JP6150864B2 - ブタサーコウイルス2型(pcv2)、それを含有する免疫原性組成物、試験キット、およびその応用 - Google Patents
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Description
ブタサーコウイルスは、ブタに感染することはできても、感染したブタに病変を引き起こさない。ブタサーコウイルスは、1,759塩基対(bp)の環状ゲノムを有する、正20面体状の一本鎖DNAウイルスである。PK−15に由来するPCVは、1995年にサーコウイルス科(Circoviridae)に分類された。
1991年にカナダで大流行して以来、PMWSは、北アメリカ、ヨーロッパ、およびアジアの多くの国々で報告されている。その後、新たなサーコウイルスが、PMWSを有するブタから単離された。PMWS由来ブタサーコウイルスの形態は、PK−15由来PCVの形態とよく似ているが、この2つのブタサーコウイルスは、ゲノム配列では68〜76%の相同性を共有しているに過ぎない。更に、非病原性PK−15由来PCVおよび病原性PMWS由来PCVは、それぞれブタサーコウイルス1型(PCV1)およびブタサーコウイルス2型(PCV2)として識別された。
PCV2ゲノムは、1,767個または1,768個のヌクレオチドを含み、11個の潜在的オープンリーディングフレーム(ORF)を有すると考えられている。11個のORFの中で、ORF1およびORF2は、最も重要な遺伝子である可能性が高く、それらは、それぞれ複製(RepおよびRep’)タンパク質およびカプシド(Cap)タンパク質をコードする。PCV2 ORF2遺伝子によりコードされるカプシド(Cap)タンパク質は、中和抗体の産生を誘導する抗原である可能性が最も高いだろう。
しかしながら、ワクチンのタイプには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:不活化ワクチン、生(弱毒化)ワクチン(ウイルスの弱毒化による)、サブユニットワクチン、DNAワクチン、および新規PCV2株(PCV2 H株)または新規PCV2株(PCV2 H株)のDNAもしくはアミノ酸配列に由来または生成される他のワクチン。
界面活性剤は、以下のものからなる群から選択される1つまたは複数である:ソルビトール脂肪酸エステル;ソルビトール脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド(またはプロピレンオキシド)の濃縮物;マンニトール脂肪酸エステル:マンニトール脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド(またはプロピレンオキシド)の濃縮物;カルボン酸、アミン、アミド、アルコール、ポリオール、エーテル、およびオキシドからなる群から選択される1つまたは複数である親水基を有する修飾マンニトール脂肪酸エステル;アンヒドロマンニトール脂肪酸エステル;カルボン酸、アミン、アミド、アルコール、ポリオール、エーテル、およびオキシドからなる群から選択される1つまたは複数である親水基を有する修飾アンヒドロマンニトール脂肪酸エステル;サッカロース脂肪酸エステル;サッカロース脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド(またはプロピレンオキシド)の濃縮物;グリセロール脂肪酸エステル;グリセロール脂肪酸エステルおよびエチレンオキシド(またはプロピレンオキシド)の濃縮物;脂肪酸およびエチレンオキシド(またはプロピレンオキシド)の濃縮物;脂肪アルコールおよびエチレンオキシド(またはプロピレンオキシド)の濃縮物;およびグリセロリン脂質。油性物質は、鉱油、植物油、および動物油からなる群から選択される1つまたは複数である。
病原体抗原のタイプには、これらに限定されないが、組換えタンパク質、サブユニットタンパク質、遺伝子欠陥を有する病原体、不活化病原体抗原等が含まれる。
1つの好ましい実施形態では、DNA断片は、新規PCV2株(PCV2 H株)の全長ゲノム配列(配列番号1)である。別の好ましい実施形態では、DNA断片は、新規PCV2株(PCV2 H株)のオープンリーディングフレーム(ORF)であり、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:
配列番号3のアミノ酸配列をコードする配列番号2のヌクレオチド配列を有するオープンリーディングフレーム1(ORF1)、
配列番号5のアミノ酸配列をコードする配列番号4のヌクレオチド配列を有するオープンリーディングフレーム2(ORF2)、および
