毒接种的昆虫细胞)的优选使用。该系统不同于本发明中提出的系统，如本文所述是使用细菌系统，用抗原回收和量化的新方法。
还在美国专利数据库中找到1999年3月12日的专利US6287856，发明名称为“Vaccinesagainstcircovirusinfections”，涉及保护免遭PCV感染的疫苗组合物。这些组合物是基于含有PCV多肽的编码序列的核酸载体，其中核酸缺少病毒复制起点，因此关于DNA疫苗，除本申请之外，其在大肠杆菌中产生抗原。
本专利申请的第一目的是在转基因的大肠杆菌中产生的纯化PCV-2重组衣壳蛋白作为疫苗抗原和诊断抗原。本专利申请的第二目的是由转基因的大肠杆菌产生的PCV2病毒样颗粒(VLP)作为疫苗抗原。两个目的均可用于由PCV-2所致感染的控制和预防规划。本申请的第三目的涉及抗PCV-2的重组疫苗，含有在转基因的大肠杆菌中产生的PCV2纯化的抗原或重组VLP或其变体，添加氢氧化铝作为佐剂。同样可用于由PCV-2所致感染的控制和预防规划。
本发明的另一目的是借助于产生的重组蛋白提供一种捕获ELISA试剂盒，用于在疫苗制剂中进一步量化。该技术的主要优点是易于执行和自动化、精确性、适应性和低成本。另外，所提出的捕获ELISA的主要优点是：样品不需要纯化，也不需要高浓度化验/测定，因为抗原由特异性抗体固定，使得该连接与这些蛋白质的浓度成正比，导致在需要量化的结果中更大的再现性。当用1升的溶液稀释时，可以检出非常低量(如50微克)的蛋白质。因此，由于其益处和便利性，该测定法成为在安全性测试和剂量-反应测定中用作参照的有力候选方法，以便验证根据需要调整，放行不同商业疫苗所要求的疫苗效能。
开发能够针对PCV-2感染产生保护作用的免疫原性化合物已经是控制PCVAD研究的总体框架内的定向搜索。在细菌系统中产生并以上文所述方式回收的PCV-2重组衣壳蛋白表明为潜在的免疫原。此外，替换作为诊断方法的检测和量化PCV-2的繁琐技术对于兽医诊断业而言是感兴趣的。因此，投资于生产和回收本文所述的重组抗原以便生产用于诊断和疫苗目的以及用于其它应用的目标化合物是非常有前景的。
附图说明
图1示出了1％琼脂糖凝胶的PCR产物的分析。M：100bpLadderDNAmarker；1、2、3和4：对应于扩增PCV-2的ORF2的DNA；C-：阴性对照(从不含PCV-2的SK6细胞提取的DNA)。
图2示出了1％琼脂糖凝胶的用EcoRI的质粒切割反应的分析，示出来自切割ORF2的400bp和316bp的条带。M：100bpLadderDNAmarker；1.1、1.2、1.4、1.6、和1.8：随机选择的白色菌落；1.9、1.10和1.11：阴性对照(蓝色菌落)。
图3示出了1％琼脂糖凝胶的采用EcoRI(泳道1)和采用XbaI(泳道2)的pCap-PCV2重组质粒切割反应的分析。M：100bpLadderDNAmarker。
图4示出了rCap-PCV-2表达的确认。15％SDS-PAGE凝胶(左)和通过蛋白质印迹法获得的硝酸纤维素膜(右)。M：分子量标记；C-：阴性对照(用空细菌表达质粒转化并用IPTG诱导的大肠杆菌提取物的可溶性部分)；和2：样品(用pCap-rPCV2转化并用IPTG诱导的大肠杆菌提取物的可溶性部分)。箭头指示与rCap-PCV-2相对应的约30kDa的条带。
图5示出了在纯化过程期间从可溶性部分获得的蛋白质(表达)谱。M：分子量标记；1：诱导的大肠杆菌提取物的可溶性部分；2：非相互作用性体积；3：用10％洗脱缓冲液洗涤；4：用20％洗脱缓冲液洗涤；5：用100％洗脱缓冲液洗脱。箭头指示纯化的rCap-PCV-2。
图6示出了由用不同硫酸铵饱和水平沉淀可溶性部分的过程所得级分的蛋白质谱。M：分子量标记；1：可溶性部分，2：级分0-20％，3：级分20％-40％，4：级分40％-60％，5：级分60％-80％，6：纯化的rCap。箭头指示rCap-PCV-2。
