CN102712930B

CN102712930B - 猪细环病毒的疫苗和诊断

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Publication number: CN102712930B
Application number: CN201080047299.6A
Authority: CN
Inventors: 孟祥锦; 黄耀伟
Original assignee: Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Current assignee: Virginia Tech Intellectual Properties Inc
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2010-08-23
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2030-08-23
Also published as: ZA201201949B; US20160216263A1; US20110045019A1; US9897605B2; HK1249111A1; CO6531416A2; EP2851428A3; EP2467484A4; KR101640062B1; JP2015221819A; CN102712930A; JP6126176B2; KR20140127903A; ES2767781T3; CN107522775A; BR112012003844A2; EP2851428A2; MX344015B; PL2851428T3; WO2011031438A9

Abstract

本发明提供4种纯化的制品，所述制品含有编码猪细环病毒(PTTV)基因型或亚型PTTV1a‑VA、PTTV1b‑VA、PTTV2b‑VA和PTTV2c‑VA的多核酸分子。本发明还提供含有这种感染性核酸基因组分子的感染性DNA克隆、生物功能性质粒或病毒载体。本发明还提供用于防止PTTV感染的活疫苗、减毒疫苗、载体表达的和纯化的重组衣壳亚单位疫苗或者死病毒疫苗。本发明还提供用于防止PTTV感染的包含PTTV特异性基因产物(尤其是ORF1衣壳基因产物)的亚单位疫苗。此外，本发明提供通过使用PTTV1、PTTV2和个体PTTV1基因型之特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)来诊断PTTV感染的方法。最后，本发明提供通过免疫学方法(例如，用于检测血清PTTV特异性抗体的使用PTTV特异性抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western印记)来诊断PTTV感染的方法。

Description

猪细环病毒的疫苗和诊断

相关申请的引用

本专利申请要求2009年8月21日提交的美国临时专利申请No.61/235,833和2010年3月23日提交的美国临时专利申请61/316,519的权益，其公开内容通过引用由此全文并入本公开内容。

技术领域

本发明涉及用于对猪细环病毒(Torque teno virus，TTV)感染提供保护的疫苗，以及猪TTV(porcine TTV，PTTV)的感染性DNA克隆及其应用。本发明还涉及猪细环病毒(porcine Torque teno virus，PTTV)感染的诊断，尤其是种特异性的或类型特异性的PTTV感染的诊断和来自不同基因型的多种毒株同时感染的诊断。

背景技术

细环病毒(TTV)于1997年首次在患有输血后非甲～戊肝炎的日本患者中被发现(Nishizawa，T.，Okamoto，H.，Konishi，K.，Yoshizawa，H.，Miyakawa，Y.，and Mayumi，M.(1997).A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels inposttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophys Res Commun 24 1(1)，92-7.)。从那时起，已在高比例的来自健康人的血清和其他组织中鉴定出大量人TTV毒株以及随后定名为小细环病毒(Torque teno mini virus，TTMV)和Torque teno midivirus(TTMDV)的两组TTV相关病毒(Hino，S.，and Miyata，H.(2007).Torque teno virus(TTV)：current status.Rev Med Virol17(1)，45-57；Okamoto，H.(2009a).History ofdiscoveries and pathogenicity of TT viruses.Curr Top Microbiol Immunol 331，1-20)。人TTV、TTMV和TTMDV是具有长度分别为3.6～3.9、2.8～2.9和3.2 kb的环状单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)基因组的无包膜的球状病毒，并且其当前被国际病毒分类学委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV；http:// www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp？bhcp＝1) 分类为新设立的指环病毒科(familyAnelloviridae)(Biagini，P.(2009).Classification of TTV and related viruses(anelloviruses).Curr Top Microbiol Immunol 331，21-33)。这三组TTV相关病毒表现出高度的遗传异质性，每组由很多基因群(genogroup)和基因型组成(Biagini，P.，Gallian，P.，Cantaloube，J.F.，Attoui，H.，de Micco，P.，and de Lamballerie，X.(2006).Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groupsin French blood donors.J Med Virol 78(2)，298-304；Jelcic，I.，Hotz-Wagenblatt，A.，Hunziker，A.，Zur Hausen，H.，and de Villiers，E.M.(2004).Isolation of multipleTT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin′s diseasepatient：genome reorganization and diversity in the hypervariable region.JVirol 78(14)，7498-507)。已证实在人中经常有不同基因型的TTV的多重感染以及TTV、TTMV和TTMDV的双重或三重感染的患病率，并且这被认为是健康成年人中常见的事件(Niel，C.，Saback，F.L.，and Lampe，E.(2000).Coinfection with multiple TT virusstrains belonging to different genotypes is a common event in healthyBrazilian adults.J Clin Microbiol38(5)，1926-30；Ninomiya，M.，Takahashi，M.，Hoshino，Y.，Ichiyama，K.，Simmonds，P.，and Okamoto，H.(2009).Analysis ofthe entiregenomes of torque teno midi virus variants in chimpanzees：infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees.J Gen Virol 90(Pt 2)，347-58；Okamoto，H.(2009a).History of discoveries and pathogenicity of TT viruses.CurrTop Microbiol Immunol 331，1-20；Takayama，S.，Miura，T.，Matsuo，S.，Taki，M.，andSugii，S.(1999).Prevalence and persistence of a novel DNA TT virus(TTV)infection in Japanese haemophiliacs.Br J Haematol104(3)，626-9)。

TTV不仅感染人，而且还感染多种其他动物物种，包括非人灵长类、树鼩(tupaias)、猪、牛、猫、狗和海狮(Biagini，P.，Uch，R.，Belhouchet，M.，Attoui，H.，Cantaloube，J.F.，Brisbarre，N.，and de Micco，P.(2007).Circular genomes relatedto anelloviruses identified in human and animal samples by using a combinedrolling-circleamplification/sequence-independent single primer amplificationapproach.J Gen Virol 88(Pt10)，2696-701；Inami，T.，Obara，T.，Moriyama，M.，Arakawa，Y.，and Abe，K.(2000).Full-length nucleotide sequence of a simian TT virusisolate obtained from a chimpanzee：evidence for a new TT virus-likespecies.Virology 277(2)，330-5；Ng，T.F.，Suedmeyer，W.K.，Wheeler，E.，Gulland，F.，and Breitbart，M.(2009).Novel anellovirus discovered from a mortality event ofcaptive California sea lions.J Gen Virol 90(Pt 5)，1256-61；Okamoto，H.(2009b).TT viruses in animals.Curr Top Microbiol Immunol 331，35-52；Okamoto，H.，Nishizawa，T.，Takahashi，M.，Tawara，A.，Peng，Y.，Kishimoto，J.，and Wang，Y.(2001).Genomic and evolutionary characterization of TT virus(TTV)in tupaias andcomparison with species-specific TTVs in humans and non-human primates.J GenVirol 82(Pt 9)，2041-50；Okamoto，H.，Nishizawa，T.，Tawara，A.，Peng，Y.，Takahashi，M.，Kishimoto，J.，Tanaka，T.，Miyakawa，Y.，and Mayumi，M.(2000a).Species-specificTT viruses in humans and nonhuman primates and their phylogeneticrelatedness.Virology 277(2)，368-78；Okamoto，H.，Takahashi，M.，Nishizawa，T.，Tawara，A.，Fukai，K.，Muramatsu，U.，Naito，Y.，and Yoshikawa，A.(2002).Genomiccharacterization of TT viruses(TTVs)in pigs，cats and dogs and theirrelatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias.J Gen Virol83(Pt 6)，1291-7)。此外，TTMV和TTMDV还感染黑猩猩(Ninomiya，M.，Takahashi，M.，Hoshino，Y.，Ichiyama，K.，Simmonds，P.，and Okamoto，H.(2009).Analysis of the entiregenomesoftorque teno midi virus variants in chimpanzees：infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees.J Gen Virol90(Pt 2)，347-58；Okamoto et al.，2000a，见上文)。尽管所鉴定的动物TTV毒株(尤其是非灵长类动物TTV)的基因组大小与人TTV的相比相对较小，但它们共有相同的基因组结构，至少有从负ssDNA翻译的两个部分重叠的开放读码框(ORF1和ORF2)和短段的具有高GC含量(～90％)的非翻译区(untranslated region，UTR)(Okamoto，2009b，见上文)。TTV ORF的排列与属于圆环病毒科(family Circoviridae)的鸡贫血病毒属(genus Gyrovirus)的鸡贫血病毒(chickenanemia virus，CAV)的排列十分相似，但与分类为同一科的猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)类型1(PCV1)和类型2(PCV2)不同(Davidson，I.，and Shulman，L.M.(2008).Unraveling the puzzle of human anellovirus infections by comparisonwith avian infections with the chicken anemia virus.Virus Res 137(1)，1-15；Hino，S.，and Prasetyo，A.A.(2009).Relationship of Torque teno virus to chickenanemia virus.Curr Top Microbiol Immunol 331，117-30)。PCV1和PCV2 的基因组是双义的(ambisense)，其中ORF1是由基因组链(genomic strand)编码的，而ORF2是由反基因组链(antigenomic strand)编码的(Hino and Miyata，2007，见上文)。最近，已通过将各自的TTV感染性DNA克隆转染进入培养的细胞而鉴定人TTV基因型1和6的转录模式(transcription pattern)和翻译产物(MuellellB.，Maerz，A.，Doberstein，K.，Finsterbusch，T.，and Mankertz，A.(2008).Gene expression of the human TorqueTeno Virus isolate P/1C1.Virology 381(1)，36-45；Qiu，J.，Kakkola，L.，Cheng，F.，Ye，C.，Soderlund-Venermo，M.，Hedman，K.，and Pintel，D.J.(2005).Human circovirus TTvirus genotype 6 expresses six proteins following transfection of a full-length clone.J Virol 79(10)，6505-10)。已报道从三种或更多种经剪接的mRNA表达至少6种蛋白质，其定名为ORF1、ORF2、ORF1/1、ORF2/2、ORF1/2和ORF2/3(Kakkola，L.，Hedman，K.，Qiu，J.，Pintel，D.，and Soderlund-Venermo，M.(2009).Replication of and proteinsynthesis by TT viruses.Curr Top Microbiol Immunol 331，53-64；Mueller et al.，2008，见上文；Qiu et al.，2005，见上文)。因此，当与动物TTV相关的更多数据变得可获得时，将很可能需要修改所推定的动物TTV的基因组结构。

尽管TTV是最先在隐源性肝炎患者中鉴定的，但随后的研究未能产生TTV在肝炎或其他疾病的发病机制中之显著作用的证据(Hino and Miyata，2007，见上文；Maggi，F.，andBendinelli，M.(2009).Immunobiology of the Torque teno viruses and otheranelloviruses.Curr Top Microbiol Immunol 331，65-90；Okamoto，2009a，见上文)。虽然不认为人TTV与疾病直接相关，但最近证明，在定菌猪(gnotobiotic pig)模型中，猪TTV(PTTV)联合猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)感染部分地有助于实验性诱导猪皮炎与肾病综合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)(Krakowka，S.，Hartunian，C.，Hamberg，A.，Shoup，D.，Rings，M.，Zhang，Y.，Allan，G.，and Ellis，J.A.(2008).Evaluation ofinduction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigswith negative results for porcine circovirus type 2.Am J Vet Res69(12)，1615-22)，并且，猪TTV联合PCV2感染还有助于实验性诱导断奶仔猪多系统衰竭综合症(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)(Ellis，J.A.，Allan，G.，andKrakowka，S.(2008).Effect of coinfection with genogroup 1 porcine torque tenovirus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemicwasting syndrome in gnotobiotic pigs.Am J Vet Res 69(12)，1608-14)。这些数据表明猪TTV在猪中是致病的。然而，需要使用生物纯形式的PTTV病毒进一步深入研究以明确表征与PTTV感染相关的疾病和病变。

与人TTV相比，PTTV的基因组信息是非常有限的。目前，仅报道了来自日本与巴西的猪的一个全长的和两个接近全长的PTTV基因组序列(Niel，C.，Diniz-Mendes，L.，andDevalle，S.(2005).Rolling-circle amplification of Torque teno virus(TTV)complete genomes from human and swine sera and identification of a novelswine TTV genogroup.J Gen Virol86(Pt 5)，1343-7；Okamoto et al.，2002，见上文)。在三种已知的PTTV毒株中，Sd-TTV31和TTV-1p毒株聚类形成基因群1(genogroup 1，PTTV1)，而TTV-2p是分类为基因群2(genogroup 2，PTTV2)的唯一毒株(Niel et al.，2005，见上文)。然而，在病毒学的分类学中，基因群分类是模糊的概念，需要进一步的和更准确的PTTV分类，但这只是在代表多基因型的新PTTV毒株的更多全长基因组序列变得可获得时才能进行。

以前已经证明PTTV感染普遍存在于来自6个不同国家(包括美国、加拿大、西班牙、中国、韩国和泰国)的猪中(McKeown，N.E.，Fenaux，M.，Halbur，P.G.，and Meng，X.J.(2004).Molecular characterization of porcine TT virus，an orphan virus，in pigsfrom six different countries.Vet Microbiol 104(1-2)，113-7)。

猪TTV在具体猪疾病的发病机制中是否发挥重要的作用仍是有争议的。在定菌猪模型中，已证明单独PTTV1感染不发生任何临床疾病，但诱导轻微的组织学损害(Krakowka，S.and Ellis，J.A.，2008.Evaluation of the effects of porcine genogroup 1torqueteno virus in gnotobiotic swine.Am J Vet Res 69，1623-9)。同时实验性接种PTTV1和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的定菌猪发生临床的猪皮炎与肾病综合征(PDNS)(Krakowka，S.，Hartunian，C.，Hamberg，A.，Shoup，D.，Rings，M.，Zhang，Y.，Allan，G.andEllis，J.A.，2008.Evaluation of induction of porcine dermatitis and nephropathysyndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirustype 2.Am J Vet Res 69，1615-22)，而接种PTTV1和猪圆环病毒类型2(PCV2)的猪发生急性断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)(Ellis et al.，2008，见上文)。尽管PCV2被认为是临床PMWS或PCV相关疾病(PCVAD)的主要病原体，但在西班牙，在具有低PCV2或没有PCV2的受PMWS侵袭的猪中观察到了比在未受PMWS侵袭的猪中更高的PTTV2感染的患病率(Kekarainen et al.，2006，见上文)。这些数据共同表明猪TTV可充当参与触发或加重猪中疾病的辅因子。