配列番号7のアミノ酸配列をコードする配列番号6のヌクレオチド配列を有するオープンリーディングフレーム3(ORF3)。
試験キットには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:(1)1つの好ましい実施形態では、新規PCV2株(PCV2 H株)の抗原であり、上記抗原は、抗原プレートに配置されており、不活化試薬で不活化されている;(2)新規PCV2株(PCV2 H株)に由来するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体;(3)新規PCV2株(PCV2 H株)の全長ゲノム配列(配列番号1)またはヌクレオチド断片(配列番号2、4、および6)に由来する遺伝子操作抗原または抗体;および(4)新規PCV2株(PCV2 H株)の全長ゲノム配列(配列番号1)またはヌクレオチド断片(配列番号2、4、および6)に由来するポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、プライマーおよびプローブが含まれる。1つの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、新規PCV2株(PCV2 H株)を検出するために使用でき、配列番号8〜11のヌクレオチド配列を有するプライマーである。
本発明は、以下の詳細な説明および添付の図面を用いるとより容易に理解可能になるが、それらは例示目的で示されているに過ぎず、したがって本発明を限定するものではない。
1.種ウイルスの供給源および単離:
組織試料は、Hsin−Chu(台湾)の養豚場の子ブタの肺およびリンパ節から採取した。これら子ブタは8週齢であり、離乳後多臓器消耗症候群(PWMS)の臨床症状を示していた。肺およびリンパ節試料を採取し、−70℃で凍結した。
細胞を、37℃、5%CO2で1時間インキュベートした後、無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。その後、細胞を、37℃、5%CO2にて4時間、2%FBSを含有するMEM培地でインキュベートした。
その後、MEM培地を廃棄し、細胞を、300mM D−グルコサミンと共に30分間インキュベートした。その後、細胞を無菌PBSで3回洗浄し、37℃、5%CO2にて72時間、8%FBSを含有するMEM培地でインキュベートした。最後に、細胞培養を、免疫蛍光アッセイ(IFA)でPCV2について試験した。
その後、抗血清を廃棄し、細胞を、無菌PBSで3回、毎回5分間洗浄した。その後、細胞を、75μlのウサギ抗ブタIgG−FITC(分子全体)(Sigama社、F1638)(二次抗体、PBSで1:1000希釈)と共に、37℃で30分間インキュベートした。その後、抗体を廃棄し、細胞を、無菌PBSで3回、毎回5分間洗浄した。最後に、96ウエル培養皿中の細胞試料の各々を、蛍光顕微鏡検査用に200μlのPBS中にマウントした。
新しく調製したPK−15細胞またはその派生細胞系に、新規PCV2株(PCV2 H株)を播種した。播種細胞から回収したウイルスは、PCV2 H株の継代1(P1)だった。PCV2 H株のP1を含有する細胞培養上清を収集し、希釈(1:2)し、新しく調製したPK−15細胞またはその派生細胞系に播種した。
播種細胞を3日間インキュベートした後、PCV2 H株の継代2(P2)を含有する細胞培養上清を収集し、希釈(1:2)し、新しく調製したPK−15細胞またはその派生細胞系に播種した。播種細胞を3日間インキュベートし、次に、PCV2 H株の継代3(P3)を含有する細胞培養上清を収集した。このプロセスを、更に3回繰り返して、PCV2 H株の継代6(P6)を得た。
本発明で単離されたPCV2 H株のゲノムは、配列番号1のヌクレオチド配列を有する。配列番号1のヌクレオチド配列を、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のGenBankデータベースの配列と比較した。
比較の結果は、PCV2 H株が、幾つかのPCV2配列(表1)と99%相同性であったことを示したが、データベースには、PCV2 H株のゲノム配列(配列番号1)と同一(100%相同性)である配列は存在しない。したがって、アラインメントの結果に基づくと、本発明で単離されたウイルス、PCV2 H株は、PCV2ファミリーに属し、新しい株であることが示されている。
図2に示されているPCV2 H株のゲノム配列の系統発生解析に基づくと、PCV2 H株は、PCV2 2dサブグループのメンバーであることが示されている。
