KR20110128267A

KR20110128267A - 신규 돼지 시르코바이러스 2비 형 분리물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20110128267A
Application number: KR1020117014851A
Authority: KR
Inventors: 졸탄 펜제즈; 페렌츠 미사; 타마쉬 투볼리; 아틸라 차골라
Original assignee: 세바 상뜨 아니말르
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2011-11-29
Also published as: EA201100862A1; US20120040438A1; WO2010061000A1; US8703468B2; EP2367933A1

Abstract

본 발명은 짧은 서열 복제물을 포함하고 세포 배양에 적용되고 10⁶TCID₅₀바이러스 /mL까지의 높은 역가로 일정하게 증식가능한, 신규 돼지 시르코바이러스 2 형 아형 B (PCV2B-Rm) 분리물에 관한 것이다. 상기 신규 분리물은 특히 돼지 시르코바이러스 2 형 (PCV2) 백신의 생산, 돼지 시르코바이러스 수반 질병의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단뿐만 아니라 돼지 내의 돼지 시르코바이러스 존재를 진단하는 데 유용하다. 본 발명은 또한 PCV2 증식에 유용한 돼지 고환(ST)로부터 유래된 신규 세포클론 및 PCV2 바이러스를 높은 역가로 생산하기 위한 방법을 제공한다.

Description

신규 돼지 시르코바이러스 2비 형 분리물 및 이의 용도{NOVEL PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2B ISOLATE AND USES THEREOF }

본 발명은 높은 역가로 생산 가능한 아형(subtype) B로부터 유래된 신규 돼지 시르코바이러스 타입(type) 2 분리물에 관한 것이다. 상기 신규 분리물(isolates)은 PCV2 백신의 효율적인 생산에 유용하다. 본 발명은 또한 PCV2의 복제 역가를 증가시키기 위한 큰 유전자간 영역에서의 변이체(mutation) 및 고역가로 증식하는 PCV2에 적용되는 신규 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 PCV2 수반 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법, 돼지 백신화(vacination), 및 PCV2 백신화 또는 진단 키트(kit)에 관한 것이다.

돼지 시르코 바이러스(Porcine circovirus; PCV)는 돼지 신장 세포 배양물(PK15 ATCC CCL-33)의 오염체로서 처음에 동정되었다. PCV 비리온(virion)은 정20육면체 구조의 약 1.76 kb 크기의 단일-가닥 선형 DNA(single-stranded circular DNA)을 갖는 외피 비보유성 바이러스이다. PCV는 시르코바이러스 과(Circoviridae family)에 속하는 시르코바이러스속(genus Circovirus)으로 분류되고 이는 앵무새 부리 및 깃털 질병 바이러스(psittacine beak-feather disease virus), 거위 시르코바이러스(goose circovirus), 카나리 시르코바이러스 (canary circovirus), 및 비둘기 시르코바이러스(pigeon circovirus)과 같은 동물 시르코바이러스로 구성된다. PCV의 2가지 유전형이 밝혀졌다. PK15 세포-유래 PCV는 돼지에 비병원성으로 여겨지고 PCV 1형 (type 1) (PCV1)으로 명명된다. 다른 한편, PCV 2 형(type 2) (PCV2)은 몇 개의 돼지 질병과 관련된 주요 감염제로서 받아 들여 졌다. PCV2 수반 질병은 전세계의 양돈업자들에 심각한 경제적 손실을 유발한다. PCV2 수반 질병에 대한 검토내용은 국제특허 WO2007/076520에 개시되고 예를 들어, 이유후 전신성 소모성증후군(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS), 돼지 피부염 신증증후군(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome; PDNS), 돼지 호흡기질병복합체(Porcine Respiratory Disease Complex; PRDC), 번식장애(reproductive disorders), 육아종성 장염(granulomatous enteris), 돼지 삼출성 표피염(exsudative epidermitis), 괴사성 림프절염(necrotizing lymphadenitis), 및 선천성진전(congenital tremors) 등을 포함한다. PCV2 아형(subtype) A (PCV2A) 및 PCV2 아형 B (PCV2B)의 발생은 특히 2000년 서유럽에서 2003년 중앙 유럽에서 보고되었다. 특히 매우 유사한 변이체가 2008년에 맷돼지에서 보고되었다.

Circovac^®(Merial), Ingelvac^®CircoFLEX (Boehringer Ingelheim Vetmedica), Suvaxyn^®PCV2 (FortDodge) 등과 같은 최근 개발된 PCV2 백신들은 불활화 PCV2A, 또는 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터에 의한 PCV2A의 ORF2 유전자의 발현으로 기반한 것들이다.

따라서, 모든 PCV2 수반 질병에 대하여 광범위하게 효과적인 치료제가 될 수 있는 PCV2 백신을 개발할 필요성이 있다. 그러나, 최근 PCV2 계통(strains) 아형A 또는 B는 몇가지 무기력증을 유발한다. 특히, PCV2 바이러스는 일반적으로 10⁵TCID₅₀ 바이러스 입자(viral particles)/mL 이하의 낮은 역가로 생산될 뿐만 아니라, 조직배양물 및 영구적으로 감염된 세포주에서는 생존을 유지할 수 없다.

본 출원인은 조직 배양물에서의 PCV2 높은 역가의 성장 및 생존유지와 같은 지금까지의 개발된 PCV2 백신들의 주요 문제를 해결할 수 있는 아형 B에 속하는 신규 PCV2 분리물(isolate)을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 측면은 신규 돼지 시르코바이러스 (Porcine Circovirus) 2 형 B 아형 (PCV2B) 분리물(isolate)을 제공한다. 신규 PCV2B 분리물은 PCV2B-Rm으로 명명하고, 보다 높은 수율의 복제로 세포 배양물에서 성장하도록 적용되었다.

본 발명의 두 번째 측면은 면역학적으로 유효량의 PCV2 바이러스 또는 PCV2 항원을 포함하는 PCV2 백신 및 PCV2 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 세 번째 측면은 상기 첫 번째 측면의 PCV2 바이러스의 뉴클로레오티드 서열로서의 짧은 서열 복제물을 포함하는 뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence), 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터(vector) 또는 세포 및 배양 세포 주에서 PCV2 바이러스 복제 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 네 번째 측면은 상기 두 번째 측면의 PCV2 백신을 투여함을 포함하는 PCV2 감염에 대하여 돼지(pig), 돈(swine), 자돈(piglet)과 같은 PCV2 수반 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다섯 번째 측면은 돼지에서 PCV2 바이러스 존재를 탐지하는 탐지방법, 이를 위한 시약, 진단 키트(diagnostic kit) 및 진단 시험법(diagnostic test)을 제공한다.

본 발명의 여섯 번째 측면은 본원에서 ST1D 및 ST6B으로 명명되는 돼지 고환 (ST) 유래 신규 세포주들을 제공한다. 이러한 신규 세포주들은 신규 PCV2B 분리물뿐만 아니라 기타 PCV2 바이러스를 제조하는데 유용하다. 이러한 측면은 또한 높은 역가를 갖는 PCV2B-Rm 를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본원에서 정의되는 용어 "PCV2 백신(vaccine)"은 PCV2 바이러스에 대하여 돼지 면역계를 자극하는 데 사용가능한 시약(agent)을 포함한다.

본원에서 정의되는 용어 "면역화(immunization)"은 객체에 면역원(immunogen)을 전달하는 공정을 포함한다. 예를 들어, 상기 면역화는 T-임파구가 돼지와 같은 면역화된 비인체 동물에서 병원체를 죽이거나 제어할 수 있으며, 이는 동물에게 이미 이전에 노출된 병원체 또는 항원에 지향하는 것이다.

따라서 본 발명의 첫 번째 측면에 따라, 본 발명은 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 미생물기탁기관(The Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; “CNCM”, Institut Pasteur, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 프랑스)에 2008. 11.27자로 기탁되고 기탁번호(accession number CNCM I-4094)를 갖는 신규 돼지 시르코바이러스 2 형 B 아형 (PCV2B)에 관한 것이다. 상기 신규 PCV2B 분리물(isolate)은 PCV2B-Rm로 명명하였다. PCV2B-Rm 은 세포 배양물에서 성장하도록 적용되고 야생형(wild-type) PCV2 바이러스와 비교시 높은 역가로 생산가능한 것이다. 상기 PCV2B-Rm 은 10⁶TCID₅₀ 바이러스 입자(viral particles)/mL까지, 10⁵내지 10⁶TCID₅₀ 바이러스 입자/mL 이상 일정하게 높은 역가로 생산 가능하다. 바람직하게는, 상기 PCV2B-Rm 은 10⁷TCID₅₀ 까지 및 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/mL까지의 높은 역가로 제조가능하다. 가장 바람직하게는, 상기 PCV2B-Rm 은 10⁵내지 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/mL, 또는 10⁶내지 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/ mL, 또는 10⁷내지 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/mL의 역가로 제조 가능한 것이다.

이러한 복제의 높은 수율은 상기 PCV2 아형(subtype) B 바이러스 게놈 (genome)의 큰 유전자간 영역에서의 짧은 복제물 서열(duplication sequence) 존재에 적어도 일부 기인한 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 상기 복제물 서열은 큰 유전자간 영역( intergenic region)에 삽입된 서열번호 3(SEQ ID NO: 3)에서 개시된 11개 염기쌍 복제물 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 PCV2B-Rm 은 분리된 형태(isolated form)로 제공되는 것이다. 본원에서 정의되는 “분리된(isolated)"은 야생형 바이러스의 자연환경과는 상이한 데에 존재하는 PCV2B-Rm으로 지칭하는 것으로 의미되는 것이다. 예를 들어, 상기 바이러스는 세포배양물 또는 기타 증식될 수 있는 인공 배양물의 구성요소; 구성요소(component) 또는 세포 배양물 상등액(cell culture supernatant); 약학 조성물(pharmaceutical composition)의 구성요소; 또는 이의 자연적 환경으로부터 부분적 또는 완전하게 정제된 형태일 수 있다.

이러한 신규한 분리물은 예를 들어 증식 또는 항원, 불활화 또는 약독화 바이러스와 같은 전체 항원, 또는 바이러스 일부 또는 이들의 면역성 펩티드(immunogenic peptide)와 같은 서브유니트(subunit)의 생산을 위한 PK/15 세포 또는 기타 임의의 기타 적절한 세포주에서 생산가능하다. 바람직하게는 PCV2B-Rm은 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 미생물기탁기관(The Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; “CNCM”, Institut Pasteur, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 프랑스)에 2008. 11.27자로 기탁되고 기탁번호(accession number I-4093 및 CNCM I-4092)를 각각 갖는 각각 ST1D 및 ST6B으로 명명된 돼지 고환(Swine testicles; ST) 유래의 신규 적용된 세포주에서 생산되는 것이다.