已在被感染猪的猪血清、粪便、唾液、精液和组织样品中检测到猪TTV，表明其多样的传播途径，包括水平和垂直传递(Kekarainen et al.，2007，见上文；Pozzuto，T.，Mueller，B.，Meehan，B.，Ringler，S.S.，McIntosh，K.A.，Ellis，J.A.，Mankertz，A.andKrakowka，S.，2009.In utero transmission of porcine torque teno viruses.VetMicrobiol 137，375-9；Sibila，M.，Martinez-Guino，L.，Huerta，E.，Llorens，A.，Mora，M.，Grau-Roma，L.，Kekaraihen，T.and Segales，J.，2009.Swine torque teno virus(TTV)infection and excretion dynamics in conventional pig farms.Vet Microbiol 139，213-8)。然而，当前对猪TTV感染的检测主要是基于常规的PCR测定。到目前为止，尚未建立血清学测定或病毒培养系统。尤其是已经广泛使用一个西班牙小组所开发的分别对PTTV1和PTTV2的UTR中保守区的嵌套式PCR扩增(Kekarainen et al.，2006，见上文)。因为病毒的量很可能与临床疾病的严重程度相关，如PCV2诱导的PCVAD所证明的那样(Opriessnig，T.，Meng，X.J.and Halbur，P.G.，2007.Porcine circovirus type 2 associated disease：update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies.J Vet Diagn Invest 19，591-615)，因此与通过常规PCR测定TTV DNA的存在相比，通过定量实时PCR测定猪TTV的病毒负荷将是重要的。此外，实时PCR比常规PCR更可靠、更迅速并且更廉价。最近，描述了用于对两个猪TTV种进行检测和定量的两种基于TaqMan探针的实时PCR测定(Brassard，J.，Gagne，M.J.，Houde，A.，Poitras，E.and Ward，P.，2009.Development of a real-time TaqMan PCR assay forthe detection of porcine and bovine Torque teno virus.J ApplMicrobiol.Nov 14，2009，印刷版之前的电子版；Gallei，A.，Pesch，S.，Esking，W.S.，Keller，C.and Ohlinger，V.F.，2009.Porcine Torque teno virus：Determination of viral genomic loads bygenogroup-specific multiplex rt-PCR，detection of frequent multiple infectionswith genogroups 1 or 2，and establishment of viral full-length sequences.VetMicrobiol.Dec 21，2009，印刷版之前的电子版)。基于探针的测定的主要缺点是，如果探针结合序列含有突变，则可能获得假阴性结果(Anderson，T.P.，Werno，A.M.，Beynon，K.A.andMurdoch，D.R.，2003.Failure to genotype herpes simplex virus by real-time PCRassay and melting curve analysis due to sequence variation within probebinding sites.J Clin Microbiol 41，2135-7)。鉴于已知的猪TTV毒株之序列之间的高度异质性，预计PTTV的野生株(field strain)的探针结合序列中存在变异。尽管特异性相对较低，但基于SYBR green的实时PCR是避免这种潜在问题的替代方法，这提供对潜在的猪TTV变体进行检测和定量的通用方法。此外，SYBR green实时PCR之后的解链曲线分析(melting curve analysis，MCA)确保反应的特异性，并且还允许不同类型病毒的多重检测(Ririe，K.M.，Rasmussen，R.P.and Wittwer，C.T.，1997.Product differentiation byanalysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction.AnalBiochem 245，154-60)。基于MCA的SYBR green实时PCR法已被成功地应用于多种人病毒和兽医病毒(Gibellini，D.，Gardini，F.，Vitone，F.，Schiavone，P.，Furlini，G.and Re，M.C.，2006.Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR Green real timemultiplex RT-PCR technique in plasma samples.Mol Cell Probes 20，223-9；Martinez，E.，Riera，P.，Sitja，M.，Fang，Y.，Oliveira，S.and Maldonado，J.，2008.Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive andrespiratory syndrome virus (PRRSV)by real-time RT-PCR and amplicon meltingcurve analysis using SYBR Green.Res Vet SCi 85，184-93；Mouillesseaux，K.P.，Klimpel，K.R.and Dhar，A.K.，2003.Inprovement in the specificity and sensitivityof detection for the Taura syndrome virus and yellow head virus of penaeidshrimp by increasing the amplicon size in SYBR Green real-time RT-PCR.JVirolMethods 111，121-7；Wilhelm，S.，Zimmermann，P.，Selbitz，H.J.and Truyen，U.，2006.Real-time PCR protocol for the detection of porcine parvovirus in fieldsamples.J Virol Methods 134，257-60)。

目前，对PTTV特异性的体液应答知之甚少。因为基于PCR的测定无法反映猪中PTTV感染的过程，用于测定PTTV血清抗体的高效的酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)是评价PTTV的血清阳性率所需的，并帮助表征PTTV在猪疾病中的作用。

到目前为止，没有可用的猪TTV的亚单位疫苗、死疫苗和活疫苗。从不同基因型中表达重组的PTTV衣壳蛋白用于开发PTTV亚单位疫苗，以及从不同的基因型构建感染性PTTV分子DNA克隆用于在细胞培养系统(该系统用于开发死疫苗和活疫苗)中繁殖生物纯形式的PTTV将是理想的和有利的。

发明内容

本发明提供猪细环病毒(PTTV)的感染性核酸分子(“感染性DNA克隆”)，其包含编码感染性PTTV的核酸分子，所述编码感染性PTTV的核酸分子含有至少一个拷贝的与选自PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA基因型的基因组序列具有至少80％同源性的基因组序列。

根据本发明的一个方面，权利要求1中所述PTTV的感染性DNA克隆，其中基因组序列选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列。

本发明提供含有感染性PTTV基因组的生物功能性质粒或病毒载体。

本发明提供以感染性克隆DNA质粒或病毒载体转染的合适的宿主细胞。

本发明提供由以PTTV感染性DNA克隆转染的细胞所产生的感染性PTTV。

本发明还提供病毒疫苗，其包含非毒性的、生理学上可接受的载剂(carrier)和免疫原性量的选自以下的成员：(a)核酸分子，其含有至少一个拷贝的与选自PTTV基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的基因组序列或其互补链具有至少80％同源性的基因组序列，(b)含有核酸分子的生物功能性质粒或病毒载体，所述核酸分子含有至少一个拷贝的与选自PTTV基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的基因组序列或其互补链具有至少80％同源性的基因组序列，(c)无毒力的、感染性的非致病性猪细环病毒，其含有与选自PTTV基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的基因组序列具有至少80％同源性的基因组序列。

根据本发明的一个方面，所述疫苗含有源自PTTV感染性克隆的活PTTV病毒。根据本发明的另一方面，所述疫苗含有源自PTTV感染性克隆的死PTTV病毒。

本发明提供在细菌表达系统中从PTTV基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA和PTTV2c-VA的ORF1衣壳基因表达的纯化的重组蛋白质，以及这些重组衣壳蛋白作为对抗PTTV感染的亚单位疫苗的应用。在本发明的一个实施方案中，在杆状病毒表达系统和其他表达载体系统中表达用作亚单位疫苗的重组衣壳蛋白。

根据本发明的另一个方面，还含有佐剂。

本发明还提供针对PTTV病毒感染对猪进行免疫的方法，其包括向猪施用免疫有效量的病毒疫苗。

根据本发明的一个方面，所述方法包括向猪施用重组的亚单位衣壳蛋白、感染性核酸分子或活PTTV病毒。

根据本发明的另一个方面，所述方法包括肠胃外、鼻内、皮内或经皮向猪施用所述疫苗。根据本发明的另一个方面，所述方法包括淋巴内或肌内向猪施用所述疫苗。

本发明还提供分离的多核苷酸，其是由SEQ ID NO：9所示PTTV1a-VA的核苷酸序列的序列组成的。

本发明还提供分离的多核苷酸，其是由SEQ ID NO：10所示PTTV1b-VA的核苷酸序列的序列组成的。

本发明还提供分离的多核苷酸，其是由SEQ ID NO：11所示PTTV2b-VA的核苷酸序列的序列组成的。

本发明还提供分离的多核苷酸，其是由SEQ ID NO：12所示PTTV2c-VA的核苷酸序列的序列组成的。

本发明还提供亚单位疫苗，其包含根据从选自PTTV的基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2(尤其是编码衣壳蛋白的ORF1)的多核苷酸序列翻译的多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白质(completeprotein)。

根据本发明的一个方面，所述多核苷酸序列选自PTTV基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的ORF1。

根据本发明的另一个方面，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTV1a-VA的ORF1。根据本发明的另一个方面，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTV1b-VA的ORF1。根据本发明的另一个方面，所述多核苷酸序列是PTTV亚型PTTV2c-VA的ORF1。

根据本发明的一个方面，所述多肽序列选自SEQ ID No：13、SEQ IDNo：14、SEQ IDNo：15、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQ IDNo：21、SEQ ID No：22、SEQ IDNo：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25、SEQ ID No：26、SEQ IDNo：27和SEQ ID No：28所示序列。

根据本发明的另一个方面，所述多肽序列示于SEQ ID No：13中。根据本发明的另一个方面，所述多肽序列示于SEQ ID No：14中。根据本发明的另一个方面，所述多肽序列示于SEQ ID No：16中。在本发明的一个具体的实施方案中，所述多肽序列是SEQ ID No：16的C-末端区域(aa(氨基酸)310～625)。根据本发明的另一个方面，SEQ ID No：20中列出所述多肽序列。

根据本发明的另一个方面，所述疫苗还含有佐剂。

本发明还提供免疫接种猪以对抗PTTV病毒感染的方法，其包括向猪施用免疫有效量的疫苗，所述疫苗包含根据从选自PTTV的基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2的多核苷酸序列翻译的多肽序列的免疫原性片段或完整的蛋白质。

根据本发明的一个方面，所述方法包括向猪施用免疫原性片段或重组的衣壳蛋白。

本发明还提供用于诊断PTTV1感染和对PTTV1负荷进行定量的方法，其包括：从怀疑感染PTTV1的样品中提取DNA，使用包含SEQ IDNO：29和SEQ ID NO：30所示序列的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，以及检测PTTV1特异性扩增。根据本发明的一个方面，所述聚合酶链式反应是SYBR green实时PCR。

本发明还提供用于诊断PTTV2感染和对PTTV2负荷进行定量的方法，其包括：从怀疑感染PTTV2的样品中提取DNA，使用包含SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQID NO：32所示序列的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，以及检测PTTV2特异性扩增。根据本发明的一个方面，所述聚合酶链式反应是SYBR green实时PCR。

本发明还提供用于同时检测和诊断PTTV1和PTTV2感染的方法，其包括：从怀疑PTTV感染的样品中提取DNA，使用包含SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示序列的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，以及检测PTTV1和PTTV2的特异性扩增。根据本发明的一个方面，聚合酶链式反应是SYBR green实时PCR。

本发明还提供用于同时检测和诊断PTTV1a和PTTV1b感染的方法，其包括：从怀疑PTTV1感染的样品中提取DNA，使用包含SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示序列的引物进行第一聚合酶链式反应(PCR)，使用包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQID NO：38所示序列的引物进行第二PCR，以及检测PTTV1a和PTTV1b特异性扩增。

本发明提供用于诊断PTTV感染的方法，其包括：使根据选自PTTV亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2的多核苷酸序列翻译的多肽序列的免疫原性片段固定化，使来自怀疑PTTV感染的猪的血清样品与所述固定化的免疫原性片段接触，以及检测所捕获的对免疫原性片段特异性的抗体。

根据本发明的一个实施方案，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTV1a-VA的ORF1。根据本发明的另一个实施方案，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTV1b-VA的ORF1。根据本发明的另一个实施方案，所述多核苷酸序列是PTTV亚型PTTV2c-VA的ORF1。

根据本发明的另一个方面，所述多肽序列选自SEQ ID No：13、SEQID No：14、SEQID No：15、SEQ ID No：16、SEQ ID No：17、SEQ ID No：18、SEQ ID No：19、SEQ ID No：20、SEQID No：21、SEQ ID No：22、SEQ IDNo：23、SEQ ID No：24、SEQ ID No：25、SEQ ID No：26、SEQID No：27和SEQ ID No：28所示序列。

根据本发明的一个实施方案，所述多肽序列示于SEQ ID No：13中。根据本发明的另一个方面，所述多肽序列示于SEQ ID No：14中。根据本发明的另一个实施方案，所述多肽序列示于SEQ ID No：16中。根据本发明的另一个实施方案，所述免疫原性片段是SEQ IDNo：16的C-末端区域(aa 310～625)。根据本发明的另一个实施方案，所述多肽序列示于SEQID No：20中。

本发明提供三种标准化的酶联免疫吸附测定(ELISA)以诊断PTTV感染和检测被PTTV基因型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA以及PTTV种2的全部已知的亚型所感染的猪血清中的抗体。

ELISA诊断测试是基于细菌表达的或杆状病毒表达的重组的PTTV基因型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA和PTTV2c-VA的ORF1衣壳蛋白。

根据本发明的另一个方面，通过Western印记检测所捕获的抗体。根据本发明的另一个方面，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测所捕获的抗体。

附图说明

通过与附图一起阅读以下对本发明的详细描述，将会更清楚地理解本发明的上述特征，其中：

图1A和1B表示猪TTV病毒的群1(种1)和群2(种2)毒株的4种原型U.S.毒株之基因组结构、基因组克隆策略和装配的示意图；

图2表示GenBank数据库中可获得的121TTV毒株之核苷酸序列对比的PASC(序列配对比校，pairwise sequence comparisons)分布。展示了属、种、类型、亚型和变体及其相应的核苷酸序列同一性的百分率；

图3A图解通过基于全长基因组核苷酸序列的邻接法(neighbor-joining method)构建的系统树(phylogenetic tree)；

图3B图解基于7种猪TTV毒株之中ORF1的推定的氨基酸序列构建的系统树；

图3C图解基于7种猪TTV毒株之中ORF1/1的推定的氨基酸序列构建的系统树；

图3D图解基于7种猪TTV毒株之中ORF2的推定的氨基酸序列构建的系统树；

图3E图解基于7种猪TTV毒株之中ORF2/2的推定的氨基酸序列构建的系统树；

图4表示7种PTTV毒株之中ORF1的全长氨基酸序列的比对；

图5表示7种PTTV毒株之中ORF2的全长氨基酸序列的比对；

图6A图解各自的标准模板(以蓝色表示)和20个猪血清样品经40个循环的扩增之后的PTTV1实时PCR产物的解链曲线；

图6B图解各自的标准模板和20个猪血清样品经40个循环的扩增之后的PTTV2实时PCR产物的解链曲线；

图7A～7E图解PTTV1/PTTV2基于SYBR green的双链体实时RCR的解链曲线分析(melting curve analysis，MCA)。

图8表示位于7种PTTV毒株之中推定的ORF1的N-末端部分之核苷酸序列的比对；

图9A和9B表示4种已知的猪TTV2的亲水性分布图和保守区；

图10A～10C图解重组PTTV2c ORF1衣壳蛋白的表达和纯化；

图11A～11C显示所选择的猪血清样品之Western印记分析的代表性结果；

图12图解基于PTTV2c-ORF1的Wentern印记与ELISA的一致性；

图13显示PTTV2血清抗体水平相对于来自不同来源的138只猪中病毒负荷的盒须图(Box-and-Whisker-plot)。

图14A图解PTTV2病毒负荷的回顾性评价；

图14B图解从到达养至到达之后2个月的10只猪中PTTV2 ORF1衣壳蛋白的抗体水平；

图15A～15C图解PTTV1a和PTTV1b重组ORF1衣壳蛋白的表达和纯化；以及

图16显示从威斯康星的农场所选择的猪血清样品的基于PTTV1a-ORF1的Western印记分析的实例。

具体实施方式

根据本发明，在一个具体的实例中，前述4种新的猪TTV亚型是从弗吉尼亚的个体公猪(boar)中分离的。

在图1A中，以粗体显示PTTV1和PTTV2的基因组，并以箭头指示4种推定的ORF(ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2)的大小和方向。还显示了富含GC的区域。虚线弧A和D分别表示用于通过嵌套式PCR从血清和精液样品中检测PTTV1和PTTV2的区域。虚线弧B和C表示用于PTTV1之基因组克隆的两个重叠的PCR片段，而虚线弧E和F表示用于PTTV2之基因组克隆的两个重叠的PCR片段。还在相应的位置显示用于研究之引物(见表1)的位置。

将第一轮PCR中表现出PTTV1与PTTV2阳性(因此，指示较高的病毒负荷)的一个公猪血清样品(SR#5)用于随后PTTV的全长基因组克隆。出人意料地是，应用设计用于克隆第一PTTV毒株Sd-TTV31以扩增病毒基因组DNA的反向PCR(Okamoto et al.，2002，见上文)的两组引物(NG372/NG373和NG384/NG385)以扩增病毒基因组DNA的初始尝试并不成功。多次试验之后，未获得PCR产物。基于PTTV1的区域A和PTTV2的区域D的初始序列，随后分别设计两对新引物(TTV1-If(SEQID NO：1)/TTV1-2340R(SEQ ID NO：2)和TTV1-2311F(SEQ IDNO：3)/TTV1-IR(SEQ ID NO：4))以扩增跨越推测的PTTV1基因组的区域B和C，以及其他两对引物(TTV2-IF(SEQ ID NO：5)/TTV2-2316R(SEQID NO：6)和TTV2-GCF(SEQ ID NO：7)/TTV2-IR(SEQ ID NO：8))以扩增跨越推测的PTTV2基因组的区域E和F(图1A和表1)。引物TTV1-2340R(SEQ ID NO：2)和TTV1-2311F(SEQ ID NO：3)是从PTTV1毒株Sd-TTV31(Okamoto et al.，2002，见上文)和TTV-1p(Niel et al.，2005)的共有序列(在PTTV2毒株TTV-2p(Niel etal.，2005，见上文)中不存在)中推出的，而引物TTV2-2316R(SEQ ID NO：6)和TTV2-GCF(SEQIDNO：7)是从毒株TTV-2p的序列(在这两种PTTV1毒株中不存在)中推出的。将具有预期大小的所产生的4种不同的PCR产物各自插入平端克隆载体，并且将所产生的重组质粒转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)。为代表片段B、C、E和F的每种构建体鉴定8至15个阳性(具有白颜色)细菌克隆，并随后测序。