图7A、B和C示出了电子显微照片：通过rCap-PCV-2形成病毒样颗粒(VLP)。放大140000X(A和B)。放大250000X(C)。通过透射电子显微镜分析样品，使用formvar/碳覆盖的200目载网。VLP可以由箭头可见。
图8示出了样品稀释物：rCap-PCV-2：10mg/L至0.004883mg/L稀释物。候选疫苗：1:50至1:103,200稀释。来自阴性大肠杆菌的裂解物：1:50至1:103,200稀释。获得的等式是y＝0.875x+0.196(R2＝0,996)，其中y是OD492nm并且x是待检测蛋白质的浓度。
图9示出了通过间接ELISA测得的在接种之前和之后小鼠中rCap-PCV-2诱导的特异性体液反应。动物在第0天和第14天接种并且在第35天激发。候选疫苗接种的动物显示明显量的抗体，特别在第二次接种后。
图10示出在采样时间用商业疫苗1接种的动物的病毒血症的评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝5E+10e0.1847x表示。在接种后的一段时间期间不存在病毒载量的显著降低(R2＝0.1195)。
图11示出了在两个采样时间用商业疫苗接种的动物的病毒血症评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝2E+13e-1.323x表示。在接种后的一段时间期间不存在病毒载量的显著降低(R2＝0.5703)。
图12示出了在采集时间用候选疫苗以50pg浓度的剂量接种的动物的病毒血症评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝2E+12e-0.766x表示。在接种后的一段时间存在病毒载量的显著减少(R2＝0.9696)。
图13示出了在采集时间用候选疫苗以50μg浓度的两个剂量接种的动物的病毒血症评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝1E+12e-0,79x表示。在接种后的一段时间存在病毒载量的显著减少(R2＝0.9418)。
图14示出了在采集时间用候选疫苗以150μg剂量浓度接种的动物的病毒血症评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝2E+17e-4.106x表示。在接种后的一段时间不存在病毒载量的显著减少(R2＝0.7912)。
图15示出了在采集时间用候选疫苗以150μg浓度的两个剂量接种的动物的病毒血症评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝4E+13e-1,594x表示。在接种后的一段时间不存在病毒载量的显著减少(R2＝0.6673)。
图16示出了在采集时间未接种动物(阴性对照)的病毒血症评估。在垂直轴上显示病毒载量，在水平轴上显示4个采集阶段：21、63、105和154日猪龄。线性回归由式y＝2E+13e-1.304x表示。在接种后的一段时间不存在病毒载量的显著减少(R2＝0.7425)。
具体实施方式
分离和克隆猪圆环病毒衣壳蛋白的编码区
从MG,PonteNova地区受PCV-2折磨的猪组织样品分离出用于扩增衣壳蛋白编码区(ORF2)SEQIDNO:03的猪圆环病毒2(PCV-2)DNA。利用在5'末端插入NdeI酶限制性位点的正向寡核苷酸5'-CGCCATATGACGTATCCAAGGAGG-3'(正向)和在编码区的末端形成XhoI位点的反向寡核苷酸5'-CCCTCGAGTTAGGGTTTAAGTGGG-3'(反向)，通过聚合酶链反应(PCR)技术扩增ORF2。这些寡核苷酸由保藏在GenBank的巴西分离株PCV-2(DQ364650)的基因组序列构建。利用TaqDNA聚合酶5U/μL在热循环仪中进行DNA片段的扩增。扩增的样品贮存在-4℃并且通过水平电泳在1％琼脂糖凝胶上分析。在紫外光下在凝胶上用溴化乙锭0.4g/mL显示716bp的DNA片段，如图1中所示。