본 발명의 두 번째 측면에 따라, 본 발명은 숙주 동물에서 특이적인 면역 반응을 유도하는, 신규 시르코바이러스 분리물 및 PCV2 백신으로부터 유래한 항원(antigen) 또는 면역원(immunogens)에 관한 것이다. 상기 PCV2 백신은 전체 PCV2-Rm, 이의 사균, 불활화 형태, 서브유니트(subunit) 또는 이의 일부, 면역원성 특성을 갖는 삽입물(insert)을 포함하는 제조합 벡터(recombinant vector), 면역반응을 유도가능한 DNA 일부(piece) 또는 단편(fragment), 단백질(protein), 폴리펩티드(polypeptide), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 상기 PCV2 백신 조성물은 당업계에 잘 알려진 표준 기법에 따라 제조가능하다.

PCV2 백신은 불활화 상태(inactivated state)에서 신규 시르코바이러스 분리물에 기반할 수 있다. 불활화 바이러스를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 불활화(Inactivation)는 상기 바이러스를 포름알데히드(formaldehyde), 파라포름알데히드(paraformaldehyde), b-프로피오락톤(propiolactone), 에틸렌이민(ethyleneimine), 비너리 에틸렌이민(binary ethyleneimine; BEI), 티로메살(thimerosal), 또는 이의 유도체와 같은 화학 시약을 노출시켜 수행가능하다. 호환적으로, 불활화는 열처리법(heat treatment) 또는 초음파법(sonication)과 같은 물리적 처치법으로 수행가능하다. 불활화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 불활화 병원체는 통상의 농축기법, 특히 한외여과법 및/또는 통상의 정제 수단에 의한 정제법, 특히, 이에 제한되지는 않으나, 겔-여과법(gel-filtration), 당경사법(sucrose gradient) 상의 초원심분리법(ultracentrifugation) 또는 특히 PEG에서의 선택적 침전법(selective precipitations)을 포함하는 크로마토그래피법(chromatography)을 이용한 통상의 정제 수단을 통하여 농축가능하다.

본 발명의 PCV2 백신은 약학적으로 허용가능한 담체에서의 면역학적으로 유효한 양의 상기 시르코바이러스 또는 상술한 바의 면역원(immunogen)을 포함하는 것이다.

면역학적으로 유효한 양의 PCV2 백신으로의 백신화를 수행하면, 돼지들은 PCV2 감염에 적어도 일부 또는 완전하게 면역화되거나 중등 또는 중증의 PCV2 감염 발전을 방지할 수 있다. PCV2 백신은 체액성(humoral) 및/또는 세포성 반응을 유발하는데 사용가능하다.

PCV2 감염증 또는 수반되는 질병으로는 그중에서도 이유후 전신성 소모성증후군(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS), 돼지 피부염 신증증후군(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome; PDNS), 돼지 호흡기질병복합체(Porcine Respiratory Disease Complex; PRDC), 번식장애(reproductive disorders), 육아종성 장염(granulomatous enteris), 돼지 삼출성 표피염(exsudative epidermitis), 괴사성 림프절염(necrotizing lymphadenitis), 및 선천성진전(congenital tremors) 등을 포함한다. 바람직하게는, 돼지와 같은 비인체 동물 객체가 PCV2 감염증의 모든 부작용 증상 또는 효과가 유의적으로 감소되거나, 경감되거나 또는 모두 차단되는 정도로 보호되는 것이다.

또한 본 발명은 PCV2 감염증 및 수반 질병을 치료하기 위하여 PCV2 아형(subtypes) A 및 B 조합을 포함하는 PCV2 백신의 조합에 관한 것이다 [Gupi P. S. Nayar et al. (Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385387) and Clark E. G. (Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499501)].

실무상, 면역학적으로 효과적인 용량에 요구되는 정확한 양은 객체의 연령 및 전반적 상태, 제형의 특성 및 투여경로와 같은 인자에 의존하여 객체들에 변화 가능하다. 적절한 "효과적인 양(effective amount)"은 당업자가 단지 통상적인 실험법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 비 인체 동물 객체의 체중에 기초로 한 최소 유용 용량, 백신 및 기타 전형적인 인자들의 농도를 확인하기 위한 적당한 용량의 PCV2 백신을 측정하거나 또는 적정하기 위한 방법들이다. 적절한 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 백신의 용량, 이의 구성요소 농도 및 백신 투여시점은 예를 들어, ELISA와 같은 항체 적정법(antibody titration) 및/또는 혈청중화 측정 분석법(seroneutralization assay)및/또는 백신화 도전 평가법(vaccination challenge evaluation)과 같은 방법에 의하여 결정가능하다.

본 발명에 따른 PCV2 백신은 특히 상술한 바대로 10⁵내지 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/mL 범위로 포함하는 PCV2B 조성물로부터 제형화되는 것이 유리하다.

PCV2 백신은 당업계 공지된 바와 같이, 투여경로에 따라, 약학적으로 허용가능한 담체(carriers), 부형제(excipients), 희석제(diluents), 보조제(adjuvants), 동결건조 안정화제(freeze drying stabilizers), 가습화제(wetting) 또는 현탁화제(emulsifying agents), pH 완충제(buffering agents), 겔화 (gelling) 또는 점증제(viscosity enhancing additives), 및 방부제(preservatives) 등과 같은 기타 성분을 추가로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체(carriers), 부형제(excipients), 또는 희석제diluents)의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 탈미네랄 처리(demineralised) 또는 증류수; 식염 용액(saline solution); 땅콩 오일(peanut oil), 땅콩기름 오일(arachis oil), 홍화유(safflower oil), 올리브 오일(olive oil), 면실유 (cottonseed oil), 옥수수 오일(maize oil), 참깨 오일(sesame oil) 또는 코코넛 오일(coconut oil)과 같은 식물 유래 오일(vegetable based oils); 메틸 폴리실록산(methyl polysiloxane), 페닐 폴리실록산(phenyl polysiloxane) 및 메틸페닐 폴리실록산(methylphenyl polysolpoxane)등과 같은 폴리실록산(polysiloxane)을 포함하는 실리콘 오일(silicone oils); 휘발성 실리콘(volatile silicones); 경질 액체 파라핀 오일(light liquid paraffin oil), 또는 중성 액체 파라핀 오일(heavy liquid paraffin oil)과 같은 광물성 오일(mineral oil); 스쿠알렌(squalane); 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose),카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) 나트륨 염, 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose)과 같은 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives); 에탄올(ethanol) 또는 이소-프로판올(iso-propanol)과 같은 저급 알칸올(alkanols); 저급 아르알칸올(lower aralkanols); 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 1,3- 부틸렌 글리콜(butylene glycol) 또는 글리세린(glycerin) 등과 같은 저급 폴리알킬렌 글리콜(lower polyalkylene glycols) 또는 저급 알킬렌 글리콜(lower alkylene glycols); 이소프로필 팔미테이트(isopropyl palmitate), 이소프로필 미리스테이트(isopropyl myristate) 또는 에틸 올레이트(ethyl oleate)과 같은 지방산 에스테르 (fatty acid esters); 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone); 한천(agar); 카라기난(carrageenan); 검 트라가칸트(gum tragacanth) 또는 검 아카시아(gum acacia), 및 페트롤레움 젤리(petroleum jelly)을 포함한다. 전형적으로, 상기 담체(carrier) 또는 담체들은 상기 백신 조성물 중량의 10% 내지 99.9%로 포함되고 소듐 히드로겐 포스페이트(sodium hydrogen phosphate), 소듐 디히드로겐포스페이트(sodium dihydrogen phosphate), 포타슘 히드로겐 포스페이트(potassium hydrogen phosphate), 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 이의 혼합물 및 유사체와 같은 공지된 시약을 이용한 통상적인 방법으로 완충화 가능하다.

보조제(adjuvants)의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 수산화 알루미늄(aluminium hydroxide; alum), 면역자극 복합체(immunostimulating complexes), 비이온성 블록 중합체(non-ionic block polymers) 또는 공중합체(copolymers), 시토킨(cytokines) (like IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFN-y 등과 같은), 사포닌(saponins), 모노포스포릴 지질(monophosphoryl lipid A; MLA), 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptides; MDP) 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 기타 가능한 보조제로는 예를 들어, 알루미늄 포타슘 설페이트(aluminium potassium sulphate), 대장균(Escherichia coli), 콜레라 톡신(cholera toxin) 또는 이의 B 서브유니트(subunit), 디프테리아 톡신(diphtheria toxin), 테타누스 톡신(tetanus toxin), 백일해 톡신(pertussis toxin)으로부터 분리된 내열성(heat-labile) 또는 열-안정성(heat-stable) 내독소(enterotoxin), 프러운트(Freund's) 불완전(incomplete) 또는 완전(complete) 보조제(adjuvant) 등을 포함한다. 디프테리아 톡신(diphtheria toxin), 테타누스 톡신(tetanus toxin) 및 백일해 톡신(pertussis toxin)과 같은 독소-기반 보조제(Toxin-based adjuvants)는 예를 들어, 포름알데히드(formaldehyde)로의 처치법에 의하여 사용 전에 불활화시킬 수 있다.

동결 건조 안정화제(freeze-drying stabilizer)의 예로는 예를 들어, 소르비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 전분(starch), 수크로스(sucrose), 덱스트란(dextran) 또는 포도당(glucose)등과 같은 탄수화물(carbohydrate), 알부민(albumin) 또는 카제인(casein)과 같은 단백질 및 이들의 유도체일 수 있다.