表1.用于扩增猪TT病毒的嵌套式PCR和基因组PCR的寡核苷酸引物

出人意料地是，鉴定到了来自每种构建体的两组序列数据，表明同一猪中存在基因群1和基因群2的两种类型的PTTV。为了区分和装配4种PTTV毒株，与三种已知的PTTV毒株(Sd-TTV31、TTV-1p和TTV-2p)一起进行序列对比(图1B和1C)。

图1B图解随后克隆的具有PCR片段B和C的PTTV1毒株PTTV1a-VA和PTTV1b-VA之全长基因组序列的区分和装配。以“^”或“＊”标记片段B中ORF1和ORF2的起始密码子以及片段C中ORF1的终止密码子。还显示了两种已知的PTTV1毒株(Sd-TTV31和TTV-1p)的相应的序列。阴影部分是保守序列，且虚线表示核苷酸缺失。

对于PTTV1，推定的ORF1的起始密码子ATG和终止密码子TGA 分别位于片段B和C(图1B)。所述密码子的位置在两个PTTV1组中有所不同，第一个与Sd-TTV31相同，而第二个与TTV-1p相同(图1B)。此外，ORF2起始密码子在所述两个群中也位于与ORF1的相一致的不同位置。此外，使用区域B的4种不同序列(两种来自测序数据，两种来自毒株Sd-TTV31和TTV-1p)和区域C的4种不同序列的系统发生分析(phylogenetic analysis)支持第一序列与Sd-TTV31类聚，以及第二序列与TTV-1p类聚(未显示数据)。因此，我们能够从片段B和C区分和装配两组序列数据成为两个分别作为毒株PTTV1a-VA(SEQ ID NO：9)和PTTV1b-VA(SEQID NO：10)而设计的全长PTTV1基因组(图1B)。

图1C图解区分和装配随后克隆的具有PCR片段E和F的PTTV2毒株PTTV2b-VA和PTTV2c-Va的全长基因组序列。包括TTV-2p毒株的相应序列，且阴影部分是保守序列。虚线表示核苷酸缺失。分别显示了每种毒株的重叠区域(用虚线框出)内的独特核苷酸(对于PTTV2b-VA(SEQ ID NO：11)是连续的“AG”核苷酸，而对于PTTV2c-VA(SEQ IDNO：12)是两个单独的“A”和“G”核苷酸)。

区分两种PTTV2毒株是较容易的。分别来自片段E和F的两组序列数据共有位于两个PCR片段之重叠区域的独特的连续“AG”核苷酸(图1C)。所装配的全长基因组序列代表PTTV2毒株，命名为PTTV2b-VA(SEQ ID NO：11)。类似地，命名为PTTV2c-VA(SEQ ID NO：12)的第二毒株的完整基因组序列是基于分别来自片段E和F的另一套序列数据在重叠区域中所共有的两个独特的单个“A”和“G”核苷酸而装配的(图1C)。使用来自片段E和F的4种序列以及来自TTV-2p的两个相应序列的系统发生分析也支持该定位(未显示数据)。

本发明提供与猪中病毒感染相关的4种分离的猪TTV病毒基因型或亚型。本发明包括但不限于猪TTV病毒基因型或亚型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA，所述病毒基因型或亚型具有SEQ ID NO：9(PTTV1a-VA)、SEQ ID NO：10(PTTV1b-VA)、SEQ IDNO：11(PTTV2b-VA)和SEQ ID NO：12(PTTV2c-VA)所示核苷酸序列、其功能等同物或互补链。要理解的是，源自任何猪TTV的具体的核苷酸序列将具有天然存在于个体病毒之间的轻度变异。序列中的这些变异可见于缺失、替换、插入等。

详细地分析了4种PTTV毒株中每一种的所提出的基因组结构，并与3种已知的PTTV毒株(Sd-TTV31、TTV-1p和TTV-2p)一起总结在表2中。所有这4种PTTV的U.S.毒株均具有类似的基因组大小，分别为2,878bp(PTTV1a-VA SEQ ID NO：9)、2,875bp(PTTV1b-VA SEQIDNO：10)、2,750bp(PTTV2b-VA SEQ ID NO：11)和2,803bp(PTTV2c-VASEQ ID NO：12)。PTTV1a-VA(SEQ ID NO：9)和Sd-TTV31均具有相同的基因组长度。所发表的毒株TTV-1p和TTV-2p的序列在UTR的富含GC的区域中均具有很多未确定的核苷酸。用对应于PTTV1和PTTV2的共有序列人工填充这些核苷酸之后，分别表明，在基因组长度上，TTV-1p与PTTV1b-VA(SEQ ID NO：10)更紧密地相关，且TTV-2p与PTTV2b-VA(SEQ ID NO：11)更紧密地相关(未显示数据)。

分别以登陆号GU456383、GU456384、GU456385和GU456386将所装配的猪TTV病毒基因型或亚型PTTV1a-VA(SEQ ID NO：9)、PTTV1b-VA (SEQ ID NO：10)、PTTV2b-VA(SEQ IDNO：11)和PTTV2c-VA(SEQ ID NO：12)的基因组序列提交至 (Nucleic AcidsResearch，2008 Jan；36(Database issue)：D25-30)。

表2.7种猪TTV毒株之基因组组织和ORF的比较

数字(除了全长基因组的大小、ORF与外显子的数目之外)表示核苷酸(nt)在相应PTTV毒株的基因组上的位置。

两项最近的研究已经鉴定了人TTV复制过程中转录的病毒mRNA和至少6种病毒蛋白质的表达(Mueller et al.，2008，见上文；Qiu et al.，2005，见上文)，这多于人TTV所编码的ORF的预计数目(Okamoto，H.，Nishizawa，T.，Tawara，A.，Takahashi，M.，Kishimoto，J.，Sai，T.，and Sugai，Y.(2000b).TT virus mRNAs detected in the bone marrowcells from an infected individual.Biochem Biophys Res Commun 279(2)，700-7)，因此，为与PTTV序列进行比较，我们将新的人TTV基因组信息包括在内。人TTV毒株P/1C1的mRNA转录物的5’-末端定位至TATA框下游25nt的“A”，其为(Mueller et al.，2008，见上文)。在所有7种PTTV毒株中，该起始点、其临近的序列(CGAATGGCTGAGTTTATGCCGC(SEQ IDNO：39)；以下划线标注所述起始点)和与上游TATA框的距离(24nt；表2)是非常保守的，表明PTTV和人TTV可使用共同的mRNA 5’-末端用于翻译。

在全部7种PTTV毒株的TATA框附近鉴定了另外5个完全保守的区域。分别为11nt的两个区域(AGTCCTCATTT(SEQ ID NO：40)和AACCAATCAGA(SEQ ID NO：41))位于TATA框的上游，而其余的3个区域(17nt的CTGGGCGGGTGCCGGAG(SEQ ID NO：42)；14nt的CGGAGTCAAGGGGC(SEQ ID NO：43)；11 nt的TATCGGGCAGG(SEQ ID NO：44))位于所提出的mRNA 5’-末端与ORF2的起始密码子之间。这些保守的PTTV特异性的序列可以含有调节病毒基因表达的共有元件。

在此之前，在3种已知的PTTV毒株的基因组中已分别提出了3种ORF(ORF 1～3)(Niel et al.，2005，见上文；Okamoto et al.，2002，见上文)。本研究中鉴定的PTTV的4种原型U.S.毒株具有该结构。人TTV中相应的ORF3已被重新命名为ORF2/2，因为其起始于与ORF2中相同的ATG，并且在剪接之后保持在相同的ORF(延伸的ORF2)中(图1A)(Mueller etal.，2008，见上文；Qiu et al.，2005，见上文))。我们按照人TTV的命名法来修订本研究中PTTV的分类。人TTV ORF1/1是新鉴定的由ORF1中两个外显子所编码的病毒蛋白质(Qiu etal.，2005，见上文)。ORF1/1与ORF1共有相同的N-和C-末端部分。很容易在所有7种PTTV毒株中鉴定PTTV ORF1/1的相应物(counterpart)(图1A和表2)。

ORF1和ORF2是由～2.8kb的病毒mRNA编码的，而ORF1/1和ORF2/2是由人TTV中～1.2kb的经剪接的病毒mRNA编码的(Mueller et al.，2008，见上文；Qiu et al.，2005，见上文)。因为也在PTTV基因组中推出了这4种ORF，且因为推断的剪接供体和受体位点的序列和位置在7种PTTV毒株中非常保守(表2)，推测猪TTV很可能也编码两种对应的mRNA。

多数人TTV毒株与编码TTV凋亡诱导蛋白(TTV apoptosis-inducing protein，TAIP)的CAV共有遗传相似性，其中将其CAV的相应物命名为凋亡蛋白(apoptin)(de Smit，M.H.，and Noteborn，M.H.(2009).Apoptosis-inducing proteins in chicken anemiavirus and TT virus.Curr Top Microbiol Immunol 331，131-49)。TAIP的ORF嵌入ORF2中。然而，对应的TAIP在猪TTV中并不存在。最近的研究表明，在培养的细胞中， CAV的复制需要凋亡蛋白或TAIP的表达(Prasetyo，A.A.，Kamahora，T.，Kuroishi，A.，Murakami，K.，and Hino，S.(2009).Replication of chicken anemia virus(CAV)requires apoptinand is complemented by VP3 of human torque teno virus(TTV).Virology 385(1)，85-92)。

序列配对比校(PASC)是有用的方法，其从相同科的所有可获得的病毒基因组序列中绘制配对核苷酸序列同一性百分率的频率分布(Bao，Y.，Kapustin，Y.，and Tatusova，T.(2008).Virus Classification by Pairwise Sequence Comparison(PASC).In″Encyclopedia of Virology，5vols.″(B.W.J.Mahy，and M.H.V.Van Regenmortel，Eds.)，Vol.5，pp.342-8.Elsevier，Oxford)。PASC程序所产生的不同的峰通常代表病毒属、种、类型、亚型和毒株的组(图2)。在本研究中，我们使用GenBank数据库中可获得的人和动物TTV相关毒株的121种全长基因组序列进行了PASC分析(图2)。假设TTV成员被分类为单独的科(指环病毒科)，在36～55％和55～67％核苷酸序列同一性处的两个主峰分别代表属和种(图2)。因此，TTV的类型被定义为具有67～85％核苷酸序列同一性的TTV组，而TTV亚型可被定义为共有85～95％核苷酸序列同一性的TTV序列的组。共有超过95％核苷酸同一性的TTV毒株可被进一步地分类为变体(图2)。Jelcic等已提议使用103种TTV隔离群的类似分类(Jelcic，I.，Hotz-Wagenblatt，A.，Hunziker，A.，Zur Hausen，H.，and de Villiers，E.M.(2004).Isolation of multiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissuefrom a Hodgkin′s disease patient：genome reorganization and diversity in thehypervariable region.J Virol 78(14)，7498-507)。

将所提议的TTV分类的标准应用于PTTV的4种原型U.S.毒株和三种其他已知PTTV毒株之基因组序列的系统发生分析。这些毒株之间全长核苷酸序列的配对比校显示，与三种PTTV2毒株相比，4种PTTV1毒株具有54.0～56.4％的核苷酸序列同一性(表3)。因此，以前在文献中定名为“基因群”的PTTV将很可能更适合定名为“种”，并且PTTV1和PTTV2很可能应当分别代表猪TTV的种1和种2。PTTV种1是由两种类型的病毒组成的，分别定名为类型1a(包括Sd-TTV31和PTTV1a-VA(SEQ ID NO：9))和类型1b(包括TTV-1p和PTTV1b-VA(SEQ IDNO：10))，因为这两种病毒类型之间的核苷酸序列同一性在69.8～70.7％之间(表3)。因为更高的序列同一性(95.1％)，Sd-TTV31和TTV1a-VA(SEQID NO：9)被确认为相同种的变体毒株。然而，这两种类型的1b毒株(TTV-1p和PTTV1b-VA(SEQ ID NO：10))可以属于两种不同的亚型(核苷酸序列同一性＝86.4％)。对于PTTV种2，基于其86.5～90.9％的核苷酸序列同一性，三种毒株很可能被分类为单独的亚型(分别是TTV-2p为亚型2a，PTTV2b-VA(SEQ ID NO：11)为亚型2b，以及PTTV2c-VA(SEQ IDNO：12)为亚型2c)。这种提议的PTTV新分类系统在系统树(图3A)中是显而易见的。基于推断的PTTV之ORF1、ORF1/1、ORF2和ORF2/2的氨基酸序列构建的系统树也与这种提议的分类相一致(图3B至3E)。

表3.7种猪TTV毒株之全长基因组序列的序列配对比校

通过使用PASC软件生成这些数据，其值表示％核苷酸序列同一性。

PTTV种、类型和亚型之间的整个基因组中分散着独特的突变以及缺失和/或插入。例如，上文中提到的图1B中所示的PTTV类型1a和1b之间，ORF1起始和终止密码子和ORF2起始密码子的位置是不同的。与PTTV1a相比，两种PTTV1b毒株还在ORF2起点之后具有2-密码子缺失(图1B)。

值得注意的是，与PTTV2c-VA相比，TTV-2p和PTTV2b-VA都具有较大的52nt的缺失，其在UTR中通第一个11-nt的保守序列(AGTCCTCATTT(SEQ ID NO：40))上游39nt。由于该缺失，PTTV2b-VA的基因组大小(TTV-2p很可能也是这样)显著小于PTTV2c-VA的大小(表2)。已从血清样品中分离了大量“亚病毒的”人TTV克隆，其被认为是全长的TTV基因组，因为这些亚病毒分子中的大多数的ORF通常保持完整(de Villiers et al.，2009；Leppik et al.，2007)。其在完整或部分缺失的UTR中具有可变的长度。TTV-2p和PTTV2b-VA 的位置似乎与人TTV亚病毒分子类似，这意味着亚型PTTV2a和PTTV2b可能是源自亚型PTTV2c的亚病毒分子。值得注意的是，其他小组(Ellis et al.，2008，见上文；Kekarainen et al.，2007，见上文；Kekarainen et al.，2006，见上文；Krakowka et al.，2008，见上文)通常用于从野生样品(field sample)中检测PTTV2的嵌套式PCR引物TTV2-nF(表1)的3’-末端序列位于缺失的两侧。因此，当前用于PTTV2检测的嵌套式PCR测定很可能不足以鉴定PTTV2c亚型的遗传多样性的毒株。

所分离的病毒毒株的来源是感染了猪TTV病毒之猪的血清、粪便、唾液、精液和组织样品。然而，考虑可使用重组DNA技术以复制和化学合成核苷酸序列。因此，本发明的范围包括所分离的核苷酸，其包括但不限于EQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：12所示核苷酸序列或其互补链；杂交至SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和SEQID NO：12所示核苷酸序列并与其至少67％互补(优选85％互补，或更优选95％互补)的多核苷酸；或选自以下的免疫原性片段：SEQ ID NO：13(PTTV1a-VA)、SEQ ID NO：14(PTTV1b-VA)、SEQ IDNO：15(PTTV2b-VA)、SEQ ID NO：16(PTTV2c-VA)所示ORF1蛋白质的氨基酸序列，SEQ ID NO：17(PTTV1a-VA)、SEQ ID NO：18(PTTV1b-VA)、SEQ ID NO：19(PTTV2b-VA)、SEQID NO：20(PTTV2c-VA)所示ORF2蛋白质的氨基酸序列，SEQ ID NO：21(PTTV1a-VA)、SEQ IDNO：22(PTTV1b-VA)、SEQ ID NO：23(PTTV2b-VA)、SEQ ID NO：24(PTTV2c-VA)所示ORF1/1蛋白质的氨基酸序列，SEQ ID NO：25(PTTV1a-VA)、SEQ ID NO：26(PTTV1b-VA)、SEQ ID NO：27(PTTV2b-VA)、SEQ ID NO：28(PTTV2c-VA)所示ORF2/2蛋白质的氨基酸序列。可通过现有技术中已知的技术确定免疫原性或抗原性编码区域或片段，并随后用于制造用于免疫活性筛选或其他诊断目的的单克隆或多克隆抗体。本发明还包括纯化的免疫原性蛋白质，其是由所分离的多核苷酸所编码的。理想地，所述蛋白质可以是至少一种上述分离的猪TTV亚型(更理想地是ORF1蛋白质)的分离的或重组的ORF1蛋白质或ORF2蛋白质。

