EA028376B1 - Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение - Google Patents

Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA028376B1
EA028376B1 EA201370140A EA201370140A EA028376B1 EA 028376 B1 EA028376 B1 EA 028376B1 EA 201370140 A EA201370140 A EA 201370140A EA 201370140 A EA201370140 A EA 201370140A EA 028376 B1 EA028376 B1 EA 028376B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cvs2
strain
pig
antibody
circovirus
Prior art date
Application number
EA201370140A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201370140A1 (ru
Inventor
Тсунь-Юньг Ко
Хсу Чунг Габриель Чэнь
Чунг-Чин У
Хань-Тин Чэнь
Original Assignee
Сбк Вирбак Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сбк Вирбак Лимитед filed Critical Сбк Вирбак Лимитед
Publication of EA201370140A1 publication Critical patent/EA201370140A1/ru
Publication of EA028376B1 publication Critical patent/EA028376B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/00063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Abstract

Изобретение предусматривает новый штамм цирковируса свиней 2 типа (ЦВС2), который был депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) под номером доступа V201117. Изобретение также предусматривает иммуногенные композиции, содержащие новый штамм ЦВС2, набор для анализов на ЦВС2 и применения нового штамма ЦВС2.

Description

Настоящее изобретение относится к области ветеринарии, в частности к новому штамму цирковируса свиней 2 типа (ЦВС2), иммуногенной композиции, содержащей штамм вируса, набору для анализа ЦВС2 и применению штамма вируса.
Предпосылки изобретения
Впервые цирковирус свиней (ЦВС) был обнаружен в клеточной линии почек свиньи (РК-15, АТСС ССЬЗЗ). Несмотря на то, что цирковирус свиней может постоянно контаминировать клетки РК-15, вирус не вызывает цитопатический эффект (СРЕ) на контаминированные клетки РК-15. Более того, ЦВС, полученный из РК-15, считается непатогенным. Несмотря на то, что цирковирус свиней может инфицировать свиней, он не вызывает патологических изменений у инфицированных свиней. Цирковирус свиней представляет собой вирус икосаэдрической формы с одноцепочечной ДНК и кольцевым геномом из 1759 пар оснований (п.о.). ЦВС, полученный из РК-15, в 1995 г. был отнесен к семейству Сисоутбае.
В 1991 г. в Канаде у свиней впервые был зарегистрирован синдром мультисистемного истощения после отъема (РМ^Б). РМ^Б поражает поросят возрастом от 5 до 12 недель. Клинически он характеризуется такими симптомами, как прогрессирующая потеря веса, одышка, бледность и периодическая желтуха. Характерные для него микроскопические поражения включают истощение лимфоидной ткани с гистиоцитарными инфильтратами в пределах лимфоидных органов, пневмонию, гранулематозное воспаление, гепатит и нефрит. После вспышки 1991 г. в Канаде о РМ\УБ сообщали во многих странах Северной Америки, Европы и Азии. Позже из свиней с РМ\УБ был выделен новый цирковирус. Поскольку морфология цирковируса свиней, выделенного при РМ\УБ. очень подобна морфологии ЦВС, полученного из РК-15, два цирковируса свиней имеют только 68-76% гомологии в их геномных последовательностях. Непатогенный ЦВС, полученный из РК-15, и патогенный ЦВС, полученный при РМ^Б, были дополнительно идентифицированы как цирковирус свиней 1 типа (ЦВС1) и цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2) соответственно.
Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2) также принадлежит к семейству Сйсоушбае. ЦВС2 представляет собой вирус без оболочки, икосаэдрической формы, диаметром 17 нм с одноцепочечной кольцевой ДНК и известный как один из самых маленьких вирусов животных. Кольцевой геном ЦВС2 содержит точку начала репликации со структурой типа стебель-петля, которая является общей характеристикой цирковирусов. Геном ЦВС2 включает 1767 или 1768 нуклеотидов и, как предполагается, имеет 11 потенциальных открытых рамок считывания (ОКЕ). Среди 11 ОКЕ ОКЕ 1 и ОКЕ 2, вероятно, являются наиболее важными генами, которые кодируют репликацию белков (Кер и Кер') и капсидный белок (Сар) соответственно. Капсидный белок (Сар), кодируемый геном ОКЕ2 ЦВС2, по всей вероятности, будет представлять собой антиген, который индуцирует выработку нейтрализующих антител.
Инфекция ЦВС2 широко распространена на большинстве свиноферм в мире. Было обнаружено, что ЦВС2 является причиной низких уровней выживаемости и низких коэффициентов конверсии корма (ЕСК) у инфицированных свиней и приводит к большим экономическим потерям в свиноводстве. Следовательно, важно разработать наборы для анализов ЦВС2 и вакцину против ЦВС2.
Краткое описание изобретения
Первый аспект настоящего изобретения относится к штамму ЦВС2, выделенному из свиней, у которых проявлялись клинические симптомы синдрома мультисистемного истощения после отъема (РМ^Б), и в дальнейшем исследован и подтвержден как новый штамм ЦВС2 (штамм ЦВС2 Н). Положительная (+) цепь генома штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н) имеет последовательность ДНК БЕф ГО Νο:1. Новый штамм ЦВС2 был депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) 5 ноября 2011 г. под номером доступа У201117.
Второй аспект настоящего изобретения относится к иммуногенной композиции, содержащей новый штамм ЦВС2 (штамм ЦВС2 Н). В одном предпочтительном варианте осуществления иммуногенная композиция представляет собой вакцину, содержащую инактивированный вирус или аттенуированный вирус нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н) и фармацевтически приемлемый носитель. Однако типы вакцины включают без ограничения инактивированную вакцину, живую (аттенуированную) вакцину (путем ослабления вируса), субъединичную вакцину, ДНК-вакцину и другие вакцины, полученные и произведенные из нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н) или из ДНК или аминокислотных последовательностей нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н).
Способ инактивации (или инактивирующая обработка) настоящего изобретения включает без ограничения обработку инактивирующим реагентом, тепловую обработку и другие способы обработки, известные специалисту в данной области. Инактивирующие реагенты включают без ограничения формальдегид, параформальдегид, бета-пропиолактон (ВРЬ), бинарный этиленимин (ВЕ1) или другие инактивирующие реагенты, пригодные для настоящего изобретения.
Фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения растворитель, эмульгатор, суспендирующее вещество, деструктор, связующее вещество, наполнитель, стабилизатор, хелатообразователь, разбавитель, загуститель, консервант, смазывающее вещество, поверхностно-активное вещество, адъювант или другие пригодные носители.
Адъювант включает без ограничения масляный адъювант (такой как минеральное масло, расти- 1 028376 тельное масло, животный жир, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и т.д.), водный адъювант (такой как гидроксид алюминия), двухфазный адъювант для образования эмульсий (такой как вода в масле в воде, в/м/в, эмульсионный адъювант), биологический адъювант (такой как СрСолигодеоксинуклеотид и токсоид) и т.д. Двухфазный адъювант для образования эмульсий включает поверхностно-активное вещество и маслянистое вещество. Поверхностно-активное вещество представляет собой одно или несколько веществ, выбранных из группы, включающей сложный эфир сорбита и жирной кислоты; концентрат сложного эфира сорбита и жирной кислоты и этиленоксида (или пропиленоксида); сложный эфир маннита и жирной кислоты; концентрат сложного эфира маннита и жирной кислоты и этиленоксида (или пропиленоксида); сложный эфир модифицированного маннита и жирной кислоты с гидрофильной группой, которая представляет собой одну или несколько групп, выбранных из группы, включающей карбоновую кислоту, амин, амид, спирт, полиол, простой эфир и оксид; сложный эфир ангидроманнита и жирной кислоты; сложный эфир модифицированного ангидроманнита и жирной кислоты с гидрофильной группой, которая представляет собой одну или несколько групп, выбранных из группы, включающей карбоновую кислоту, амин, амид, спирт, полиол, простой эфир и оксид; сложный эфир сахарозы и жирной кислоты; концентрат сложного эфира сахарозы и жирной кислоты и этиленоксида (или пропиленоксида); сложный эфир глицерина и жирной кислоты; концентрат сложного эфира глицерина и жирной кислоты и этиленоксида (или пропиленоксида); концентрат жирной кислоты и этиленоксида (или пропиленоксида); концентрат жирного спирта и этиленоксида (или пропиленоксида) и глицерофосфолипид. Маслянистое вещество представляет собой одно или больше одного веществ, выбранных из группы, включающей минеральное масло, растительное масло и животный жир.
Иммуногенная композиция настоящего изобретения дополнительно содержит по меньшей мере один антиген патогена. Антигены патогенов включают без ограничения антиген вируса свиного гриппа (81У), антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РККБУ), антиген микоплазмы, антиген парвовируса свиней (РРУ), антиген рожи свиней и антиген вируса псевдобешенства (болезни Ауески). Типы антигенов патогенов включают без ограничения рекомбинантные белки, субъединичные белки, патогены с дефектом гена, антигены инактивированных патогенов и т.д.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу защиты свиней от инфекции ЦВС2, который включает введение иммунологически эффективной дозы указанной иммуногенной композиции ЦВС2 свинье для повышения ее иммунитета против инфекции ЦВС2, снижения тяжести вирусемии и клинических симптомов, а также повышения уровня выживаемости и массы тела.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к антителу к ЦВС2, полученному из нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н). Антитело включает без ограничения моноклональные антитела, поликлональные антитела и полученные способами генной инженерии антитела. В одном предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой поликлональное антитело, полученное посредством инъекции животному нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н). В другом предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело, полученное посредством скрининга библиотеки гибридом моноклональных антител.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к фрагментам ДНК нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н). Фрагменты ДНК имеют нуклеотидные последовательности 8ЕО ГО Νο:1, 2, 4 и 6. Применения фрагментов ДНК включают без ограничения производство ДНК-вакцины и субъединичной вакцины и конструирование праймеров или зондов для обнаружения ЦВС2 в образце. В одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент ДНК представляет собой последовательность полноразмерного генома (5>ЕО ГО Νο:1) нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н). В другом предпочтительном варианте осуществления фрагменты ДНК представляют собой открытые рамки считывания (ОКЕ) нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н), которые включают без ограничения открытую рамку считывания 1 (ОКР1), имеющую нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 2, которая кодирует аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 3, открытую рамку считывания 2 (ОКР2), имеющую нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 4, которая кодирует аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 5, и открытую рамку считывания 3 (ОКР3), имеющую нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 6, которая кодирует аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 7.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к набору для анализа на ЦВС2. Набор для анализа применяется для обнаружения ЦВС2 или антител к ЦВС2 в исследуемом образце. Набор для анализа содержит без ограничения (1) антиген нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н), в одном предпочтительном варианте осуществления антиген нанесен на планшет с антигеном и инактивирован инактивирующим реагентом; (2) моноклональное или поликлональное антитело, полученное из нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н); (3) полученный(ое) способами генной инженерии антиген или антитело, происходящие из последовательности полноразмерного генома (5>ЕО ГО Νο: 1) или нуклеотидных фрагментов (8ЕО ГО Νο: 2, 4 и 6) нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н); и (4) полинуклеотид, полученный из последовательности полноразмерного генома (5>ЕО ГО Νο: 1) или нуклеотидных фрагментов (8ЕО ГО Νο: 2, 4 и 6) нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н). Полинуклеотид включает без ограничения праймеры и зонды. В одном предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид представляет собой праймер, кото- 2 028376 рый может быть использован для обнаружения нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н), и при этом праймеры имеют нуклеотидные последовательности 8ЕО ГО N0: 8-11.