PCV2 백신은 추가적으로 예를 들어 아티노바실러스 플루로뉴노미아(Actinobacillus pleuropneunomia); 아데노바이러스(Adenovirus); 동부 말 뇌척수염 바이러스 (Eastern equine encephalomyelitis viruses)와 같은 알파바이러스(Alphavirus); 발란티디움 콜리(Balantidium coli); 보르텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica); 브라키스피라 종(Brachyspira spp.), 바람직하게는 B. 히오디엔테리아(hyodyentheriae), B. 필로시콜리(pilosicoli), B. 이노센스 (innocens), 브루셀라 수위스(Brucella suis), 바람직하게는 비오바르스(biovars) 1, 2 및 3; 고전적 돼지 발열 바이러스(Classical swine fever virus), 아프리카 돼지 발열 바이러스(African swine fever virus); 클라미디어(Chlamydia) 및 클라미도필라 종(Chlamydophila sp.) 및 바람직하게는 C. 페코럼(pecorum) 및 C. 아보투스(abortus); 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 바람직하게는 Cl. 디피실(difficile), Cl. 페르프링겐(perfringens) 형(types) A, B 및 C, Cl. 노비(novyi), Cl. 셉티쿰(septicum), Cl. 테타니(tetani); 소화기(Digestive) 및 기관지(respiratory) 코로나바이러스(Coronavirus); 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum); 에이메리아 종(Eimeria spp); 미코플라즈마 하에모수위스(Mycoplasma haemosuis)로 현재 지칭되는 에페리쓰로주니스 수위스(Eperythrozoonis suis); 에리시펠로쓰릭스 류시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae); 대장균 (Escherichia coli); 해모필루스 파라수위스(Haemophilus parasuis), 바람직하게는 아형 1, 7 및 14; 혈구응집 뇌척수염 바이러스(Hemagglutinating encephalomyelitis virus); 이소스포라 수위스(Isospora suis) ; 일본 뇌척수염 바이러스 (Japanese Encephalitis virus); 노소니아 인트라셀루라리스 (Lawsonia intracellularis); 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 바람직하게는 렙토스피라 오스트랄리스(Leptospira australis), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로해모라지카에(Leptospira icterohaemorrhagicae), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 포모나(Leptospira Pomona) 및 렙토스피라 타라소비(Leptospira tarassovi); 만하이미아 해몰리티카(Mannheimia haemolytica) ;미코박테리움 종(Mycobacterium spp). 바람직하게는, M. 아비움(avium), M. 인트라셀룰라레(intracellulare) 및 M. 보비스(bovis): 미코플라스마 히포뉴모니아에(Mycoplasma hyponeumoniae); 파르보바이러스(Parvovirus); 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida); 포신 시토메골로바이러스 (Porcine cytomegolovirus); 포신 파로바이러스(Porcine parovirus), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus): 슈도라비에스 바이러스(Pseudorabies virus); 로타바이러스(Rotavirus); 사지야마 바이러스 (Sagiyama virus) ; 살로넬라 종(Salmonella spp), 바람직하게는, S. 티히무리움(thyhimurium) 및 S. 콜레라에수위스(choleraesuis); 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp) 바람직하게는, S. 히쿠스(hyicus); 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 바람직하게는 스트렙토코커스 수위스(Strep. suis); 스와인 시토메갈로바이러스 (Swine cytomegalovirus); 스와인 헤르페스 바이러스(Swine herpes virus); 스와인 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus); 스와인 폭스 바이러스 (Swine pox virus); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) ; 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) 및 돼지 포진 바이러스 (virus of exanthema of swine); 또는 기타 포신 시르코바이러스의 분리물(isolate) 또는 아형(subtype)과 같은 돼지 병원체로부터 선택된 하나 이상의 병원체로부터 유래된 면역원(immunogen)을 포함할 수 있다.

PCV2 백신은 수성 액제(aqueous solution), 유중수(water-in-oil), 또는 수중유(oil-in-water) 에멀젼(emulsion), 시럽제(syrup), 엘리서제(elixir), 팅크제(tincture)와 같은 액제 제형, 멸균 현탁액(suspension) 또는 에멀젼(emulsion) 형태와 같은 비경구(parenteral), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 근육내(intramuscular) 또는 정맥내(intravenous) 투여법(예를 들어, 주사용 투여)을 위한 제제일 수 있다. 이러한 제형은 당업계에 잘 알려져 있으며 전형적으로 적절한 담체 또는 용매 계에서 항원 및 기타 전형적인 첨가제를 용해시켜 제조가능하다. 또한 액제 제형은 현탁화 또는 에멀젼화 시약을 포함하는 현탁액 및 에멀젼을 포함할 수 있다. 바람직한 PCV2 백신은 당업계에 잘 알려진 기법에 따라 제조가능한, 예를 들어, 유중수 또는 수중유와 같은 에멀젼 형태로 본 발명에 따른 불활화(inactivated) PCV2B-Rm을 포함하는 것이다.

투여경로는 점막내 투여(mucosal administration)를 통한 경피(percutaneous) 경로 또는 비경구적 경로(parenteral route), 피내(intradermal), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 또는 복강내(intraperitoneal) 경로일 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 단독 또는 다른 치료법 또는 처치법으로 동시투여법(co-administered) 또는 일련 투여법(sequentially administered)으로 투여될 수 있다. 상술한 PCV2 백신은 바람직하게는 PCV2 감염증 또는 수반 질병에 대하여 돼지를 백신화하기 위하여 PCV2 바이러스 아형(virus subtypes) A 및 B 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 세 번째 측면에 따라, 본 발명은 신규 PCV2B-Rm 게놈(genome)의 전장(full) 또는 일부(partial) 서열을 포함하는 핵산 분자(nucleic acid molecule)에 관한 것이다. 특히, 상기 핵산 분자는 서열번호 1(SEQ ID NO: 1)의 뉴클레오티드 서열, 이의 단편(fragment), 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4% 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호 (genetic code)의 퇴화(degeneration) 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 핵산 분자는 또한 서열번호 2(SEQ ID NO: 2)의 변형된 큰 유전자간 영역(intergenic region)에 상응하는 뉴클레오티드 서열, 이의 단편(fragment), 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호 (genetic code)의 퇴화(degeneration) 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

호환적으로, 본 발명에 상기 핵산 분자는 또한 서열번호 3(SEQ ID NO: 3)의 큰 유전자간 영역(intergenic region)에서의 11개 염기쌍 복제 서열(duplication sequence), 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호 (genetic code)의 퇴화(degeneration) 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 핵산 분자는 복제서열이 큰 유전자간 영역(intergenic region)에 삽입된 야생형 PCV2 바이러스의 게놈성(genomic) 서열을 포함한다. 상기 PCV1 바이러스 게놈(genome) 내에 삽입된 상기 복제 서열(duplication sequence)은 서열 번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호 (genetic code)의 퇴화(degeneration) 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열인 것이다. 상기한 게놈성 서열은 임의의 PCV2 바이러스 아형(subtype) A 또는 아형 B로부터 유래가능하다.

핵산 분자는 DNA 또는 RNA, 변형된 골격을 포함하는 것과 같은 DNA 및 RNA의 이중가닥 (double-stranded) 또는 단일 가닥(single-stranded) 유사체를 포함한다. 단일 가닥(Single- stranded) DNA 또는 RNA 는 센스 스트랜드(sense strand)이라고도 지칭되는 코드화 스트랜드(coding strand)일 수 있으며 또는 이는 안티-센스 스트랜드(anti-sense strand)로도 지칭되는 비-코드화 스트랜드(non-coding strand)일 수 있다.

2개 핵산 서열 간의 상동성(homology) 정도는 GCG 프로그램 패키지(program package) (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)로 제공되는 GAP와 같은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). 하기 DNA 서열 비교법(sequence comparison)에 대한 하기 세팅(setting)을 GAP와 함께 이용한다: GAP 창제 벌점(creation penalty) 5. 0 및 GAP 연장 벌점(extension penalty) 0.3. 핵산 분자는 갭 창제 벌점(gap creation penalty) 5 및 갭 넓이 벌점(gap width penalty) 0.3의 내정된 세팅을 이용하여 GCG 프로그램 패키지의 일부로 사용가능한, 파일업 배열 소프트웨어(Pileup alignment software)을 이용하여 상호 정렬될 수 있다.

주어진 핵산 분자가 특정한 핵산과 혼성화되는가 여부를 결정하는 적절한 실험 조건은 10분간 5 x SSC에서 검사될 관련된 핵산 시료를 포함하는 필터(filter)를 미리 담그는 단계(pre-soaking), 및 상기 필터를 용액(5 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS 및 100μg/ml의 변성되고 초음파 처리된 연어 정자 DNA)중에서 전-혼성화하는 단계 (pre-hybridisation), 및 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌 (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbour, New York)에 따른 혼성화 방법(hybridisation methods)에 따라, 약 45℃에서 12시간 동안 10ng/ml 의 P-dCTP-표지성 프로브(labeled probe) 농도를 포함하는 동일한 용액에서의 혼성화는 단계를 포함한다. 그리고 상기 필터를 55℃이상 (낮은 가혹조건; low stringency), 60℃이상 (중간 가혹 조건; medium stringency), 65℃이상 (중간/높은 가혹조건; medium/high stringency), 70℃이상 (높은 가혹조건; high stringency), 또는 75℃ 이상 (매우 높은 가혹조건; very high stringency) 조건 하에서 용액(2 x SSC, 0.5% SDS)에서 30분간 2회 세척한다. 혼성화(Hybridisation)는 x-선 필름(ray film)에 대한 상기 필터의 노출법으로 탐지가능하다.

하기 실시예에서 개시된 바와 같이, 상기 제조된(engineered) PCV2 바이러스는 큰 유전자간 서열(large intergenic sequence) 중 복제 서열(duplication sequence)을 PCV2 클론(clone)의 게놈(genome)에 도입함으로서 생산가능하다. 바람직하게는, 상기 복제 서열은 서열번호(SEQ ID NO: 3)의 11bp 서열인 것이다. 상기 복제 서열은 도 5에 나타난 바와 같은 PCV2B 게놈(genome)의 41 및 52 위치의 뉴클레오티드 사이에 삽입가능하다. 서열 삽입(sequence insertions) 방법은 당업계에 공지되고 당업자라면 용이하게 달성 가능하다. PCV2B 의 게놈 및 보다 구체적으로 아형 B1, B2, B4, B5 또는 B6은 본 발명에 따라 변형가능하다. 바람직하게는, 상기 복제 서열은 1778 bp을 갖는 상기한 PCV2B-Rm에서의 변형된 게놈을 생산하기 위하여 1767bp (GenBank No. DQ233257)을 갖는 PCV2 아형 B1 바이러스의 게놈에서 삽입된 것이고 도 2 및 염기서열 (SEQ ID NO: 1)에 개시된다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 원핵세포(prokaryotic) 또는 진핵세포(eukaryotic) 유래의 네이키드 핵산 분자(naked nucleic acid molecules)와 같은 핵산 분자 그 자체; 벡터(vector) ; 바이러스(virus) 또는 숙주세포(host cell) 등의 형태로 제공가능하다. 벡터로는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터(expression vectors)를 포함한다. 본 발명의 벡터는 예를 들어, 포로모터(promoter)가 상기 핵산 분자와 작동가능하게 연결되고 상기 핵산 분자 내에서 전사 종결자 (transcription terminator)가 작동가능하게 연결된, 전사 프로모터 및 전사 종결자를 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현 예로서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자로 형질전환된 숙주세포(host cell)을 제공하는 것이다. 숙주세포의 적절한 예들은 당업계에 공지되거나 당업자에 의하여 용이하게 선택가능하다. 예를 들어, 숙주 세포는 진핵 세포 및 원핵세포를 포함할 수 있다. 진핵세포의 예로는 포유동물 (예를 들어, 돼지), 곰팡이(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 및 식물 세포를 들 수 있다. 원핵세포는 예를 들어 대장균(E. coli)을 포함한다.

