CN103014056B - 一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2ORF1截短蛋白TTSuV2ORF1’的酵母表达及应用。本发明通过获取TTSuV2ORF1基因全序列、TTSuV2ORF1蛋白抗原性分析、对截短TTSuV2ORF1’序列的酵母表达、TTSuV2ORF1’截短蛋白的鉴定与纯化，获得真核表达的截短蛋白TTSuV2ORF1’，将该蛋白作为包被抗原用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，试剂盒具有较高的特异性、重复性及稳定性。本发明获得的截短表达的TTSuV2ORF1’重组蛋白还可以应用于猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中。

Description

一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达及应用

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达及应用。

背景技术

输血传播病毒（Transufson Transmitted Viurs，TTV）是一类无囊膜，二十面体，单股负链环状DNA病毒，电镜观察病毒颗粒直径约为30-32nm。TTV首次由日本学者从一例未知病原的非甲-非戊型输血后肝炎病人的血清中发现，随后人们在非灵长类以及猪、牛、羊、犬，猫、家禽等多种家养及野生动物体内也发现了TTV的感染。2009年，国际病毒分类协会（ICTV）将猪的TTV划分到指环病毒科（Anelloviridae）细环病毒属（Iotatorquevirus），并进一步划分为两个种:猪Ⅰ型细环病毒（Torque teno sus virus Ⅰ：TTSuV1)和猪Ⅱ型细环病毒（Torque teno sus virus Ⅱ：TTSuV2)。作为一种较为新型的病毒，TTSuV2的致病机理知之甚少。2004年，McKeown对中国，爱荷华州，泰国，安大略，韩国，西班牙，魁北克和萨斯喀彻温省这六个不同国家地区的154份猪血清进行检测，TTSuV2阳性率可高达66.2%(102/154)。Aramouni等证实了TTSuV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）和猪皮炎肾病综合征(PDNS)之间有一定的联系并发现TTSuV2与其他已知的猪病原体协同感染可以导致疾病加重。近年来，关于TTSuV2和TTSuV2的报道逐渐增多，TTSuV2的感染具有广泛性和普遍性，这一特点引起了诸多科研工作者的关注。因此，加强对TTSuV2的流行病学调查，确定其抗原性位点，对TTSuV2的防治有十分重要的意义。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，获得酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白作为包被抗原在用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中，提高试剂盒的特异性、重复性及稳定性。

本发明的另一目的在于提供一种酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，采用本发明的酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白作为包被抗原，以获得具有良好特异性、重复性和稳定性的TTSuV2抗体诊断试剂盒。

本发明的目的之四在于提供一种酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白在猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中的应用。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，其包括以下步骤：

1）TTSuV2 ORF1待表达片段的选择:以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LATaqDNA聚合酶扩增目的片段；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用ClustalX软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2 ORF1序列SEQ IDNO:3；

2）TTSuV2 ORF1’片段的选择：应用ProtScale氨基酸分析软件在上述的TTSuV2 ORF1序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的TTSuV2 ORF1’序列为SEQ ID NO:4的蛋白片段；

3）TTSuV2 ORF1’的酵母表达：构建插入TTSuV2 ORF1’的pPICZαA重组质粒，电转化P．pastoris X‐33酵母菌，筛选重组TTSuV2 ORF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段；

4）TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化：筛选出的高拷贝子，用50%硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2 ORF1’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白。

本发明中，步骤1）应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段的反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s,共30个循环；72℃延伸8min；反应完成后用1.0%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳。

本发明中，步骤3）的具体过程为：应用Primer Premier5.0设计引物SEQ IDNO:5和引物SEQ ID NO:6，以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZαA，连接，转化E.coli：DH5α后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZα‐TTSuV2 ORF1’，Sac I单酶切线性化；将酵母菌X‐33制备成感受态细胞，取出80μl感受态细胞与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，转入0.2cm电转杯，电转化，将菌液用1ml冰浴山梨醇l0倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30℃培养2～3d，在200-1000μg/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有1000μg/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25ml BMGY培养基，于30℃培养至OD_600nm≈4.0，离心、收集菌体，用100ml BMMY培养基重悬培养，每日取样1ml，并补加纯甲醇于培养基至终浓度为0.5％，诱导表达5d，取样品离心收集上清作SDS-PAGE分析，以Anti-HIS-antibody为第一抗体，Western Blotting获得真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段。

