CN114317456A - 一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法及猪圆环病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型的灭活方法，它是用二乙烯亚胺(BEI)和甲醛联合灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液。本发明猪圆环病毒2型毒株的灭活方法，稳定性好、成本低、灭活周期短，易于大生产应用。用本发明灭活的猪圆环病毒2型毒株制备的疫苗，免疫应激少、免疫效果好，适宜市场推广使用。

Description

一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法及猪圆环病毒疫苗

技术领域

本发明具体涉及一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法及猪圆环病毒疫苗。

背景技术

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型引起的猪的一种传染病，引起仔猪断奶综合征、猪皮炎与肾病综合征及母猪繁殖障碍，其临床表现多样化。猪感染圆环病毒后，可引起严重的免疫抑制，从而继发或并发其他传染病，如猪肺炎支原体、猪繁殖与呼吸综合征等疾病。

甲醛对病毒核酸和病毒蛋白质都有破坏作用,但首先是使病毒核酸灭活,即与含氨基的核苷酸碱基(如A、G、U)结合而使病毒核酸变性。甲醛较高浓度和较长时间的作用，可与病毒蛋白质的胺基结合而形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，后者再与酰胺发生交联反应。病毒蛋白质因而变性,阻止病毒核酸的逸出从而达到灭活的目的。二乙烯亚胺(BEI)作为一种烷化剂，灭活机制是生物DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤,引起单链断裂、双螺旋链交联及干扰酶系统和核蛋白作用，从而破坏核酸代谢、合成，导致病毒核酸芯子破坏而达到灭活目的。相比于甲醛灭活，BEI可以破坏病毒核酸但不改变病毒蛋白质。

目前市场销售猪圆环病毒2型疫苗大多采用甲醛灭活，少数采用BEI灭活，采用甲醛作为灭活剂，工艺成熟，价格低廉，一般需要在37～39℃处理72h左右，使用浓度一般为3‰，配苗免疫易引起免疫应激。目前也有文献报道采用价格更昂贵BEI作为灭活剂进行灭活，使用浓度一般为5mmol/L，通常在37℃处理24～72小时，在BEI浓度太低的情况下，难以保证灭活效果，且工艺不稳定。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法，它是用二乙烯亚胺和甲醛联合灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液。

进一步地，所述二乙烯亚胺在猪圆环病毒2型毒株抗原液中的浓度为1～4mmol/L，优选2mmol/L。

进一步地，所述甲醛在猪圆环病毒2型抗原液中的浓度为0.5‰～1‰，ml/ml，优选浓度为0.8‰，ml/ml。

进一步地，所述灭活是在温度30～40℃，转速80～200rpm/min的条件下灭活24～72小时。

更进一步地，所述灭活是在温度37℃，转速120rpm/min的条件下灭活24小时。

更进一步地，所述灭活后添加硫代硫酸钠终止灭活。

更进一步地，所述硫代硫酸钠在猪圆环病毒2型毒株抗原液中的浓度为1～4mmol/L，优选2mmol/L。

本发明还提供了一种猪圆环病毒灭活疫苗，它是由如下原辅料制备而成：

前述制备的灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液90～100份，吐温-80 1～5份，白油180～200份，司本-80 4～16份，硬脂酸铝2～6份。

进一步地，它是由如下原辅料制备而成：

前述制备的灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液96份，吐温-80 4份，白油188份，司本-80 12份，硬脂酸铝4份。

本发明最后提供了一种前述猪圆环病毒灭活疫苗的制备方法，它包括如下步骤

1)油相制备：取白油和司本-80混合，加硬脂酸铝加热搅拌至透明；

2)水相制备：取吐温-80，灭菌，冷却后加灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液，振荡至吐温-80溶解；

3)乳化：取油相搅拌10～20min，再加入水相搅拌30～60min，即得猪圆环病毒灭活疫苗。

进一步的，步骤3)所述油相搅拌速度为100～300转/分钟，时间30分钟，优选油相搅拌速度300转/分钟；所述加入水相搅拌速度3000转/分钟，时间30分钟。

本发明猪圆环病毒2型毒株的灭活方法，相比于单独用甲醛灭活，具有减少甲醛添加量、保证病毒蛋白质成分结构完整性、作用时间短、且灭活效果更佳、后期配苗免疫减少了免疫应激，且免疫保护效果更佳的优势；相比于BEI灭活方式具有减少BEI添加量、更经济、免疫保护效果更佳的优势，且保证灭活彻底性及灭活抗原的无菌性。本发明灭活方法稳定性高、成本低、灭活周期短，易于大生产应用。用本发明灭活的猪圆环病毒2型毒株制备的疫苗，免疫应激少、免疫效果好，适宜市场推广使用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1不同灭活方式疫苗效力对比试验结果折线图