Типы набора для анализа включают без ограничения набор для твердофазного иммуносорбентного анализа (ЕЫ§Л), набор с микрочипом, набор для иммунофлуоресцентного анализа (ΙΕΑ), набор для полимеразной цепной реакции (РСК) и другие наборы для анализов, полученные на основе нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н). В одном предпочтительном варианте осуществления набор для анализа содержит, по меньшей мере, планшет с антигеном, который включает новый штамм ЦВС2 (штамм ЦВС2 Н), и при этом набор для анализа может быть использован для обнаружения антител к ЦВС2 в исследуемом образце.
Новый штамм ЦВС2 (штамм ЦВС2 Н) настоящего изобретения включает все субкультивируемые пассажи и мутанты, которые имеют сходные вирусные характеристики, геном или патогенность, как у нового штамма ЦВС2 (штамма ЦВС2 Н).
Выражения ДНК (нуклеиновая кислота), полинуклеотид, аминокислота, пептид, полипептид в настоящем изобретение могут встречаться в естественном, выделенном, рекомбинантном или синтетическом состоянии.
Выражения предупреждение, защита и против относятся к результатам наблюдения, которые сравнивали с результатами наблюдения в отношении невакцинированных раскрытой иммуногенной композицией животных, при этом вакцинированные раскрытой иммуногенной композицией животные могут обладать повышенной способностью противостоять инфекции ЦВС2 и родственным заболеваниям, возникшим в результате инфекции ЦВС2.
Значение технических и научных выражений, как описано в данном документе, может быть четко понято специалистом в данной области.
Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих иллюстративных примерах. Хотя примеры могут представлять только выбранные варианты осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что нижеследующие примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1А - неинфицированные клетки РК-15, культивируемые в течение 4 дней (масштаб (100х)); фиг. 1В - клетки РК-15, инфицированные штаммом ЦВС2 Н, культивируемые в течение 4 дней (масштаб (100 х));
фиг. 2 - филогенетический анализ геномной последовательности штамма ЦВС2 Н;
фиг. 3 - выравнивание аминокислотной последовательности ОКР2 (8ЕО ГО N0: 5) штамма ЦВС2 Н и трех других аминокислотных последовательностей, которые имеют наибольшие сходства последовательностей с аминокислотной последовательностью ОКР2 штамма ЦВС2 Н в базе данных ОепБаик Национального центра биотехнологической информации (Νί','ΒΙ);
фиг. 4 - выравнивание аминокислотной последовательности ОКР2 штамма ЦВС2 Н и аминокислотной последовательности ОКР2 (доступ в ОепВапк: ΑΌΌ25772) прототипа ЦВС2 26 (доступ в ОепВапк: Ζ109556);
фиг. 5 - результаты ЕЬТЗА ЦВС2 образцов сыворотки, полученных в различные моменты времени от мышей, вакцинированных инактивированной вакциной на основе штамма ЦВС2 Н;
фиг. 6 - результаты ΙΡΑ ЦВС2 образцов сыворотки, полученных в различные моменты времени от поросят, вакцинированных инактивированной вакциной на основе нового штамма ЦВС2 Н;
фиг. 7 - массы тел поросят, вакцинированных инактивированной вакциной на основе штамма ЦВС2 Н.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Пример 1. Выделение и идентификация ЦВС2.
1. Источник и выделение посевного вируса.
Образцы ткани отбирали из легких и лимфоузлов поросят на свиноферме в Синьчжу, Тайвань. У данных поросят 8-недельного возраста проявлялись клинические симптомы синдрома мультисистемного истощения после отъема (РАМ8). Образцы легких и лимфоузлов собирали и замораживали при -70°С.
Для выделения вирусов образцы тканей гомогенизировали и 0,2 мл каждого гомогената инокулировали в монослой клеток РК-15 или их производные клеточные линии, которые не содержат цирковирус свиней (ЦВС), вирус классической чумы свиней (С8ЕУ), аденовирус свиней, парвовирус свиней, вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РКК8У), вирус псевдобешенства (РКУ), вирус везикулярной болезни свиней (8УЭУ), микоплазму и бактерии. После инкубирования в течение 1 ч при 37°С, 5% СО2, клетки три раза отмывали стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (РВ8). Затем в течение 4 ч клетки инкубировали в среде МЕМ, содержащей 2% ЕВ8. при 37°С, 5% СО2. После этого среду МЕМ удаляли и клетки инкубировали с 300 мМ Ό-глюкозамина в течение 30 мин. Затем клетки три раза отмывали стерильным РВ8 и инкубировали в течение 72 ч в среде МЕМ, содержащей 8% ЕВ8, при 37°С, 5% СО2. В заключение, культуры клеток исследовали на ЦВС2 при помощи иммунофлуоресцентного анализа (ΙΕΑ).
Протокол ΙΕΑ описан следующим образом.
- 3 028376
Во-первых, клетки образцов три раза отмывали стерильным РВ8, 5 мин каждый раз, и фиксировали с помощью 75 мкл 80% ацетона в течение 30 мин при 4°С. Затем ацетон удаляли и клетки отмывали три раза стерильным РВ8, 5 мин каждый раз. После этого клетки инкубировали с 75 мкл противовирусной поликлональной имунной сыворотки к цирковирусу свиней (УМРЭ®) (первичное антитело, разведение 1:1500 в РВ8) в течение 30 мин при 37°С. Затем удаляли имунную сыворотку и клетки отмывали три раза стерильным РВ8, 5 мин каждый раз. После этого клетки инкубировали с 75 мкл коньюгата Р1ТС-1дО кролика к антителу свиньи (целая молекула) (81дта, Р1638) (вторичное антитело, разведение 1:1000 в РВ8) в течение 30 мин при 37°С. Затем антитело удаляли и клетки отмывали три раза стерильным РВ8, 5 мин каждый раз. В заключение, каждый из образцов клеток помещали в 96-луночный культуральный планшет в 200 мкл РВ8 для флуоресцентного микроскопического исследования.
Вирус, который инфицировал клетки и дал наибольшее количество положительных результатов ΙΡΆ, выбирали в качестве посевного вируса. Затем определяли геномную последовательность посевного вируса, как указано в 8ЕО ΙΌ Νο: 1. Последовательность выравнивали, анализировали и в заключение утверждали как новый штамм ЦВС2 (анализы и результаты выравнивания последовательности описаны ниже). Данный новый штамм ЦВС2 назвали штаммом ЦВС2 Н.
2. Пересев посевного вируса.
Свежеполученные клетки РК-15 или их производные клеточные линии инокулировали новым штаммом ЦВС2 (штаммом ЦВС2 Н), и вирус, полученный из инокулированных клеток, представлял собой пассаж 1 (Р3) штамма ЦВС2 Н. Супернатант культуры клеток, который содержал Р1 штамма ЦВС2 Н, собирали, разводили (1:2) и инокулировали в свежеполученные клетки РК-15 или их производные клеточные линии. После этого инокулированные клетки инкубировали в течение 3 дней, супернатант культуры клеток, который содержал пассаж 2 (Р2) штамма ЦВС2 Н, собирали, разводили (1:2) и инокулировали в свежеполученные клетки РК-15 или их производные клеточные линии. Инокулированные клетки инкубировали в течение 3 дней и в дальнейшем собирали супернатант культуры клеток, который содержал пассаж 3 (Р3) штамма ЦВС2 Н. Процесс повторяли еще три раза для получения пассажа 6 (Р6) штамма ЦВС2 Н.
Во время процесса культивирования клеток РК-15 или их производных клеточных линий, которые инокулированы штаммом ЦВС2 Н, в инокулированных клетках наблюдали цитопатический эффект (СРЕ), как показано на фиг. 1В. Кроме того, на фиг. 1А показана морфология и рост неинокулированных клеток РК-15 через 4 дня культивирования (100х), тогда как на фиг. 1В показана морфология и рост инокулированных штаммом ЦВС2 Н клеток РК-15 через 4 дня культивирования (100х). Подобным образом, СРЕ, наблюдаемый в производных клеточных линиях РК-15, которые инокулированы штаммом ЦВС2 Н, на фиг. 1В может быть приведен для сравнения.
3. Идентификация посевного вируса.
Геном штамма ЦВС2 Н, выделенного в настоящем изобретении, имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 1. Нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 1 сравнивали с последовательностями в базе данных ОеиВаик Национального центра биотехнологической информации (Νί'.ΈΙ). Результаты сравнения показали, что штамм ЦВС2 Н был на 99% гомологичным некоторым последовательностям ЦВС2 (табл. 1), но в базе данных не было последовательности, идентичной (гомологичной на 100%) геномной последовательности штамма ЦВС2 Н (8ЕО ГО Νο: 1). Таким образом, на основании результатов выравнивания показано, что вирус, выделенный в настоящем изобретении, штамм ЦВС2 Н, принадлежит к семейству ЦВС2 и является новым штаммом. На основании филогенетического анализа геномной последовательности штамма ЦВС2 Н, представленного на фиг. 2, показано, что штамм ЦВС2 Н является членом подгруппы ЦВС2 26.
- 4 028376
Таблица 1
Результаты сравнения геномной ДНК штамма ЦВС2 Н и последовательностей в базе данных ОепВапк НСВТ с использованием НСВТ ВЕА8Т
Номер доступа Описание Максимальный показатель Суммарный показатель Максимальная идент.
НМ038017.1 цирковирус свиней 2, штамм ΒΌΗ 3236 3236 99%
ουοοπιο.ι цирковирус свиней 2, изолят ВТО901Ь 3236 3236 99%
ЕР675230.1 цирковирус свиней 2, штамм ΟΧΗΖ-1 3236 3236 99%
Ои083583.1 цирковирус свиней 2, изолят ЦВС2С53 3230 3230 99%
00359002.1 цирковирус свиней 2, штамм 0X0839 3230 3230 99%
ΡΙ644929.1 цирковирус свиней 2, изолят ОР08 3230 3230 99%
РИ26398.1 цирковирус свиней 2, штамм ΟΧΛΥΖ-1 3230 3230 99%
НМ038030.1 цирковирус свиней 2, штамм АН 3229 3229 99%
НМ161710.1 цирковирус свиней 2, изолят ВХ-2 3225 3225 99%
Анализ показывает, что штамм ЦВС2 Н настоящего изобретения имеет открытые рамки считывания (ОКТ) 1, 2 и 3. ОКЕ1 имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 2, которая кодирует аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 3. ОКЕ2 имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 4, которая кодирует аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Νο: 5. ОКТ3 имеет нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО Νο: 6, которая кодирует аминокислотную последовательность 81%) ГО Νο: 7.