本发明中，所述Kod plus高保真酶的PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸40s,设置30个循环；68℃延伸8min。

本发明所述的酵母表达的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白作为包被抗原在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。

一种TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其包括用本发明所述的酵母表达的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白包被抗原包被的酶标板，100μlTTSuV2阳性对照血清，100μl TTSuV2阴性对照血清，100μl HRP标记兔抗猪二抗，100μl抗体稀释液、100μl显色液、100μl终止液以及洗脱液。

上述TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中，所述HRP标记兔抗猪二抗液是兔抗猪二抗与HRP保护液按照体积比为1﹕2000-5000的比例稀释；所述抗体稀释液为0.1%BSA1.0g加入PBS至1000ml；所述显色液为50mg TMB，10mLDMSO，9.8g柠檬酸和1.2ml 30%H₂O₂加蒸馏水定容至1000ml；所述终止液为双蒸水178.3mL和98%的浓硫酸21.7mL混合。

上述TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中所述酵母表达的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白包被抗原的包被浓度为0.25-1μg/ml。

本发明所述的酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白在猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明获得酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白作为包被抗原在用于TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中，提高试剂盒的特异性、重复性及稳定性。本发明获得的酵母表达的TTSuV2 ORF1截短蛋白还可以应用于猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1：酵母表达的TTSuV2 ORF1截短蛋白的SDS-PAGE及Western-blotting图：

a）泳道1：毕赤酵母分泌表达TTSuV2 ORF1’后的上清SDS-PAGE图（50%硫酸铵沉淀）；泳道2：毕赤酵母分泌表达TTSuV2 ORF1’后的上清SDS-PAGE图（未浓缩上清）；泳道3：毕赤酵母阴性对照上清SDS-PAGE图（转化分泌表达空质粒的阴性对照）；m1：非预染蛋白marker；

b）m2：蛋白预染marker；泳道1：毕赤酵母分泌表达TTSuV2 ORF1’后的上清Western-blotting图；泳道2：毕赤酵母阴性对照上清Western-blotting图；泳道3：纯化后的酵母表达的TTSuV2 ORF1’Western-blotting鉴定图；

c）泳道1：纯化后的酵母表达的TTSuV2 ORF1’SDS-PAGE图；泳道2：阴性对照；m1：非预染蛋白marker，图中箭头所指均为重组TTSuV2 ORF1’；

图2为本发明的免疫后血清OD值。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，

猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，包括以下步骤：

1）TTSuV2 ORF1待表达片段的选择:以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LATaqDNA聚合酶扩增目的片段，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s,共30个循环；72℃延伸8min；反应完成后用1.0%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用ClustalX软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2 ORF1序列SEQ IDNO:3；

2）TTSuV2 ORF1’片段的选择：应用ProtScale氨基酸分析软件在上述的TTSuV2 ORF1序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的TTSuV2 ORF1’序列为SEQ ID NO:4的蛋白片段；

3）TTSuV2 ORF1’的酵母表达：构建插入TTSuV2 ORF1’的pPICZαA重组质粒，电转化P．pastoris X‐33酵母菌，筛选重组TTSuV2 ORF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段；具体程序为：应用PrimerPremier5.0设计引物SEQ ID NO:5和引物SEQ ID NO:6，以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸40s,设置30个循环；68℃延伸8min；电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZαA，连接，转化E.coli：DH5α后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZα‐TTSuV2 ORF1’，Sac I单酶切线性化；将酵母菌X‐33制备成感受态细胞，取出80μl感受态细胞与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，转入0.2cm电转杯，电转化，将菌液用1ml冰浴山梨醇l0倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30℃培养2～3d，在200-1000μg/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有1000μg/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25ml BMGY培养基，于30℃培养至OD_600nm≈4.0，离心、收集菌体，用100ml BMMY培养基重悬培养，每日取样1ml，并补加纯甲醇于培养基至终浓度为0.5％，诱导表达5d，取样品离心收集上清作SDS-PAGE分析，以Anti-HIS-antibody为第一抗体，Western Blotting获得真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段；