具体实施方式

实施例1、本发明猪圆环病毒2型毒株的灭活方法

(1)制备二乙烯亚胺(BEI)

将2mol/L的2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)和2mol/L的NaOH溶液等体积混合，置37℃水浴，每隔10～15分钟摇匀1次，60分钟后即环化产生二乙烯亚胺(BEI)，终浓度为1mol/L；

(2)取细胞破碎后的猪圆环病毒2型抗原液，加步骤1)制备的BEI至其浓度为2mmol/L，再加入体积比0.8‰的甲醛，置于37℃恒温摇床120rpm/min灭活24小时，最后加入终浓度为2mmol/L的硫代硫酸钠终止灭活。

实施例2本发明猪圆环病毒灭活疫苗的制备

配方：实施例1制备的灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液96份，吐温-80 4份，注射用白油188份，司本-80 12份，硬脂酸铝4份。

制备方法：

1)油相制备

取注射用白油，加司本-80混合，再加硬脂酸铝加热，边加边搅拌，至透明为止；

2)水相的制备

取吐温-80，装入带玻璃球的瓶中灭菌，冷却后分别加入灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液，充分振荡，使吐温-80完全溶解。

3)乳化取油相置于高速剪切机内，以300转/分钟搅拌10分钟，缓慢加入水相，再以3000转/分钟乳化30分钟。定量分装并密封于4℃，即得。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1猪圆环病毒灭活工艺筛选

1猪圆环病毒2型抗原液制备

将猪圆环病毒2型全病毒按MOI＝0.015接种细胞密度1×10⁶cells/ml PK纯悬浮细胞，37℃培养3日，收获细胞培养物，经8000rpm离心15分钟收集上清，高压均质机压力500bar、流速50L/min、循环15min，破碎细胞，4℃保存备用。

2猪圆环病毒2型抗原液灭活方法

2.1甲醛灭活猪圆环病毒2型抗原液

取甲醛按体积比3‰加入到细胞破碎后的猪圆环病毒2型抗原液中，于37℃恒温摇床120rpm/min灭活72小时，添加体积比3‰硫代硫酸钠溶液终止灭活，按灭活检验方法进行检验。

2.2 BEI灭活猪圆环病毒2型抗原液

将2mol/L的2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)和2mol/L的NaOH溶液等体积混合，置37℃水浴，每隔10～15分钟摇匀1次，60分钟后即环化产生二乙烯亚胺(BEI)，终浓度为1mol/L。将BEI加入到细胞破碎后的猪圆环病毒2型抗原液中，至终浓度为5mmol/L，于37℃恒温摇床120rpm/min灭活64小时，添加终浓度5mmol/L硫代硫酸钠溶液终止灭活，按灭活检验方法进行检验。

2.3甲醛、BEI联合灭活猪圆环病毒2型抗原液

将2mol/L的2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)和2mol/L的NaOH溶液等体积混合，置37℃水浴，每隔10～15分钟摇匀1次，60分钟后即环化产生二乙烯亚胺(BEI)，终浓度为1mol/L。将BEI加入到细胞破碎后的猪圆环病毒2型抗原液中，至终浓度为2mmol/L，同时添加体积比0.8‰的甲醛溶液，于37℃恒温摇床120rpm/min灭活24小时，添加终浓度2mmol/L的硫代硫酸钠溶液终止灭活，按灭活检验方法进行检验。

3不同灭活方式灭活检验及无菌检验

采用2项下3种灭活方式灭活PCV2抗原，每种灭活方式各灭活5批抗原，每批抗原量为10L。灭活结束的抗原取样进行灭活彻底性检验及无菌检验，结果见表1.采用甲醛灭活抗原，5/5灭活彻底且无菌；采用BEI灭活抗原,5/5灭活彻底，但有1批抗原出现细菌污染；采用BEI、甲醛联合灭活的抗原5/5灭活彻底且无菌。

4不同灭活方式疫苗制备

4.1油相制备 取注射用白油188份，加司本-80 12份，混合后，加硬脂酸铝4份，加热，边加边搅拌，至透明为止。

4.2水相的制备 取吐温-80 4份，装入带玻璃球的瓶中灭菌，冷却后分别加入经不同灭活方式灭活的PCV2病毒液96份，充分振荡，使吐温-80完全溶解。

4.3乳化 取油相2份置于高速剪切机内，以300转/分钟搅拌10分钟，缓慢加入水相1份，再以3000转/分钟乳化30分钟。定量分装并密封于4℃保存备用。

5不同灭活方式疫苗安全性对比试验

筛选外观生长发育良好，无咳嗽气喘等临床症状；PCR检测PCV2病原阴性；ELISA检测PCV2、PRRSV抗体阴性；荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒核酸阴性的实验仔猪14～21日龄健康易感仔猪20头，分四组，即甲醛灭活疫苗组、BEI灭活疫苗组、甲醛BEI联合灭活疫苗组、不免疫对照组，每组5头。接种前观察2～3日，每日定时测定体温1次，取其平均值作为基础体温。除不免疫对照组外，其余组别每头仔猪颈部肌肉注射疫苗4.0ml，接种后每日定时测量体温1次，连续观察14日。与接种前相比，精神、食欲应无明显变化；注射部位应吸收良好，无明显的眼观病变，如红肿、溃疡、结节、肉芽肿等；体温升高应不超过基础体温1℃；若体温升高超过基础体温1℃，但不超过1.5℃，且稽留不超过48小时；判为安全，具体接种方案见表2，接种结果见表3。