Поскольку капсидный белок, кодируемый геном ОКТ2 ЦВС2, по всей вероятности, являлся бы антигеном, который индуцирует выработку нейтрализующих антител, то нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО Νο: 4) и аминокислотную последовательность (8Е0 ГО Νο: 5) ОКТ2 штамма ЦВС2 Н сравнивали с последовательностями в базе данных ОепВапк NСВI. Результаты сравнения показали, что в базе данных ОепВапк NСВI нет последовательности, идентичной (гомологичной на 100%) нуклеотидной последовательности (8ЕР ГО Νο: 4) или аминокислотной последовательности (8ЕР ГО Νο: 5) ОКТ2 штамма ЦВС2 Н. Наибольшая гомология между аминокислотной последовательностью ОКТ2 штамма ЦВС2 Н (8ЕР ГО Νο: 5) и последовательностями в базе данных ОепЬапк составляет 98%. На фиг. 3 показано выравнивание аминокислотной последовательности ОКТ2 штамма ЦВС2 Н (8ЕО ГО Νο: 5) и верхние три последовательности с наибольшей гомологией, при этом выравнивание указывает на то, что 6 аминокислот 81%) ГО Νο: 5 отличаются от верхних трех последовательностей. Аминокислотную последовательность (8ЕР ГО Νο: 5) ОКТ2 штамма ЦВС2 Н дополнительно сравнивали с аминокислотной последовательностью (доступ в ОепВапк: ΆΌΌ25772) ОКТ2 прототипа ЦВС2 подгруппы 26 (доступ в ОепВапк: /.10955Ь), и результаты, показанные на фиг. 4, указывают на то, что в двух последовательностях различаются 7 аминокислот, и две последовательности обладают гомологией 97%.
В дополнение нуклеотидные последовательности (8НО ГО Νο: 2 и 6) и аминокислотные последовательности (8ЕР ГО Νο: 3 и 7) ОКТ1 и ОКТ3 штамма ЦВС2 Н сравнивали с последовательностями в базе данных ОепВапк NСВI. Результаты сравнения показали, что в базе данных ОепВапк NСВI нет последовательности, идентичной (гомологичной на 100%) нуклеотидным последовательностям или аминокислотным последовательностям ОКТ1 или ОКТ3 штамма ЦВС2 Н.
Исследования указывают на то, что штамм ЦВС2 Н настоящего изобретения является новым штаммом цирковируса свиней 2 типа (ЦВС2). Новый штамм ЦВС2 был депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) 5 ноября 2011 г. под номером доступа У201117.
Пример 2. Получение вакцины на основе штамма ЦВС2 Н.
1. Культивирование вируса.
Клетки РК-15, которые не содержали цирковирус свиней (ЦВС), вирус классической чумы свиней (С8ЕУ), аденовирус свиней, парвовирус свиней, вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РКК8У), вирус псевдобешенства (РКУ), вирус везикулярной болезни свиней (8УИУ), микоплазму и бактерии, культивировали в ростовой среде для культур клеток (среда МЕМ, содержащая 5% ЕВ8, рН 7,2±0,2) при 37°С, 5% СО2. После образования монослоя клеток РК-15 клетки РК-15 разделяли 0,2% трипсином-ЭДТА и суспендировали в поддерживающей среде для культур клеток (среда МЕМ, содержащая 2% ЕВ8, рН 7,4±0,2) для подсчета клеток. Затем клетки разбавляли ростовой средой для культуры клеток до конечной концентрации 3,0х105 клеток/мл и распределяли по роллер-флаконам для культивирования в течение 3-4 дней при 37°С, чтобы добиться слившегося монослоя. После этого среду для куль- 5 028376 тур клеток удаляли из роллер-флаконов и клетки отмывали РВ§. Исходный раствор вируса штамма ЦВС2 Н разводили поддерживающей средой для культур клеток до конечной концентрации 104’0 ТСГО50/мл и инокулировали им монослои клеток РК-15 в роллер-флаконах. Для культивирования вируса инфицированные клетки инкубировали в течение 48-96 ч при 37°С. Титр вируса штамма ЦВС2 Н контролировали с помощью иммунофлуоресцентного анализа (ΙΡΑ). Затем для получения раствора вируса штамма ЦВС2 Н собирали супернатант культур клеток, когда титр вируса достигал 106’0 ТСГО50/мл или выше, или когда цитопатический эффект (СРЕ) достигал 70-80%.
2. Способ инактивации.
вес.% формальдегида добавляли к раствору вируса штамма ЦВС2 Н, полученному на вышеуказанном этапе, до конечной концентрации 0,2% (вес./об.), а затем вирус инактивировали путем непрерывного встряхивания с формальдегидом в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно 48 ч при 37°С. После того как вирус был полностью инактивирован, раствор вируса штамма ЦВС2 Н, содержащий формальдегид, центрифугировали для удаления формальдегида. Затем центрифугированный раствор вируса суспендировали в буферном растворе, таком как дистиллированная вода или фосфатно-буферный солевой раствор (РВ§), и суспендированный раствор вируса, представляющий собой инактивированный исходный раствор антигена инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н, хранили при 4°С для дальнейшего применения.
3. Получение инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н.
Стерилизованный двухфазный адъювант для образования эмульсий, такой как масляный адъювант вакцины ΜΟΝΤΑΝΙΌΕ™ ΙδΑ 206 для эмульсии вода в масле в воде (в/м/в), добавляли к инактивированному исходному раствору антигена инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н до конечной концентрации 50% (об./об.) в резервуаре для эмульсии для смешивания и эмульгирования. Эмульгированный продукт представляет собой инактивированную вакцину на основе штамма ЦВС2 Н с масломадъювантом.
Другие пригодные адъюванты для инактивированной вакцины ЦВС2 настоящего изобретения, известные специалистам в данной области, также могут применяться в настоящем изобретении в качестве адъювантов. Двухфазный адъювант для образования эмульсий (такой как эмульсионный адъювант вода в масле в воде), применяемый в данном примере, может быть заменен без ограничения масляным адъювантом (таким как минеральное масло, растительное масло, животный жир, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и т.д.), водным адъювантом (таким как гидроксид алюминия) или биологическим адъювантом (таким как СрС-олигодеоксинуклеотид и токсоид).
Пример 3. Получение набора для анализа на ЦВС2 - 1.
Набор для анализа на ЦВС2 в данном примере представляет собой планшет с антигеном, содержащий вирусный антиген штамма ЦВС2 Н. Во-первых, клетки РК-15 или их моноклональные клеточные линии культивировали, трипсинизировали и повторно суспендировали в среде для культур клеток при конечной концентрации 2х105 клеток/мл. 50 мкл клеток РК-15 и 50 мкл исходного раствора вируса штамма ЦВС2 Н (1х103 ТСГО50/мл) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета для культур клеток (плоское дно) и инкубировали в течение 72 ч при 37°С, 5% СО2. Клетки, инфицированные штаммом ЦВС2 Н, дважды отмывали стерильным РВδ и фиксировали 80% ацетоном в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляли ацетон и три раза отмывали клетки стерильным РВδ. После этого планшет переворачивали и потом просушивали в термостате при 37°С. Просушенный планшет представляет собой планшет с антигеном, содержащий вирусный антиген штамма ЦВС2 Н, и может быть использован в анализе ΕΌΙδΑ для определения количества антител к ЦВС2 в образце сыворотки. Затем планшет хранили при -20°С для дальнейшего применения (ТЕсйсг с соавт., 1995).
Пример 4. Получение набора для анализа на ЦВС2 - 2.
Набор для анализа на ЦВС2 в данном примере представляет собой планшет с антигеном, содержащий рекомбинантный капсидный белок штамма ЦВС2 Н. Рекомбинантный капсидный белок представляет собой антиген планшета с антигеном. Капсидный белок кодируется геном ΟΡΕ2 штамма ЦВС2 Н и имеет аминокислотную последовательность δΕφ ΙΌ Νο: 5.
Нуклеотидную последовательность ΟΚΕ2 штамма ЦВС2 Н сначала амплифицировали путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). Вирусную ДНК штамма ЦВС2 Н применяли в качестве матричной ДНК в реакции ПЦР. Прямой праймер и обратный праймер конструировали для амплификации нуклеотидной последовательности ΟΚΕ2. Прямой праймер в данном примере имеет сайт расщепления ΗίηάΙΙΙ, а обратный праймер в данном примере имеет сайт расщепления ХйоТ Праймеры могут быть сконструированы специалистами в данной области согласно нуклеотидной последовательности ΟΚΕ2 (δΕφ ΙΌ Νο: 4) настоящего изобретения. Для реакции ПЦР ПЦР-смесь, содержащую 8 мкл матричной ДНК, 5 мкл 10х буфера ПЦР (ΜΌΒίο, [пс.), 8 мкл бЭТР (каждого по 1,25 мМ), 1 мкл каждого праймера (каждого по 50 мкМ) и 0,5 мкл Р£ц ДНК-полимеразы (ΜΌΒίο, Ιικ.). в конечном объеме 50 мкл помещали в реактор СепеАтр РСК δу8ΐет 2400 (АррНеб ВюууЧепъ). Реакцию ПЦР начинали с исходного этапа предварительного нагревания ПЦР-смеси при 95°С в течение 5 мин и амплификацию ДНК выполняли за 25 циклов при следующих параметрах: денатурирование при 95°С в течение 30 с, отжиг при 55°С в течение 30 с и
- 6 028376 удлинение при 72°С в течение 30 с. Реакцию ПЦР завершали этапом конечной достройки в течение 5 мин при 72°С. Продукты ПЦР очищали при помощи набора для РСК-М С1еап Ир (Уюдеп).
После очистки продукты ПЦР встраивали в вектор экспрессии рЕТ24а. Очищенные продукты ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24а (Коуадеп) расщепляли двумя ферментами рестрикции (№те Епд1апб Вю1аЪ§), НшбШ и Хйо1, соответственно, в течение 8 ч при 37°С. После реакции расщепления ферментами рестрикции расщепленные продукты ПЦР и вектор экспрессии рЕТ24а очищали с помощью набора для РСК-М С1еап Ир (Уюдеп) соответственно. Очищенные продукты ПЦР пришивали к очищенному вектору экспрессии рЕТ24а и продукт сшивания трансформировали в клетку-хозяина (Е. сой). Отбирали трансформанты, а клон с соответствующей последовательностью идентифицировали путем секвенирования ДНК и обозначили как рЕТ24а-ОКР2.