从琼脂糖凝胶纯化PCR产物。随后，将纯化的PCV-2ORF2克隆至扩增载体(-TEasy载体系统-PROMEGA)中。将如试剂盒制造商所指示获得的结合混合物添加至大约100μL的含有细菌大肠杆菌DH5α的溶液，其中事先使得所述细菌具有感受态(SambrookJ.,Russell,D.W.,MolecularCloning:Alaboratorymanual.3rded,ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，2001)，并且在冰中实施培育达30分钟。随后，细胞和质粒DNA的混合物受到在水浴中在42℃的热休克达1分钟，并再次在冰上达2分钟。随后，添加900μL的无抗生素的LB-Net(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；pH7.5)并将细胞在37℃以250rpm在轨道摇床中培育达2小时。将该混合物铺在含有氨苄青霉素(5至10mg/mL)的固态LB-琼脂培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，1.5％选择琼脂；pH7.5)上并且在37℃培育达12至14小时。
回收氨苄青霉素抗性克隆并用于通过PCR和酶测定从借助微型质粒制备法提取的质粒来确认含有感兴趣的基因的质粒的存在(SambrookJ.,Russell,D.W.,MolecularCloning:Alaboratorymanual.3rded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork，2001)。用限制性酶EcoRI进行酶测定，并且通过电泳法在1％琼脂糖凝胶中分析后续切割反应(图2)。按照与上述PCR相同的方式进行菌落的PCR，不过，借助无菌牙签添加转化子菌落的等分试样，替代来自感染组织的基因组DNA。还通过电泳法在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
利用PCR产物纯化试剂盒纯化获得的通过酶测定和菌落PCR确定含有病毒DNA的质粒样品，并且随后送至GenomicsLaboratory,BIOAGRO/UFV以便后续测序以确定载体的正确装配。测序反应基于双脱氧核苷酸(ddNTP)链终止技术(Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.DNAsequencingwithchain-terminatinginhibitors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，V.74，p.5463-5467，1977)。利用生物信息学软件将生成的序列编辑并装配成“重叠群”，随后相互比较，并且利用BLAST软件将序列保藏于theGenBank。ORF2的翻译序列在SEQIDNO:04描述。将含有该构建体的克隆在含有20％甘油的微量离心管中的LB-Net培养基内贮存并储存在-80℃。
转移猪圆环病毒2衣壳蛋白的编码区至细菌系统中的表达载体
在检验了载体中插入物的正确序列后，对pCapPCV-2质粒DNA样品SEQIDNO:03(扩增载体)进行酶测定，在酶测定中，特异性限制性位点用于将ORF2基因插入细菌表达载体(pET-16b-Novagen)，所述细菌表达载体受lacT7启动子控制并且具有在N末端编码10组氨酸尾的序列(用于通过与含镍树脂的亲和力进行纯化)。pCapPCV-2中的ORF2序列以及细菌表达载体用NdeI和XhoI消化。在切割后，利用T4DNA连接酶结合产物(消化的细菌表达载体和ORF2插入物(从扩增载体取出))。结合反应随后用来转化大肠杆菌DH5α；如上文所述。