4）TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化：筛选出的高拷贝子，用50%硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2 ORF1’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白。

应用实施例1

酵母表达的TTSuV2 ORF1截短蛋白在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用，具体步骤如下：

1）抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

采用棋盘滴定法，将纯化的酵母表达的TTSuV2 ORF1截短蛋白在酶标板上从左到右以起始浓度为4μg/ml按照在后的孔浓度为在先孔浓度的1/2的梯度浓度稀释包被酶标板，最后一列作为空白对照；每孔100μL，37℃放置1小时；用PBST洗板1次，每孔加入10％羔羊血清，37℃封闭1小时，阳性对照血清和阴性对照血清分别进行梯度稀释，自上而下加入到反应板中，每孔加入100μl，最后一行为无血清对照，37℃反应1小时，PBST洗涤3次，每孔加入100μl的HRP标记兔抗猪二抗，37℃反应1小时，PBST洗涤3次，，每孔加入底物显色液100μl，避光显色10分钟，每孔加入100μl终止液，于450nm处读数仪读取OD值，620nm作为参考波长。结果确立包被抗原的最佳包被浓度为0.25-1μg/ml，血清最佳稀释倍数为10-100倍；

2）试剂盒的组装与优化：将纯化的酵母表达的TTSuV2 ORF1截短蛋白稀释到0.25-1μg/mL，加到酶标板上，每孔100μL，4℃包被6-8小时或37℃1小时，用PBST洗板1次，每孔加入含10％羔羊血清的PBST，37℃封闭1小时。将待检血清样品用PBST稀释10-100倍，加到酶标板上，每孔100μL，设置阴性和阳性对照，37℃反应1小时，PBST洗涤3次，每孔加入100μL 2000-5000倍稀释的HRP标记兔抗猪二抗，37℃反应1小时，PBST洗涤3次，每孔加入底物显色液100μL，避光显色3-10分钟，每孔加入100μl终止液，于450nm处读数仪读取OD值，620nm作为参考波长。

应用实施例2

应用本发明的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒检测血清：

（1）将酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白用稀释至0.25μg/mL，加到酶标板上，每孔100μl，4℃包被过夜6-8小时，用PBST洗板1次，每孔加入含10％羔羊血清的PBST，37℃封闭1小时；

（2）将待检血清样品用PBST稀释40倍，加到酶标板上，每孔100μl，设置阴性和阳性对照，37℃反应1小时，所有样本均设置两个重复；

（3）PBST洗涤3次，每孔加入100μl 3000倍稀释的HRP标记兔抗猪二抗，37℃反应1小时，PBST洗涤3次，每孔加入底物显色液100μl，避光显色8分钟，每孔加入100μl终止液，于450nm处读数仪读取OD值，重复实验两次，结果如下表1：

表1:应用TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒检测72份血清样品所对应的平均OD值

表1中，*为阴性对照的平均值，**为阳性对照的平均值。

根据试剂盒判定标准，TTSuV2抗体阳性率为35%。诊断试剂批间与批内重复性良好，变异系数小于12.5%（行业规定标准为小于15%）。

应用实施例3

酵母表达的TTSuV2ORF1截短蛋白作为亚单位疫苗的应用：

1）应用PCR的方法检测两月龄健康仔猪血清，筛选TTSuV2结果为阴性的猪；用本发明的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒进一步筛选出TTSuV2抗体为阴性的猪10只；随机将10只猪分为2组，每组5只；