Бактерии с рЕТ24а-ОКР2 культивировали в 2 мл бульона ЬВ в течение 16-18 ч при 37°С, а затем культуру добавляли в свежий бульон ЬВ, содержащий 25 мкг/мл канамицина, в соотношении 1:50 и культивировали при 37°С, 200 об/мин. Когда оптическая плотность культуры при длине волны 600 нм (ОИ600) достигала 0,6, то в культуру добавляли изопропил-в-И-тиогалактозид (1РТО) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали культуру в течение еще 6 ч при 37°С, 200 об/мин. 1 мл культуры центрифугировали (10000хд) и затем при помощи В-РЕКТМ Вас1епа1 Рго1еш Ехйасйоп (Р1егсе Рго1еш Кекеагсй Ргобисек) определяли, являлись рекомбинантные белки растворимыми белками или вирусным включением. 40 мкл реагента добавляли к центрифугированным бактериям и взбалтывали на вихревой мешалке в течение 1 мин. Смесь затем центрифугировали при 10000хд. Белки, суспендированные в супернатанте, представляли собой растворимые белки, тогда как белки в нижней части (осадок) представляли собой тельца включения. Растворимые белки растворяли в 1х буфере для образца для анализа δΌδРЛОЕ, тогда как вирусные включения смешивали с 2х буфером для образца для анализа δΌδ-РАОЕ. Оба образца кипятили в течение 20 мин и затем центрифугировали. Белки в супернатанте обоих образцов разделяли с помощью 15% δΌδ-РЛОЕ для анализа экспрессии рекомбинантного капсидного белка штамма ЦВС2 Н. После анализов рекомбинантные капсидные белки штамма ЦВС2 Н применяли для получения планшетов с антигеном.
Рекомбинантный капсидный белок штамма ЦВС2 Н разводили РВδ (рН 9,6) до конечной концентрации 10 мкг/мл. Разведенный рекомбинантный белок наносили на 96-луночный планшет для культуры клеток (плоское дно) (100 мкл/лунка) при 37°С в течение 2 ч и затем при 4°С в течение ночи. После этого каждую лунку планшета отмывали три раза РВδ в течение 3-5 мин и добавляли 200 мкл 0,15% блокирующего раствора ВδΑ для блокирования рекомбинантного белка в течение 2 ч при 37°С. Затем каждую лунку планшета отмывали РВδ и планшет хранили при 4°С для дальнейшего применения.
Пример 5. Получение антител к штамму ЦВС2 Н.
1. Поликлональные антитела к штамму ЦВС2 Н.
Инактивированный штамм ЦВС2 Н с достаточным титром вируса смешивали с подходящим адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда. Прежде всего, смесью заражали животных, таких как мыши, свиньи, козы и кролики, а при необходимости после соответствующего периода времени (такого как 2-3 недели) можно было провести вторую иммунизацию. После еще одного соответствующего периода времени (такого как 2-3 недели) сыворотку зараженных животных собирали как поликлональные антитела к штамму ЦВС2 Н.
При необходимости поликлональные антитела к штамму ЦВС2 Н могут быть конъюгированы с хромогенными или флуоресцентными репортерами.
При необходимости зараженные животные могут быть дополнительно вакцинированы для повышения титра антител после первой или второй иммунизации.
Животные, которые могут быть заражены для выработки поликлональных антител к штамму ЦВС2 Н, включают без ограничения мышей, кроликов, птиц (яйца), свиней, коз, крупный рогатый скот и водных животных.
2. Моноклональные антитела к штамму ЦВС2 Н.
Инактивированным штаммом ЦВС2 Н с достаточным титром вируса или специфическим фрагментом антигена (например, ОКР2) штамма ЦВС2 Н в первую очередь заражали животное (такое как мышь). При необходимости инактивированный вирус или фрагмент антигена может быть смешан с подходящим адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда. Также при необходимости после соответствующего периода времени (такого как 2-3 недели) может быть проведена вторая иммунизация. После еще одного соответствующего периода времени (такого как 2-3 недели) сыворотку зараженного животного брали для оценки, являлись ли клетки селезенки животного пригодными для выработки моноклональных антител к штамму ЦВС2 Н. Слияние пригодных клеток селезенки, взятых у зараженных животных, и клеток миеломы (таких как клеточная линия РО и клеточная линия Νδ) осуществляли с применением полиэтиленгликоля (РЕО, такого как РЕ01500). Гибридомы, которые вырабатывают антитела соответствующей специфичности, отбирали из слитых клеток и затем субклонировали для того, чтобы они стали гибридомами, пригодными для выработки моноклональных антител к штамму ЦВС2 Н.
Моноклональные антитела к штамму ЦВС2 Н можно применять в наборах для анализов, при лече- 7 028376 нии или в пищевой или кормовой добавке для повышения иммунитета у животных.
Пример 6. Испытание эффективности инактивированной вакцины на основе ЦВС2 - 1.
1. Протокол вакцинации и отбор образцов.
Мышей Ва1Ь/с пятинедельного-шестинедельного возраста без особых патогенов (ЗРР) случайно разделяли на 4 группы по 15 мышей в каждой. Анализ ЕЬ1ЗА показал, что все 60 мышей были отрицательны в отношении антител к ЦВС2. Мышам из 3 вакцинных групп (групп 1-3) делали внутримышечную инъекцию инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н по 0,2 мл из 3 различных партий соответственно. Спустя две недели после первой иммунизации (ρ.ί.) мышей из 3 вакцинных групп повторно иммунизировали такой же дозой вакцины из 3 различных партий. Мышей из группы 4 не вакцинировали, и они служили в качестве отрицательного контроля. На 2, 3, 4 и 5 неделях после первой иммунизации (ρ.ί.) случайно отбирали по 5 мышей из каждой группы для отбора образцов сыворотки. Все образцы сыворотки анализировали с помощью ЕЫЗА.
2. Обнаружение антител к ЦВС2 с помощью ЕЫЗА.
Планшеты с антигеном, полученные в примере 3 или 4, в данном примере могут применяться в качестве планшетов для ЕЫЗА. Планшеты для ЕЫЗА промывали 3 раза 50 ммоль/л РВЗ (рН 7,2), содержащим 500 мкл/л Т\уссп-20 (т.е РВЗТ), каждый раз в течение 3-5 мин. Для блокирования планшетов для ЕЫЗА в каждую лунку планшетов для ЕЫЗА добавляли по 200 мкл 0,15% блокирующего раствора ВЗА, а затем планшеты для ЕЫЗА инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После этого планшеты для ЕЫЗА промывали РВЗ. Образцы сыворотки мышей разводили в пятьдесят раз (1:50) с помощью РВЗ, а затем проводили последовательные 2-кратные разведения. Разведенные образцы сыворотки добавляли в лунки планшетов для ЕЫЗА (100 мкл/лунка) и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После инкубирования планшеты промывали РВЗ. Затем в лунки добавляли вторичное антитело (такое как вторичное антитело кролика к антителу мыши), конъюгированное с пероксидазой хрена (НРР). После инкубирования в течение 1 ч при 37°С планшеты промывали РВЗ. Для визуализации результатов в лунки добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ). После инкубирования реакцию останавливали путем добавления 2 мМ Н2ЗО4. Результаты представляли как соотношения положительных-отрицательных (Р/Ν). Соотношение Р/Ν рассчитывали путем деления оптической плотности при 450 нм (ОИ450) данного исследуемого образца на ОИ450 стандартного отрицательного контроля. Соотношения Р/Ν > 2,1 считали положительными. Максимальными значениями разведений соотношений Р/Ν > 2,1 считали титры антител из ЕЫЗА образцов сыворотки.
В дополнение к НРР и ТМВ в данном примере также можно применять другие хромогенные репортеры или флуоресцентные метки с такой же функцией, такие как щелочная фосфатаза (АР), 4метиллумбеллиферилфосфат (4-МИР) и флуоресцеинизотиоцианат (Р1ТС).
3. Результаты.
Через 2 недели после первой иммунизации (ρ.ί.) антитела к штамму ЦВС2 Н обнаружили у всех вакцинированных мышей. После второй иммунизации титры антител из ЕЬРЗА у вакцинированных мышей достигали 1800-2000 на 35-й день после первой иммунизации (ά.ρ.ί.) (фиг. 5). Следовательно, результаты указывали на то, что инактивированная вакцина на основе штамма ЦВС2 Н настоящего изобретения была способна эффективно индуцировать иммунные ответы у мышей.
Пример 7. Испытание эффективности инактивированной вакцины на основе ЦВС2 - 2.
1. Протокол вакцинации и отбор образцов.
Двум здоровым поросятам 5-6-недельного возраста проводили внутримышечное инъецирование 1 мл инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н соответственно. Спустя три недели после первой иммунизации (ρ.ί.) поросят повторно иммунизировали такой же дозой вакцины. Образцы сыворотки брали у обоих поросят перед первой иммунизацией (5-6-недельный возраст), перед второй иммунизацией (8-9-недельный возраст) и через 2 недели после второй иммунизации (10-11-недельный возраст). Обоих поросят взвешивали в то самое время, когда делали отбор сыворотки. Все образцы сыворотки анализировали с помощью ЕЫЗА.
2. Обнаружение антител к ЦВС2 с помощью ЕЫЗА.
Планшеты с антигеном, полученные в примере 3 или 4, в данном примере могут применяться в качестве планшетов для ЕЬ1ЗА. Планшеты для ЕЬ1ЗА промывали 3 раза 50 ммоль/л РВЗ (рН 7,2), содержащим 500 мкл/л Т\уссп-20 (т.е РВЗТ), каждый раз в течение 3-5 мин. Для блокирования планшетов для ЕЬ1ЗА в каждую лунку планшетов для ЕЬ1ЗА добавляли по 200 мкл 0,15% блокирующего раствора ВЗА, а затем планшеты для ЕЬ1ЗА инкубировали в течение 2 ч при 37°С. После этого планшеты для ЕЫЗА промывали РВЗ. Образцы сыворотки свиней разводили в пятьдесят раз (1:50) с помощью РВЗ, а затем проводили последовательные 2-кратные разведения. Разведенные образцы сыворотки добавляли в лунки планшетов для ЕЬ1ЗА (100 мкл/лунка) и планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После инкубирования планшеты промывали РВЗ. Затем в лунки добавляли вторичное антитело (такое как вторичное антитело козы к антителу свиньи), конъюгированное с пероксидазой хрена (НРР). После инкубирования в течение 1 ч при 37°С планшеты промывали РВЗ. Для визуализации результатов в лунки добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ). После инкубирования реакцию останавливали путем добавления 2
- 8 028376 мМ И2ЗО4. Результаты представляли как соотношения положительных-отрицательных (Р/Ν). Соотношение Р/Ν рассчитывали путем деления оптической плотности при 450 нм (ΟΌ450) данного исследуемого образца на ΟΌ450 стандартного отрицательного контроля. Соотношения Р/Ν > 2,1 считали положительными. Максимальными значениями разведений соотношений Р/Ν > 2,1 считали титры антител из ЕЫЗА образцов сыворотки.