随机从菌落选出转化体克隆以识别具有插入物的质粒。为了克隆确认，进行菌落PCR，显示对于两组随机选择的菌落，位点定向克隆如预期那样进行，产生716bp的片段。选择阳性菌落并且每个菌落分别进行PCR。对于向重组质粒呈现近似大小为716bp的菌落，对PCAP-RPCV-2质粒SEQIDNO:01实施切割反应，以确认它们的正确方向。因此，分别从EcoRI消化和XbaI消化观察到718bp和472bp预期大小的条带，以及对应于质粒的剩余片段的高分子量(条带)(图3)。所获得的重组质粒被命名为PCAP-rPCV2并贮藏在含有15％-30％甘油的微量离心管中，并储存在-70℃。
表达猪圆环病毒2衣壳重组蛋白和对SDS-PAGE凝胶的分析
在TB1000mL(胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油4mL，磷酸二氢钾2.31g/L，和磷酸氢二钾12.54g/L)中以中等规模进行重组蛋白的完整表达。对此，将大肠杆菌菌株BL21-DE3-RIL密码子plus的感受态细菌用PCAP-rPCV2构建体以类似于用扩增载体所实施的方式转化。因此，大约20纳克的PCAP-rPCV2重组质粒被添加至100L的感受态细胞，并且混合物在冰上被培育达30分钟。随后，细胞混合物和质粒DNA在水浴中在42℃受到热休克达1分钟，并再次在冰上达2分钟。随后，添加900μLof无抗生素的LB培养基(细菌胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L和氯化钠10g/L)并将细胞在37℃以250rpm培育达2小时。细胞被百倍稀释(1:100)到含有氨苄青霉素50μg/mL的LB培养基并且在37℃和200rpm培育达12小时(预接种)。还在LB-Net，pH7.0，氯霉素17μg/mL中进行阴性对照(非转化的BL21细菌)的培养。细胞随后在含氨苄青霉素100μg/mL的TB液体培养基，pH7.0中1:100稀释，并且将培养物在30℃/250rpm培育大约3小时直至光密度(OD600)达到0.6-0.8。利用氯霉素17μg/mL对阴性对照进行相同的程序。在达到OD后，将培养物等分试样转移至新管，在新管中进行1、2、3、4和5小时诱导以便了解最佳诱导时间。测试的IPTG浓度是0.1、0.5和1mM，并且所用的温度是30℃和37℃，总是在剧烈搅拌和充分通气下进行。对于阴性对照，实施相同的程序。在每种条件下采集1mL样品，以10000xg离心达1分钟，弃去上清液，并且将细胞沉淀物贮存在-20℃以便通过SDS-PAGE进行分析。
为了纯化，在诱导期间观察到最佳产生时间(4小时)、温度(30℃)和IPTG浓度(0.25mM)，因此，诱导1升含有重组质粒pCap-rPCV2的正在生长的菌落。以最佳条件诱导后，将样品在4℃以10,000g离心达20分钟。弃去上清液并将细胞沉淀物贮存在-20℃。
融化从100mL体积的诱导的培养基得到的沉淀物并用裂解缓冲液(NaH2PO420mM；NaCl300mM，咪唑5mM，pH8.0)再悬浮到最终体积为大约2.5mL。向该缓冲液添加1mg/mL的溶菌酶，并且随后将样品在0℃培育达30分钟。用6个超声处理循环进行细胞裂解过程，每次200-300瓦特10秒，间隔10秒，并将管放在冰上以防止样品升温。通过在4℃以15000xg离心达30分钟，沉淀细胞残片和包涵体。将上清液(可溶性部分)被收集在新管中并用于纯化PCV-2重组衣壳蛋白，命名为rCap-PCV-2(SEQIDNO:02)。
在15％聚丙烯酰胺凝胶中分析样品(包括阴性对照)(SambrookJ.,Russell,D.W.,MolecularCloning:Alaboratorymanual.3rded，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork，2001)。在跑胶后，通过染色溶液(CoomassieBrilliantBlueR-2500.1％、乙酸9％、乙醇45％)显示凝胶。电泳运行确认了诱导的样品中存在大约30kDa的条带。该质量对应于由添加至组氨酸尾的PCV-2ORF2编码的蛋白质。通过蛋白质印迹技术实施表达确认(图4)。