猪TTV的ORF1被认为编码与结构和复制相关的蛋白质(Maggi，F.，andBendinelli，M.(2009).Immunobiology of the Torque teno viruses and otheranelloviruses.Curr Top Microbiol Immunol 331，65-90)。7种PTTV毒株的ORF1编码的产物具有624～635aa的长度，并在被认为具有DNA结合活性的N-末端具有较高数目的精氨酸残基(图4)。在图4中，阴影部分是保守序列。虚线表示氨基酸缺失。以实线框出RCR模体(motif)。以虚线框出PTTV1毒株的三个HVR(PTTV1-HVR 1、2和3)和PTTV2毒株的两个HVR(PTTV-HVR 1和2)。以箭头指示ORF1/1的连接边界。预测的滚环复制(rolling-circlereplication，RCR)模体(Ilyina，T.V.，and Koonin，E.V.(1992).Conserved sequencemotifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encodedby diverse replicons from eubacteria，eucaryotes and archaebacteria.NucleicAcids Res 20(13)，3279-85)在不同的PTTV类型和亚型中存在于不同位置，这可以是类型或亚型特异性的。在PTTV类型1a毒株(PTTV1a-VA SEQ ID NO：13的aa位置14～17)和类型1b毒株(PTTV1b-VA SEQ ID NO：14的aa位置379～382)中，RCR模体-III(YxxK)分别是保守的，而在所有三种PTTV2毒株中所鉴定的相同保守模体位于PTTV2b-VA SEQ ID NO：15的aa位置482～485(图4)。PTTV2b-VA SEQ ID NO：15和PTTV2c-VA SEQ IDNO：16还在PTTV2b-VA之aa位置331～333具有保守的RCR模体-II(HxQ)，其在TTV-2p中不存在(图4)。

PTTV毒株的ORF1蛋白质在种1和种2之间共有非常低的aa序列同一性，仅为22.4至25.8％，这使其难以在两个种之间鉴定显著保守的aa序列(图4)。在PTTV种1中，ORF1在类型1a和1b毒株之间的aa同一性是50.3～52.7％。在四个PTTV1毒株之中鉴定了具有相对高数目的aa替换的三个主要的高变区(hypervariable region，HVR)(PTTV1-HVR1至3)，而在三个PTTV2毒株之中观察到了两个HVR(PTTV2-HVR 1和2)(图4)。所述三个PTTV2毒株在相应的PTTV1-HVR1区域具有约20-aa的缺失。此外，PTTV2的两种HVR位于相应的PTTV1-HVR3区域内(图4)。这些HVR仅位于ORF1中，而不位于截短的ORF1/1中。如对人TTV的研究所表明的那样，它们很可能在逃避宿主免疫监视以及帮助PTTV建立持久感染中发挥作用。

ORF2的aa序列在四种PTTV1(PTTV1a-VA SEQ ID NO：17；PTTV1b-VA SEQ ID NO：18)毒株和三种PTTV2(PTTV2b-VA SEQ IDNO：19；PTTV2c-VA SEQ ID NO：20)毒株之间显著不同(图5)。然而，它们在N-末端共有保守的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein-tyrosinephosphatase，PTPase)样模体(Wx₇Hx₃CxCx₅H)(图4)。该模体在所有人TTV、TTMV和TTMDV毒株以及CAV之中也是保守的。TTMV或CAV ORF2蛋白质还表现出丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphatase，S/T PPase)活性(Peters，M.A.，Jackson，D.C.，Crabb，B.S.， andBrowning，G.F.(2002).Chicken anemia virus VP2 is a novel dual specificityprotein phosphatase.J Biol Chem 277(42)，39566-73)。ORF2蛋白质的双重特异性被认为在病毒复制期间调节宿主基因转录、信号转导和细胞因子应答。最近，对CAV中模体的最后一个组氨酸残基之前两个保守的碱性aa残基诱变分析揭示这两个残基影响病毒复制、体外细胞病理学和体内减毒(Peters，M.A.，Crabb，B.S.，Washington，E.A.，and Browning，G.F.(2006).Site-directed mutagenesis of the VP2 gene of Chicken anemia virusaffects virus replication，cytopathology and host-cell MHC class Iexpression.J Gen Virol 87(Pt 4)，823-31；Peters，M.A.，Crabb，B.S.，Tivendale，K.A.，and Browning，G.F.(2007).Attenuation of chicken anemia virus by site-directedmutagenesis of VP2.J Gen Virol88(Pt 8)，2168-75)。这两个碱性aa残基(“KK”)在这三种PTTV2毒株中是保守的。然而，仅第一碱性残基(“R”)保持在两种PTTV1a毒株中，而在PTTV1b毒株中，两个碱性残基均被替换(图5)。在图5中，虚线表示氨基酸缺失。阴影部分是在TTV、TTMV和CAV中所鉴定的共同模体Wx₇Hx₃CxCx₅H(以下划线表示)中的5个保守氨基酸。以“^”表示所述模体的最后一个组氨酸之前的两个碱性aa残基的位置，所述模体被证明影响CAV中病毒复制、细胞病理学或体内减毒。

总之，本发明还测定了代表弗吉尼亚的单个公猪的血清样品中不同基因型或亚型的四种猪TTV毒株的全长基因组序列。来自本研究的研究结果清楚地表明，与人TTV类似，存在不同基因型或亚型的多重PTTV感染，并且其在猪中很可能是常见的。我们还提供了有关基因组的组织、变异性的程度以及PTTV的保守核苷酸和氨基酸模体的特征，这些将改善当前的PCR检测测定，有助于开发用于血清学诊断的试剂，并帮助起始PTTV的结构与功能研究。根据7种已知的PTTV毒株之基因组序列的系统发生和遗传分析，本研究中还提出了新的PTTV分类。

本发明还提供通过检测感染了猪TTV的猪或其他哺乳动物的样品中的病毒DNA用于诊断猪TTV感染的方法。本发明的一个优选的实施方案涉及用于在猪或其他哺乳动物物种中使用用于聚合酶链式反应(PCR)的寡核苷酸引物检测猪TTV核酸序列的方法，以进一步帮助诊断病毒感染或疾病。用于检测猪TTV病毒核酸序列在猪或其他哺乳动物物种中存在或不存在的诊断测试包括从感染了猪TTV的猪或怀疑感染TTV的猪的样品中分离病毒DNA，使用PTTV1特异性的(SEQ ID NO：29/SEQ IDNO：30)或PTTV2特异性的(SEQ ID NO：31/SEQID NO：32)引物进行 SYBR green实时定量PCR。

在本发明的另一个实施方案中，可以改变诊断方法以通过使用PTTV1/PTTV2双链体实时PCR同时检测PTTV1和PTTV2。更具体地说，所述方法包括从感染了猪TTV的猪或怀疑感染TTV的猪的样品中分离病毒DNA，使用PTTV1特异性的(SEQ ID NO：29/SEQ ID NO：30)或PTTV2特异性的(SEQ ID NO：31/SEQ ID NO：32)引物在同一实时PCR反应中进行实时PCR。因为可通过MCA区别PTTV1和PTTV2之间的T_m值，因此可同时检测PTTV1和PTTV2的存在。

在本发明的另一个实施方案中，诊断方法可采用双链体嵌套式PCR。所述方法包括从感染了猪TTV的猪或怀疑感染TTV的猪的样品中分离病毒DNA，使用一对引物P1ab-mF(SEQID NO：33)/P1ab-mR(SEQ IDNO：34)进行第一轮PCR，并使用两对引物进行第二轮PCR，P1a-nF(SEQID NO：35)/P1a-nR(SEQ ID NO：36)用于检测PTTV1a，而P1b-nF(SEQID NO：37)/P1b-nR(SEQ ID NO：38)用于检测PTTV1b，并使PCR产物可视化。

本领域技术人员可以根据现有技术中公知的方法来优化上述诊断方法。

因此，本发明的一个实施方案开发两种新的单链体(singleplex)SYBR green实时PCR测定以分别定量两种猪TTV种的病毒负荷。设计PTTV1以及PTTV2特异性的引物以分别靶向目前可获得的6种PTTV1和4种PTTV2全长基因组之中极端保守的区域。本发明的另一个实施方案将两种单链体测定组合成为双链体实时PCR测定，随后，可通过鉴定它们不同的解链温度的病毒扩增子MCA来同时检测两个猪TTV种(PTTV1a和PTTV1b)。在第3个实施方案中，开发了用于在第一轮PCR中，从两种类型的PTTV1中同时扩增病毒DNA并在第二轮PCR中差异检测类型1a和1b的双链体嵌套式PCR测定，用于在单个样品中鉴定两种类型的猪TTV种(PTTV1a和PTTV1b)。这些测定代表用于诊断种特异性的或类型特异性的猪TTV的简单且实用的工具。

通过对10种可获得的猪TTV全长基因组的多重序列比对而鉴定了潜在的引物序列。根据紧接6种PTTV1基因组之中推断的ORF2之前的两个保守的基因组区域设计了PTTV1特异性的引物TTV1F(SEQ IDNO：29)和TTV1R(SEQ ID NO：30)，而根据在紧接4种PTTV2基因组之中推断的ORF2/2之后的两个保守的基因组区域设计PTTV2特异性的引物TTV2F4(SEQID NO：31)和TTV2R4(SEQ ID NO：32)(表4)。引物未表现出潜在的自身二聚化和交叉二聚化。预期的扩增子分别是对应于PTTV1b-VA基因组的来自PTTV1引物的大小为118-bp的片段，以及对应于PTTV2c-VA基因组的来自PTTV2引物的大小为200-bp的片段。表4.用于实时PCR和双链体嵌套式PCR检测猪TTV的寡核苷酸引物

根据本发明的一个具体的实施方案，可采用使用PTTV1特异性和PTTV2特异性引物的SYBR green单链体实时PCR，以特异性地分别检测猪TTV1和TTV2DNA。对于PTTV1，建立25μl的跨越一系列靶DNA浓度的标准曲线。所显示的线性范围跨越4.4×10¹至4.4×10⁸拷贝。最小检出限(44个拷贝)对应于37.57的阈值循环(C_t)。对于PTTV2，也生成了标准曲线，并将其用于检测25μl反应物中范围为从8.6×10⁰至8.6×10⁸拷贝的DNA浓度。最小检出限(8.6个拷贝)的相应C_t是36.53。

根据本发明的另一个具体的实施方案，应用SYBR green双链体实时PCR用于同时检测猪TTV1和TTV2的DNA。PTTV1(87.0℃)与PTTV2(80.0℃)之间T_m值7度的差异使得以MCA彼此区别它们成为可行。因此，可将两个单链体测定联合成为双链体实时PCR测定，用于同时检测PTTV1和PTTV2。阳性样品是在该产品已知的T_m之内具有对称解链峰的样品。首先通过使用10倍稀释的PTTV1和PTTV2标准物混合物验证这种新测定。使用无菌水作为模板的无模板阴性对照显示未见于单链体测定的PTTV1与PTTV2引物之间通过交叉二聚化所引起的非特异性扩增 (图7a)。这产生了72.0℃至76.0℃之间的不同解链峰。图7A显示PTTV1标准物(红色；T_m＝87.0℃)、PTTV2标准物(绿色；T_m＝80.0℃)和无模板的阴性对照(由引物交叉二聚化所引起；黑色)的解链峰。图7B～7E显示具有不同PTTV1和PTTV2病毒负荷的代表性血清样品的解链峰。图7B显示公猪血清样品no.5：相对高的PTTV1和PTTV2的病毒负荷，但PTTV2＞PTTV1；图7C显示公猪血清样品no.12：相对高的PTTV1和PTTV2病毒负荷，但PTTV1＞PTTV2；图7D显示公猪血清样品no.14：低的PTTV1和PTTV2病毒负荷；图7E显示公猪血清样品no.10：PTTV1阳性，但PTTV2阴性。通过单链体实时PCR测定的每个样品中PTTV1和PTTV2的病毒负荷(单位：基因组拷贝/ml)显示在相应的解链峰的上方。

在一个实例中，当将双链体实时测定应用于20个成年公猪的血清样品时，具有相对高的PTTV1和PTTV2病毒负荷的样品显示出对应于PTTV1和PTTV2的两种不同的解链曲线，没有非特异性解链峰(图7B和7C)，而具有低PTTV1或PTTV2病毒负荷的样品显示出病毒特异性的以及非特异性的解链曲线(图7D和7E)。尽管样品#14中两个解链峰非常小，它们被认为是阳性的，因为它们显示出视觉上的差异以及在PTTV1和PTTV2的合适T_m下对称的升降(图7D)。相反，样品#10被认为仅是PTTV1阳性，因为不明显地存在对称的PTTV2解链峰(图7E)。这些结果与两个单链体测定的结果相一致(表5)。此外，解链峰的大小和形状定量地反映所检测的样品中相应的病毒负荷。

根据本发明的另一个方面，双链体嵌套式PCR被用于差异检测两种猪TTV类型(PTTV1a和PTTV1b)。

本发明的发明人证明猪TTV种1中存在两种不同基因型(暂时命名为PTTV1a和PTTV1b)。为了进一步确定PTTV1a和PTTV1b的共感染在猪中是否是普遍的，开发了快速区别这二者的新的双链嵌套式PCR测定。猪TTV基因组DNA序列的比对鉴定了位于推测的编码病毒衣壳蛋白之ORF1的N-末端部分的保守基因组区域(图8)。该区域还在上游含有完整的ORF2和部分UTR。设计引物P1ab-mF(SEQ IDNO：33)/P1ab-mR(SEQ ID NO：34)以在第一轮PCR中同时扩增PTTV1a和PTTV1b。使用PTTV1a特异性的引物P1a-nF(SEQ ID NO：35)/P1a-nR(SEQ ID NO：36)与PTTV1b 特异性的引物P1b-nF(SEQ IDNO：37)/P1b-nR(SEQ ID NO：38)的混合物，在第二轮PCR中差异扩增每种基因型。PTTV1a和PTTV1b的最终PCR产物的大小分别为162bp和96bp，其可通过以溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳而容易地区分。因为引物的特异性，不期望以该测定检测PTTV2的DNA(图8)。在图8中，以点和阴影表示保守序列。虚线表示核苷酸缺失。以箭头标记用于双链体嵌套式PCR的三对引物的位置和方向。

在一个实例中，通过可视化预期大小的两个条带以及随后测序确证PCR产物(未显示数据)的测定，进行双链体嵌套式PCR测定的来自成年公猪的20个血清样品均被发现为PTTV1a和PTTV1b阳性。在19个精液样品中，未扩增出PCR产物，这与上述PTTV1的常规嵌套式PCR和实时PCR测定的结果相一致。

根据回顾性研究(Segales et al.，2009，见上文)，早在1985年，在西班牙猪农场中就已经发现被两个种的猪TTV感染的猪。然而，猪TTV是否与任何具体的猪疾病相关仍然是难以捉摸的。因为两个猪TTV种在家猪中均具有高患病率，据推测，测定TTV病毒负荷比评价TTV DNA的存在更为重要。血清和精液样品中病毒负荷的水平已被表示为PCV2感染中PCVAD的重要标志物(Opriessnig et al.，2007，见上文)。因此，定量的PTTV特异性实时PCR测定的建立可帮助鉴定与猪TTV相关的潜在疾病状况。

最近描述了两种基于TaqMan探针的实时PCR测定。加拿大小组所开发的单链体测定不是种特异性的，且仅设计用于定量两个PTTV种的总病毒负荷(Brassard et al.，2009，见上文)。德国小组所建立的双链体测定允许特异性地和同时地检测这两个种(Gallei etal.，2009，见上文)。通过对3种猪TTV基因组序列(Sd-TTV31、TTV-1p和TTV-2p)的比对，确定了用于这两种测定之引物的靶序列，并将其在UTR中定位。在本研究中，使用可获得的7种其他完整PTTV基因组序列(4种PTTV1和3种PTTV2序列)，我们分析并重新确定了10种全长PTTV基因组之中的保守区。基于来自本研究的已更新的比对结果，开发了两种种特异性的基于SYBR green的单链体实时PCR测定，以分别对PTTV1和PTTV2的病毒负荷进行定量。设计用于我们的测定中的引物，以使其结合至与以前之研究的不同保守的基因组区域，这可增加定量的准确度。我们的测定显示出客观的种特异性和检测灵敏度，每25-μl反应物，对PTTV1为44个基因组拷贝和对PTTV2为8.8个基因组拷贝，而在以基于TaqMan探针的双链体实时PCR中报道的检出限为每个反应10个基因组拷贝(Gallei et al.，2009，见上文)。此外，基于SYBR green的实时PCR测定是灵活而又廉价的方法，其可无需使用荧光标记探针而直接进行。最后，考虑到猪TTV表现出高度的遗传多样性，来自基于SYBR green之测定的结果不太可能受到不同猪TTV变体之遗传背景的影响，在基于TaqMan探针的测定中，所述变体很可能在探针结合序列中含有突变。