比較の結果は、PCV2 H株のORF2のヌクレオチド配列(配列番号4)またはアミノ酸配列(配列番号5)と同一(100%相同性)の配列が、NCBI GenBankデータベースには存在しないことを示している。PCV2 H株のORF2のアミノ酸配列(配列番号5)とGenbankデータベース配列との最も高い相同性は、98%であった。
図3には、PCV2 H株のORF2のアミノ酸配列(配列番号5)と最も高い相同性を示す上位3つの配列とのアラインメントが示されており、このアラインメントによると、配列番号5の6つのアミノ酸が、上位3つの配列と異なっていることが示されている。PCV2 H株のORF2のアミノ酸配列(配列番号5)を、PCV2 2dサブグループプロトタイプ(GenBank登録番号:ZJ0955b)のORF2のアミノ酸配列(GenBank登録番号:ADD25772)と更に比較した。
図4に示されている結果は、この2配列間では7つのアミノ酸が異なっており、この2配列は、97%相同性を共有していることを示す。
1.ウイルス培養
ブタサーコウイルス(PCV)、ブタコレラウイルス(CSFV)、ブタアデノウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)、仮性狂犬病ウイルス(PRV)、ブタ水疱病ウイルス(SVDV)、マイコプラズマ、および細菌に感染していないPK−15細胞を、37℃、5%CO2にて細胞培養増殖培地(5%FBSを含有するMEM培地(pH7.2±0.2))で培養した。
PK−15細胞の単層が形成された後、PK−15細胞を、0.2%トリプシン−EDTAを用いて剥離し、細胞計数用の細胞培養維持培地(2%FBSを含有するMEM培地(pH7.4±0.2))に懸濁した。その後、細胞を、細胞培養増殖培地で3.0×105細胞/mlの終濃度に希釈し、ローラーボトルに配分し、37℃にて3〜4日間培養してコンフルエント単層に到達させた。その後、ローラーボトル内部の細胞培養培地を廃棄し、細胞をPBSで洗浄した。
PCV2 H株のウイルス原液を、細胞培養維持培地で104.0TCID50/mlの終濃度に希釈し、ローラーボトルのPK−15細胞単層に播種した。ウイルスを増殖させるため、感染細胞を、37℃で48〜96時間インキュベートした。PCV2 H株のウィルス力価を、免疫蛍光アッセイ(IFA)によりモニターした。その後、PCV2 H株のウイルス溶液を収集するため、ウイルス力価が106.0TCID50/ml以上に達したか、または細胞変性効果(CPE)が70〜80%に達した時点で、細胞培養の上清を回収した。
37パーセント(37重量%)のホルムアルデヒドを、前述のステップで収集したPCV2 H株のウイルス溶液に添加して、終濃度を0.2%(w/v)にし、その後ウイルスを、37℃にて少なくとも24時間、好ましくは48時間、ホルムアルデヒドと共に連続振とうすることにより不活化した。ウイルスを完全に不活化した後、ホルムアルデヒドを含有するPCV2 H株のウイルス溶液を遠心分離して、ホルムアルデヒドを除去した。その後、遠心分離したウイルス溶液を、蒸留水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)等の緩衝溶液に懸濁し、懸濁ウイルス溶液を、PCV2 H株不活化ワクチンの不活化抗原原液とし、後の使用のために4℃で保管した。
水中油中水型(W/O/W)乳剤用のMONTANIDE(登録商標)ISA 206油性ワクチンアジュバント等の無菌2相性乳化アジュバントを、混合および乳化するために、乳剤タンク内のPCV2 H株不活化ワクチンの不活化抗原原液に添加して、終濃度50%(v/v)にした。乳化産物は、油性アジュバントを有するPCV2 H株不活化ワクチンである。
この例で使用される2相性乳化アジュバント(水中油中水型乳剤アジュバント等)は、これらに限定されないが、以下のものに置き換えることができる:油性アジュバント(鉱油、植物油、動物油、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント等)、水性アジュバント(水酸化アルミニウム等)、生物学的アジュバント(CpGオリゴデオキシヌクレオチドおよびトキソイド等)。
この例におけるPCV2試験キットは、PCV2 H株のウイルス抗原を含有する抗原プレートである。最初に、PK−15細胞またはその単クローン細胞系を培養し、トリプシン処理し、2×105細胞/mlの終濃度で細胞培養培地に再懸濁した。50マイクロリットル(μl)のPK−15細胞および50μlのPCV2 H株のウイルス原液(1×103TCID50/ml)を、96ウエル細胞培養プレート(平底)の各ウエルに添加し、37℃、5%CO2にて72時間インキュベートした。