纯化猪圆环病毒2重组衣壳蛋白和对SDS-PAGE凝胶的分析
在琼脂糖固定化镍树脂中借助亲和色谱法从可溶性部分纯化PCV-2病毒重组衣壳蛋白。所用的技术是“快速性能液相色谱”(FPLC)，通过载有镍的色谱柱用于纯化与组氨酸尾融合的重组蛋白。纯化借助于几个分析参数如线性流速、洗涤体积及洗脱体积、和咪唑浓度及脲浓度被标准化。在纯化后，将含有蛋白质的溶液在50个体积的含有300mMNaCl的50mMpH7.2的碳酸盐缓冲液中透析3次总计9小时(三小时透析)。在15％聚丙烯酰胺凝胶上如前文所述分析全部纯化步骤的样品。蛋白质被成功纯化并且可以在图5中见到。
rCap-PCV-2浓度估计
可以利用Bradford描述的方法确定纯化和透析的PCV-2病毒衣壳重组蛋白的量(Bradford,M.M.,1976,ArapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingthePrincipleofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry，V.72，p.248-254，1976)。通过线性回归进行计算，其中从测试的BSA稀释物的光密度值的最佳拟合获得等式y＝0.3267+0,0108x。
通过用硫酸铵沉淀回收猪圆环病毒2衣壳重组蛋白以及制备疫苗化合物和病毒样颗粒(VLP)的形成验证
对此，向含有rCap-PCV-2的可溶性部分添加量足以形成20％饱和度(至0°)的Na2SO4，并且随后，将样品在冰上以100rpm培育达30分钟。接着，将蛋白质提取物在0℃以15,000xg离心达20分钟。在离心结束时，收集上清液并将沉淀物重悬于相同体积的含有300mMNaCl的pH7.0碳酸盐缓冲液中(硫酸铵0-20％的蛋白质级分)。向上清液添加量足以形成40％饱和度的Na2SO4，从该盐溶液的初始20％饱和度开始。随后，重复在冰上培育和搅拌和离心步骤以获得饱和度20％-40％、40％-60％和60％-80％的硫酸铵级分。这些级分在含有300mMNaCl的pH7.0碳酸盐缓冲液中透析并且随后贮存在4℃达最长两天，以便通过SDS-PAGE(图6)、蛋白质印迹法和捕获ELISA分析。每种疫苗使用1mL剂量的佐剂氢氧化铝凝胶(OMEGA-ChemicalsInc.)。
为了VLP验证，对蛋白质印迹法呈阳性结果的来自CsCl梯度的(多个)级分分别对500mL碳酸盐缓冲液(300mMNaCl，50mM碳酸盐，pH7.0)透析2次，每次达4小时。将大约10μL的各级分添加至formvar/碳覆盖的200目载网并且允许在室温放置1分钟。随后，用滤纸移除过多的样品，并且将一滴2％乙酸双氧铀添加在每个载网中并且允许作用1分钟。用滤纸移除过多的该造影剂，并将载网留在干燥器中达2日。在透射电子显微镜上进行分析并且拍摄影像(图7A、B和C)。
通过捕获ELISA量化PCV2疫苗抗原
在这个ELISA测定中，将兔中产生的抗rcap-PCV-2抗体沉淀并用作捕获和检测抗体，后者与过氧化物酶缀合。在标准化中，最佳抗原浓度是0.625g/mL，捕捉抗体的最佳稀释度是15μg/mL，并且过氧化物酶缀合的检测抗体为1:800。全部过程均按照Checkerboard法进行(CrowtherJ.R.ELISA.TheoryandPractice.MethodsinMolecularBiology，V.42，p.1-223，1995)。在优化了捕获ELISA工作条件后，rCap-PCV-2的浓度用于通过线性回归构建标准曲线(y＝0.196+0,875x)(图8)。通过计算吸光度值的均值进行标准曲线的构建，其中在覆有捕获抗体(0.625g/mLof浓度)的96孔微板中，以2为基数从蛋白质的连续稀释(从5mg/L开始至0.0048mg/L)获得所述吸光度值。测定法的工作范围定义为曲线的线性区域，其中相关系数R2＝0.996。因此，7点校正自rCap-PCV-20.625-0.0391mg/L，对应于线性回归分析的结果。