본 발명에 따른 PCV 2 백신은 전체(whole) PCV2B-Rm 바이러스 형태 또는, 예를 들어, 핵산 분자 또는 상술한 상기 핵산 분자를 운반하는 벡터와 같은 다른 형태로 제공될 수 있다. 상기 핵산은 11 염기쌍 복제 서열(base pair duplication sequence)을 포함하며 이는 야생형 바이러스와 비교시 증가된 수율의 복제율을 초래한다.

본 발명의 네 번째 측면에서, 본 발명은 상술한 높은 역가의 PCV2B-Rm 바이러스를 포함하는 PCV2 백신을 투여함을 포함하는 돼지 에서의 면역 반응을 면역화하거나 또는 유도하는 방법뿐만 아니라 돼지에서의 백신화 방법 및 PCV2 수반 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법들을 제공한다.

상술한 바와 같이, PCV2 감염증(infections) 또는 수반 질병(associated diseases)은 그 중에서 이유후 전신성 소모성증후군(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS), 돼지 피부염 신증증후군(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome; PDNS), 돼지 호흡기질병복합체(Porcine Respiratory Disease Complex; PRDC), 번식장애(reproductive disorders), 육아종성 장염(granulomatous enteris), 돼지 삼출성 표피염(exudative epidermitis), 괴사성 림프절염(necrotizing lymphadenitis), 및 선천성진전(congenital tremors) 등을 포함한다.

상기 방법은 치료학적으로 유효 용량의 PCV2 백신을 투여함을 포함한다, 본 발명의 백신은 용이하게 비강내(intranasally), 경피(transdemally), (즉, 전신 흡수를 위한 피부 표면상 또는 지점에 적용한), 비경구적으로(parenterally), 안구내(ocularly) 투여법 등으로 투여가능하다. 상기 투여의 비경구 경로로는 이에 제한되지는 않으나, 근육내(intramuscular), 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal) 투여법 및 유사법을 포함한다.

본 발명에 따라 제조된 PCV2 백신의 투여용량은 종(species), 사육법(breed), 나이(age), 크기(size), 백신화 이력(vaccination history), 백신화될 동물의 건강 상태(health status)뿐만 아니라 투여 경로, 즉, 피하(subcutaneous), 피내(intradermal) 또는 근육내(intramuscular) 또는 정맥내(intravenous) 투여법에 따라 좌우될 것이다.

본 발명의 백신은 단회 용량 또는 반복된 용량으로 투여가능하다. 본 발명의 백신은 다독으로 투여되거나 또는 예를 들어, 돼지 면역원성 또는 백신 조성물과 같은 하나 이상의 추가 조성물과 동시적 또는 일련적으로 투여될 수 있다. 서로 상이한 시간에 상기 조성물이 투여되면 상기 투여는 서로 다르게 분리되거나 시간이 겹칠 수 있다.

본 발명의 하나의 구현 예로서, 본 발명의 PCV2B-Rm 을 포함하는 백신 조성물은 객체 자체의 면역 반응력을 증강 시키기 위하여 PCV2 감염되기 쉽거나 또는 감염될 위험성이 있는 객체 에게 투여하는 것이다. 본 발명의 하나의 구현 예로서 백신이 투여되는 객체는 돼지이다. 그러나, 상기 객체는 상기 바이러스에 대하여 면역 반응을 발휘하기에 바람직할 수 있는 임의의 동물(예를 들어, 비 인체 동물)일 수 있다. 상기 동물은 PCV2 또는 이와 근접한 관계의 바이러스에 의하여 감염되기 쉬울 수 있다.

본 발명의 PCV2 백신은 바람직하게는 돼지, 성인 돼지에 투여하는 것이나 젊은 돼지, 새끼 돼지 또는 임신중 암 돼지 또는 비인체 포유동물(non human mammals)의 기타 형태 동물에 투여가능하다. 임신중 암퇘지의 백신화는 특히 모체 항체의 전달과정을 통하여 신생아에게 수동 면역을 부여하는 바와 같은 유리한 효과를 갖는다. 상기 돼지는 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 주령; 1 내지 6 주령; 2 내지 5 주령; 또는 3 내지 4 주령 이하 일 수 있다. 예를 들어, "시험(test)" 동물은 돼지에 대한 백신의 영원한 사용 또는 발전을 위하여 PCV2 백신의 수행능을 평가하기 위하여 본 발명의 PCV2 백신을 투여할 수 있다. 바람직하게는, 상기 백신은 PCV2 바이러스에 노출된 바가 없는 객체에게 투여되는 것이다. 바람직하게는, 상기 객체는 이유후 전신성 소모성증후군(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome; PMWS), 및/또는 돼지 피부염 신증증후군(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome; PDNS)에 대한 백신화가 요구되는 돼지이다.

본 발명은 본 발명의 PCV2 백신 및 아티노바실러스 플루로뉴노미아(Actinobacillus pleuropneunomia); 아데노바이러스(Adenovirus); 동부 말 뇌척수염 바이러스 (Eastern equine encephalomyelitis viruses)와 같은 알파바이러스(Alphavirus); 발란티디움 콜리(Balantidium coli); 보르텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica); 브라키스피라 종(Brachyspira spp.), 바람직하게는 B. 히오디엔테리아(hyodyentheriae), B. 필로시콜리(pilosicoli), B. 이노센스 (innocens), 브루셀라 수위스(Brucella suis), 바람직하게는 비오바리스(biovars) 1, 2 및 3; 고전적 돼지 발열 바이러스(Classical swine fever virus), 아프리카 돼지 발열 바이러스(African swine fever virus); 클라미디어(Chlamydia) 및 클라미도필라 종(Chlamydophila sp.) 및 바람직하게는 C. 페코럼(pecorum) 및 C. 아보투스(abortus); 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 바람직하게는 Cl. 디피실(difficile), Cl. 페르프링겐(perfringens) 형(types) A, B 및 C, Cl. 노비(novyi), Cl. 셉티쿰(septicum), Cl. 테타니(tetani); 소화기(Digestive) 및 기관지(respiratory) 코로나바이러스(Coronavirus); 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum); 에이메리아 종(Eimeria spp); 미코플라즈마 하에모수위스(Mycoplasma haemosuis)로 현재 지칭되는 에페리쓰로주니스 수위스(Eperythrozoonis suis); 에리시펠로쓰릭스 류시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae); 대장균 (Escherichia coli); 해모필루스 파라수위스(Haemophilus parasuis), 바람직하게는 아형 1, 7 및 14; 혈구응집 뇌척수염 바이러스(Hemagglutinating encephalomyelitis virus); 이소스포라 수위스(Isospora suis) ; 일본 뇌척수염 바이러스 (Japanese Encephalitis virus); 노소니아 인트라셀루라리스 (Lawsonia intracellularis); 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 바람직하게는 렙토스피라 오스트랄리스(Leptospira australis), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로해모라지카에(Leptospira icterohaemorrhagicae), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 포모나(Leptospira Pomona) 및 렙토스피라 타라소비(Leptospira tarassovi); 만하이미아 해몰리티카(Mannheimia haemolytica) ;미코박테리움 종(Mycobacterium spp). 바람직하게는, M. 아비움(avium), M. 인트라셀룰라레(intracellulare) 및 M. 보비스(bovis): 미코플라스마 히포뉴모니아에(Mycoplasma hyponeumoniae); 파르보바이러스(Parvovirus); 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida); 포신 시토메골로바이러스 (Porcine cytomegolovirus); 포신 파로바이러스(Porcine parovirus), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus): 슈도라비에스 바이러스(Pseudorabies virus); 로타바이러스(Rotavirus); 사지야마 바이러스 (Sagiyama virus); 살로넬라 종(Salmonella spp), 바람직하게는, S. 티히무리움(thyhimurium) 및 S. 콜레라에수위스(choleraesuis); 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp) 바람직하게는, S. 히쿠스(hyicus); 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 바람직하게는 스트렙토코커스 수위스(Strep. suis); 스와인 시토메갈로바이러스 (Swine cytomegalovirus); 스와인 헤르페스 바이러스(Swine herpes virus); 스와인 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus); 스와인 폭스 바이러스 (Swine pox virus); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii); 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) 및 돼지 포진 바이러스 (virus of exanthema of swine); 또는 기타 포신 시르코바이러스의 분리물 또는 아형(subtype)과 같은 돼지에서의 다른 질병을 유발하는 유기체 억제에 효과적인 하나 이상의 면역원성 활성 구성성분을 포함하는 조합 백신(combination vaccine)을 포함하는 것이다.

본 발명은 상술한 바와 같은 면역학적으로 유효한 양의 PCV2 백신을 포함하는 콘테이너(container)를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 유효한 양의 PCV2 백신을 포함하는 임의적으로 멸균 콘테이너, 돼지에 백신을 투여하기 위한 수단(means), 및 최종적으로 PCV2 수반 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 돼지로의 상기 면역학적으로 유효한 양의 상기 조성물의 투여를 위한 정보를 포함하는 사용 설명서(instruction manual)를 포함하는 백신화 키트(vaccination kit)를 제공한다.

본 발명은 추가적으로 PCV2 바이러스 또는 이의 서브-유니트(sub-unit)와 결합가능한 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 토끼(rabbit), 기니 피그(guinea pig), 또는 설치류(rodent)와 같은 동물을 면역하는 단계 및 여기에서 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체는 다클론성(polyclonal) 또는 단일 클론성(monoclonal) 항체 제제(antibody preparations), 단일특이적 항혈청(monospecific antisera), 인간 항체(human antibodies), 또는 결합할 항원과 결합하는 인간화 항체(humanized antibodies)와 같은 혼성체(hybrid) 또는 키메라 항체(chimeric antibody), 변형된 항체(altered antibodies) (Fab')2 단편(fragments), F(ab) 단편, Fc 단편, 단일(single)- 도메인(domain) 항체, 이량체성(dimeric) 또는 3량체성(trimeric) 항체 단편 또는 구조체(constructs), 또는 이들의 기능성 단편(functional fragments)일 수 있다. 항체는 당업계에 공지되고 저서(“A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)”)에 개시되어 있다.