尽管存在TTV DNA，本研究中测试的来自健康猪的所有的血清样品均具有低于2×10⁶拷贝/ml的低含量的PTTV1和PTTV2。此外，在3个精液样品中仅检测到极低滴度的PTTV2DNA。如常规嵌套式PCR所测定的那样，多数受试血清样品还是PCV2DNA阳性的(未显示数据)。很多具有低病毒负荷的PCV2阳性的猪不发生临床PCVAD。发生PCVAD的建议阈值是10⁷ PCV2基因组拷贝/ml血清或更高(Opriessnig et al.，2007，见上文)。此外，精液PCV2DNA阳性也是疾病状态的显著标志物(Opriessnig et al.，2007，见上文；Pal，N.，Huang，Y.W.，Madson，D.M.，Kuster，C.，Meng，X.J.，Halbur，P.g.and Opriessnig，T.，2008.Development and validation of a duplex real-time PCR assay for thesimultaneous detection and quantification of porcine circovir us type 2 andan internal control on porcine semen samples.J Virol Methods 149，217-25)。种特异性的PTTV的情况可以与PCV2的情况相同，并且可需要大于10⁷拷贝/ml的高PTTV滴度以诱导猪的疾病。本研究中开发的种特异性的实时PCR测定将为将来的使用大量来自多种疾病状况的临床样品的与疾病相关的PTTV的研究提供简单且实用的工具。

此外，通过将两种种特异性的单链体测定相结合，我们开发并验证了用于在基于MCA的双链体实时PCR测定中同时检测和区分两种猪TTV种(PTTV1和PTTV2)的快速、廉价和可靠的筛选。尽管该测定并不意在精确定量这两个PTTV种，但它是可以替代常规嵌套式PCR的用于检测目的的更方便的方法。与实时PCR相比，用于检测猪TTV的常规嵌套式PCR是耗时的(需要总共4轮PCR)、费力的，并且在多轮PCR过程中易于发生样品污染。由于PTTV1和PTTV2种之间不同的T_m值，双链体PCR扩增之后的MCA能够确保不同的反应特异性。这种双链体实时测定的另一个优势是，当进行所描述的方案时，不是必需包括PTTV1和PTTV2标准物，这使其更容易地更为广泛地用于装备有自动实时PCR仪的任何诊断实验室。

已证明相同种的不同基因型或亚型的猪TTV的多重感染(Gallei et al.，2009，见上文)。尤其是我们以前的研究表明猪TTV种1是由两种不同的类型(PTTV1a(包括毒株Sd-TTV31和PTTV1a-VA)和PTTV1b(包括TTV-1p和PTTV1b-VA))组成的。根据系统发生分析(未显示数据)，两种新发表的具有全长基因组的PTTV1隔离群(来自加拿大的swSTHY-TT27(GQ120664)和来自德国的TTV1#471819(GU188045))均分类为类型1b。本研究中描述的双链嵌套式PCR确证两种PTTV1基因型的双重感染经常发生于猪中。这种新测定是迄今第一种开发用于区分PTTV1a和1b的诊断性PCR法。因为目前尚不知道PTTV1a和PTTV1b感染的一种或两种是否代表与疾病相关的相关因子，我们的差异PCR测定应当对未来这两种PTTV类型的潜在疾病相关性具有重大价值。

根据本发明的另一个方面，表达猪TTV的ORF蛋白质，并将其用于免疫检测测定以检测猪TTV特异性抗体的存在。在本发明的另一个实施方案中，在大肠杆菌(Escherichiacoli(E.coli))中分别表达和纯化三种截短的和组氨酸标记的ORF1蛋白质(PTTV1a、PTTV1b和PTTV2)。此外，开发并使用来自不同来源的猪血清样品验证了基于这些重组抗原的血清Western印记和ELISA测定。尤其是使用PTTV1a、PTTV1b以及PTTV2特异性ELISA的血清学测试提供了用于揭示猪TTV感染与疾病的相关性的准确且简单的工具。

根据本发明的另一个方面，在大肠杆菌表达系统中作为重组ORF1衣壳蛋白而表达和纯化猪TTV的ORF蛋白质(图10，图15)。在大肠杆菌(E.coli)中分别表达和纯化三种截短的并且His标记的ORF1衣壳蛋白(PTTV1a、PTTV1b和PTTV2)，并使其充当对抗PTTV感染的重组衣壳亚单位疫苗。

四种猪TTV2毒株(TTV-2p、TTV2#472142、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA)具有迄今可获得的完整基因组序列。尽管它们在系统发生上分类为三种推定的亚型，但编码来自四种PTTV2的氨基酸的ORF1之亲水性分布图的对比分析表明它们共有3个亲水区域，分别为从N-末端aa 1～49的富含精氨酸的区域和位于中部和C-末端部分的两个特别的结构域(I和II)(图9A)。以虚线框表示用于截短的PTTV2c-VA ORF1表达的C-末端区域和其他三种PTTV2毒株所共有的相应的区域。氨基酸序列的比对证明4种PTTV2毒株之中结构域I(aa 322～349)和II(aa 536～625)的高水平的序列保守性(图9B)。

因为亲水结构域被认为对很多蛋白质的抗原性是十分重要的，所以选择含有这两铬结构域的PTTV2c-VA ORF1 SEQ ID NO：16的C-末端区域(aa 310～625)用于蛋白质的表达，其可用作抗原用于猪血清中PTTV2特异性抗体的检测。根据本发明的一个方面，截短的PTTV2c ORF1的表达足以检测全部PTTV2亚型(2a、2b和2c；也见图3A)。

根据本发明的一个实施方案，构建与8×His标签融合的PTTV2cORF1基因的C-末端部分，并在大肠杆菌中表达。重组蛋白质是不溶的，并且表达于细菌的内含体中。图10A显示未纯化的2c-ORF1产物的SDS-PAGE。图10B显示纯化的2c-ORF1产物的SDS-PAGE。图10C显示使用抗His标签的mAb对纯化的2c-ORF1产物进行Western印记分析。白色箭头指示具有预期大小的ORF1蛋白质及其截短的产物，而黑色箭头显示预期的截短蛋白质的推测的二聚体。M：蛋白质分子量标记(protein marker)。在图10A中，与对照样品相比，在2c-ORF1未纯化的样品中产生了两个显著的多肽(白色箭头)。～40KDa的带与2c-ORF1的预期大小相一致，而～30KDa的多肽很可能是来自前者的N-末端截短的产物。用镍亲和柱纯化之后，以SDS-PAGE显示包含两种所述的显著带的4种多肽(图10B)。还使用抗His标签的mAb通过western印记检测它们(图10C)。根据预测的大小(～80KDa和～60KDa)，两个高分子量的带(黑色箭头)是分别由～40KDa和～30KDa的两个多肽所形成的同二聚体。结果表明，成功地产生了纯化的C-末端PTTV2c-ORF1，并且其可被用于在猪血清中检测猪TTV2抗体。

根据本发明的另一个方面，可使用纯化的C-末端PTTV2c-ORF1通过Western印记检测多种猪血清样品中的猪TTV2抗体。白色箭头指示具有预期大小的ORF1蛋白质及其截短的产物。应当注意的是，仅绿颜色的带被认为是阳性的。收集总共超过200个来自不同来源的常规猪(健康的或患病的)、CD/CD猪和定菌猪的血清样品。使用纯化的C-末端PTTV2c-ORF1作为抗原，随机选择样品用于检测抗PTTV2c-ORF1的IgG抗体。图11A显示常规猪的所选择的猪血清样品之Western印记分析的结果，图11B显示CD/CD猪的结果，而图11C显示定菌猪的结果。将纯化的PTTV2c-ORF1产物用作抗原。在多数常规猪(图11A)和CD/CD猪(图11B)的样品中检测到这两个显著的～40KDa和～30KDa的带，表明这些猪中广泛的PTTV2感染。然而，来自不同来源(Blacksburg，VA和Ames，IA)的所有定菌猪均没有可检测到的PTTV2抗体(图11C)。还观察到了其他低分子量的带(图11A和11B)。其很可能来自Western印记中的非特异性的反应性。

根据本发明的另一个方面，PTTV2特异性的ELISA可被用作猪TTV2血清学测试。在少数来自威斯康星农场的常规猪的样品中显示血清阴性结果(图12)。将这些阴性样品合并，并在开发PTTV2特异性的ELISA中将其用作阴性参比。该来源的其余样品是阳性的(图12，左侧的4个泳道)。此外，用于细胞培养的来自商业公司的猪血清(据认为是无OIE疾病的血清)还显示强烈的抗PTTV2-ORF2阳性(图12)，其被用作ELISA的阳性对照。通过棋盘滴定(checkboard titration)测定纯化的2c-ORF1抗原、猪血清和IgG缀合物的浓度，以呈现低背景信号并得到阳性和阴性对照之间OD₄₀₅值的最高差异。最佳的抗原量为69ng/孔，通过使用1∶100稀释的血清样品和1∶4000稀释的IgG缀合物，获得了最佳的ELISA结果。在每次试验中，ELISA截断值的范围是0.25至0.5。图4显示反映血清western印记与所开发的ELISA之一致性的代表结果。

选择来自3个群的138个常规猪血清样品以分析通过实时PCR的PTTV2病毒负荷与通过ELISA的抗PTTV2IgG抗体水平之间的相关性。结果显示，与中等PTTV2病毒负荷值的猪相比，具有不可检测的或更高的PTTV2病毒负荷(10⁸拷贝/ml)的猪更可能具有较低的血清PTTV2抗体滴度(图13)。

尤其是还通过比较从到达新设施至到达两个月后血清中PTTV2病毒负荷和抗PTTV2病毒水平分析了来自同一群中10只猪的血清。2个月之后，10只猪中的9只具有降低的病毒负荷(3只没有可检测的病毒)，而10只猪的9只中抗PTTV2抗体的滴度升高(图14A和14B)。这些结果表明，这10只猪在早期获得了PTTV2感染，这逐渐诱导了体液应答，并产生抗ORF1衣壳的IgG抗体。PTTV2-ORF1IgG抗体能够中和或者甚至清除病毒，表明ORF1的确编码病毒衣壳蛋白，并可含有对抗PTTV2的中和表位。

根据本发明的一个实施方案，在大肠杆菌系统中分别表达和纯化C-末端PTTV1a和PTTV1b ORF1蛋白质。使用抗His标签之mAb的SDS-PAGE和western印记分析显示1a-和1b-ORF产物具有两种多肽，一种具有预期的大小(～40KDa)，而另一个为推定的同二聚体(～80KDa)(图15A～C)。图15A显示未纯化的和纯化的1a-ORF1产物的 SDS-PAGE。图15B显示纯化的1b-ORF1和1b-ORF1ctruc产物的SDS-PAGE。图15C显示使用抗His标签的mAb进行的纯化的1a-和1b-ORF1产物的Western印记分析。白色箭头指示具有预期大小的ORF1蛋白质，而黑色箭头显示推定的ORF1蛋白质的二聚体。与2c-ORF1的表达相比，未观察到截短的多肽。作为对比对照，C-末端截短的1b-ORF1区域(1b-ORF1ctruc)的表达导致与其C-末端未截短的相应物(1b-ORF1)相比分子量更低的多肽(图15B)。

根据本发明的一个实施方案，纯化的C-末端PTTV1a-和PTTV1b-ORF1蛋白质被用于开发上文中描述的用于PTTV2的基因型特异性的血清Western印记和ELISA。图16显示使用1a-ORF1作为抗原的血清Western印记的阴性(泳道1～2)和阳性(泳道3～5)的实例。在PTTV1a和PTTV1b特异性的ELISA(未显示数据)中，使用与PTTV2-ORF1相同的抗原量(69ng)、血清的稀释(1∶100)和IgG缀合物的稀释(1∶4000)。

此外，本发明提供用于检测猪TTV感染的有用诊断试剂，其包含从天然宿主中纯化的单克隆或多克隆抗体，例如通过以有效的免疫原性量用猪TTV或本发明的免疫原性组合物接种猪以产生病毒感染，并从被感染的猪的血清中回收抗体。或者，可在实验动物中产生对抗天然或合成的多肽的抗体，所述多肽源自或表达自由所分离的猪TTV的核苷酸序列编码的氨基酸序列或免疫原性片段。例如，可以从杂交瘤细胞中产生单克隆抗体，所述杂交瘤细胞获自以多肽抗原免疫的小鼠(例如，Balb/c)，所述多肽抗原源自所分离的猪TTV的核苷酸序列。通过在标准细胞培养基中的次黄嘌呤、胸苷和氨基蝶呤中生长来进行对杂交瘤细胞的选择，所述标准细胞培养基例如Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM)或极限必需培养基(minimal essential medium)。可以根据现有技术中已知的方法来克隆产生抗体的杂交瘤细胞。随后，可将所形成的离散的集落转移进入培养板的分开的孔中，以在合适的培养基中培养。通过常规的筛选方法，使用合适的抗原或免疫原对分泌抗体的细胞进行鉴定。注射杂交瘤之后，通过在小鼠中获取腹水来体外或体内培养杂交瘤细胞，通过公知的技术产生所需的单克隆抗体。

对于另一种替代的方法，可根据现有技术中已知的方法，在杆状病毒表达系统或大肠杆菌表达系统中表达猪TTV衣壳蛋白。所表达的重组猪 TTV衣壳蛋白可在酶联免疫吸附测定(ELISA)中用作用于诊断的抗原。例如，基于猪重组衣壳抗原的ELISA测定可被用于在猪和哺乳动物物种中检测猪TTV的抗体。尽管优选ELISA测定，但也可使用其他已知的诊断测试，例如免疫荧光测定(immunofluorescence assay，IFA)、免疫过氧化酶测定(immunoperoxidase assay，IPA)等。

理想地，可使用根据本发明的商业化的ELISA诊断测定，以在猪中诊断猪TTV感染。这些实例展示了使用猪TTV的纯化的ORF1和ORF2蛋白质来开发ELISA测定，以在猪中检测抗TTV抗体。使用了从感染了猪TTV的猪中收集的血清和来自对照猪的阴性血清以验证该测定。PTTV2特异性的、PTTV1a特异性的和PTTV1b特异性的抗体被证明特异性地识别PTTV ORF蛋白质。通过本领域技术人员已知的技术进一步标准化的该测试可优化猪TTV诊断测定的商业化。

本发明的另一个方面是包含所分离的猪TTV或抗原蛋白质的独特免疫原性组合物及其用于生产或产生抗体的应用，所述抗原蛋白质是由上文中描述的所分离的多核苷酸编码的。所述组合物含有无毒性的、生理学上可接受的载剂以及任选地一种或更多种佐剂。可添加很容易从常规的赋形剂和辅料(co-formulant)中选择的合适载剂，例如水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油等。可进行常规的测试以确保最终组合物的物理相容性和稳定性。

根据本发明，还提供了猪细环病毒(TTV)的感染性分子和核酸分子，核酸分子所产生的活病毒，以及保护猪免受猪TTV病毒感染或由猪TTV与其他病毒共感染所引起的疾病的兽医疫苗。本发明还提供可用作疫苗的免疫原性多肽表达产物。

猪TTV的新感染性DNA分子包含编码感染性PTTV1a-VA(SEQ IDNO：9)、PTTV1b-VA(SEQ ID NO：10)、PTTV2c-VA(SEQ ID NO：11)或PTTV2c-VA(SEQ ID NO：12)基因组之至少一部分的核酸分子。感染性PTTV DNA克隆优选地含有PTTV1或PTTV2的ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2基因的至少一种。可将多个拷贝的PTTV1a-VA(SEQ IDNO：9)、PTTV1b-VA(SEQ ID NO：10)、PTTV2c-VA(SEQ ID NO：11)或PTTV2c-VA(SEQ ID NO：12)基因组插入单个DNA分子以构建串联的感染性PTTV克隆。

当转染到PK-15细胞中并将其给予猪时，本文中描述的所克隆的PTTV(尤其是PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2c-VA和串联PTTV2b-RR、PTTV2c-RR)的基因组DNA被证明是体外或体内感染性的。这种新的、容易繁殖的病原体适合用于开发合适的疫苗接种方案以预防猪中的PTTV感染。