3. Результаты.
Через 3 недели после первой иммунизация (ρ.ι.) антитела к штамму ЦВС2 Н обнаружили у обоих вакцинированных поросят. Через 2 недели после второй иммунизации титры антител из ЕЫЗА у вакцинированных поросят составляли больше 11000 (табл. 2). Следовательно, результаты указывали на то, что инактивированная вакцина на основе штамма ЦВС2 Н настоящего изобретения была способна эффективно индуцировать иммунные ответы у мышей.
Таблица 2
Титры антител у вакцинированных поросят согласно ЕЫЗА
Момент Перед первой Перед второй
времени иммунизацией иммунизацией
отбора (5-6-недельный (8-9-недельный
образцов возраст) возраст)
Через 2 недели после второй иммунизации (10-11 -недельный возраст)
Поросенок 1 1 8,490 11,728
Поросенок 2 1 10,263 13,065
Пример 8. Испытание эффективности инактивированной вакцины на основе ЦВС2 - 3.
1. Протокол вакцинации и отбор образцов.
Сорок здоровых поросят 2-недельного возраста случайно разделяли на 4 группы по 10 поросят в каждой. В возрасте 3 недель поросятам из 3 вакцинных групп (групп 1-3) проводили внутримышечную инъекцию инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н по 1 мл из 3 различных партий соответственно. Спустя три недели после первой иммунизации (ρ.ι.) поросят повторно иммунизировали такой же дозой вакцины. Поросят из группы 4 не вакцинировали, и они служили в качестве отрицательного контроля. Образцы сыворотки отбирали у всех поросят за 1 неделю до первой иммунизации (2недельный возраст) и на 1, 2, 3 и 5 неделях после первой иммунизации (4-, 5-, 6- и 8-недельный возраст соответственно). Всех поросят взвешивали в возрасте 3, 4, 5, 6 и 8 недель. Все образцы сыворотки анализировали с помощью ЕЫЗА.
Таблица 3
Схема вакцинации и отбора образцов
Возраст (недели) 2 3 4 5 6 8
Вакцинация - Первая вакцинация - - Вторая вакцинация -
Тест 1 Отбор крови, ΙΡΑ - Отбор крови, ΙΡΑ Отбор крови, ΙΡΑ Отбор крови, ΙΡΑ Отбор крови, ΙΡΑ
Тест 2 - Взвешивание Взвешивание Взвешивание Взвешивание Взвешивание
2. Обнаружение антител к ЦВС2 с помощью 1РА.
Планшеты с антигеном, полученные в примере 3, применяли в данном примере. Планшеты с антигеном брали из -20°С для оттаивания и просушивали при 37°С. Образцы сыворотки свиней разводили в пятьдесят раз (1:50) с помощью РВЗ, а затем проводили последовательные 2-кратные разведения. Разведенные образцы сыворотки добавляли в лунки планшетов с антигеном (50 мкл/лунка) и планшеты инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После инкубирования планшеты промывали 3 раза РВЗ для удаления необъединенных антител. Затем в лунки добавляли 50 мкл 1дС кролика к антителу свиньи, конъюгированного с Р1ТС (1:100, 31дша). После инкубирования в темноте в течение 30 мин планшеты промывали 3 раза РВЗ и рассматривали под флуоресцентным микроскопом для подсчета титра антител к штамму ЦВС2 Н (Ко11пцне/-А1'по|а с соавт., 2000).
- 9 028376
3. Результаты.
3.1. Титр антител.
Через 2 недели после первой иммунизации (ρ.ΐ.) образцы сыворотки вакцинированных поросят (в возрасте 5 недель) согласно ΙΡΑ имели титры приблизительно 600, тогда как образцы сыворотки просят контрольной группы согласно ΙΡΑ имели титры приблизительно 200 (табл. 4 и фиг. 6). После второй иммунизации согласно ΙΡΑ титры у вакцинированных поросят (в возрасте 6 недель) резко повышались (согласно ΙΡΑ титры составляли больше 13000). У вакцинированных поросят в возрасте 8 недель титры согласно ΙΡΆ составляли больше 46000, тогда как у невакцинированных поросят титры согласно ΙΡΆ были очень низкими, приблизительно 170.
Таблица 4
Титры антител к штамму ЦВС2 Н у вакцинированных поросят согласно ΙΡΆ
Возраст (недели) 2 4 5 6 8
группа 1 800 200 600 13440 48640
группа 2 1680 230 620 20800 46720
группа 3 1100 220 650 18660 49760
группа 4 (контроль) 1880 210 190 300 170
3.2. Прирост массы.
Вакцинированные поросята имели более высокий прирост массы, чем невакцинированные поросята в контрольной группе (табл. 5 и фиг. 7). В возрасте 8 недель вакцинированные поросята были приблизительно на 2 кг тяжелее, чем невакцинированные поросята.
Таблица 5
Массы тел невакцинированных поросят, кг
Возраст (неделя) 3 4 5 6 8
группа 1 8,4461 9,9512 12,4207 16,1756 20,5284
группа 2 7,3718 9,064 11,7594 15.2267 20,3755
группа 3 7,9564 9,5413 12,3461 15,8561 20,4345
группа 4 (контроль) 7,5906 8,9899 11,724 12,9102 18,6059
Следовательно, результаты указывали на то, что инактивированная вакцина на основе штамма ЦВС2 Н настоящего изобретения была способна эффективно индуцировать иммунные ответы у свиней, повышать иммунитет у свиней и, таким образом, увеличивать прирост массы у свиней.
Пример 9. Испытание эффективности инактивированной вакцины на основе ЦВС2 - 4.
1. Протокол вакцинации и инфицирования ЦВС2.
Поросят в возрасте четырнадцати-шестнадцати дней случайно разделяли на 4 группы по 5 поросят в каждой. Все 20 поросят были отрицательны касательно антител к ЦВС2. Поросятам из 3 вакцинных групп (групп 1-3) проводили внутримышечную инъекцию инактивированной вакцины на основе штамма ЦВС2 Н по 1 мл из 3 различных партий соответственно. Спустя две недели после первой иммунизации (ρ.ΐ.) поросят повторно иммунизировали такой же дозой вакцины. Поросята из группы 4 были невакцинированными и служили в качестве отрицательного контроля. Через 5 недель после первой иммунизации проводили контрольное заражение всех поросят исходным раствором вируса штамма ЦВС2 Н (вирулентного штамма) в дозе 106,0 дозу заражения 50% культуры ткани на мл (106,0 ТСГО50/мл). Проводили контрольное заражение каждого поросенка интраназально 1 мл исходного раствора вируса и внутримышечно 2 мл исходного раствора вируса. Образцы сыворотки и мазков из носа отбирали через 7, 11, 19 и 25 дней после контрольного заражения для обнаружения вирусемии ЦВС2 с помощью ПЦР.
2. Обнаружение вирусемии ЦВС2 с помощью ПЦР.
Уровни вирусной ДНК во взятых после контрольного заражения ЦВС2 образцах сыворотки свиней определяли с применением ПЦР. Вирусную ДНК выделяли с помощью реагента ΏΝΑζοΙ®. Прежде всего к 200 мкл сыворотки добавляли 400 мкл реагента ΏΝΑζοΙ® и смесь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант смешивали с двойным объемом абсолютного этанола для преципитации ДНК. Затем смесь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин и удаляли супернатант. Осадок
- 10 028376
ДНК отмывали 75% этанолом, центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин для удаления этанола и в конечном итоге растворяли в 8 мМ №О11.
Праймеры для ПЦР, применяемые для обнаружения вирусемии ЦВС2, имеют следующие последовательности:
ЦВС2-Р1: 5' ОТОААОТООТАТТТТООТОСС 3' (БЕр ΙΌ Νο: 8),
ЦВС2-К1: 5' ОТСТТССААТСАСОСТТСТОС 3' (БЕр ΙΌ Νο: 9).
Праймеры ЦВС2-Р1 (прямой) и ЦВС2-К1 (обратный) применяли для амплификации фрагмента из 284 п.о. из ОКР1 ЦВС2. ПЦР-смесь с конечным объемом 25 мкл содержала 1 мкл прямых праймеров, 1 мкл обратных праймеров, 1,5 мкл 25 мМ М§2+, 2,0 мкл 2,5 мМ άNТР, 2,5 мкл 10х буфера, не содержащего М§2+, 0,2 мкл Тац ДНК-полимеразы, 11,8 мкл дистиллированной воды и 5 мкл матричной ДНК. Реакцию ПЦР начинали с исходного этапа предварительного нагревания ПЦР-смеси при 95°С в течение 5 мин и амплификацию ДНК выполняли за 38 циклов при следующих параметрах: денатурирование при 94°С в течение 30 с, отжиг при 55°С в течение 30 с и удлинение при 72°С в течение 30 с. Реакцию ПЦР завершали этапом конечной достройки в течение 5 мин при 72°С и затем хранили при 4°С. Продукты ПЦР затем анализировали в 1% агарозном геле и визуализировали с помощью окрашивания бромидом этидия.
Кроме того, другая пара праймеров для ПЦР, применяемая для обнаружения вирусемии ЦВС2, имела следующие последовательности:
ЦВС2-Р2: 5' ТОТТООСОАООАОООТААТО '3 (БЕр ΙΌ Νο: 10),
ЦВС2-К2: 5' ТОООАСАОСАОТТОАООАОТ '3 (БПЦ) ΙΌ Νο: 11).
Праймеры ЦВС2-Р2 (прямой) и ЦВС2-К2 (обратный) применяли для амплификации фрагмента из 676 п.о. из ЦВС2.
3. Вскрытие и исследование на патологии.
На 25 день после контрольного заражения поросят умерщвляли и вскрывали для исследования патологических нарушений в органах и забора образцов лимфатических узлов и легких. Образцы тканей фиксировали в 4% формальдегиде, заливали в парафин и затем делали срезы. Срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) и рассматривали под микроскопом.
4. Результаты.
4.1. Оценка вирусемии.
Результаты ПЦР показали, что через 25 дней после контрольного заражения случаев вирусемии у вакцинированных поросят (группы 1-3) было на 40-60% меньше, чем случаев вирусемии у невакцинированных поросят (группа 4) (табл. 6). Результаты показали, что инактивированные вакцины на основе штамма ЦВС2 Н настоящего изобретения были способны индуцировать иммунитет у свиней, уменьшать тяжесть и продолжительность вирусемии у свиней и защищать свиней от инфицирования ЦВС2.