본 발명의 다섯 번째 측면에 따라서, 본 발명은 돼지에서의 시르코바이러스를 존재를 진단하는 방법, 이를 위한 시약 및 진단용 키트는 추가적으로 제공한다. 따라서, 이의 목적은 시약을 이용한 진단용 시험법(diagnostic test) 및 이와 관련된 방법이다.

상술한 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 돼지 시르코바이러스를 인지가능한 시약(reagent)을 제조할 수 있다. 당업자라면 특이적 진단을 수행하기 위하여 서열 번호 (SEQ ID NO: 1-3) 내에서의 20 내지 50bp 주변의 단편을 선별할 수 있을 것이다. 따라서, 본원에서 개시된 DNA 서열 및 이들의 단편들은 혼화성법 또는 PCR 실험법에 의하여 시르코바이러스를 탐지하기 위한 프로브(probe) 및/또는 프라이머(primer)로서 사용가능하다. 상기 바이러스에 의하여 코드화되거나 백터에 의하여 발현되는 항원도 진단을 목적으로 한 시약으로 사용가능하며 이는 면역형광법(immunofluorescence) 또는 웨스턴 블롯 실험법(Western blotting experiments)에 의하여 탐지가능하다. 상술한 바와 같은 단일클론성(Monoclonal) 또는 다클론성(polyclonal) 항체가 예를 들어, ELISA 및 면역크로마토그래피법(immunochromatography)을 이용하여 당업계에 잘 알려진 기법에 따라 진단용 시험법(diagnostic test) 및 시약(reagent)에 사용가능하다.

따라서, 진단용 키트는 PCV2 바이러스에 대하여 특이적인 DNA 프로브(probes) 또는 프라이머(primers), 항체 및/또는 항원 및/또는 다클론성(polyclonal) 또는 단일클론성 (monoclonal) 항체를 포함가능하며 진단용 시험법(diagnostic testing)은 시험될 돼지로부터 수득한 생리학적 액체 (혈액, 혈장, 혈청 및 유사물) 시료 또는 조직(신경절, 간, 폐, 신장 및 유사물) 시료 상에서 수행될 수 있다.

또한 본 발명은 PCV2 아형 B 바이러스 게놈의 유전자간 영역 내에, 서열번호 3(SEQ ID NO: 3)의 뉴클레오티드 서열과 같은 복제 서열(duplication sequence), 서열번호 3(SEQ ID NO: 3)의 뉴클레오티드 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 이상 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드와 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 삽입(insert)하는 단계를 포함하는 PCV2 바이러스를 증가된 수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 상술한 바와 같이, 상기 복제 서열은 예를 들어, 서브유니트(subunit) B1 내지 B6를 포함하는, PCV2 아형 B 바이러스의 큰 유전자간 영역에서 삽입될 수 있다.

또한 본 발명은 PCV2 바이러스를 제조하는 방법 및 신규 PCV2B-Rm를 제조하기 위한 적합한 숙주 세포(host cell)을 제공한다. 다양한 숙주 세포들이 신규 PCV2B-Rm를 생산하기에 유용하고 당업계에 잘 알려진 예를 들어, PK 세포 (cells)와 같은 돼지 신장 세포와 같은 돼지 세포를 포함한다.

본 발명의 여섯 번째 측면에 따라서, 본 발명은 10⁶TCID₅₀ 바이러스 입자/mL까지, 또는 10⁷TCID₅₀ 내지 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/mL 범위의 일정하게 높은 역가로 PCV2 바이러스를 생산하기 위하여 여국적으로 감염 가능한 돼지 고환(Swine Testicles; ST) 세포로부터 유래된 신규 세포 주를 제공한다. ST1D 및 ST6B으로 명명된 2개의 클론(clone)들은 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 미생물기탁기관(The Collection Nationale de Cultures de Microorganismes; “CNCM”, Institut Pasteur, 25 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, 프랑스)에 2008. 11.27자로 기탁되고 기탁번호(accession number CNCM I-4093 and CNCM I-4092)로 기탁된 것이다. 신규 ST 세포주는 높은 수율의 PCV2 아형 B 바이러스 생산을 위하여 유용하다. 신규 ST 세포주는 또한 면역학적으로 유효한 양의 PCV2 아형 B 바이러스가 특히 높은 수율을 갖는, PCV2 아형 B 바이러스를 생산하는 효율적인 방법을 위하여 유용하다. 추가적으로, 이러한 신규 세포 클론들은 PCV2 의 아형 A 또는 B과 같은 기타 돼지 시르코바이러스를 돼지 신장 세포주 PK/15보다 높은 역가로 증식하기에 필요할 수 있다. PCV2B-Rm 또는 기타 돼지의 증식이 실시예 3에 개시되어 있다.

상기 숙주 세포레 대한 적절한 성장 조건은 당업자에게 잘 알려져 있고 그중에서 적당한 영양 조건을 선택함도 포함될 것이다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 배양 배지는 적어도 물, 염, 영양소, 필수 아미노산, 비타민 및 항균제를 포함하고 또한 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기한 측면들 및 장점들은 비제한적으로 설명한 곳으로 간주 되어야 한 하기 실시예들을 통하여 보다 명확히 설명될 것이다.

본 발명의 상기한 목적들 및 장점들은 하기한 발명의 상세한 설명뿐만 아니라, 명세서 전반에 걸친 설시되는 일부들을 의미하는 참고 기호 및 이에 제한되지 않은 첨부되는 하기 도에 대한 설명란을 고려한다면 보다 명확히 설명될 것이다.
도 1은 2007년도 유럽, 아시아 및 미국에서의 알려진 PCV2 아형 A 및 B 서열에 대한 완전한 게놈 분석 결과에 기초한 게통수를 나타낸 도이며(신규 PCV2B-Rm 바이러스 위치도 제공함);
도 2는 신규 PCV2B-Rm (서열 번호: 1)의 DNA 서열을 나타낸 도이며;
도 3는 큰 유전자간 영역 변이체 (서열번호 2)의 DNA 서열을 나타낸 도이며;
도 4는 큰 유전자간 영역 내에 삽입된 짧은 복제 뉴클레오티드 서열 (서열번호 3)을 나타낸 도이며;
도 5는 신규 PCV2-Rm 게놈의 1743 내지 64 위치에서의 뉴클레오티드 서열을 일부를 도시한 내용이며(추가적인 H3 및 Y2 서열을 포함하는 서열 복제는 “서열 복제(Sequence duplication”로 밑줄함):
도 6는 PCV2A 및 PCV2B-Rm 바이러스 아형에 대한 ORF2 유전자 산물에 의하여 코드화된 캡시드 단백질 서열(capsid protein sequence)의ㅣ 아미노산 서열을 비교한 것이며 (2개 아형간의 차이가 있는 아미노산 기를 볼드(bold)체로 표기하고 항원성 부위를 박스화하고 밑줄친 아미노산 서열은 세포에 독성이 알려지고 일반적으로 세포에서 ORF2 유전자의 클로닝 및 발현 전에 제거됨):
도 7는 본 발명에 따른 확립된 ST 세포주에서의 일반적 바이러스 성장 및 병렬적 PCV2B-Rm 성장을 나타낸 그래프이며(6, 20, 35, 50 및 65일째 생산 수율을 나타냄).

하기한 실시예들은 본 발명의 범위를 한정함이 아니고 설명하고자 하는 것으로 간주 되어야 한다.

실시예 1- PCV2B - Rm 바이러스의 분리 및 배양

이유후 전신성 소모성증후군의 임상적 신호 및 사후 특성을 나타내는 감염된 돼지 시르코바이러스 (Porcine Circovirus) 2 형 (PCV2) 감염된 돼지의 임프절 시료를 회수하고 -20℃에서 냉동시켰다. 해동 조직을 동일 용량의 스트렙토마이신(streptomycin; 100μg/ml) 및 페니실린(penicillin; 100 IU/ml) 첨가된 DMEM (Dulbecco’s Modified Minimum Essential Medium, GIBCO)배지와 함께 멸균 모르타르(mortar)에서 갈아 균질화하였다. 상기 시료를 10분간 5000g 속도로 미세 원심분리하여 정제하고, 100μl 의 상등액을 10% 우 태아 혈청(fetal bovine serum; Invitrogen)이 첨가된 상기한 배지를 이용하여 50% 충만도(confluency)에서 돼지 시르코바이러스 (Porcine Circovirus; PCV) 제거 돼지 고환 세포 (swine testicle cell)에 접종하였다. 충만에 도달한 감염 세포를 트립신 처리(trypsinized)하고 25cm²플라스틱 세포 배양 플라스크(Corning)에 500,000세포/ml로 접종하였다. 중합연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 1/10^th 의 트립신 처리된 세포 현탁액을 PCV2 게놈(genome) 탐지에 사용하였다. 접종되고 비접종된 세포 배양물들을 CO₂ 배양기에서 +37℃를 유지하였다. 상기 과정은 일련적으로 반복 수행하였고 바이러스 증식은 각 단계에서 PCR 또는 간접 면역 형광 어세이법(indirect immune fluorescence assay)으로 측정하였다.

실시예 2- 면역 형광법에 의한 DCV2 항원의 탐지

PCV 2 특이적 다클론성 혈청을 PCV2 및 돼지 파보바이러스(porcine parvovirus), PRRS 및 고전적 돼지 열 (classical swine fever)을 포함하는 기타 바이러스 질병이 없는 성인 돼지에서 생산하였다. 3마리 돼지에게 살아 있는 PCV2B-Rm 바이러스를 2주간 간격으로 2회 근육내 주사하고 임상적 신호의 양상을 측정하였다. 혈액 시료를 매주 채혈하고 최초 주사 7주 후의 면역화 종료 시점에 안락사시켰다. PCV2 특이 항체의 존재를 하기와 같이 탐지하였다. 혈청을 개별적으로 0.5% 우 혈청 알부민(bovine serum albumin) 첨가된 PBS의 1:10 희석으로 시작하여 10배 희석하였다. PCV2 감염 세포들을 상온에서 10분간 아세톤/에탄올 욕조에서 고정하고 혈청 희석액과 같이 +37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 2차 항체를 +37℃에서 1시간 동안 항-돼지 IgG 표지된 플루오레신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)으로 1:100 희석하였다. 과잉의 항체를 각 단계 후에 PBS로 세척하여 제거하고 반응을 자외선 하에서 형광 현미경으로 관찰하였다.