根据本发明的另一个实施方案，通过融合PCR，三种单基因组拷贝(one-genome-copy)的PTTV DNA克隆分别来自原型US隔离群PTTV1a-VA、PTTV1b-VA和PTTV2c-VA。将每种全长基因组DNA通过平端连接插入克隆载体pSC-B-amp/kan。限制性位点BamH I是三种PTTV基因组上的独特位点，在三种基因组的两端改造所述位点以协助生成多联体(coneatemer)，并因此模拟TTV的环状基因组。每个克隆所选择的质粒DNA的BamH I单酶切消化清楚地导致4.3-Kb和2.8-Kb两个不同大小的片段(图18A)。4.3-Kb片段表示骨架载体，而2.8-Kb片段表示所插入的PTTV基因组DNA。以相同的酶酶切消化的空载体pSC-B-amp/kan仅显示4.3-Kb的带(图18A)。所产生的PTTV克隆分别被定名为pSC-PTTV1a、pSC-PTTV1b和pSC-PTTV2c(图17A～C)。

此外，将来自克隆pSC-PTTV2c的两个拷贝的全长PTTV2c-VA基因组串联连接到pSC-B-amp/kan载体中以产生克隆pSC-2PTTV2c-RR(图17D)。对pSC-PTTV2c与pSC-2PTTV2c-RR之间的Afl II单酶切消化图谱的比较表明后一种质粒具有代表PTTV2c的第二拷贝的额外的2.8-Kb片段(图18B，右图)。随后，我们使用相同的克隆策略以产生源自德国TTV克隆TTV2-#471942-全长(TTV2-#471942-full)的串联二聚化的PTTV2b DNA克隆。与一个基因组拷贝的相应物(图18B，左图)相比，用Hind III单独酶切消化，在该构建体(定名为pSC-2PTTV2b-RR)(图17F)中存在代表第二拷贝的PTTV2b基因组的额外的2.8-Kb片段，确证构建成功。

通过体外转染PK-15细胞测试所构建的PTTV感染性克隆的复制能力。分别使用商业化生成的抗PTTV2c ORF1的兔多克隆抗体的IFA证实了克隆TTV2-#471942-全长和pSC-PTTV2c的两种多联体是有复制能力的(图19A和图20A)。将所转染的细胞传代并不清除或降低荧光信号(图19B和图20B)，表明ORF1蛋白质的表达是由模拟天然PTTV2b或PTTV2c环状分子的PTTV2多联体所产生的。在模拟转染的细胞或DNA 转染的细胞中使用预免疫的兔血清作为抗体用于IFA检测(未显示数据)，未观察到荧光信号。使用抗PTTV1a ORF1抗体，克隆pSC-PTTV1a的多联体也显示出是有复制能力的(图21)。阳性荧光信号位于转染或传代细胞的核中，表明猪TTV很可能在细胞核中复制。这并不出人意料，因为猪圆环病毒(PCV)具有类似的体外表达模式。

在PK-15细胞中直接转染串联二聚化的克隆pSC-2PTTV2b-RR或pSC-2PTTV2c-RR导致病毒复制并产生ORF1衣壳抗原。使用抗PTTV2ORF1的抗体确证两种克隆也都是有复制能力的，且阳性ORF1抗原位于核中(图22A和B)。

根据本发明的一个实施方案，猪TTV的感染性克隆可以用于接种猪，将随后诱出宿主动物的免疫应答，并刺激产生中和抗体。在本发明的一个具体的实施方案中，当注射进入常规猪的淋巴结和肌肉中时，两种串联二聚化的PTTV2克隆是感染性的。

为了测试PTTV2分子克隆的体内感染性，用克隆pSC-2TTV2b-RR或pSC-2TTV2c-RR接种常规猪。在接种后天数(day post-inoculation，DPI)为0、7、14、21和28时，从动物中收集血清样品。在pSC-2TTV2c-RR接种的猪中检测PTTV2DNA，分别始于7DPI(#92)、14DPI(#188和#191)和21DPI(#180)(图23，右图)。对于接种了克隆pSC-2TTV2b-RR的猪，PTTV病毒血症出现的较晚：两只始于14DPI(#189和#192)，一只始于21DPI(#181)，以及一只始于28DPI(#193)(图23A，左图)。通过PTTV2特异性的实时PCR测定，在所有被接种的猪中，该过程中病毒负荷升高，最高病毒负荷出现在尸检前的28DPI(图23A)。将从所选的猪中扩增的实时PCR产物测序，发现具有与pSC-2TTV2b-RR或pSC-2TTV2c-RR的相应区域相同的序列(未显示数据)。

在0和7 DPI，所有被接种的猪均为PTTV2 ORF1抗体阴性。在14DPI，所有4只接种了pSC-2TTV2b-RR的猪均血清转变为抗PTTV2ORF1 IgG，而接种了pSC-2TTV2c-RR组的猪分别在14(#92和#180)、21(#191)和28(#188)DPI时发生血清转变(图23B)。结果表明，发生了活跃的猪TTV2b或TTV2c感染。

感染性病毒和感染性分子DNA克隆的疫苗以及使用它们的方法也包括在本发明的范围之内。被接种的猪受到保护而免受病毒感染和TTV2 感染或共感染所引起的相关疾病。通过向猪施用根据本发明的免疫有效量的疫苗，该新方法保护需要保护的猪免受病毒感染，例如，包含免疫原量的感染性PTTV DNA的疫苗，含有PTTV的感染性DNA克隆的质粒或病毒载体，重组PTTV DNA、多肽表达产物、细菌表达的或杆状病毒表达的纯化的重组ORF1衣壳蛋白等。可同时给予猪其他抗原(例如，PRRSV、PPV)、其他猪感染物和免疫刺激剂，以提供对抗病毒感染的广谱保护。

疫苗包含例如感染性病毒和分子DNA克隆，在合适的质粒或载体(例如，pSC-B载体)中克隆的PTTV感染性DNA基因组、无毒力的活病毒、失活的病毒、表达的重组衣壳亚单位疫苗等，并联合无毒性的、生理学上可接受的载剂，以及任选的一种或更多种佐剂。所述疫苗还可包含本文中描述的感染性TTV2分子DNA克隆。优选感染性的PTTV DNA、含有感染性病毒基因组的质粒DNA和活病毒，其中最优选活病毒。本发明的无毒力的活病毒疫苗提供相对于传统病毒疫苗的优势，所述传统病毒疫苗使用减毒活病毒(其有风险转化回有毒力的状态)或繁殖完整病毒的死细胞培养物(其可能无法诱导足够的用于防御病毒性疾病的抗体免疫应答)。

疫苗和使用它们的方法也包括在本发明的范围之内。被接种的哺乳动物物种被保护而免受严重的病毒感染，还可提供对PTTV共感染相关疾病(猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)和其他相关疾病)的保护。所述疫苗包含例如失活的或减毒的猪TTV病毒，无毒的、生理学上可接受的载剂，任选地一种或更多种佐剂。

可与本发明的疫苗一起施用的佐剂是升高猪对疫苗的免疫应答的物质。所述佐剂可与所述疫苗同时以及在相同的位置施用，或在不同的时间(例如，作为加强剂)施用。还可以以不同于施用疫苗的方式或位置向猪有利地施用佐剂。合适的佐剂包括但不限于氢氧化铝(alum)、免疫刺激复合物(ISCOMS)、非离子嵌段聚合物或共聚物、细胞因子(例如，IL-1、IL-2、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、皂苷、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MLA)、胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)等。其他合适的佐剂包括例如硫酸铝钾、从大肠杆中分离的热不稳定的或热稳定的肠毒素、霍乱毒素或其B亚单位、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐剂等。可在使用前灭活基于佐剂的毒素(白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素)，例如，通过用甲醛处理而灭活。

疫苗还可含有其他抗原以促进感染性PTTV DNA克隆(例如，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(porcine parvorirus，PPV)、其他猪感染物和免疫刺激剂)的免疫活性。

本发明的新疫苗不限于任何具体的类型或制备方法。所克隆的病毒疫苗包括但不限于感染性DNA疫苗(即，使用质粒、载体或其他常规载剂直接将DNA注射进入猪)、活疫苗、修饰的活疫苗、灭活的疫苗、亚单位疫苗、减毒的疫苗、遗传改造的疫苗等。通过现有技术中已知的标准方法制备这些疫苗。

另一个益处是，本发明的优选的活病毒提供比其他类型的减毒疫苗更容易制造、存储和递送的遗传稳定的疫苗。

本发明的另一种优选的疫苗利用合适的质粒向猪递送非致病性DNA克隆。与使用繁殖完整病毒的活或死细胞培养物的传统的疫苗相反，本发明提供用含有感染性病毒基因组的质粒DNA直接接种猪。

通过现有技术中已知的技术生产本发明中理想的其他遗传改造的疫苗。所述技术包括但不限于重组DNA进一步操作、重组蛋白质的氨基酸修饰或替换，等。

制造基于重组DNA技术的遗传改造的疫苗，例如通过鉴定病毒基因中编码负责在猪中诱导更强的免疫或保护性应答的蛋白质(例如，来自ORF1、ORF1/1、ORF2、ORF2/2等的蛋白质)的替代性部分。可将这样鉴定的基因或免疫显性片段克隆进入标准的蛋白质表达载体(例如，杆状病毒载体)，并用于感染合适的宿主细胞(见例如O′Reilly et al.，“Baculovirus Expression Vectors：A Lab Manual，”Freeman & Co.，1992)。培养所述宿主细胞，因此表达所需的疫苗蛋白质，可将其纯化至所需的程度，并配制成为合适的疫苗产品。重组的亚单位疫苗是基于细菌表达的(图10，图15)或杆状病毒表达的ORF1衣壳蛋白(PTTV1a、PTTV1b和PTTV2)。

如果克隆保留了任何不合需要的天然致病能力，还可以精确定位病毒基因组中负责任何残余毒力的核苷酸序列，并通过例如位点定向诱变(site-directed mutagenesis)将病毒遗传改造为无毒力的病毒。位点定向诱变能够添加、删除或改变一个或更多个核苷酸(见例如Zoller et al.，DNA3：479-488，1984)。合成含有所需突变的寡核苷酸，并将其退火至单链病毒DNA的一部分。使用来自该过程的杂交分子转化细菌。随后，使用所分离的含有合适突变的双链DNA通过连接至全长DNA的限制性片段并随后转入进入合适的细胞培养物而产生全长DNA。可通过本领域技术人员已知的任何标准技术来完成将基因组连接进入用于转移的合适载体。可使用任何常规方法(例如，磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合和其他公知的技术)(例如，Sambrook et al.，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)来进行将所述载体转染进入宿主细胞以产生病毒子代。所克隆的病毒随后表现出所需的突变。或者，可合成两个含有合适突变的寡核苷酸。可将这些寡核苷酸退火以形成双链DNA，其可被插入病毒DNA以产生全长DNA。

向需要防御病毒感染的猪施用免疫有效量的本发明的疫苗。通过常规测试可以很容易地测定或很容易地滴定要接种猪的免疫有效量或者免疫原性量。有效量是这样的量，其中获得对疫苗足够的免疫应答，以保护暴露于PTTV病毒的猪。优选地，将猪保护至这样的程度，其中病毒性疾病的一种至所有的不良生理症状或作用被显著地降低、改善或完全阻止。

可以以单剂量或以重复剂量施用所述疫苗。剂量范围可以是例如从约1微克至约1,000微克含有感染性嵌合DNA基因组的质粒DNA(取决于疫苗的免疫活性成分的浓度)，优选100至200微克猪TTV DNA克隆，但不应当含有足以导致病毒感染的不良反应或生理症状的基于病毒的抗原量。现有技术中已知用于测定或滴定合适剂量的活性抗原剂以根据猪的体重、抗原的浓度和其他典型因素发现最小有效剂量的方法。优选地，感染性病毒DNA克隆用作疫苗，或可体外生成活的感染性病毒，并随后将所述活病毒用作疫苗。在该情况下，可给予猪例如从约50至约10,000的活病毒的50％组织培养物感染剂量(50％tissue cultureinfective dose，TCID 50)。

本发明的新疫苗不限于任何具体的类型或制备方法。所述疫苗包括但不限于修饰的活病毒、灭活的疫苗、亚单位疫苗、减毒的疫苗、遗传改造的疫苗等。

活疫苗的优势是在接受所述疫苗时激活所有可能的免疫应答，包括全身的、局部的、体液的和细胞介导的免疫应答。活病毒疫苗的劣势可超过其优势，在于污染活的偶然的病毒剂的可能性或在实践中病毒可恢复毒力的风险。

为制备灭活的病毒疫苗，例如，可在培养的猪细胞系(例如但不限于PK-15细胞)中进行病毒的繁殖和病毒的生产。随后通过本领域普通技术人员广泛知晓的方案优化连续的病毒灭活，或者优选通过本文中描述的方法来优化。

可以通过用灭活剂(例如，甲醛或疏水溶剂、酸等)，通过用紫外光或X射线照射，通过加热等处理猪TTV来制备灭活的病毒疫苗。以现有技术中所理解的方式进行灭活。例如，在化学灭活中，用足够量或浓度的灭活剂，以足够高(或低，取决于灭活剂)的温度或pH处理合适的病毒样品或含有病毒的血清样品足够长的时间，以灭活病毒。以足以灭活病毒的温度和时间长度进行热灭活。使用一定波长的光或其他能源进行做够长时间的辐射灭活以灭活病毒。如果病毒不能感染易于感染的细胞，则认为病毒已被灭活。

亚单位疫苗的制备通常不同于制备修饰的活疫苗或灭活的疫苗。制备亚单位疫苗之前，必须鉴定疫苗的保护性成分或抗原成分。在本发明中，PTTV1a、PTTV1b和PTTV2的ORF1衣壳蛋白被鉴定为PTTV的抗原成分，在大肠杆菌(E.coli)(在本发明中)和其他表达系统(例如，杆状病毒表达系统)中对其进行表达和纯化，用作亚单位重组衣壳疫苗。这样的保护性成分或抗原性成分包括：病毒衣壳蛋白的某些氨基酸区段或片段，其在猪中引起特别强烈的保护性或免疫应答；单或多病毒衣壳蛋白本身、其寡聚物和病毒衣壳蛋白的更高度的关联，所述衣壳蛋白形成病毒亚结构或者所述亚结构的可鉴定的部分或单位；存在于或接近病毒表面或在病毒亚结构(例如，与病毒相关的脂蛋白或脂质基团)中的寡糖苷(oligoglycoside)、糖脂或糖蛋白等。优选地，采用ORF1蛋白作为亚单位疫苗的抗原成分。还可使用其他蛋白质，例如ORF2、ORF1/1和ORF2/2基因中的核苷酸序列所编码的蛋白质。通过现有技术中已知的方法，很容易鉴定这些免疫原性成分。一旦被鉴定，病毒的保护性或抗原部分(即，“亚单位”)随后通过现有技术中已知的方法纯化和/或克隆。亚单位疫苗提供相对于其他基于活病毒的疫苗的优势，因为亚单位(例如，高度纯化的病毒亚单位)比完整病毒的毒性低。

如果通过基因重组技术产生亚单位疫苗，可通过例如上文中提供的方法表达所克隆的亚单位(例如，ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2基因)，并还可通过现有技术中已知的方法来优化(见例如，Maniatis et al.，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，Mass.(1989))。另一方面，如果所使用的亚单位代表病毒的完整结构特征(例如，完整的衣壳蛋白)，则必须随后优化将其从病毒中分离的方法。在这两种情况下，优化灭活方案之后，可在制造之前优化亚单位的纯化方案。

为了制备减毒的疫苗，首先通过现有技术中已知的方法将活的致病病毒减毒(使其无致病性或无害)，或者优选如本文中描述的那样减毒。例如，可通过本发明的技术制备减毒的病毒，所述技术涉及通过含胚猪卵(embryonated pig egg)的新的连续传代。可在自然界中发现减毒的病毒，并且其可具有天然的基因缺失，或者，作为替代，可通过制造基因缺失或产生基因突变来使所述致病病毒减毒。所述减毒的和失活的病毒疫苗包含本发明的优选的疫苗。

通过现有技术中已知的技术产生遗传改造的疫苗，其也是本发明中理想的。所述技术涉及但不限于使用RNA、重组DNA、重组蛋白质、活病毒等。

例如，纯化之后，可以通过现有技术中已知的方法从合适的临床、生物样品(例如，血清、粪便、唾液、精液和组织样品)中分离野生型病毒，优选通过本文中教导的方法使用被感染的猪或被感染的合适细胞系进行分离。通过现有技术中已知的方法，从生物纯的病毒或感染物中提取DNA，优选通过在CsCl梯度中超速离心来提取。通过现有技术中已知的方法(见Maniatis et al.，同上)，将病毒基因组的cDNA克隆进入合适的宿主，随后分析病毒基因组以测定基因组的用于产生病毒的抗原性部分的关键区域。在下文中，该过程基本与用于修饰的活疫苗、灭活的疫苗或亚单位疫苗的方法相同。