PCV2 H株に感染した細胞を、無菌PBSで2回洗浄し、室温にて15分間80%アセトンで固定した。その後、アセトンを廃棄し、細胞を、無菌PBSで3回洗浄した。その後、プレートを逆さまにし、次いで37℃のインキュベータで乾燥させた。乾燥させたプレートは、PCV2 H株のウイルス抗原を含有する抗原プレートであり、ELISA試験に使用して、血清試料中のPCV2に対する抗体量を検出できる。その後、プレートを、後の使用のために−20℃で保管した(Tischer et al., 1995)。
この例におけるPCV2試験キットは、PCV2 H株の組換えカプシドタンパク質を含有する抗原プレートである。組換えカプシドタンパク質は、抗原プレートの抗原である。カプシドタンパク質は、PCV2 H株のORF2遺伝子によりコードされており、配列番号5のアミノ酸配列を有する。
PCR反応には、8μlのテンプレートDNA、5μlの10×PCR緩衝液(MDBio社)、8μlのdNTP(各1.25mM)、1μlの各プライマー(各50μM)、および0.5μlのPfu DNAポリメラーゼ(MDBio社)を含有ししており、最終容積が50μlであるPCR混合液を、GeneAmp PCRシステム2400反応装置(Applied Biosystems社)に設置した。
PCR反応は、PCR混合液を95℃で5分間予熱する初期ステップから開始し、DNA増幅は、以下のパラメーターのサイクルを25回繰り返すことにより実施した:95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、および72℃で30秒間の伸長。PCR反応は、72℃で5分間の最終伸張ステップで終了した。PCR産物を、PCR−Mクリーンアップキット(Viogene社)で精製した。
制限酵素切断反応の後、消化したPCR産物およびpET24a発現ベクターを、PCR−Mクリーンアップキット(Viogene社)を用いてそれぞれ精製した。精製したPCR産物を、精製したpET24a発現ベクターにライゲーションし、ライゲーション産物を宿主細胞(大腸菌、E.coli)に導入した。形質転換体を選択し、DNA塩基配列決定法により正確な配列を有するクローンを特定し、pET24a−ORF2と命名した。
1ミリリットルの培養物を遠心分離し(10,000×g)、次いで、B−PERTM細菌タンパク質エクストラクション(Pierce Protein Research Produces社)を用いて、組換えタンパク質が、可溶性タンパク質かまたは封入体かを決定した。40マイクロリットル(μl)の試薬を、遠心分離した細菌に添加し、1分間ボルテックスミキサーで振とうした。その後、混合物を10,000×gで遠心分離した。
上清に懸濁されていたタンパク質は、可溶性タンパク質であり、下部(ペレット)のタンパク質は封入体だった。可溶性タンパク質を、SDS−PAGE分析用の1×試料緩衝液に溶解し、封入体を、SDS−PAGE分析用の2×試料緩衝液と混合した。試料は両方とも、20分間沸騰させ、その後遠心分離した。両試料の上清中のタンパク質を、15%SDS−PAGEで分離し、PCV2 H株の組換えカプシドタンパク質の発現を分析した。分析後、PCV2 H株の組換えカプシドタンパク質を使用して、抗原プレートを製作した。
1.抗PCV2 H株ポリクローナル抗体
十分なウィルス力価を有する不活化PCV2 H株を、フロインド完全アジュバント等の好適なアジュバントと混合した。混合物を、マウス、ブタ、ヤギ、およびウサギ等の動物に一次接種した。必要に応じて、適切な期間をおいて(2〜3週間等)二次免疫を実施してもよい。
更に適切な期間をおいて(2〜3週間等)、接種した動物の血清を、抗PCV2 H株ポリクローナル抗体として採取した。
十分なウイルス力価を有する不活化PCV2 H株またはPCV2 H株の特異的抗原断片(ORF2等)を、動物(マウス等)に一次接種した。必要に応じて、非活化ウイルスまたは抗原断片を、フロインド完全アジュバント等の好適なアジュバントと混合できる。また、必要に応じて、適切な期間をおいて(2〜3週間等)二次免疫を実施してもよい。
更に適切な期間をおいて(2〜3週間等)、接種した動物の血清を採取して、動物の脾臓細胞が、抗PCV2 H株モノクローナル抗体の産生に好適か否かを評価した。接種した動物から採取した好適な脾臓細胞およびミエローマ細胞(FO細胞系およびNS細胞系等)の細胞融合は、ポリエチレングリコール(PEG1500等のPEG)を使用して達成した。適切な特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを融合細胞から選択し、次いで、抗PCV2 H株モノクローナル抗体を産生するのに好適なハイブリドーマにサブクローニングした。