실시예 3- PCV2B - Rm 바이러스로 ST1D 세포를 감염시키는 전통 포로토콜

500.000 ST1D 세포들을 10%FBS, L-글루타민(Glutamine) 및 HEPES를 첨가한 10ml MEM-E 배지에 T25 플라스크 (20.000 cells/cm²)에서 접종하였다. 접종후, 세포를 0.01 또는 0.05 MOI를 적용한 PCV2B-Rm 바이러스 현탁액 (IFtiter: 5-6 log 10 TCID 50/ml)로 감염시켰다. 세포를 배지를 갈지 않고 충만도에 도달시까지(약 3-5일) 배양하였다. 충만된 세포를 트립신으로 헤쳐 내고 새로운 배지 (30ml/flask)로 채운 T75 플라스크에서 접종하였다. 충만도에 도달시 후에 (약 3-5일), 세포들을 50-60ml 배지가 담긴 T175플라스크에서 분할하였다. 충만 단계에 도달 후에는 세포들을 냉동시키고 해동하였다. 이러한 주기를 3회 반복하였다. 3회 주기 후에, 상기 현탁액을 멸군 튜브에서 회수하고 4℃에서 10분간 3000g로 원심분리하였다. 상등액을 회수하고 펠렛(pellet)을 제거하였다. 바이러스 현탁액을 -20℃ 또는 -70℃에서 보관하였다. 선택적으로, 1회 단계 감염 프로토콜(one step infection protocol)로 사용될 수 있다. 이 경우에, T175 플라스크 (20.000/cm²) 중 세포를 PCV2B-Rm (MOI:0.1)으로 감염시키고, 4-5일간 배양가능하다. 충만도에 도달시에 세포를 상기한 공정과 유사하게 냉동하고 해동한다. 이러한 방법으로 5-6 log 10 TCID₅₀/ml IF 역가가 달성된다.

실시예 4- 신규 PCV2B - Rm 바이러스의 불활화( inactivation )

하기 실시예들은 에틸렌이민(ethylenimine)을 이용하여 생성된/증식된 PCV2B-Rm 바이러스 현탁액을 불활화시키는 방법을 예시한 것이다.

4-1

불활화 시약(inactivating agent) 에틸렌이민(ethylenimine) (이후 EI로 지칭함)을 37℃에서 1시간 동안 0.2M 2-브로모메틸아민(bromethylamin)-히드로브로미드(hydrobromide) 및 0.4M 수산화 나트륨을 반응시켜 0.8 % 최종 농도로 합성하였다.

PCV2B-Rm 바이러스 현탁액의 불활화를 23℃ 및 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 0.05% (w/v) 및 0.075% (w/v) 농도로 수행하였다. EI 스톡 용액(stock solution)의 pH 수치는 불활화에 사용하기 전에 8.0-8.5로 적정하였다.

불활화를 다음날 1.5M 과잉으로 50% (w/v) 소듐 티오설페이트(sodium-thiosulphate) 용액을 바이러스 현탁액에 넣어 정지시키고 pH를 7.2-7.4로 글리신(glycin)-HCl 완충액을 가하여 적정하였다.

본원에서 제조하는 바와 같이, 상기 PCV2B-Rm 바이러스는 불활화 동안 적용된 농도, 온도 및 시간과 상관없이 적절한 불활화 조절 방법에 따라 완전하게 불활화시켰다.

4-2

호환적인 불활화 방법으로 PCV2B-Rm 바이러스 현탁액중 EI 합성을 반응기내(in-situ) 방법으로 수행하였다.

불활화의 최초 단계는 0.05% 최종 농도에서 바이러스 현탁액중에서 EI를 직접 합성하는 단계이다. 상기 바이러스 현탁액을 37℃에서 예비-가열한 후에 10% (w/v) 2-브로모에틸아민(bromethylamin)-히드로브로미드(hydrobromide) 용액을 첨가하였다. 6시간 동안 합성도중에 바이러스 현탁액을 37℃로 유지하고 pH를 1M 수산화 나트륨을 첨가하여 7.8-8.2로 계속적으로 적정하였다.

합성을 마친 후에, 0.05% (w/v) 농도로 EI를 함유하는 바이러스 현탁액의 온도를 23℃로 냉각시키고 불활화를 24시간 동안 수행하였다. 전체 불활화 공정 동안 온도는 23℃를 유지시켰다.

최종적으로 불활화 과정을 다음날 1.5M 과잉으로 50% (w/v) 소듐 티오설페이트(sodium-thiosulphate) 용액을 바이러스 현탁액에 넣어 정지시키고 pH를 7.5-7.8로 계속 적정하였다. EI를 23℃에서 5시간 동안 제거하였다.

본원에서 제조하는 바와 같이, 상기 PCV2B-Rm 바이러스는 적당한 불활화 조절 방법에 따라 완전하게 불활화시켰다.

실시예 5- 보조제(10% 오일)와의 PCV2B - Rm 바이러스의 제조

보조제 첨가 PCV2B-Rm 바이러스 조성물을 하기와 같이 제조하였다:

1 단계: 고 전단 회전 고정자 현탁화 기기(high shear rotor stator emulsifier)를 이용하여 제형을 제조하였다. 현탁제를 제조하기 위하여, 오일 상의 한 부피를 수상 (#1) 한 부피와 같이 25℃에서 현탁화 하였다. 상기 수상을 1 분간 5000 rpm (회전수/분)속도로 진탕하에 오일상을 첨가하였다. 회전 속도를 1 분간 10000 rpm 으로 상승시키면서 부피를 점진적으로 증가시켰다. 이 단계에서 현탁제는 유중수( water-in-oil) 현탁제이다.

현탁제를 위하여, 상의 조성은 하기와 같다:

(1) 유 상(Oily phase; 200 ml):

- 소르비탄 모노올레인트(Sorbitan monooleate): 1.8% v/v,

- 소르비탄 트리올레이트 (Sorbitan trioleate) (20 OE): 10.2% v/v,

- 경질 액체 파라핀 오일(Light liquid paraffin oil): 88% v/v,

(2) 수 상(Aqueous phase #1; 200 ml):

- 소르비탄 모노올레이트(sorbitan monooleate)의 20% (w/v) 용액 (20 OE): 11.25% v/v

- 포스페이트 디소딕(Phosphate disodic) 및 모노포타식(monopotassic) 0.02M 등장 완충액 (pH 7.2-7.6): 88.75% v/v 소르비탄 모노올레이트 및 소르비탄 트리올레이 (20 OE)을 유상에 도입하였다.

소르비탄 모노올레이트의 20% (w/v) 용액 (20 OE)을 예를 들어, 포스페이트 디소딕 및 모노포타식 0.02M 등장 완충액과 같은 백신과 동일한 완충액에서 제조하였다. 교반을 중지하고 에멀젼이 수중유(oil-in-water) 에멀젼으로 변화하였다. 상기 에멀젼을 4시간 이상 5℃에서 냉동 챔버(chamber)에 위치하였다. 이 단계에서 상기 에멀젼은 50% 오일상을 포함하는 예비-에멀젼(pre-emulsion)이었다.

2 단계: 수상(#2)을 PCV2B-Rm와 200ml의 포스페이트 디소딕 및 모노포타식 0.02M 등장 완충액 (pH 7.2-7.6)로 제조하였다. 1 단계에서 얻은 예비-에멀젼을 약 5℃로 냉각시키고, 동일 온도에서 수상 (#2)부피의 절반을 첨가하여 희석시키고 1분간 자석 막대로 회전시키면서 혼합하였다.

실시예 6- 돼지의 면역화( PCV2 에 대한 모체항체로)

4주령 암컷 새끼돼지를 PCV2 혈청양성(seropositive), 일반적인 양돈장에서 무작위로 선택하였다. 선택된 동물을 실험 시설로 옮기고 1차 백신화 전까지 순화시켰다. 이 기간 동안 동물 체중을 측정하고 혈액 시료를 간접 면역형광법 (indirect immunfluorescence; IIF) 어세이법(assay)을 이용하여 새끼 돼지의 혈청학적 상태를 측정하기 위하여 회수하였다(하기 참조). 그리고 새끼 돼지를 각각 10 마리로 구성된 3개 그룹으로 나누었다.

상기 새끼 돼지 1번째 그룹은 실험 첫 날(day 0) 실시예 5에서 제조된 보조제를 갖는 PCV2B-Rm 바이러스 백신으로 백신화하였다 (그룹 A: Group A) on day 0 (7-주령 새끼 돼지). 1 번째 대조군(control group)은 실시예 5의 보조제만을 투여하였다(그룹 A: Group B). 2 번째 그룹은 PBS 만을 투여하였다 (그룹 C: Group C). 2 ml 부피로 근육내 투여법으로 주사하였다. 실험 21째 날(day 21)에 백신 또는 PBS를 2 번째로 투여하였다 (10-주령 새끼 돼지). 실험 42일째 (day 42), 2 번째 백신화 3주후에, 각 그룹중 7마리 돼지들에게 10³TCID₅₀의 PCV2-Rm 바이러스/ml를 포함하는 2 ml PCV2B-Rm 바이러스 현탁액을 비강내 투여법으로 도전(challenge)하였다. 도전 바이러스(challenge virus)는 PCV2B-Rm 바이러스의 조기 통과(early passage) 형태였다. 도전후에, 새끼 돼지들을 실험 55일(day 55) 및 77일(day 77)에 측정하였다. 직장(Rectal) 온도를 1 번째 백신화 3일 전에 기록하였다 (실험 이후 -3, -2, -1 일째 및 0, 1, 2, 3, 20, 21, 22, 23, 42, 43, 44, 45일째).

혈액 시료를 1 번째 백신화 7일 전(day -7), 2 번째 백신화 시점(실험 21일째; day 21), 도전시(실험 42일; day 42) 및 면역형광 혈청학 분석을 위하여 55, 64 및 72일 째에 각각 채취하였다. 혈청을 0.5% 우혈청 알부민이 첨가된 PBS에서 1:2 희석농도를 시작하여 2배씩 희석하여 각각 시험하였다. PCV2 감염 세포를 상온에서 10분간 아세톤/에탄올 욕조에서 고정하고 혈청 희석액과 같이 +37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 2차 항체를 1:100 희석 항-돼지(anti-pig) IgG 표지된 플루오레신 이소티오시아네이트 (fluorescein isothiocyanate)로 +37℃에서 1시간 동안 희석하였다. 과잉의 항체를 각 단계 후에 PBS로 세척하여 제거하고 반응을 자외선에서 형광 현미경으로 관찰하였다.