制造基于重组DNA技术的遗传改造的疫苗，例如通过鉴定病毒基因中编码负责在猪中诱导更强免疫或保护性应答之蛋白质(例如，来自ORF1、ORF2、ORF1/1和ORF2/2等的蛋白质)的部分。可将这样鉴定的基因或免疫显性片段克隆进入标准的蛋白质表达载体(例如，杆状病毒载体)，并用于感染合适的宿主细胞(见例如，O′Reilly et al.，“BaculovirusExpression Vectors：A Lab Manual，”Freeman & Co.(1992))。培养所述宿主细胞，因而表达所需的疫苗蛋白质，其可被纯化至所需的程度并被配制成为合适的疫苗产品。

例如可在昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达可用于疫苗的遗传改造蛋白质。可将通过常规方法纯化或分离的所述遗传改造蛋白质直接接种进入猪或哺乳动物物种以赋予其对抗猪TTV的保护。

可用含有多核酸(polynucleic acid)的转移载体转化昆虫细胞系(例如，sf9、sf21或HIGH-FIVE)，所述多核酸获自病毒或拷贝自编码一种或更多种病毒免疫显性蛋白质的病毒基因组。转化载体包括例如线性化的杆状病毒DNA和含有所需多核苷酸的质粒。可以用线性化的杆状病毒DNA和质粒共转染宿主细胞系以制造重组的杆状病毒。

或者，可将来自所分离的编码一种或更多种衣壳蛋白的猪TTV的DNA插入活的载体(例如，痘病毒或腺病毒)并用作疫苗。

向需要防御所述感染或综合征的猪或哺乳动物物种施用免疫有效量的本发明的疫苗。可以通过常规的测定容易地测定或容易地滴定所述“免疫有效量”。有效量是这样的量，其中获得了对疫苗的足够免疫应答，以保护暴露于猪TTV病毒或猪TTV共感染的猪或其他哺乳动物，所述共感染可引起猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)和其他相关疾病。优选地，保护猪或其他哺乳动物物种至这样的程度，其中发现病毒疾病的一种至所有的不良生理症状或作用被显著地降低、改善或完全阻止。

可以以单剂量或以重复剂量施用所述疫苗。剂量可含有例如从1至1,000微克基于病毒的抗原(取决于疫苗的免疫活性成分的浓度)，但不应当含有足以导致病毒感染的不良反应或生理症状的基于病毒的抗原。现有技术中已知用于根据鸟类或哺乳动物的体重、抗原浓度和其他典型因素来测定或滴定合适的活性抗原剂之合适剂量的方法。

可向猪施用疫苗。此外，可给予人(例如，高风险感染病毒剂的猪农)该疫苗。考虑可设计基于猪TTV的疫苗以提供对抗猪和人TTV的广泛保护。换句话说，可以优选地设计基于猪TTV的疫苗以通过所谓的“琴纳法(Jennerian approach)”(即，可被Edward Jenner用于对抗人天花的牛痘病毒疫苗)来防御人TTV感染。理想地，直接向尚未暴露于TTV病毒的猪或其他哺乳动物物种施用所述疫苗。可方便地经口、口内、鼻内、经皮、肠胃外等施用所述疫苗。肠胃外施用途径包括但不限于肌内、静脉内、腹膜内和皮下途径。

当作为液体施用时，可以以水溶液剂、糖浆剂、酏剂、酊剂等的形式制备本疫苗。这样的制剂是现有技术中已知的，并且通常是通过在合适的载体或溶剂系统中稀释抗原和其他典型的添加剂而制备的。合适的载体或溶剂包括但不限于水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油等。典型的添加剂是例如认证的染料(certified dye)、香料、甜味剂和抗菌的防腐剂(例如，硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠))。可以例如通过添加部分水化的明胶、山梨糖醇或细胞培养基来稳定这样的溶液，并且可以通过常规方法使用现有技术中已知的试剂(例如，磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾及其混合物等)来缓冲。

液体制剂还可包括含有助悬剂或乳化剂联合其他标准辅料的混悬剂和乳剂。可通过常规方法制备这些类型的液体制剂。例如，可以使用胶体磨来制备混悬剂。例如，可使用匀浆器来制备乳剂。

设计用于注射进入体液系统的肠胃外制剂需要合适的等渗性以及缓冲至相应的哺乳动物体液水平的pH。可以用氯化钠和其他所需的盐适当地调节等渗性。可以使用合适的溶剂(例如，乙醇或乙二醇)以升高制剂中成分的溶解度以及液体制剂的稳定性。可在本发明疫苗中使用的其他添加剂包括但不限于葡萄糖、常规的抗氧化剂和常规的螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))。胃肠外剂型还必须是使用前已灭菌的。

如下实施例证明本发明的某些方面。然而，要理解的是，这些实施例仅用于举例，并不意在完全定义本发明的条件和范围。应当理解的是，当给予典型的反应条件(例如，温度、反应时间等)时，尽管通常不太方便，但还可使用所指定的范围以上和以下的条件。实施例是在室温(约23℃.至约28℃.)和在大气压下进行的。除非另有说明，本文中提到的所有部分和百分比是基于重量的，且所有温度是以摄氏度表示的。

实施例1

病毒DNA的提取、嵌套式PCR和基因组PCR：

在研究中使用了取自来自弗吉尼亚猪农场的20只常规成年公猪的便利的血清和精液样品。使用QIAamp DNA小提试剂盒(DNA mini kit)(Qiagen)从20个血清样品和19个精液样品中分离总DNA。为了筛选阳性的含有PTTV的样品，通过使用AmpliTag Gold聚合酶(Applied Biosystems)开始进行PTTV1和PTTV2的UTR中之保守区的嵌套式PCR扩增。所使用的扩增PTTV1的片段A的两个引物对是TTV1-mF(SEQ IDNO：45)/TTV1-mR(SEQ ID NO：46)(用于第一轮的PCR)和TTV1-nF(SEQ ID NO：47)/TTV1-nR(SEQ ID NO：48)(用于第二轮的PCR)，而用于扩增PTTV2的片段D的两个引物对是TTV2-mF(SEQ IDNO：49)/TTV2-mR(SEQ ID NO：50)(用于第一轮的PCR)和TTV2-nF(SEQ ID NO：51)/TTV2-nR(SEQ ID NO：52)(用于第二轮的PCR；图1A和表1)。

为了扩增PTTV1和PTTV2的全长基因组序列，我们首先进行了反基因组PCR(inverse genomic PCR)，其分别使用位于PTTV1的区域A的一对保守的基因特异性的引物TTV1-IF(SEQ ID NO：1)/TTV1-IR(SEQ ID NO：4)和位于PTTV2的区域D的另一对基因特异性的引物TTV2-IF(SEQ ID NO：5)/TTV2-IR(SEQ ID NO：8)，根据制造商的使用说明使用Herculase II融合DNA聚合酶(Stratagene)。未检测到预期大小的PCR产物。随后，我们设计了新的引物组以在第二轮PCR中分别扩增覆盖完整的PTTV1和PTTV2基因组的两个区域(图1A)。用于扩增PTTV1的片段B和C的引物对分别是TTV1-IF(SEQ IDNO：1)/TTV1-2340R (SEQID NO：2)和TTV1-2311F (SEQ IDNO：3)/TTV1-IR(SEQ ID NO：4)，而用于扩增PTTV2的片段E和F的引物对分别是TTV2-IF(SEQ ID NO：5)/TTV2-2316R(SEQ ID NO：6)和TTV2-GCF(SEQID NO：7)/TTV2-IR(SEQ ID NO：8)(图1A和表1)。片段C和F分别含有PTTV1和PTTV2的富含GC的区域。分别切除、纯化所扩增的PCR产物，并随后根据制造商的使用说明(Stratagene)通过StrataClone Blunt PCR克隆策略将其克隆进入pSC-B-amp/kan载体(Stratagene)，随后对DNA进行测序。

实施例2

筛选从来自弗吉尼亚农场的公猪中收集的猪TTV阳性样品：

此前，通过嵌套式PCR，根据日本PTTV1毒株Sd-TTV31的UTR序列(McKeown et al.，2004，见上文)，从不同地理区域的猪中检测猪TTVDNA。随着最近对PTTV2的鉴定，已使用了两种不同的嵌套式PCR引物组分别扩增PTTV1的区域A和PTTV2的区域D(图1A)(Ellis etal.，2008，见上文；Kekarainen，T.，Sibila，M.，and Segales，J.(2006).Prevalence ofswine Torque teno virus in post-weaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs in Spain.J Gen Virol 87(Pt 4)，833-7；Krakowka et al.，2008，见上文)。在本发明中，也使用了类似的检测方法以从美国的猪中鉴定PTTV毒株。为了筛选天然的PTTV1阳性或PTTV2阳性的样品以随后用于测定全长的基因组序列，从弗吉尼亚的农场的20只公猪中收集20个血清样品(SR#1-20)和19个精液样品(SM#1-18和SM#20)用于嵌套式PCR分析。出入意料的是，所有20个血清样品均为PTTV1阳性的，且19个也是PTTV2阳性的(除了SR#18)。相反，仅1个精液样品(SM#6)是PTTV阳性的，3个精液样品(SM#8、9和20)是PTTV2阳性的。该结果与西班牙最近的研究相一致，在所述研究中公猪精液样品显示PTTV DNA阳性(Kekarainen，T.，Lopez-Soria，S.，and Segales，J.(2007).Detection of swine Torque teno virus genogroups 1 and 2in boar seraand semen.Theriogenology 68(7)，966-71)，并因此表明潜在的PTTV垂直传播。然而，精液中PTTV1和PTTV2的流行率远低于血清，表明在同一猪的血清与精液中PTTV DNA的存在没有直接关联。

实施例3

序列和系统发生分析：

使用Lasergene package(DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行DNA和氨基酸的属(generic)分析和比对。用于比对和比较的三种已知PTTV毒株的基因组序列及其相应的GenBank登录号是Sd-TTV31(AB076001)、TTV-1p(AY823990)和TTV-2p(AY823991)。使用GenBank中可获得的人和动物TTV相关毒株的121种全长基因组序列，使用在线软件PASC(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/pasc/viridty.cgi？textpage＝overview)进行序列配对比校(PASC)(Bao et al.，2008)。

通过PAUP 4.0软件(David Swofford，Smithsonian Institute，Washington，DC，distributed by Sinauer Associate Inc.)中的邻接法，基于全长基因组序列和7种毒株的4种ORF的推断的氨基酸序列构建系统树。数据获自1000次重复取样。

实施例4

设计用于诊断猪PTTV感染的PCR引物

使用Lasergene package(DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行DNA序列的分析和比对。用于比对的10种猪TTV毒株的全长基因组序列及其相应的GenBank登录号如下。种PTTV1：Sd-TTV31(AB076001)、PTTV1a-VA(GU456383)、TTV-1p(AY823990)、PTTV1b-VA(GU456384)、swSTHY-TT27(GQ120664)和TTV1#471819(GU188045)。种PTTV2：PTTV2b-VA(GU456385)、PTTV2c-VA(GU456386)、TTV-2p(AY823991)和TTV2#472142(GU188046)。分别鉴定了6种PTTV1和4种PTTV2基因组之中的保守序列，并随后将其用于指导使用BeaconDesigner软件(PREMIER Biosoft International，Palo Alto，CA)选择实时PCR的引物。通过Lasergene package设计用于PTTV1双链体嵌套式PCR的引物。

实施例5

PTTV1和PTTV2实时PCR的标准曲线

使用以前描述(Huang et al.，2010)的引物TTV1-IF(5′-CATAGGGTGTAACCAATCAGATTTAAGGCGTT-3′)和TTV1-2340R(5′-GGTCATCAGACGATCCATCTCCCTCAG-3′)，从相同的PCR片段中重新扩增对应于PTTV1b-VA基因组的PCR片段B的2091bp的区域。通过QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)凝胶纯化所产生的扩增子，并通过NanoDrop分光光度计对其定量，用于猪TTV种1的实时PCR标准模板。通过在载体pSC-B-amp/kan(Huang et al.，未发表的数据)中装配来自PTTV2c-VA的PCR片段E和F，构建了PTTV2c-VA毒株pSC-PTTV2c的全长DNA克隆。质粒pSC-PTTV2c(7082bp)被用于猪TTV种2的实时PCR标准模板，并通过NanoDrop分光光度计测量质粒DNA的浓度。分别使用两种模板的10倍稀释系列生成实时PCR标准曲线。

实施例6

提取病毒DNA用于PCR测定

按照之前的描述(Huang et al.，2010)，使用QIAamp DNA小提试剂盒(Qiagen)从收集自弗吉尼亚猪农场的20只常规成年公猪(没有临床症状)的20个血清样品和19个精液样品中分离总DNA。使用400μl的血清和精液样品体积以在最终50μl无菌水的洗出液中提取DNA。将所有所提取的DNA样品存储于-20℃，直到进行实时PCR测试。之前已描述过通过常规嵌套式PCR对这些样品进行的猪TTV检测(Huang et al.，2010)。使用以相同的方法从山羊血清样品中所提取的总DNA作为阴性对照。

实施例7

SYBR green实时定量PCR测定

使用SensiMix SYBR & Fluorescein试剂盒(Quantace Ltd)和MyiQ iCYCLER实时PCR仪(BIO-RAD Laboratories)分别进行PTTV1特异性的和PTTV2特异性的实时PCR。每25-μl反应物含有12.5μlSYBR green Master Mix、4μl所提取的DNA、0.5μl每种引物(10nM)和7.5μl无菌水。PTTV1的PCR条件是：95℃10分钟，随后40个循环的扩增(95℃15秒，59.4℃30秒，72℃10秒)。紧接着，通过从55℃至95℃逐渐升高温度且每0.5℃测量荧光信号而获得解链温度分析。PTTV2的PCR条件与PTTV1的相同，只是退火温度为56℃。在每次运行中，包括了PTTV1和PTTV2标准模板作为阳性对照。使用MyiQ System软件(BIO-RAD Laboratories)进行扩增和数据分析。在相同的板上两个重复地运行所有样品。

实施例8

两种单链体测定的特异性和敏感性

通过使用退火温度梯度的10倍稀释扩增测定了扩增PTTV1特异性和PTTV2特异性测定的扩增的最佳退火温度分别是59.4℃和56℃。仅使用PTTV1模板时，使用引物TTV1F/TTV1R获得118-bp产物的扩增，而仅当使用引物TTVF4/TTVR4时，观察到以PTTV2为模板的200-bp产物的扩增。两种测定均未从对方获得任何交叉的扩增，确证了引物和靶标的特异性(未显示数据)。

在每25μl一系列靶DNA浓度下建立PTTV1标准曲线。显示线性范围跨越4.4×10¹至4.4×10⁸拷贝。最小检出限(44个拷贝)对应于37.57的阈循环(C_t)。C_t＞37.57的受试样品被认为低于检出限，且不可定量。类似地，生成PTTV2标准曲线，并用于检测每25μl反应物中范围为8.6×10⁰至8.6×10⁸拷贝的DNA浓度。最小检出限(8.6个拷贝)所对应的C_t是36.53。被认为是PTTV1阳性或PTTV2阳性的所有样品具有低于各自的最大检出限的拷贝数。使用10倍稀释的PTTV1或PTTV2标准模板(图6a和6b；蓝色曲线)以及20个公猪血清样品的解链曲线分别显示87.0℃(PTTV1)和80.0℃(PTTV2)的解链温度(T_m)(图6a和6b；红色曲线)。对于使用无菌水或山羊血清DNA作为模板的阴性对照，未观察到峰(图6a和7b；黑色线)。

实施例9

在公猪血清和精液样品中定量猪TTV1和TTV2

病毒负荷表示为每ml初始公猪血清样品中PTTV1或PTTV2基因组的拷贝数。在范围是1.91×10³至3.25×10⁵拷贝/ml的全部20个血清样品中都检测到了PTTV1 DNA，而在范围是3.59×10²至1.39×10⁶拷贝/ml的19个血清样品(除了#10)中检测到PTTV2 DNA。结果与我们以前通过使用常规嵌套式PCR的研究相一致(表5)。没有精液样品是PTTV1阳性的，而三个精液样品是PTTV2阳性的，且病毒负荷非常低(分别为230、244和357拷贝/ml)。