结果表明，用甲醛灭活方式制备疫苗免疫猪只出现免疫应激现象且体温、精神食欲异常。用BEI灭活方式，甲醛、BEI联合灭活方式制备疫苗免疫猪只未出现免疫应激现象，体温、精神食欲正常。采用甲醛、BEI联合灭活方式制备疫苗免疫猪只体重组增重优于其他两组，安全性检验合格。

表2 不同灭活方式疫苗安全性对比试验方案

表3 不同灭活方式疫苗安全性对比试验结果

6不同灭活方式疫苗效力对比试验

筛选外观生长发育良好，无咳嗽气喘等临床症状；PCR检测PCV2病原阴性；ELISA检测PCV2、PRRSV抗体阴性；荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒核酸阴性的实验仔猪14～21日龄健康易感仔猪20头，分四组，即甲醛灭活疫苗组、BEI灭活疫苗组、甲醛BEI联合灭活疫苗组、不免疫对照组，每组5头。除不免疫对照组外，其余组别每头仔猪颈部肌肉注射疫苗2.0ml，接种后第7、14、21、28日用猪圆环病毒2型ELISA抗体检测检测盒(武汉科前)进行抗体水平测定。具体接种方案见表4，接种后疫苗效力见表5和图1。

结果表明，BEI灭活方式灭活疫苗免疫猪只在抗体水平上高于甲醛灭活方式灭活疫苗免疫猪只，甲醛、BEI联合灭活疫苗免疫猪只在抗体水平上均高于甲醛灭活组、BEI灭活组。

表4 不同灭活方式疫苗效力对比试验方案

表5 不同灭活方式疫苗效力对比试验结果

注：PCV2抗体S/P值≥0.16判为阳性，S/P值＜0.16判为阴性；表中PCV2抗体为平均值。

综上，采用BEI和甲醛联合对猪圆环病毒2型毒株进行灭活，相比于单独用甲醛灭活，具有减少甲醛添加量、保证病毒蛋白质成分结构完整性、作用时间短、且灭活效果更佳、后期配苗免疫减少了免疫应激，且免疫保护效果更佳的优势；相比于BEI灭活方式具有减少BEI添加量、更经济、免疫保护效果更佳的优势，且保证灭活彻底性及灭活抗原的无菌性。

Claims (11)

1.一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法，其特征在于，它是用二乙烯亚胺和甲醛联合灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述二乙烯亚胺在猪圆环病毒2型毒株抗原液中的浓度为1～4mmol/L，优选2mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述甲醛在猪圆环病毒2型抗原液中的浓度为0.5‰～1‰，ml/ml，优选浓度为0.8‰，ml/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭活是在温度30～40℃，转速80～200rpm/min的条件下灭活24～72小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述灭活是在温度37℃，转速120rpm/min的条件下灭活24小时。

6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其特征在于：所述灭活后添加硫代硫酸钠终止灭活。

7.根据权利要求1、4或5所述的方法，其特征在于：所述硫代硫酸钠在猪圆环病毒2型毒株抗原液中的浓度为1～4mmol/L，优选2mmol/L。

8.一种猪圆环病毒灭活疫苗，其特征在于：它是由如下原辅料制备而成：

权利要求1所述方法制备的灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液90～100份，吐温-80 1～5份，白油180～200份，司本-80 4～16份，硬脂酸铝2～6份。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：它是由如下原辅料制备而成：

权利要求1所述方法制备的灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液96份，吐温-80 4份，白油188份，司本-80 12份，硬脂酸铝4份。

10.一种权利要求8或9所述猪圆环病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤

1)油相制备：取白油和司本-80混合，加硬脂酸铝加热搅拌至透明；

2)水相制备：取吐温-80，灭菌，冷却后加灭活猪圆环病毒2型毒株抗原液，振荡至吐温-80溶解；

3)乳化：取油相搅拌10～20min，再加入水相搅拌30～60min，即得猪圆环病毒灭活疫苗。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤3)所述油相搅拌速度为100～300转/分钟，时间30分钟，优选油相搅拌速度300转/分钟；所述加入水相搅拌速度3000转/分钟，时间30分钟。

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