실험 42 및 55일째, 3-3 피그(pigs), 및 72일째 마지막 4 피그(pig)/그룹을 안락사시키고 부검을 수행하였다. 종격 및 장간막 임프절을 면역조직화학법을 위하여 회수하였다. 바이러스를 회수된 장간막 임프절을 이용하여 정량적 PCR로 정량분석하였다.

임상증상:

그룹중 평균 채중상의 유의적인 변화는 없었다.

백신화 그룹(vacinated group) 및 대조군(control PBS group)의 면역형광 혈청학 결과를 표 1에 나타냈다:

	A (보조제 + 실시예 5 제조PCV2B-Rm 바이러스)	B (보조제 단독)	C (PBS)
Day -7	64	181	148
Day 21 (2^ndvac.)	338	237	444
Day 42 (Challenge)	1663	732	805
Day 55	1722	4096	41285
Day 64	2435	19484	8431
Day 72	1448	11585	16384

도전 후에, 그룹 A의 IF 필터는 도전 전과 기본적으로 동일한 수준을 유지하였다. 다른 그룹에서는 의미 있는 역가(titer) 상승을 관찰할 수 있었다.

면역조직화학법:

면역조직화학법(Immunohistochemistry)을 문헌(2007; Opriessnig T, Meng X, Halbur P: 2007, Porcine circovirus type 2associated disease: Update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies J Vet Diagn Invest 19: 591-615)에 개시된 방법에 기반으로 하여 실험을 수행하였다. 마우스에서 생산된 36A9 다클론 항체(monoclonal antibody) 및 키트(EnVision anti-mouse HRP kit, Dako, Glostrup, Denmark) 를 탐지에 사용하였다. 시료들을 하기 판정 기준에 따라 기록하였다:

0= 항체 무(no antigen)

1= 항원이 여포(follicle)의 10% 미만에서 탐지

2= 항원이 여포(follicle)의 10-50% 범위에서 탐지

3= 항원이 여포(follicle)의 50% 이상에서 탐지

std 는 표준 편차(standard deviation)의 약어

바이러스성 항원은 세포질 및 대식세포의 핵에서 탐지됨.

	면역조직화학 점수 (종격 임프절) (시료 D42, 55, 72)
그룹	평균	std
-	-	-
A (보조제 넣은PCV2B-Rm 바이러스)	0.25	0.43
B (보조제만)	1.33	0.58
C (PBS)	1.55	0.69

	면역조직화학 점수 (장간막 임프절) (시료 D42, 55, 72)
그룹	평균	std
-	-	-
A (보조제 넣은PCV2B-Rm 바이러스)	0.17	0.14
B (보조제만)	1.20	0.42
C (PBS)	1.36	0.63

대조군중 종격 (표 2) 및 장간막 (표 3) 임프절의 면역조직화합 점수는 백신화 군(vaccinated group)에 비하여 점수가 높았다. 가장 낮은 점수가 그룹 A에서 발견되었다. 일반적으로, 장간막 임프절의 점수는 장간막 임프절과 비교하여 높았다.

실시간(Real time) PCR을 문헌(Brunborg et al., 2004, Journal of Virological Methods 122: 171178)에 개시된 방법따라 수행하였다. PCV2 바이러스 부하(viral load)를 PCV2 서열을 포함하는 플라스미드(plasmid DNA)을 이용하여 정량화하였다. 서로 상이한 채취일에, 장간막 임프절에서 PCV2의 복제 숫자를 측정하고 하기 표 4에 나열하였다:

	복제 숫자
그룹	Day 42 (도전)	Day 55	Day 72	평균
-	-	-	-	-
A (보조제 넣은PCV2B-Rm 바이러스)	7	38	2617	87
B (보조제만)	33756	132154	137168	84898
C (PBS)	42223	683163	101521	143069

가장 낮은 복사 숫자가 그룹 A에서 발견하였다.

IF 혈청학(serology), IHC 및 실시간 PCR 결과에 기초하여, 보조제 넣은 PCV2B-Rm 백신화 그룹은 PCV2B 바이러스로 도전 후에 완벽하게 보호되었다.

The collection Nationale de Cultures de Cultrues de Microorganismes

CNCMI-4092

20081127

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CNCMI-4093

20081127

The collection Nationale de Cultures de Cultrues de Microorganismes

CNCMI-4094

20081127

SEQUENCE LISTING <110> CEVA SANTE ANIMALE <120> NOVEL PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2B ISOLATE AND USES THEREOF <130> B1167 <150> US61/118,505 <151> 2008-11-28 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1778 <212> DNA <213> Porcine circovirus 2BRm <400> 1 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cggcagcacc tcagcagcaa 60 catgcccagc aagaagaatg gaagaagcgg accccaaccc cataaaaggt gggtgttcac 120 tctgaataat ccttccgaag acgagcgcaa gaaaatacgg gatcttccaa tatccctatt 180 tgattatttt attgttggcg aggagggtaa tgaggaagga cgaacacctc acctccaggg 240 gttcgctaat tttgtgaaga agcagacttt taataaagtg aagtggtatt tgggtgcccg 300 ctgccacatc gagaaagcga aaggaacaga tcagcagaat aaagaatact gcagtaaaga 360 aggcaactta ctgatggagt gtggagctcc tagatctcag ggacaacgga gtgacctgtc 420 tactgctgtg agtaccttgt tggagagcgg gagtctggtg accgttgcag agcagcaccc 480 tgtaacgttt gtcagaaatt tccgcgggct ggctgaactt ttgaaagtga gcgggaaaat 540 gcagaagcgt gattggaaga ctaatgtgca cgtcattgtg gggccacctg ggtgtggtaa 600 aagcaaatgg gctgctaatt ttgcagaccc ggaaaccaca tactggaaac cacctagaaa 660 caagtggtgg gatggttacc atggtgaaga agtggttgtt attgatgact tttatggctg 720 gctgccctgg gatgatctac tgagactgtg tgatagatat ccattgactg tagagactaa 780 aggtggaact gtaccttttt tggcccgcag tattctgatt accagcaatc agaccccgtt 840 ggaatggtac tcctcaactg ctgtcccagc tgtagaagct ctttatcgga ggattacttc 900 cttggtattt tggaagaatg ctacagaaca atccacggag gaagggggcc agttcgtcac 960 cctttccccc ccatgccctg aatttccata tgaaataaat tactgagtct tttttatcac 1020 ttcgtaatgg tttttattac tcattaaggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct 1080 ctgaattgta catacatggt tacacggata ttgtattcct ggtcgtatat actgttttcg 1140 aacgcaatgc cgaggcctac gtggtctaca tttccagcag tttgtagtct cagccacagc 1200 tgatttcttt tgttgtttgg ttggaagtaa tcaatagtgg aatctaggac aggtttgggg 1260 gtaaagtagc gggagtggta ggagaagggc tgggttatgg tatggcggga ggagtagttt 1320 acataggggt cataggtgag ggctgtggcc tttgttacaa agttatcatc tagaataaca 1380 gcactggagc ccactcccct gtcaccctgg gtgatcgggg agcagggcca gaattcaacc 1440 ttaacctttc ttattctgta gtattcaaag ggcacagagc gggggtttga gccccctcct 1500 gggggaagaa agtcattaat attgaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttttg 1560 acagtggttc gcttgatagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca 1620 tttttccttc tccagcggta acggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg 1680 atctggccaa gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctcc ggtaacgcct ccttggatac 1740 gtcatatctg aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1778 <210> 2 <211> 53 <212> DNA <213> Porcine circovirus 2BRm <400> 2 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atg 53 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Porcine circovirus 2BRm <400> 3 cggcagcacc t 11