表5.在来自弗吉尼亚农场的成年公猪的20个血清样品和19个精液样品中通过不同的测定检测猪TTV的比较

实施例10

PTTV1/PTTV2双链体实时PCR测定

在含有12.5μl SYBR green Master Mix、0.5μl每种PTTV1引物、0.5μl每种PTTV2引物、4μl DNA和6.5μl无菌水的25-μl PCR系统中进行PTTV1/PTTV2双链体实时PCR测定。双链体PCR条件和解链温度分析与PTTV1的分析相同，只是退火温度为58℃。分析解链峰以区别PTTV1特异性的和PTTV2特异性的扩增子。

实施例11

双链体嵌套式PCR

在50μl的总体积中，使用Platinum PCR HiFi Supermix(Invitrogen)，使用4μl所提取的DNA进行第一轮PCR。PCR条件是：模板DNA在94℃下初始变性2分钟，30个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒。将4-μl小份的第一轮PCR产物用于具有相同PCR试剂和条件的第二轮PCR。在第一轮PCR中使用一对引物P1ab-mF/P1ab-mR，而在第二轮PCR中使用两对引物(P1a-nF/P1a-nR用于检测PTTV1a，以及P1b-nF/P1b-nR用于检测PTTV1b)的混合物(表1)。通过以溴化乙锭染色的在1％琼脂糖上进行的凝胶电泳使扩增产物可视化，通过UV光区分对每种类型特异性的两个带。

实施例12

构建PTTV1和PTTV2的ORF表达质粒

从各自全长DNA克隆(pSC-PTTV1a、pSC-PTTV1b和pSC-PTTV2c；在别处已有描述)中扩增PTTV1a、PTTV1b和PTTV2c的ORF I的C末端部分。所扩增的片段预期分别编码蛋白质产物，对于PTTV1a(ORF1 aa位置317～635(SEQ ID NO：13)；GenBank登录no.GU456383)具有319aa，对于PTTV1b(ORF1 aa位置322～639(SEQ IDNO：14)；GenBank登录no.GU456384)具有318aa，以及对于PTTV2c(ORF1aa位置310～625(SEQ ID NO：16)；GenBank登录no.GU456386)具有316 aa。还扩增了编码248aa(ORF1 aa位置322～569(SEQ IDNO：14))的PTTV1的C-末端截短的片段，并将其用作SDS-PAGE分析的对比对照。通过将PCR产物克隆进入大肠杆菌/杆状病毒/哺乳动物细胞三重表达的载体pTriEx1.1-Neo(Novagen)的NcoI和XhoI限制位点之间而构建所有质粒，以生产C-末端8×His标签的融合蛋白质。将这4种重组质粒定名为pTri-PTTV1a-ORF1、pTri-PTTV1b-ORF1、pTri-PTTV1b-ORF1ctruc和pTri-PTTV2c-ORF1。通过DNA测序确证所有克隆的序列。

实施例13

重组的PTTV1和PTTV2蛋白的表达

将4种表达质粒分别转化进入Rosetta 2(DE3)pLacI感受态细胞(Novagen)，并将细菌置于含有100μg/ml氨苄西林的LB琼脂板上，在37℃下过夜。将每个构建体的单个转化菌落用于接种3ml含有100μg/ml氨苄西林(LB/amp)的LB培养基中，在37℃下培养6～8小时。随后，通过添加25％过滤灭菌的甘油将每种构建体的混浊的3ml培养基用于制造细菌原液，并在-80℃下冷冻该培养物。纯化之前，将每种构建体的10μl冷冻的细菌原液用于接种3mlLB/amp的起子培养物(starter culture)，并在37℃下培养6～8小时。用所述起子培养物接种100-ml过夜表达TB培养基(Overnight Express TB Media)(Novagen)以诱导蛋白的表达，并在37℃下培养16～18小时。孵育之后，在4℃下，以3400rpm对自身诱导的培养物进行15分钟离心。弃去所产生的每种构建体的上清液，并将每种细菌沉淀保存在-20℃备用。

实施例14

重组蛋白质的纯化和透析

重组蛋白质是不溶性的，且在细菌内含体内表达。根据制造商的使用说明(Novagen)，用BugBuster和rLysozyme处理每种细菌沉淀，并添加Benzonase核酸酶(Novagen)用于降解DNA和RNA。随后，用840μl裂解缓冲液(6M盐酸胍、0.1M磷酸钠、0.01MTris-盐酸、0.01M咪唑，pH 8.0)重悬每种包含体沉淀，并在-80℃冷冻至少30分钟。随后融化，用另外2.5ml裂解缓冲液稀释，并在室温下轻轻地旋转30分钟。通过在室温下以15,000g离心30分钟收集裂解液的上清液。向每个被倾倒的上清液中添加50％-Ni-NTA His-bind浆液(His-bind slurry)(Novagen)，在室温下振摇混合物60分钟以促进his-标签的结合。将裂解液/树脂混合物加载进入空的色谱柱。初始流通之后，向柱中添加7-ml裂解缓冲液并使其流通。随后，用7mL清洗缓冲液(8M尿素、0.1M磷酸钠、0.15M氯化钠、0.02M咪唑，pH 8.0)清洗2次。通过向所述柱4次分别添加1ml小份的洗脱缓冲液(8M尿素、0.05M磷酸钠、1M氯化钠、0.5M咪唑，pH 8.0)实现对靶蛋白的洗脱。通过SDS Page和考马斯蓝染色分析四个洗脱级分。

将含有显著浓度的靶蛋白的洗出物注射进入具有20,000分子量截断的0.5ml～3ml透析盒(Pierce)中。使用一系列4种透析缓冲液用于透析：透析缓冲液1(6M尿素、0.05M磷酸钠、0.8M氯化钠、0.3M咪唑，pH 8.0)、透析缓冲液2(4M尿素、0.033M磷酸钠、0.533M氯化钠、0.2M咪唑，pH 8.0)、透析缓冲液3(2.67M尿素、0.022M磷酸钠、0.356M氯化钠、0.133M咪唑，pH 8.0)和透析缓冲液4(1.5M尿素、0.0148M磷酸钠、0.237M氯化钠、0.089M咪唑，pH8.0)。随后，在4℃下，在每种透析缓冲液中浸没并旋转所述透析盒6小时。当完成透析时，从所述盒中除去每种重组的His标签融合蛋白质，使用NanoDrop定量并冷冻于-80℃。

实施例15

SDS-PAGE和抗-His-标签的Western印记

开发Western印记以通过使用抗6×His标签的单克隆抗体(Rockland)检测纯化的重组蛋白。将等体积的每种纯化的截短的ORF1蛋白质与LDS/10％β-ME混合，并在95℃下煮10分钟。将10-μl煮过的样品添加至装有4～12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)的每个合适的孔中，在1×MES运行缓冲液(Invitrogen)中以200伏运行43分钟。使用转印记半干转移设备(Trans blot semi dry transfer apparatus)和1×转移缓冲液(Invitrogen)将蛋白质转移至PVDF膜(Bio-Rad)。转移一旦完成，在室温下将所述PVDF膜在Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor)中孵育1小时。在Odyssey封闭缓冲液/0.2％吐温20中，以1∶1000稀释抗6×His标签的MAb，并在除去之前的Odyssey封闭缓冲液之后，将所述MAb转移至所述膜。将所述MAb与所述膜置于振荡器(rocker)上，在室温下孵育2小时，或者在4℃下孵育过夜，随后用tris缓冲盐水/0.05％吐温20(TBS-T，Sigma)清洗所述膜3次。在Odyssey封闭缓冲液/0.2％吐温20/0.1％SDS中，以1∶5000稀释山羊抗兔IgG IRDye 800(Li-Cor)抗体。将其转移至新鲜清洗的PVDF膜，并使其在室温和轻轻的振荡下孵育1小时。用TBS-T清洗所述膜3次，用TBS清洗1次，用Li-Cor Odyssey成像。

实施例16

血清Western印记

开发血清western印记，并将其用于鉴定阳性和阴性血清对照，用于ELISA显影。在上文所述的SDS-PAGE之后，将蛋白质转移至PVDF膜，并随后在室温下将所述膜在Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor)中孵育1小时。在Odyssey封闭缓冲液/0.2％吐温20中，以1∶100稀释所选的血清样品，并在除去之前的Odyssey封闭缓冲液之后，将所述样品转移至所述膜。将所述血清样品与所述膜置于振荡器(rocker)上，在室温下孵育2小时，随后用tris缓冲盐水/0.05吐温20(TBS-T，Sigma)清洗所述膜3次。在Odyssey封闭缓冲液/0.2％吐温20/0.1％SDS中，以1∶2500稀释山羊抗猪IgG IRDye 800抗体(Rockland)。将其转移至新鲜清洗的PVDF膜，并使其在室温和轻轻的振荡下孵育1小时。用TBS-T清洗所述膜3次，用TBS清洗1次，用Li-Cor Odyssey成像。

实施例17

间接PTTV1a、PTTV1b和PTTV2特异性的ELISA

通过棋盘滴定确定用于包被板和稀释抗血清与缀合物的最优抗原浓度。通过以100μl/孔在pH为9.6的1×碳酸盐包被缓冲液(Carbonate Coating Buffer，CCB)和结合ELISA板的包被介质(Greiner)中将每种纯化的重组His标签融合蛋白质(分别为PTTV1a、PTTV1b和PTTV2c)稀释至680ng/ml而起始ELISA。覆盖所述板，使其在37℃下孵育2小时。包被之后，除去被稀释的蛋白质，用300μl1×TBS-T清洗每个孔3次。随后以300μl/孔的体积添加无蛋白质的封闭缓冲液(Protein Free Blocking Buffer)(Pierce)，并使所述板在37℃下孵育1小时。同时，在96孔稀释块(dilution block)中，在150μl无蛋白的封闭缓冲液中以1∶100稀释血清样品。随后，除去所述块，将每种经稀释的血清样品转移至ELISA板上相应的孔中。使所述板在37℃下孵育2小时，随后，用300μlTBS-T清洗每个孔3次。随后，在12ml无蛋白的块中，以1∶4000稀释HRP缀合的抗猪IgG抗体(Rockland)，并将100μl添加至板的每个孔中。将其在37℃下孵育1小时，随后用300μl TBS-T清洗每个孔3次。为了使ELISA显影，向板的每个孔中添加100μl Sure Blue Reserve1-Component(KPL)。20分钟之后，向每个孔中添加100μl1N HCL以终止显影。随后于450nm读板。

实施例18

数据分析

将来自商业公司(制造于新西兰，且被认为没有所有的OIE疾病)的用于细胞培养研究的猪血清用作三种ELISA方案的阳性对照，因为通过血清western印记检测，所述血清均是PTTV1a、PTTV1b和PTTV2阳性的，并显示出高OD值(＞2.0)。我们初始使用合并的定菌猪血清作为阴性对照，因为其在western印记检测中是阴性的。随后，与阴性的定菌猪血清相比较，我们筛选了收集自威斯康星猪农场的常规猪的一些猪血清。其在western印记检测中也是阴性的，并且其OD值与阴性的定菌猪血清的OD相对应。将这些常规猪血清合并，并用作阴性对照。为每个ELISA计算截断值，其为阴性对照组(n＝4)的平均OD值加标准差的3倍。

实施例19

构建猪TTV1a和2c的全长基因组DNA克隆

从以前描述的构建体中重新扩增来自US隔离群PTTV1a-VA(GenBank登录no.GU456383)的PCR片段B和C，并随后使用载体pSC-B-amp/kan(Stratagene)上的Herculase II融合DNA聚合酶(Stratagene)，通过重叠PCR，利用基因组两端的BamH I位点，将其装配进入全长基因组DNA。所产生的构建体被定名为pSC-PTTV1a(图17A)。使用相同的策略，以相同骨架载体上相同的限制位点(BamH I)构建来自US隔离群PTTV1b-VA(GenBank登录no.GU456384)的克隆pSC-PTTV1b(图17B)和来自US隔离群PTTV2c-VA(GenBank登录no.GU456386)的克隆pSC-PTTV2c(图17C)。含有全长基因组DNA的质粒TTV2-#471942-全长(TTV2-#471942-full)(Fig.17E)源自德国致病猪TTV2分离群。TTV2-#471942是AndreasGallei博士(BIVI，Germany)惠赠的。根据系统发生分析(未显示数据)，TTV2-#471942与US隔离群PTTV1b-VA一起分类为猪TTV亚型2b。

实施例20

构建猪TTV2b和2c的串联二聚化DNA克隆

通过BamH I酶切消化，从克隆pSC-PTTV2c切除全长PTTV2c基因组，纯化和连接以形成多联体。将经连接的多联体克隆进入BamH I预酶切消化的pSC-B-amp/kan载体以产生串联二聚化的DNA克隆pSC-2PTTV2c-RR(图1D)。类似地，使用EcoR V限制位点，从克隆TTV2-#471942-全长中生成串联二聚化的DNA克隆(pSC-2PTTV2b-RR)(图1F)。

实施例21

PTTV1a、PTTV1b和PTTV2特异性的抗ORF1多克隆抗体

ORF1编码的产物是推测的TTV衣壳蛋白。为了生成PTTV1a、PTTV1b和PTTV2特异性的抗ORF1多克隆抗体以检测PTTV ORF1蛋白质的表达和测定PTTV DNA克隆的感染性，在Rockland Immunochemicals(Gilbertsville，PA)，作为定制抗体生产服务，在大肠杆菌中分别表达来自PTTV1a、PTTV1b和PTTV2c的三种ORF1蛋白质，纯化并随后将其用于免疫接种新西兰白兔(New Zealand white rabbit)。从经免疫接种的兔中生产每种抗ORF1的多克隆抗体。

实施例22

PTTV感染性克隆的体外转染

转染之前，以2×10⁵个细胞/孔将PK-15细胞接种到6孔板上，并使其生长至60％～70％汇合。根据制造商的方案，使用Lipofectamine LTX(Invitrogen)分别将DNA克隆pSC-2PTTV2b-RR和pSC-2PTTV2c-RR直接转染进入PK-15细胞。对于克隆pSC-PTTV1a、pSC-PTTV2c和TTV2-#471942-全长，将按照上文的描述所产生的经连接的多联体分别用于转染。将细胞培养3至5天，随后将其用于免疫荧光测定(IFA)以测定猪TTV的ORF1的表达。或者，将经转染的细胞传代进入新的6孔板中并继续培养3天，然后进行IFA检测。

实施例23

免疫荧光测定(IFA)

用PBS清洗经转染或传代的细胞2次，并用丙酮固定。在细胞上添加500微升以PBS1∶500稀释的对PTTV1a或PTTV2特异性的抗体，并在室温下孵育1小时。用PBS清洗三次，并随后添加500μl以1∶200稀释的德克萨斯红(Texas red)标记的或Alexa Fluor 488-标记的山羊抗兔IgG(Invitrogen)。在室温下孵育1小时之后，用PBS清洗，用500μl以1∶1000稀释的DAPI(KPL，Inc.)染色细胞，并使其在荧光显微镜下可视化。

实施例24

用串联二聚化的猪TTV2克隆体内接种常规猪

进行猪接种研究以测定两种串联二聚化的猪TTV2克隆(pSC-2TTV2b-RR和pSC-2TTV2c-RR)的感染性。简单地说，将8只4周龄的猪TTV2血清阴性和病毒DNA阴性的常规猪随机分入两组，每组4只。分别安置每组猪，并在符合机构动物管理与使用委员会(Institutional Committee on Animal Care and Use)的全部要求的条件下饲养。

通过联合淋巴结内途径和肌内途径注射每组的全部猪。分别为4只猪(no.181、189、192和193)注射200μg pSC-2TTV2b-RR质粒DNA，而为另外4只猪(no.92、180、188和191)分别接种200μlpSC-2TTV2c-RR克隆。每天监控猪之疾病的临床体征，总共监控28天。在接种后第28天，对所有的猪进行尸检。

虽然本发明是通过描述多个实施方案而说明的，并且虽然详细地描述了示例性的实施方案，申请人并不意在如此详细地限制或以任何方式限定所附权利要求书的范围。本领域技术人员会很容易想到其他修改。因此，在其更广泛的方面，本发明不限于具体的细节、代表的设备和方法以及所显示和描述的示例性的实施例。因此，只要不背离申请人的总的发明构思的精神和范围，可以偏离这样的细节。

Claims

1.PTTV的ORF1蛋白，其由SEQ ID NO:13,14,15或16所示。