Таблица 6
Вирусемия в сыворотке свиней, определяемая с помощью ПЦР
До
Дни после контрольного заражения
заражения 7 11 19 25
группа 1 0/5а 2/5 2/5 1/5 1/5
группа 2 0/5 2/5 1/5 0/5 0/5
группа 3 0/5 3/5 2/5 1/5 1/5
группа 4
0/5 4/5 3/5 4/5 3/5
(контроль)
а Знаменатели представляют количества подверженных испытанию поросят, а числители представляют количества поросят с вирусемией.
4.2. Гистопатологическое исследование.
Через 25 дней после контрольного заражения поросят умерщвляли и вскрывали. Увеличение паховых, средостенных и брыжеечных лимфоузлов обнаружили у 2 невакцинированных поросят, и срезы лимфатических узлов были бледные. У другого невакцинированного поросенка были не спавшиеся, жесткие легкие, отек легких и покрытые белыми пятнами почки. У всех вакцинированных поросят не обнаружили тяжелых патологических нарушений (табл. 7 и 8).
- 11 028376
Таблица 7
Патологические нарушения у вакцинированных и невакцинированных поросят Патологическое нарушение
Группа Увеличение лимфоузлов Отек легких Покрытые белыми пятнами почки Слабое увеличение селезенки Другое нарушениеь
группа 1 0/5а 0/5 0/5 0/5 0/5
группа 2 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
группа 3 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
группа 4 (контроль) 2/5 1/5 1/5 1/5 0/5
а Знаменатели представляют количества вскрытых поросят, а числители представляют количества поросят с патологическими нарушениями.
ь Другое нарушение включает слабое увеличение печени или желчного пузыря и кишечный метеоризм.
В табл. 8 показаны результаты микроскопического гистопатологического исследования срезов тканей и результаты оценки вирусемии ЦВС2 с помощью ПЦР. Практически у всех невакцинированных поросят (группа 4) наблюдали гистопатологические изменения в лимфоузлах, такие как лимфопению и инфильтрацию макрофагами, и все взятые образцы лимфоузлов от невакцинированных поросят были положительны на вирусемию РСУ2. Кроме того, у 3 невакцинированных поросят наблюдали гистопатологические изменения в легких, такие как инфильтрацию клетками воспаления, и 2 взятых образца тканей легких от невакцинированных поросят были положительны на вирусемию ЦВС2. По сравнению с невакцинированными поросятами у вакцинированных поросят проявлялось значительное уменьшение гистопатологических изменений и вирусемии ЦВС2. Гистопатологические изменения в лимфоузлах наблюдали только у 1 вакцинированного поросенка (свинья № А4) из 15 (группы 1-3), и взятые образцы лимфатических узлов от вакцинированного поросенка (свинья № А4) были единственными положительными на вирусемию ЦВС2 лимфоузлами. Результаты показали, что инактивированная вакцина на основе штамма ЦВС2 Н настоящего изобретения была способна защищать свиней от инфекции ЦВС2, и степень защиты составляла 80-100%.
Таблица 8
Микроскопическое гистопатологическое исследование срезов тканей и оценка вирусемии РСУ2 с помощью ПЦР после контрольного заражения ЦВС2
Степень защиты (%)
А1
А2
АЗ
Группа 1 А4 А5 Промежуточный итог 1/5 + 1/5 + 0/5 + 1/5 0/5 0/5* 0/5* +
1/5 80
В1 - - - - - - - -
В2 - - - - - - - -
ВЗ - - - - - - - -
Группа 2 В4 - - - - - - - -
В5 - - - - - - - -
Промежуточный 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 100
итог
С1 - - - - - - - -
С2 - - - - - - - -
СЗ - - - - - - - -
Группа 3 С4 - - - - - - - -
С5 - - - - - - - -
Промежуточный 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 100
итог
Ш + + + + - + - +
Ό2 + + + + + + + +
ИЗ + + + + + +
Группа 4 (контроль) И4 - + + + - - - +
И5 - + - + - - - +
Промежуточный 2/5 5/5 4/5 5/5 1/5 3/5 2/5 5/5
итог * Знаменатели представляют количества вскрытых поросят, а числители представляют количества поросят с патологическими нарушениями.
Согласно всех результатов инактивированная вакцина на основе штамма ЦВС2 Н настоящего изобретения эффективно индуцирует иммунитет у свиней, защищает вакцинированных свиней от инфекции
- 12 028376
ЦВС2, уменьшает тяжесть и продолжительность вирусемии у свиней, сводит к минимуму клинические симптомы и увеличивает прирост массы тела.
Разумеется, многие изменения и модификации вышеописанного варианта осуществления данного изобретения могут быть выполнены без отклонения от его сущности. Соответственно, изобретение раскрыто для содействия прогрессу в науке и полезных областях техники и должно ограничиваться только объемом формулы изобретения.
Перечень последовательностей <110> СБК Вирбак Лимитед <120> Цирковирус свиней типа 2 (РСУ2),содержащая его иммуногенная композиция,набор для анализа и их применение <160> 11 <210> 1 <211> 1767 <212> ДНК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа <220>
<223> Геномная последовательность штамма Н цирковируса свиней 2 типа <400> 1
ассадсдсас 60 ДДсддсадсд дсадсассДс ддсадсассД садсадсаас аДдсссадса
адаададДдд 120 аадаадсдда ссссаассас аДааааддДд ддДдДДсасд сДдааДааДс
сДДссдаада 180 сдадсдсаад ааааДасддд адсДсссааД сДсссДаДДД даДДаДДДДа
ДДдДДддсда 240 ддааддДааД даддадддсс даасасссса ссДасадддд ДДсдсДааДД
ДДдДдаадаа 300 дсааасДДДД ааДааадДда адДддДаДДД ДддДдсссдс ДдссасаДсд
адааадсдаа 360 аддаасадаД садсадааДа аадааДаДДд садДааадаа ддсаасДДас
ДдаДадааДд 420 ДддадсДссД адаДсДсаад дасаасддад ДдассДсДсД асДдсДдДда
дДассДДдДД 480 ддададсддд адДсДддДда ссдДДдсада дсадсасссД дДаасдДДДд
ДсадаааДДД 540 ссдсдддсДд дсДдаасДДД ДдааадДдад сдддааааДд садаадсдДд
аДДддаадас 600 дааДдДасас дДсаДДдДдд ддссассДдд дДдДддсааа адсаааДддд
сДдсДааДДД 660 Ддсадасссд дааассасаД асДддааасс ассДадааас аадДддДддд
аДддДДасса 720 ДддДдаадаа дДддДЛдЛДа ДДдаДдасДД ДДаДддсДдд сДдссдДддд
аДдаДсДасД дадасДсДдД даДсдаДаДс сДДДдасДдД ДдадасДааа ддДддаасДд
780
- 13 028376
РассРРРРРР 840 ддсссдсадр аРРсРдаРРа ссадсааРса дассссдРРд дааРддРасР
ссРсаасРдс 900 РдРсссадсР дРадаадсРс РсРаРсддад даРРасРРсс ррддрарррр
ддаадааРдс 960 Расадаасаа Рссасддадд аадддддсса дРРсдРсасс сРРРсссссс
саРдсссРда 1020 аРРРссаРаР даааРаааРР асРдадРсРР РРРРаРсасР РсдРааРддР
РРРРаРРаРР 1080 сасРРадддР РаадРддддд дРсРРРаада РРаааРРсРс РдааРРдРас
аРасаРддРР 1140 аРасддаРаР РдРадРссРд дРсдРаРаРа сРдРРРРсда асдсадрдсс
даддссРаса 1200 РддРсРасаР РРссадРадР ррдрадрсрс адссададРР даРРРсРРРР
дрраррдддр 1260 РддаадРааР сдаРРдРссР аРсааддаса ддРРРсдддд РааадРассд
ддадРддРад 1320 дадаадддсР дддРРаРддР аРддсдддад дадРадРРРа саРаддддРс
аРаддРРадд 1380 дсаРРддссР РРдРРасааа дРРаРсаРсР адааРаасад садРддадсР
сасРссссРд 1440 РсасссРддд РдаРРдддда дсадддссад ааРРсаассР РаассРРссР
РаРРсРдРад 1500 РаРРсааадд дсасадрдад ддддсРРдад сссссРссРд ддддаадааа
аРсаРРааРа 1560 РРаааРсРса РсаРдРссас аРРссаддад ддсдРРсРда сРдРддРРРР
сРРдасадРа 1620 РаассдаРдд Рдсдддадад дсдддРдРРд аадаРдссаР РРРРссРРсР
ссадсддРаа 1680 сддрддсддд ддРддасРад ссаддддсдд сддсддадда РсРддссаад
аРддсРдсдд дддсддРдРс РРсдРсРдсд дРаасдссРс сРРддаРасд РсаРсдсРда
1740 ааасдааада адрдсдсрдр аадРаРР 1767 <210> 2 <211> 945 <212> ДНК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа <220>
<223> Последовательность ДНК открытой рамки считывания 1 (ОКГ1) штамма Н цирковируса свиней 2 типа <400> 2
аРдсссадса 60 адаададРдд аадаадсдда ссссаассас аРааааддРд ддРдРРсасд
сРдааРааРс 120 сРРссдаада сдадсдсаад ааааРасддд адсРсссааР сРсссРаРРР
даРРаРРРРа 180 РРдРРддсда ддааддРааР даддадддсс даасасссса ссРасадддд
РРсдсРааРР 240 ррдрдаадаа дсааасРРРР ааРааадРда адРддРаРРР РддРдсссдс
РдссасаРсд 300 адааадсдаа аддаасадаР садсадааРа аадааРаРРд садрааадаа
ддсаасРРас 360 РдаРадааРд РддадсРссР адаРсРсаад дасаасддад РдассРсРсР
асрдсрдрда 420 дРассРРдРР ддададсддд адРсРддРда ссдррдсада дсадсасссР