1.ワクチン接種プロトコールおよび試料採取
5〜6週齢の特定病原体除去(SPF)Balb/cマウスを、無作為に各群15匹マウスの4群に分割した。ELISA試験は、60匹のマウス全てが、抗PCV2抗体に陰性だったことを示した。3ワクチン接種群(第1群〜第3群)のマウスに、3つのロット違いの0.2ml不活化PCV2 H株ワクチンをそれぞれ筋肉内注射した。一次免疫(p.i.)の2週間後に、3ワクチン接種群のマウスを、同じ用量の3つのロット違いのワクチンで追加免疫した。第4群のマウスにはワクチン接種をせず、陰性対照とした。一次免疫(p.i.)の2、3、4、および5週間後に、各群から5匹のマウスを無作為に選択し、血清試料を採取した。血清試料は全てELISAにより試験した。
実施例3または4で調製した抗原プレートは、この例ではELISAプレートとして使用できる。ELISAプレートを、500μl/LのTween−20を含有する50mmol/LのPBS(pH7.2)(つまり、PBST)で、3回、毎回3〜5分間洗浄した。
ELISAプレートをブロッキングするために、200μLの0.15%BSAブロッキング溶液を、ELISAプレートの各ウエルに添加し、その後、ELISAプレートを37℃で2時間インキュベートした。その後、ELISAプレートをPBSで洗浄した。マウス血清試料を、PBSで50倍(1:50)希釈し、その後、2倍連続希釈を行った。希釈した血清試料を、ELISAプレートのウエルに添加し(100μl/ウエル)、プレートを37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSで洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体(ウサギ抗マウス二次抗体等)を、ウエルに添加した。
37℃で1時間インキュベートした後、プレートをPBSで洗浄した。結果を視覚化するため、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)をウエルに添加した。インキュベーションした後、2mM H2SO4を添加することにより反応を停止させた。結果は、陽性対陰性(P/N)比として報告した。P/N比は、所与の試験試料の450nmにおける光学密度(OD450)を、標準陰性対照のOD450で除算することにより算出した。P/N比≧2.1を、陽性とみなした。P/N比≧2.1の最大希釈を、血清試料のELISA抗体価とみなした。
一次免疫(p.i.)の2週間後に、抗PCV2 H株抗体が全てのワクチン接種マウスで検出された。二次免疫後、ワクチン接種マウスのELISA抗体価は、一次免疫後日数(d.p.i.)35日で1800〜2000に達した(図5)。したがって、これらの結果は、本発明の不活化PCV2 H株ワクチンが、マウスの免疫応答を効果的に誘導できたことを示した。
1.ワクチン接種プロトコールおよび試料採取
5〜6週齢の2匹の健常子ブタに、1mlの不活化PCV2 H株ワクチンをそれぞれ筋肉内注入した。一次免疫(p.i.)の3週間後に、同じ用量のワクチンで子ブタを追加免疫した。血清試料を、一次免疫前(5〜6週齢)、二次免疫前(8〜9週齢)、および二次免疫の2週間後(10〜11週齢)に両子ブタから採取した。血清採取と同じ時点で、両子ブタを計量した。血清試料は全てELISAにより試験した。
実施例3または4で調製した抗原プレートは、この例ではELISAプレートとして使用できる。ELISAプレートを、500μl/LのTween−20を含有する50mmol/LのPBS(pH7.2)(つまり、PBST)で、3回、毎回3〜5分間洗浄した。ELISAプレートをブロッキングするために、200μLの0.15%BSAブロッキング溶液を、ELISAプレートの各ウエルに添加し、その後、ELISAプレートを37℃で2時間インキュベートした。その後、ELISAプレートをPBSで洗浄した。