为了量化疫苗化合物中的蛋白质，使用0.6g的沉淀物，等同于100mL的用pCap-2-RPCV重组质粒转化的大肠杆菌的细胞诱导培养基，其中所述重组质粒含有与PCV-2的ORF2相对应的基因，并用IPTG诱导以便产生重组蛋白。作为阴性样品，使用相同量的用空细菌表达载体转化的细胞的提取物。将这些细胞的沉淀物融化并重悬于2mL裂解缓冲液(NaH2PO420mM；NaCl300mM，咪唑5mM，pH8.0)中。向裂解缓冲液添加溶菌酶1mg/mL、1mMPMSF并且随后在冰上培育达30分钟。用6个超声处理循环进行细胞裂解的过程，每次200-300W10秒，间隔10秒，并且将管放在冰上以防止样品升温。通过Holden和同事(公开的方法)确定候选疫苗中rCap-PCV-2的未知浓度(Holden,L.,Faeste,C.K.,Egaas,E.QuantitativeSandwichELISAforthedeterminationoflupine-lupinusspp.infoods，JournalofAgricultureFoodChemistry，V.53，p.5866-5871，2005)，其中进行疫苗连续稀释并且将OD492nm值与标准曲线的线性部分的中点最接近的稀释度用来计算疫苗中蛋白质的浓度。因此，在计算样品稀释因子后，候选疫苗中rCap-PCV-2(SEQIDNO:02)的浓度是0.73mg/mL。
展示性实验
小鼠中的实验
将多只五周龄雌性小鼠如下分成4个组，每组5只动物：一组用开发的候选疫苗(硫酸铵0-40％透析的蛋白质沉淀)；一组用纯化的rCap-PCV-2；一组用磷酸盐缓冲液PBS(阴性对照)接种；和，一组用抗猪圆环病毒的商业疫苗(阳性对照)接种。在用候选疫苗接种的组、用纯化蛋白质接种的组和用PBS接种的组中，添加氢氧化铝用作佐剂，例外的是用商业疫苗接种的动物。动物通过腹膜腔内注射被接种2次(两个剂量)，其中剂量之间间隔是14天。在候选疫苗接种的组中和在纯化蛋白质接种的组中接种的rCap-PCV-2的量对于第一次剂量是30μg，而第二次是15μg。在接种后0、14、28和35天时间通过眼窦穿刺法采集血液样品以进行血清分析。在激发后14天使动物安乐死。遵循巴西动物实验学会(COBEA)所采用的动物实验的所有伦理原则(CertificateofEthicsforAnimalUse(CEUA)/UFV，CaseNo054/2011)。
通过间接ELISA技术进行体液免疫反应的评价。通过Checkerboard滴定法评价rCap-PCV-2抗原的最佳工作浓度和血清(第一抗体)的最佳稀释度(CrowtherJ.R.ELISA.TheoryandPractice，MethodsinMolecularBiology，V.42，p.1-223，1995)。确定最佳抗原(rcap-PCV-2)浓度分别为0.156μg/孔和1:4,000，用于该PCV-2阳性小鼠血清。
用候选疫苗接种的小鼠显示与对用商业疫苗接种的小鼠所获得的相似水平，尤其在第二次疫苗剂量后(图9)，可能是由于VLP的存在(图7)和所用的佐剂浓度。
猪中的实验
来自标准商业农场的21日龄猪用候选疫苗接种并与商业疫苗比较。评价在猪中含有PCV-2(rCap-PCV-2)病毒衣壳重组蛋白的疫苗化合物的抗原潜力。对此，使用来自PonteNova地区,MG的商业农场的140头大约21日龄的猪。遵重农场采用的管理实施实验。遵循DepartmentofVeterinaryMedicineDVT/UFV的StandardsofConductfortheuseofAnimalsinTeaching,Research,andExtension，注册号37/2012进行这项现场研究。