дРаасдРРРд 480 РсадаааРРР ссдсдддсрд дсРдаасРРР РдааадРдад сдддааааРд
садаадсдрд 540 аррддаадас дааРдРасас дРсаРРдРдд ддссассРдд дрдрддсааа
адсаааРддд 600 сРдсРааРРР Рдсадасссд дааассасаР асРддааасс ассРадааас
аадрддрддд 660 арддррасса рддрдаадаа дрддррдрра РРдаРдасРР РРаРддсРдд
сРдссдРддд 720 аРдаРсРасР дадасРсРдР даРсдаРаРс сРРРдасРдР РдадасРааа
ддрддаасрд 780 РассРРРРРР ддсссдсадр аРРсРдаРРа ссадсааРса дассссдРРд
дааРддРасР 840 ссРсаасРдс РдРсссадсР дРадаадсРс РсРаРсддад даРРасРРсс
РРддРаРРРР 900 ддаадааРдс Расадаасаа Рссасддадд аадддддсса дРРсдРсасс
сРРРсссссс саРдсссРда аРРРссаРаР даааРаааРР асРда
<210> 3 <211> 314 <212> БЕЛОК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа
945 <220>
<223> Аминокислотная последовательность открытой рамки считывания 1 (ΟΚΕΊ) штамма Н цирковируса свиней 2 типа <400> 3
Мер Рго Зег Ьуз Ьуз Зег <31у Агд Зег О1у Рго О1п Рго Шз Ьуз Агд 15 10 15
Тгр Уа1 РНе ТНг Ьеи Азп Азп Рго Зег О1и Азр б1и Агд Ьуз Ьуз Не 20 25 30
Агд О1и Ьеи Рго 11е Зег Ьеи РНе Азр Туг РНе 11е Уа1 <31у (31и С1и 35 40 45
С1у Азп О1и С1и <31у Агд ТНг Рго ΗΪ3 Ьеи С1п О1у РНе А1а Азп РНе 50 55 60
Уа1 Ьуз Ьуз С1п ТНг РНе Азп Ьуз Уа1 Ьуз Тгр Туг РНе С1у А1а Агд 65 70 75 80
Суз Нтз 11е С1и Ьуз А1а Ьуз С1у ТНг Азр О1п ОЯп Азп Ьуз О1и Туг 85 90 95
Суз Зег Ьуз <31и <31у Азп Ьеи Ьеи 11е <31и Суз <31у А1а Рго Агд Зег 100 105 110
О1п С1у <31п Агд Зег Азр Ьеи Зег ТНг А1а Уа1 Зег ТНг Ьеи Ьеи С1и 115 120 125
Зег О1у Зег Ьеи Уа1 ТНг Уа1 А1а <31и С1п ΗΪ3 Рго А7а1 ТНг РНе Уа1 130 135 140
Агд Азп РНе Агд С1у Ьеи А1а О1и Ьеи Ьеи Ьуз Уа1 Зег О1у Ьуз Мер 145 150 155 160
С1п Ьуз Агд Азр Тгр Ьуз ТНг Азп Уа1 ΗΪ3 Уа1 11е Уа1 С1у Рго Рго 165 170 175
С1у Суз О1у Ьуз Зег Ьуз Тгр А1а А1а Азп РНе А1а Азр Рго С1и ТНг 180 185 190
ТНг Туг Тгр Ьуз Рго Рго Агд Азп Ьуз Тгр Тгр Азр С1у Туг Нхз О1у 195 200 205
С1и С1и Уа1 Уа1 Уа1 Не Азр Азр РНе Туг О1у Тгр Ьеи Рго Тгр Азр 210 215 220
Азр Ьеи Ьеи Агд Ьеи Суз Азр Агд Туг Рго Ьеи ТНг Уа1 С1и ТНг Ьуз 225 230 235 240
С1у С1у ТНг Уа1 Рго РНе Ьеи А1а Агд Зег Не Ьеи Не ТНг Зег Азп 245 250 255
О1п ТНг Рго Ьеи С1и Тгр Туг Зег Зег ТНг А1а Уа1 Рго А1а Уа1 С1и 260 265 270
А1а Ьеи Туг Агд Агд Не ТНг Зег Ьеи Уа1 РНе Тгр Ьуз Азп А1а ТНг 275 280 285
С1и <31п Зег ТНг С1и С1и С1у О1у С1п РНе Уа1 ТНг Ьеи Зег Рго Рго 290 295 300
Суз Рго О1и РНе Рго Туг С1и Не Азп Туг 305 310 <210> 4 <211> 705 <212> ДНК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа <220>
<223> Последовательность ДНК открытой рамки считывания 2 (ОКГ2) штамма Н цирковируса свиней 2 типа <400> 4
аРдасдРаРс сааддаддсд РРассдсада сдаадасасс дсссссдсад ссаРсРРддс 60
садаРссРсс 120 дссдссдссс сРддсРадРс сасссссдсс ассдРРассд сРддадаадд
аааааРддса 180 РсРРсаасас ссдссРсРсс сдсассаРсд дРРаРасРдР саадаааасс
асадРсадаа 240 сдсссРссРд даардрддас аРдаРдадаР РРааРаРРаа РдаРРРРсРР
сссссаддад 300 ддддсРсаад сссссРсасР дРдсссРРРд ааРасРасад ааРааддаад
дРРааддРРд 360 ааРРсРддсс сРдсРсссса аРсасссадд дрдасадддд адРдадсРсс
асРдсРдРРа РРсРадаРда РаасРРРдРа асаааддсса аРдсссРаас сРаРдасссс
420
РаРдРааасР 480 асРссРсссд ссаРассаРа асссадссср РсРссРасса сРсссддРас
РРРассссда 540 аассрдрсср РдаРаддаса аРсдаРРасР Рссаасссаа Раасаааада
ааРсаасРсР 600 ддсРдадасР асааасРасР ддаааРдРад ассаРдРадд ссРсддсасР
дсдРРсдааа 660 асадРаРаРа сдассаддас РасааРаРсс дРаРаассаР дрардрасаа
РРсададааР РРааРсРРаа адасссссса сРРаасссРа адРда
705 <210> 5 <211> 234 <212> БЕЛОК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа <220>
<223> Аминокислотная последовательность открытой рамки считывания 2 (ОК.Е2) штамма Н цирковируса свиней 2 типа <400> 5
МеР ТНг Туг Рго Агд Агд Агд Туг Агд Агд Агд Агд ΗΪ8 Агд Рго Агд 15 10 15
Зег НФз Ьеи О1у Θΐη Не Ьеи Агд Агд Агд Рго Тгр Ьеи Уа1 ΗΪ8 Рго 20 25 30
Агд НФз Агд Туг Агд Тгр Агд Агд Ьуз Азп (31у 11е РНе Азп ТНг Агд 35 40 45
Ьеи Зег Агд ТНг 11е <31у Туг ТНг Уа1 Ьуз Ьуз ТНг ТНг Уа1 Агд ТНг 50 55 60
Рго Зег Тгр Азп Уа1 Азр Мер Мер Агд РНе Азп 11е Азп Азр РНе Ьеи 65 70 75 80
Рго Рго С1у О1у О1у Зег Зег Рго Ьеи ТНг Уа1 Рго РНе О1и Туг Туг 85 90 95
Агд Не Агд Ьуз Уа1 Ьуз Уа1 С1и РНе Тгр Рго Суз Зег Рго Не ТНг 100 105 110 <31п <31у Азр Агд <31у Уа1 Зег Зег ТНг А1а Уа1 Не Ьеи Азр Азр Азп 115 120 125
РНе Уа1 ТНг Ьуз А1а Азп А1а Ьеи ТНг Туг Азр Рго Туг Уа1 Азп Туг 130 135 140
Зег Зег Агд НФз ТНг Не ТНг С1п Рго РНе Зег Туг НФз Зег Агд Туг 145 150 155 160
РНе ТНг Рго Ьуз Рго Уа1 Ьеи Азр Агд ТНг Не Азр Туг РНе Θΐη Рго 165 170 175
Азп Азп Ьуз Агд Азп С1п Ьеи Тгр Ьеи Агд Ьеи С1п ТНг ТНг <31у Азп 180 185 190
Уа1 Азр НФз УаФ С1у Ьеи С1у ТНг А1а РНе С1и Азп Зег Не Туг Азр 195 200 205
ОЯп Азр Туг Азп Не Агд Не ТНг Мер Туг Уа1 О1п РНе Агд <31и РНе 210 215 220
Азп Ьеи Ьуз Азр Рго Рго Ьеи Азп Рго Ьуз 225 230 <210> б <211> 315 <212> ДНК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа <220>
<223> Последовательность ДНК открытой рамки считывания 3 (ОКЕЗ) штамма Н цирковируса свиней 2 типу
<400> 6 аРддРаасса 60 РсссассасР РдРРРсРадд РддРРРссад рардрддррр ссдддРсРдс
ааааРРадса 120 дсссаРРРдс РРРРдссаса сссаддрддс сссасаарда сдРдРасаРР
сдРсРРссаа 180 РсасдсРРсР дсаРРРРссс дсРсасРРРс аааадРРсад ссадсссдсд
даааРРРсРд 240 асааасдРРа садддРдсРд сРсРдсаасд дРсассадас РсссдсРсРс
саасааддра сРсасадсад РадададдРс асрссдррдр ссРРдадаРс РаддадсРсс
300 асаРРсРаРс адраа 315 <210> 7 <211> 104 <212> БЕЛОК <213> Штамм Н цирковируса свиней 2 типа <220>
<223> Аминокислотная последовательность открытой рамки считывания 3 (ОК.ЕЗ) штамма Н цирковируса свиней 2 типа <400> 7
Меб Уа1 ТНг Не Рго Рго Ьеи Уа1 Зег Агд Тгр РНе Рго Уа1 Суз О1у 15 10 15
РНе Агд Уа1 Суз Ьуз 11е Зег Зег Рго РНе А1а РНе А1а ТНг Рго Агд 20 25 30
Тгр Рго Шз Азп Азр Уа1 Туг Не Агд Ьеи Рго Не ТНг Ьеи Ьеи Шз 35 40 45
РНе Рго А1а Шз РНе С1п Ьуз РНе Зег С1п Рго А1а С1и Не Зег Азр 50 55 60
Ьуз Агд Туг Агд Уа1 Ьеи Ьеи Суз Азп О1у Шз С1п ТНг Рго А1а Ьеи 65 70 75 80
С1п С1п О1у ТНг Шз Зег Зег Агд С1и Уа1 ТНг Рго Ьеи Зег Ьеи Агд 85 90 95
Зег Агд Зег Зег ТНг РНе Туг <31п 100 <210> 8 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер/зонд для обнаружения цирковируса свиней 2 типа <400> 8 дбдаадбддб аббббддбдс с <210> 9 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер/зонд для обнаружения цирковируса свиней 2 типа <400> 9 дбсббссааб сасдсббсбд с <210> 10 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер/зонд для обнаружения цирковируса свиней 2 типа <400> 10 бдббддсдад дадддбаабд <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер/зонд для обнаружения цирковируса свиней 2 типа <400> 11

Claims (14)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2), который содержит геномную последовательность δΕρ ΙΌ Νο:
    1.
  2. 2. Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2) по п.1, который депонирован в Китайском центре коллекции типовых культур (ССТСС) под номером доступа У201117.
  3. 3. Цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2) по п.1, где ЦВС2 способен вызывать цитопатический эффект (СРЕ) в клеточной линии РК-15 или ее производных клеточных линиях.
  4. 4. Иммуногенная композиция, которая содержит цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2) по п.1, где ЦВС2 является инактивированным.
  5. 5. Иммуногенная композиция по п.4, которая дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
  6. 6. Иммуногенная композиция по п.5, где носитель представляет собой адъювант.
  7. 7. Иммуногенная композиция по п.4, где ЦВС2 инактивирован инактивирующим реагентом или тепловой обработкой.