Claims

CNCM에 기탁번호(accession number CNCM I-4094)를 갖는 신규 분리된 돼지 시르코바이러스 균주 2 형.
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호의 퇴화 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 신규 분리된 돼지 시르코바이러스 균주 2 형.
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호의 퇴화 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 큰 유전자간 영역 서열을 갖는 신규 분리된 돼지 시르코바이러스 균주 2 형.
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호의 퇴화 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 반복된 유전자를 갖는, 돼지 시르코바이러스 2 형 아형 B1 게놈의 41 내지 52 위치에서의 뉴클레오티드로부터 11개 염기쌍 반복 서열(repeat sequence)을 포함하는 변이된 돼지 시르코바이러스 2 형 아형 B1.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
돼지 시르코바이러스 균주가 불활화된 것인 신규 돼지 시르코바이러스 균주.
전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
돼지 시르코바이러스 균주가 돼지 시르코바이러스 2형에 대하여 객체에서의 면역 반응을 유도하기 위한 것인 신규 돼지 시르코바이러스 균주.
돼지 시르코바이러스 2형 수반 질병을 치료하기 위한, 전술한 항 중 어느 한 항에 따른 치료학적으로 효과적인 양의 돼지 시르코바이러스 균주를 포함하는 조성물.
이유후 전신성 소모성증후군, 돼지 피부염 신증증후군, 돼지 호흡기질병복합체, 번식장애, 육아종성 장염, 돼지 삼출성 표피염, 괴사성 림프절염, 및 선천성진전르로부터 선택된 돼지 시르코바이러스 2형 수반 질병을 치료하기 위한, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 치료학적으로 효과적인 양의 돼지 시르코바이러스 균주를 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 시르코바이러스 균주 생산을 위한 숙주 세포.
제 9항에 있어서,
상기 숙주세포는 돼지 고환 세포로부터 유래된 것인 숙주 세포.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,
상기 숙주세포는 CNCM에 기탁번호(CNCM I-4093 또는 CNCM I-4092)를 갖는 숙주 세포.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 돼지 시르코바이러스 2 형 바이러스를 증식하기 위한 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 영구적으로 감염된 숙주세포의 용도.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 시르코바이러스 배양 접종물으로 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포에 접종하는 단계; 상기 바이러스가 성장하기에 적절한 조건하에서 상기 세포를 성장시키는 단계; 및 상기 세포로부터 돼지 시르코바이러스 2 형을 회수하는 단계를 포함하는, 돼지 시르코바이러스 2 형 바이러스를 생산하는 방법.
제 13항에 있어서,
상기 돼지 시르코바이러스 2형 바이러스가 10⁶TCID₅₀ 바이러스 입자/mL까지의 역가로 생산되는 방법.
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 상기 시르코바이러스 게놈의 큰 유전자간 영역으로 삽입하는 단계; 10⁶TCID₅₀ 바이러스 입자/mL까지의 역가를 얻기 위한 적절한 조건하에서 세포 주를 성장시키는 단계를 포함하는 돼지 시르코바이러스 2 형 바이러스를 증식시키는 방법.
10⁶TCID₅₀ 바이러스 입자/mL까지의 역가 또는 10⁵내지 10⁸TCID₅₀ 바이러스 입자/mL 를 포함하는, 제 13 항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 방법으로 수득되는 돼지 시르코바이러스 2B 형 조성물.
제 10 항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 숙주세포를 접종하는 단계; 상기 세포를 상기 시르코바이러스가 성장하기에 적절한 조건 하에서 성장시키는 단계; 및 상기 세포로부터 돼지 시르코바이러스를 회수시키는 단계를 포함하는, 돼지 시르코바이러스 1 또는 2 형, 아형 A 또는 B를 증식시키는 방법.
서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호의 퇴화 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 또는 가혹한 조건하에서의 유전자 암호의 퇴화 내에서 이에 상응하는 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 반복된 유전자를 갖는, 돼지 시르코바이러스 2 형 아형 B1 게놈의 41 위치에서의 뉴클레오티드로부터 11개 염기쌍 반복 서열(repeat sequence)을 포함하는 돼지 시르코바이러스 2 형 아형 B의 게놈을 포함하는 핵산 분자.
서열 번호 1, 서열번호 2 또는 상기 폴리펩티드를 코드화하는 이들의 일부를 포함하는 하나 이상의 시르코바이러스 폴리펩티드 발현을 위한 핵산 분자.
서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변이된 ORF1 발명을 위한 핵산 분자.
제 20항 또는 제 21항에 있어서,
상기 핵산이 동질성 또는 이질성 프로모터와 같은 포로모터 서열 및 시스-작용 전사 조절 유전자(cis-acting transcription regulatory sequence)와 기능적으로 연결된, 핵산 분자.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자에 의하여 코드화된 단백질.
제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 바이러스, 플리스미드 또는 숙주세포.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 따른 시르코바이러스 2 형, 이의 서브유니트, 제 23항의 재조합 단백질, 제 24항의 재조합 벡터, 바이러스 또는 플라스미드 또는 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 증식하는 세포 주 및 수의학적으로 허용가능한 운반체(vehicle) 또는 부형제를 포함하는, 돼지 시로코바이러스에 대하여 면역하적 반응을 유도시키기 위한 시르코바이러스 백신 조성물.
제 25항에 있어서,
상기 조성물은 제 16항의 조성물로부터 제형화되는 것인 시르코바이러스 백신 조성물.
제 25항 내지 제 26항중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 추가적으로 경질 파라핀 오일(light paraffin oil), 카보머(carbomer), 수산화 알루미늄(aluminium hydroxide), 사포닌(saponins), 아비리딘(aviridine), (N,N-디옥타데실(dioctadecyl)-N', N'-비스(bis)(2-히드록시에틸)-프로판디아민(propanediamine)), DMRIE 또는 DDA, 약학적으로 허용 가능한 담체, 및/또는 시토킨(cytokine)과 같은 보조제를 포함하는 시르코바이러스 백신 조성물.
제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시르코바이러스 백신 조성물은 돼지 시르코바이러스 수반 질병을 치료하기 위한 것인 시르코바이러스 백신 조성물.
제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돼지 시르코바이러스 수반 질병은 이유후 전신성 소모성증후군, 돼지 피부염 신증증후군, 돼지 호흡기질병복합체, 번식장애, 육아종성 장염, 돼지 삼출성 표피염, 괴사성 림프절염, 및 선천성 진전으로부터 선택된 질병인 시르코바이러스 백신 조성물.
제 25항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 돼지의 또 다른 질병-유발 유기체를 억제하기에 효과적인 면역학적으로 활성 구성성분을 추가적으로 포함하는 시르코바이러스 백신 조성물.
제 30항에 있어서,
상기 조성물은 효과적인 양의 PCV2 아형 A 바이러스를 추가적으로 포함하는 시르코바이러스 백신 조성물.
제 30항에 있어서,
상기 조성물은 추가적으로 아티노바실러스 플루로뉴노미아(Actinobacillus pleuropneunomia); 아데노바이러스(Adenovirus); 동부 말 뇌척수염 바이러스 (Eastern equine encephalomyelitis viruses)와 같은 알파바이러스(Alphavirus); 발란티디움 콜리(Balantidium coli); 보르텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica); 브라키스피라 종(Brachyspira spp.), 바람직하게는 B. 히오디엔테리아(hyodyentheriae), B. 필로시콜리(pilosicoli), B. 이노센스 (innocens), 브루셀라 수위스(Brucella suis), 바람직하게는 비오바르스(biovars) 1, 2 및 3; 고전적 돼지 발열 바이러스(Classical swine fever virus), 아프리카 돼지 발열 바이러스(African swine fever virus); 클라미디어(Chlamydia) 및 클라미도필라 종(Chlamydophila sp.) 및 바람직하게는 C. 페코럼(pecorum) 및 C. 아보투스(abortus); 클로스트리듐 종(Clostridium spp.), 바람직하게는 Cl. 디피실(difficile), Cl. 페르프링겐(perfringens) 형(types) A, B 및 C, Cl. 노비(novyi), Cl. 셉티쿰(septicum), Cl. 테타니(tetani); 소화기(Digestive) 및 기관지(respiratory) 코로나바이러스(Coronavirus); 크립토스포리듐 파르붐(Cryptosporidium parvum); 에이메리아 종(Eimeria spp); 미코플라즈마 하에모수위스(Mycoplasma haemosuis)로 현재 지칭되는 에페리쓰로주니스 수위스(Eperythrozoonis suis) ; 에리시펠로쓰릭스 류시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae); 대장균 (Escherichia coli); 해모필루스 파라수위스(Haemophilus parasuis), 바람직하게는 아형 1, 7 및 14; 혈구응집 뇌척수염 바이러스(Hemagglutinating encephalomyelitis virus); 이소스포라 수위스(Isospora suis) ; 일본 뇌척수염 바이러스 (Japanese Encephalitis virus); 노소니아 인트라셀루라리스 (Lawsonia intracellularis); 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 바람직하게는 렙토스피라 오스트랄리스(Leptospira australis), 렙토스피라 카니콜라(Leptospira canicola), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa), 렙토스피라 익테로해모라지카에(Leptospira icterohaemorrhagicae), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 렙토스피라 포모나(Leptospira Pomona) 및 렙토스피라 타라소비(Leptospira tarassovi); 만하이미아 해몰리티카(Mannheimia haemolytica) ;미코박테리움 종(Mycobacterium spp). 바람직하게는, M. 아비움(avium), M. 인트라셀룰라레(intracellulare) 및 M. 보비스(bovis): 미코플라스마 히포뉴모니아에(Mycoplasma hyponeumoniae); 파르보바이러스(Parvovirus); 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida); 포신 시토메골로바이러스 (Porcine cytomegolovirus); 포신 파로바이러스(Porcine parovirus), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(porcine reproductive and respiratory syndrome virus): 슈도라비에스 바이러스(Pseudorabies virus); 로타바이러스(Rotavirus); 사지야마 바이러스 (Sagiyama virus) ; 살로넬라 종(Salmonella spp), 바람직하게는, S. 티히무리움(thyhimurium) 및 S. 콜레라에수위스(choleraesuis); 스타필로코커스 종 (Staphylococcus spp) 바람직하게는, S. 히쿠스(hyicus); 스트렙토코커스 종 (Streptococcus spp.), 바람직하게는 스트렙토코커스 수위스(Strep. suis); 스와인 시토메갈로바이러스 (Swine cytomegalovirus); 스와인 헤르페스 바이러스(Swine herpes virus); 스와인 인플루엔자 바이러스 (Swine influenza virus); 스와인 폭스 바이러스 (Swine pox virus); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii) ; 수포성 구내염 바이러스 (Vesicular stomatitis virus) 및 돼지 포진 바이러스 (virus of exanthema of swine); 또는 기타 포신 시르코바이러스의 분리물(isolate) 또는 아형(subtype)으로부터 선택된 하나 이상의 돼지 병원체로부터 선택된 하나 이상의 병원체를 포함하는 시르코바이러스 백신 조성물.
제 25항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 따른 면역학적으로 유효한 양의 조성물을 투여함을 포함하는, 돼지 시르코바이러스 2형에 대한 숙주 면역 반응을 유도하기 위한 방법.
제 25항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 따른 면역학적으로 유효한 양의 조성물을 투여함을 포함하는, 동물의 돼지 시르코바이러스 수반 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법.
제 34항에 있어서,
상기 돼지 시르코바이러스 수반 질병은 이유후 전신성 소모성증후군, 돼지 피부염 신증증후군, 돼지 호흡기질병복합체, 번식장애, 육아종성 장염, 돼지 삼출성 표피염, 괴사성 림프절염, 및 선천성 진전으로부터 선택된 질병인 방법.
제 33항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 동물에 비경구적, 근육내, 경피적, 경구적, 안구내 똔느 비강내 투여법으로 투여되는 방법.
면역학적으로 유효한 양의 제 25항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 콘테이너.
제 37항의 콘테이너, 및 PCV2 수반 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 돼지로의 상기 면역학적으로 유효한 양의 상기 조성물의 투여를 위한 정보를 포함하는 사용 설명서를 포함하는 키트.
서열번호 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열, 이의 단편, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 99% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오티드와 80% 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열과 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 서열에 상응하는 DNA 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단용 키트 또는 시약.
제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 개시된 바이러스와 결합 가능한 다클론 또는 단일클론 항체 또는 이의 서브유니트를 포함하는 진단용 키트 또는 시약.
조직 또는 액체 시료를 회수하는 단계; 상기 시료를 제 39항 또는 제 40항에 개시된 진단용 시약과 접촉시키는 단계; 및 상기 시료중 돼지 시르코바이러스 존재를 혼성화법, PCR, 면역형광법, 웨스턴 블롯법, ELISA 또는 면역크로마토그래피법에 의하여 탐지하는 단계를 포함하는 돼지 중 시르코바이러스 존재를 진단하는 방법.