ブタ血清試料を、PBSで50倍(1:50)希釈し、その後、2倍連続希釈を行った。希釈した血清試料を、ELISAプレートのウエルに添加し(100μl/ウェル)、プレートを37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをPBSで洗浄した。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体(ヤギ抗ブタ二次抗体等)を、ウエルに添加した。37℃で1時間インキュベートした後、プレートをPBSで洗浄した。結果を視覚化するために、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)をウエルに添加した。インキュベーション後、2mM H2SO4を添加することにより反応を停止させた。
結果は、陽性対陰性(P/N)比として報告した。P/N比は、所与の試験試料の450nmにおける光学密度(OD450)を、標準陰性対照のOD450で除算することにより算出した。P/N比≧2.1を、陽性とみなした。P/N比≧2.1の最大希釈を、血清試料のELISA抗体価とみなした。
一次免疫(p.i.)の3週間後に、抗PCV2 H株抗体が両ワクチン接種子ブタで検出された。二次免疫の2週後、ワクチン接種した子ブタのELISA抗体価は、11,000を超えていた(表2)。したがって、これらの結果は、本発明の不活化PCV2 H株ワクチンが、ブタの免疫応答を効果的に誘導できたことを示した。
1.ワクチン接種プロトコールおよび試料採取
2週齢の40匹の健常子ブタを、各群10匹子ブタの4群に無作為に分割した。3週齢時に、3ワクチン接種群(第1群〜第3群)の子ブタに、3つのロット違いの1ml不活化PCV2 H株ワクチンをそれぞれ筋肉内注射した。一次免疫(p.i.)の3週間後に、同じ用量のワクチンで子ブタを追加免疫した。第4群の子ブタにはワクチン接種をせず、陰性対照とした。血清試料を、一次免疫の1週間前(2週齢)、ならびに一次免疫の1、2、3、および5週間後(それぞれ、4週齢、5週齢、6週齢、および8週齢)に、全ての子ブタから採取した。子ブタは全て、3、4、5、6、および8週齢時に計量した。血清試料は全てELISAにより試験した。
実施例3で調製した抗原プレートを、この例で使用した。抗原プレートを、−20℃から取り出し、37℃で解凍および乾燥した。ブタ血清試料を、PBSで50倍(1:50)希釈し、その後2倍連続希釈を行った。希釈した血清試料を、抗原プレートのウエルに添加し(50μl/ウエル)、プレートを37℃で30分間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをPBSで3回洗浄し、未結合抗体を除去した。その後、50マイクロリットル(50μl)のFITC結合ウサギ抗ブタIgG(1:100、Sigma社)を、ウエルに添加した。暗所で30分間インキュベートした後、プレートをPBSで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で検査して、抗PCV2 H株抗体の力価を算出した。(Rodriguez−Arriojaら、2000年)
3.1 抗体価
一次免疫(p.i.)の2週間後、ワクチン接種子ブタ(5週齢)に由来する血清試料は、約600のIFA力価を示したが、対照群に由来する血清試料は、約200のIFA力価を示した(表4および図6)。二次免疫後、ワクチン接種子ブタ(6週齢)のIFA力価は劇的に増加した(IFA力価は、13,000を超えている)。8週齢では、ワクチン接種子ブタは、46,000を超えるIFA力価を示したが、非ワクチン接種子ブタは、約170の非常に低いIFA力価を示した。
ワクチン接種子ブタは、対照群の非ワクチン接種子ブタよりも高い体重増加を示した(表5および図7)。8週齢では、ワクチン接種子ブタは、非ワクチン接種子ブタよりも体重が約2kg重かった。
1.ワクチン接種プロトコールおよびPCV2感染
14〜16日齢の子ブタを、各群5匹子ブタの4群に無作為に分割した。20匹の子ブタは全て、抗PCV2抗体に陰性だった。3ワクチン接種群(第1群〜第3群)の子ブタに、3つのロット違いの1ml不活化PCV2 H株ワクチンをそれぞれ筋肉内注射した。
一次免疫(p.i.)の2週間後、同じ用量のワクチンで子ブタを追加免疫した。第4群の子ブタにはワクチン接種をせず、陰性対照とした。一次免疫の5週間後に、全ての子ブタを、1ml当たり106.0の50%組織培養感染用量(106.0TCID50/ml)のPCV2 H株(毒性株)ウイルス原液で負荷した。各子ブタを、1mlのウイルス原液で鼻腔内に、および2mlのウイルス原液で筋肉内に負荷した。血清および鼻腔スワブ試料を、負荷の7、11、19、および25日後に採取して、PCRによりPCV2ウイルス血症を検出した。