  8. 8. Иммуногенная композиция по п.4, которая дополнительно содержит по меньшей мере один патогенный антиген, выбранный из группы, включающей антиген вируса свиного гриппа (δΙν), антиген вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РККδV), антиген микоплазмы, антиген парвови- 17 028376 руса свиней (РРУ), антиген рожи свиней и антиген вируса псевдобешенства.
  9. 9. Способ защиты свиньи от инфицирования цирковирусом свиней 2 типа, включающий введение иммуногенной композиции по п.4 свинье для увеличения иммунитета против ЦВС2 у свиньи.
  10. 10. Антитело к цирковирусу свиней 2 типа (ЦВС2), полученное с помощью ЦВС2 по п.1.
  11. 11. Антитело к цирковирусу свиней 2 типа (ЦВС2) по п.10, которое представляет собой моноклональное антитело, поликлональное антитело или антитело, полученное способами генной инженерии.
  12. 12. Полинуклеотид, кодирующий полипептид открытой рамки считывания 2 (ОРР2) вируса ЦВС2 по п.1, при этом полипептид ОРР2 имеет последовательность 8ЕР ГО Νο: 5.
  13. 13. Полинуклеотид по п.12, где полинуклеотид содержит последовательность 8ЕР ГО Νο: 4.
  14. 14. Набор для анализа образца на цирковирус свиней 2 типа (ЦВС2), содержащий вирусный антиген вируса по п.1 или антитело по п.10, где антитело представляет собой моноклональное антитело, поликлональное антитело или антитело, полученное способами генной инженерии.
EA201370140A 2010-12-22 2011-12-20 Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение EA028376B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061426087P 2010-12-22 2010-12-22
PCT/CN2011/084277 WO2012083837A1 (zh) 2010-12-22 2011-12-20 猪第二型环状病毒、含彼的免疫组合物、检测套组及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201370140A1 EA201370140A1 (ru) 2013-10-30
EA028376B1 true EA028376B1 (ru) 2017-11-30

Family

ID=46313165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201370140A EA028376B1 (ru) 2010-12-22 2011-12-20 Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9101571B2 (ru)
EP (2) EP2657333B1 (ru)
JP (2) JP2014507124A (ru)
KR (1) KR101740764B1 (ru)
CN (1) CN103314103B (ru)
AU (1) AU2011348702B2 (ru)
BR (1) BR112013015675A2 (ru)
DK (1) DK2657333T3 (ru)
EA (1) EA028376B1 (ru)
ES (1) ES2763327T3 (ru)
MX (1) MX351578B (ru)
TW (2) TWI508974B (ru)
UA (1) UA110632C2 (ru)
WO (1) WO2012083837A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2697849C1 (ru) * 2019-04-26 2019-08-21 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) Способ диагностики цирковируса свиней

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA113192C2 (xx) * 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
CN103893750B (zh) * 2012-12-31 2015-11-25 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗猪伪狂犬病、猪流感疫苗组合物及其应用
WO2014182872A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Protatek International, Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
EP3035958B1 (en) 2013-08-23 2022-10-26 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Porcine circovirus type 2 (pcv2) subunit vaccine
CN104749361B (zh) * 2015-01-21 2017-04-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型抗原捕获elisa试剂盒
CN105445457B (zh) * 2015-03-24 2017-08-11 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体及试剂盒
MX2017014414A (es) 2015-05-14 2018-03-16 Merial Inc Metodo para la produccion de circovirus porcino y vacunas pcv2.
CN105606804A (zh) * 2016-01-20 2016-05-25 福州大北农生物技术有限公司 一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法
CN107686833B (zh) * 2016-04-18 2021-02-19 华南农业大学 一种猪细小病毒毒株及其应用
HUE061972T2 (hu) 2016-11-03 2024-02-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vakcina sertés parvovirus és sertés reprodukciós és légzõszervi szindróma vírus ellen, és eljárások ezek elõállítására
EA201991065A1 (ru) 2016-11-03 2019-11-29 Вакцина против свиного парвовируса
CN109206509B (zh) * 2017-06-29 2021-07-20 洛阳普泰生物技术有限公司 与伪狂犬病病毒gD蛋白结合的单克隆抗体及其应用
CN107308446B (zh) * 2017-07-14 2021-03-23 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法
CN107227380A (zh) * 2017-07-26 2017-10-03 杭州师范大学 一种同步检测pcv2和prv感染的引物序列及方法
CN110343670B (zh) * 2018-04-04 2022-08-30 普莱柯生物工程股份有限公司 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用
CN110387355B (zh) * 2018-04-18 2022-08-30 普莱柯生物工程股份有限公司 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用
WO2019238611A1 (en) * 2018-06-11 2019-12-19 Ceva Sante Animale Vaccination against porcine circoviruses
CN109468413B (zh) * 2018-12-14 2021-09-10 湖南中净生物科技有限公司 一种母猪繁殖障碍病原检测引物、试剂盒、病原检测方法和应用
CN110041409B (zh) * 2019-05-07 2022-09-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用
CN110698542B (zh) * 2019-09-16 2022-03-22 长江大学 人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用
CN110711202B (zh) * 2019-10-25 2022-08-19 湖南农业大学 Phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用
FR3120944A1 (fr) 2021-03-21 2022-09-23 Virbac Procédé de détermination de l’âge optimum de vaccination de porcelets par mesure d’une teneur en anticorps dans le colostrum de truies au sein d’un élevage
CN114317456A (zh) * 2021-12-15 2022-04-12 成都史纪生物制药有限公司 一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法及猪圆环病毒疫苗
CN115094060A (zh) * 2022-06-23 2022-09-23 湖南农业大学 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸的试剂盒及方法
CN115947794A (zh) * 2022-07-19 2023-04-11 沈阳农业大学 一种pcv2 orf3特异性多肽及应用
CN116813718B (zh) * 2023-08-30 2023-10-27 北京瑞阳瑞泰生物科技有限公司 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101343671A (zh) * 2008-08-25 2009-01-14 湖南省兽医总站 猪2型圆环病毒pcr快速检测试剂盒
CN101549155A (zh) * 2009-05-27 2009-10-07 福州大北农生物技术有限公司 猪圆环病毒ⅱ型灭活疫苗及其制备方法
WO2009126356A2 (en) * 2008-01-23 2009-10-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
WO2010061000A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA78180C2 (ru) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кольцевой вирус свиньи, вакцины и диагностические реагенты
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US20040062775A1 (en) 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
EP3766518A1 (en) 2005-12-29 2021-01-20 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Pcv2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
TWI367256B (en) * 2008-10-07 2012-07-01 Academia Sinica Vaccine composition and kit providing protective immunity against porcine circovirus 2
UA113192C2 (xx) * 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126356A2 (en) * 2008-01-23 2009-10-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
CN101343671A (zh) * 2008-08-25 2009-01-14 湖南省兽医总站 猪2型圆环病毒pcr快速检测试剂盒
WO2010061000A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof
CN101549155A (zh) * 2009-05-27 2009-10-07 福州大北农生物技术有限公司 猪圆环病毒ⅱ型灭活疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI, Baoxiang, Advances in detection and vaccination techniques of porcine circovirus type 2, ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE, ISSN: 0529-5130, vol. 40, no. 9, pages 89-92, 31 December 2008 (31.12.2008), see the whole document *
DONG, Xintian et al., Preparation and Immune Efficacy of Inactivated Vaccine against Porcine Circovirus 2, ACTA VETERINARIAET ZOOTECHICA SINICA, ISSN: 0366-6964, vol. 39, no. 5, pages 639-644, 31 December 2008 (31.12.2008), see the whole document *
GenBanK registry number: AY291317, 02 June 2003 (02.06.2003), see nucleotide and amino acid sequence see the whole document *
GenBanK registry number: GQ359002, 19 August 2009 (19.08.2009), see nucleotide and amino acid sequence see the whole document *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2697849C1 (ru) * 2019-04-26 2019-08-21 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) Способ диагностики цирковируса свиней

Also Published As

Publication number Publication date
TWI508974B (zh) 2015-11-21
KR101740764B1 (ko) 2017-05-26
CN103314103B (zh) 2015-06-24
KR20130098430A (ko) 2013-09-04
EP2657333A1 (en) 2013-10-30
AU2011348702A1 (en) 2013-07-18
ES2763327T3 (es) 2020-05-28
MX351578B (es) 2017-10-19
WO2012083837A1 (zh) 2012-06-28
TW201225975A (en) 2012-07-01
EP2657333A4 (en) 2014-11-12
US9101571B2 (en) 2015-08-11
CN103314103A (zh) 2013-09-18
UA110632C2 (uk) 2016-01-25
EA201370140A1 (ru) 2013-10-30
DK2657333T3 (da) 2019-12-09
US20150297709A1 (en) 2015-10-22
US9770501B2 (en) 2017-09-26
MX2013007211A (es) 2014-03-12
JP6150864B2 (ja) 2017-06-21
JP2014507124A (ja) 2014-03-27
AU2011348702B2 (en) 2016-06-16
BR112013015675A2 (pt) 2020-10-06
TW201437226A (zh) 2014-10-01
TWI442935B (zh) 2014-07-01
EP3604504A1 (en) 2020-02-05
US20120164170A1 (en) 2012-06-28
EP2657333B1 (en) 2019-10-02
JP2016052313A (ja) 2016-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA028376B1 (ru) Цирковирус свиней 2 типа (цвс2), содержащая его иммуногенная композиция, набор для анализа и их применение
US8277814B2 (en) Avian Astrovirus
US8703468B2 (en) Porcine circovirus type 2B isolate and uses thereof
CN102971425A (zh) 活的减毒嵌合猪圆环病毒疫苗
CN107375922B (zh) 一种水溶性复合免疫佐剂及猪圆环病毒病疫苗
KR102336158B1 (ko) 돼지유행성설사병바이러스 및 돼지로타바이러스에 대한 백신 조성물
CN104059889B (zh) 伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用
CN112500458B (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株亚单位疫苗、其制备方法及应用
CN113073083B (zh) 犬细小病毒弱毒株、及其制备的疫苗组合物和应用
US20130251719A1 (en) Bone marrow aplasia with haemorrhagic disease in calves caused by novel pathogen
CN114921422B (zh) 一种犬源猫细小病毒分离株及其应用
CN109790522B (zh) 减毒的猪瘟病毒标记活疫苗株及利用其的用于口服施用的疫苗组合物
CN1225553C (zh) 表达猪细小病毒vp2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法
KR102239927B1 (ko) 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물
Coombes et al. Chicken anaemia virus: a short review
CN112522217B (zh) 一种犬瘟热弱毒株及其制备的疫苗组合物和应用
Zhang et al. Evaluation of immune response and protection in animals given mink parvovirus vaccines
Trinh Virologic, antigenic and genetic characterization of chicken anemia virus (CAV) and development of a new serologic diagnostic method
Dai Virologic, antigenic and genetic characterization of

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title