2）搜集含有酵母表达的TTSuV2 ORF1’蛋白的酵母细胞表达上清和pPICZα空质粒转化筛选的酵母细胞上清，与疫苗用矿物油佐剂混合，均质乳化至油包水；

3）免疫筛选好的两组仔猪，设其中一组为阴性对照组，颈部注射含有对照上清的乳化物；另一组注射含有重组TTSuV2 ORF1’的乳化物。注射量为：1mL/只，四周后加强免疫一次。耳静脉采血，搜集免疫前（0周）和一免后第3、4和二免后第3、4周的血液样品，分离血清，用本实验室原核表达纯化的TTSuV2ORF1蛋白包被酶标板检测实验猪血清中的TTSuV2 ORF1抗体水平。

如图2所示，与阴性对照相比，利用重组TTSuV2 ORF1’免疫猪一次后（第四周），TTSuV2抗体有显著提高，由于TTSuV 2ORF1是TTSuV2唯一的结构蛋白，该结果说明截短的TTSuV2 ORF1’是TTSuV2刺激动物产生抗体的结构域之一，有制备TTSuV2亚单位疫苗的应用价值。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法，其特征在于其包括以下步骤：

1)TTSuV2 ORF1待表达片段的选择:以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LATaqDNA聚合酶扩增目的片段；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用Clustal X软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2 ORF1序列SEQ IDNO:3；

2)TTSuV2 ORF1’片段的选择：应用ProtScale氨基酸分析软件在上述序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的序列为SEQ IDNO:4的蛋白片段TTSuV2 ORF1’；

3)TTSuV2 ORF1’的酵母表达：构建插入TTSuV2 ORF1’的pPICZαA重组质粒，电转化P.pastoris X-33酵母菌，筛选重组TTSuV2 ORF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段；

4)TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化：筛选出的高拷贝子，用50％硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2 ORF1’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白。

2.根据权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法，其特征在于：步骤1)应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段的反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s,共30个循环；72℃延伸8min；反应完成后用1.0％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳。

3.根据权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法，其特征在于：步骤3)的具体过程为：应用Primer Premier5.0设计引物SEQ ID NO:5和引物SEQ ID NO:6，以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZαA，连接，转化E.coli：DH5α后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZα‐TTSuV2 ORF1’，Sac I单酶切线性化；将酵母菌X‐33制备成感受态细胞，取出80μl感受态细胞与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，转入0.2cm电转杯，电转化，将菌液用1ml冰浴山梨醇l0倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30℃培养2～3d，在200-1000μg/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有1000μg/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25ml BMGY培养基，于30℃培养至OD_600nm≈4.0，离心、收集菌体，用100ml BMMY培养基重悬培养，每日取样1ml，并补加纯甲醇于培养基至终浓度为0.5％，诱导表达5d，取样品离心收集上清作SDS-PAGE分析，以Anti-HIS-antibody为第一抗体，Western Blotting获得真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段。

4.根据权利要求3所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法，其特征在于：所述Kod plus高保真酶的PCR扩增反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸40s,设置30个循环；68℃延伸8min。

5.权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白作为包被抗原在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。

6.一种TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于：其包括用权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白包被抗原包被的酶标板，100μl TTSuV2阳性对照血清，100μl TTSuV2阴性对照血清，100μl HRP标记兔抗猪二抗，100μl抗体稀释液、100μl显色液、100μl终止液以及洗脱液。

7.根据权利要求6所述的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述HRP标记兔抗猪二抗液是兔抗猪二抗与HRP保护液按照体积比为1﹕2000-5000的比例稀释；所述抗体稀释液为0.1％BSA1.0g加入PBS至1000ml；所述显色液为50mg TMB，10mL DMSO，9.8g柠檬酸和1.2ml 30％H₂O₂加蒸馏水定容至1000ml；所述终止液为双蒸水178.3mL和98％的浓硫酸21.7mL混合。

8.根据权利要求6所述的TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述的TTSuV2-ORF1截短蛋白包被抗原的包被浓度为0.25-1μg/ml。

9.权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达方法表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白在猪Ⅱ型细环病毒亚单位疫苗中的应用。