PCRを使用して、PCV2負荷後に採取したブタ血清試料中のウィルスDNAレベルを決定した。ウィルスDNAを、DNAzol(登録商標)試薬で抽出した。最初に、400μlのDNAzol(登録商標)試薬を、200μlの血清に添加し、混合物を12,000rpmで15分間遠心分離した。上清を2倍容積の無水エタノールと混合して、DNAを沈殿させた。混合物を、12,000rpmで15分間遠心分離した後、上清を廃棄した。DNAペレットを75%エタノールで洗浄し、12,000rpmで15分間遠心分離してエタノールを除去し、最終的に8mM NaOHに溶解した。
PCV2−F1:5’GTGAAGTGGTATTTTGGTGCC3’ (配列番号8)
PCV2−R1:5’GTCTTCCAATCACGCTTCTGC3’ (配列番号9)
PCV2−F1(順方向)およびPCV2−R1(逆方向)プライマーを使用して、PCV2のORF1に由来する284bp断片を増幅した。最終容積を25μlとしたPCR混合物は、1μlの順方向プライマー、1μlの逆方向プライマー、1.5μlの25mM Mg2+、2.0μlの2.5mM dNTP、2.5μlの10×無Mg2+緩衝液、0.2μlのTaq DNAポリメラーゼ、11.8μlの蒸留水、および5μlのテンプレートDNAを含有していた。
PCR反応は、PCR混合液を95℃で5分間予熱する初期ステップから開始し、DNA増幅は、以下のパラメーターのサイクルを38回繰り返すことにより実施した:94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、および72℃で30秒間の伸長。PCR反応は、72℃で5分間の最終伸長ステップで終了し、その後4℃で維持した。次に、PCR産物を、1%アガロースゲルで分析し、臭化エチジウム染色により視覚化した。
PCV2−F2:5’TGTTGGCGAGGAGGGTAATG’3 (配列番号10)
PCV2−R2:5’TGGGACAGCAGTTGAGGAGT’3 (配列番号11)
PCV2−F2(順方向)およびPCV2−R2(逆方向)プライマーを使用して、PCV2に由来する676bp断片を増幅した。
負荷の25日後、子ブタを犠牲にして解剖し、器官の病理学的異常を観察し、リンパ節および肺を採取した。組織試料を、4%ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、その後薄片にした。組織切片をヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色し、顕微鏡で観察した。
4.1 ウイルス血症の評価
PCRの結果は、負荷の25日後に、ワクチン接種子ブタ(第1群〜第3群)におけるウイルス血症の発症率が、非ワクチン接種子ブタ(第4群)における発症率より、40〜60%低かったことを示した(表6)。これらの結果は、本発明の不活化PCV2 H株ワクチンが、ブタの免疫を誘導し、ブタのウイルス血症の重症度および持続期間を低減し、PCV2感染からブタを防御できたことを示した。
負荷の25日後に子ブタを犠牲にして解剖した。鼠径部、縦隔、および腸間膜リンパ節の肥大が、2匹の非ワクチン接種子ブタに見られ、リンパ節の切片は蒼白だった。別の非ワクチン接種子ブタは、虚脱していない弾力性のある肺、肺水腫、および白斑腎(white−spotted kidney)を有していた。ワクチン接種子ブタは全て、肉眼でわかる病理学的異常を示さなかった(表7及び表8)。
加えて、炎症性細胞浸潤等の肺の組織病理学的病変が、3匹の非ワクチン接種子ブタに観察され、非ワクチン接種子ブタから試料採取した肺組織のうちの2つが、PCV2ウイルス血症に陽性だった。非ワクチン接種子ブタと比較して、ワクチン接種子ブタは、組織病理学的病変およびPCV2ウイルス血症の著しい低減を示した。リンパ節の組織病理学的病変は、ワクチン接種子ブタ15匹(第1群〜第3群)中1匹(ブタ番号A4)でしか観察されず、ワクチン接種子ブタ(ブタ番号A4)から試料採取したリンパ節が、PCV2ウイルス血症陽性の唯一のリンパ節だった。これらの結果は、本発明の不活化PCV2 H株ワクチンが、PCV2伝染からブタを防御できたことを示した。防御比率は、80%から100%だった。
Claims (10)
- 配列番号1のゲノム配列を含むことを特徴とするブタサーコウイルス2型(PCV2)ウイルス。
- 中国典型培養物保蔵センター(CCTCC)に寄託番号CCTCC V201117として寄託されていることを特徴とする請求項1に記載のブタサーコウイルス2型(PCV2)ウイルス。
- PK−15細胞系またはその派生細胞系に細胞変性効果(CPE)を引き起こすことができることを特徴とする請求項1に記載のブタサーコウイルス2型(PCV2)ウイルス。