将这些动物分成7组，每组20只动物。组1和组2用商业疫苗根据制造商的推荐接种。将组3和组4用含有50μg的重组蛋白的商用候选者接种，其中组3的动物在21日龄接受一次剂量，而组4的动物在21日龄和35日龄接受两次剂量。相比之下，组5和组6用含有150μg的重组蛋白的候选疫苗接种，分别使用一次和两次剂量，按照与组3和组4相同的接种方案。组7(对照组)用磷酸盐缓冲液(PBS)接种。所有免疫接种均通过肌肉注射途径进行。从最初适应期至屠宰日采集血样，用于病毒载量量化。在动物的第21、63、105和154生活日采集血样。利用商用提取试剂盒进行总DNA提取。通过PCR实时按照Silva等人所述的方案进行所采集的血清中的PCV-2病毒载量的量化(Silva,F.M.F.,SilvaJr.,A.,VidigalP.M.,OliveiraC.R.,Viana,V.W.,Silva,C.H.O.,Vargas,I.,Fietto,J.L.R.,Almeida,M.R.PorcineCircovirus-2ViralLoadversusLesionsinPigs:PerspectivesforPost-weaningmultisystemicWastingSyndrome，JournalofComparativePathology，v.144，p.296-302，2011)。反应按一式三份进行并且所有分析的Ct(阈值循环)代表来自每个样品的Ct平均数，因此，由每个样品的Ct平均数，可计算每个组和每次采集的平均和标准偏差。通过指数回归分析，求得的均值用于病毒载量的递降趋势评估。统计上，在商业疫苗1和2中未观察到病毒载量降低趋势/递降趋势(图10和图11)。在组3和组4中分别在统计上证实了病毒载量的降低(rCap-PCV250μg，一次和两次剂量)，R2＝0.96和R2＝0.94(图12和图13)，其中从第三周的分析存在向下趋势。组5和组6(rCap-PCV2，150μg-一次和两次剂量)没有显示在统计上病毒载量的可容许的递降趋势(分别为R2＝0.7184和R2＝0.638-图14和图15)。阴性对照组显示没有病毒载量在统计上的递降趋势(图16)。
结论
目前，在兽医市场，真对PCV-2的商业疫苗由外国企业销售，并且它们在巴西以外生产，因此疫苗批次具有进口成本。本发明的疫苗抗原可用于在常规猪养殖体系中PCV-2相关疾病防治规划的动物的接种，并且代表了商用疫苗的替代品。ELISA试剂盒可用于PCV-2疫苗抗原的量化，可用于对商业疫苗和/或实验疫苗的质量保证测试。

Claims (8)

1.一种猪圆环病毒2的重组抗原，其中，它是SEQIDNO:02。
2.根据权利要求1所述的重组抗原，其中，它包含位于PCV-2重组衣壳蛋白的氨基末端区的10个组氨酸残基。
3.根据权利要求1和2中任一权利要求所述的重组抗原作为PCV-2的病毒样颗粒(VLP)，其中，它包含SEQIDNO:02的寡聚化产物。
4.一种疫苗制剂，其中，它包括如权利要求1和2中限定的纯化抗原，或如权利要求3中限定的VLP，与可药用佐剂结合，尤其是与氢氧化铝结合。
5.一种ELISA捕获型诊断试剂盒，其中，它包含如权利要求1和2中限定的SEQIDNO:02，和抗SEQIDNO:02抗体。
6.权利要求1、2和3所限定的抗原的应用，其中，它应用于生产诊断试剂盒和生产疫苗化合物，并且不限于这些用途。
7.权利要求4所限定的疫苗制剂的应用，其中，它用于控制与PCV-2相关的疾病。
8.权利要求5所限定的诊断试剂盒的应用，其中，它用于PCV-2的衣壳蛋白量化，尤其在疫苗制剂中。
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