- 請求項1に記載のブタサーコウイルス2型(PCV2)ウイルスを含むことを特徴とする免疫原性組成物。
- 薬学的に許容される媒体を更に含むことを特徴とする請求項4に記載の免疫原性組成物。
- 前記PCV2ウイルスは不活化プロセスで処理されていることを特徴とする請求項4に記載の免疫原性組成物。
- ブタインフルエンザウイルス(SIV)の抗原、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の抗原、マイコプラズマの抗原、ブタパルボウイルス(PPV)の抗原、丹毒の抗原、および仮性狂犬病ウイルスの抗原からなる群から選択される少なくとも1つの病原体抗原を更に含むことを特徴とする請求項4に記載の免疫原性組成物。
- 請求項1に記載のPCV2ウイルスのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号5の配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチドは、配列番号4の配列を含むことを特徴とする請求項8に記載のポリヌクレオチド。
- ブタサーコウイルス2型(PCV2)試験キットであって、請求項1に記載のウイルスのウイルス抗原または請求項8に記載のポリヌクレオチドの1以上からなることを特徴とする試験キット。
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US7192594B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
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US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
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US20030096377A1 (en) * | 2001-06-28 | 2003-05-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2 |
US7276353B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
US7279166B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
DK2371383T3 (en) | 2005-12-29 | 2015-11-30 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Use of a PCV2 immunogenic composition for reduction of clinical symptoms in pigs |
EP1941903A1 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
US20090317423A1 (en) * | 2008-01-23 | 2009-12-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
CN101343671A (zh) * | 2008-08-25 | 2009-01-14 | 湖南省兽医总站 | 猪2型圆环病毒pcr快速检测试剂盒 |
TWI367256B (en) * | 2008-10-07 | 2012-07-01 | Academia Sinica | Vaccine composition and kit providing protective immunity against porcine circovirus 2 |
EP2367933A1 (en) * | 2008-11-28 | 2011-09-28 | Ceva Sante Animale | Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof |
CN101549155B (zh) * | 2009-05-27 | 2012-05-09 | 福州大北农生物技术有限公司 | 猪圆环病毒ⅱ型灭活疫苗及其制备方法 |
UA113192C2 (xx) * | 2011-12-06 | 2016-12-26 | Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2) |
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