KR101320192B1 - 토크 테노 바이러스(ｔｔｖ) 분리물 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 토크 테노 바이러스("TTV")의 신규 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(이들의 신규 유전자형을 포함함)에 관한 것으로, 이들은 모두 돼지 및 다른 동물에서 질병을 치료 및 예방하기 위한 백신의 제조에 유용하다. 본 발명의 실시에 따라 제공된 백신은 다중 돼지 TTV 유전자형 및 분리물에 대해 효과적이다. 바이러스의 증식 및 백신의 제조에 유용한 감염성 클론과 마찬가지로, 진단 및 치료용 다클론성 및 단클론성 항체도 본 발명의 한 특징이다. 본 발명의 특히 중요한 측면은 TTV ORF1 단백질 또는 이의 펩티드 단편을 항원으로 제공하는 백신을 포함한다.
Description
본 출원은 35 USC 119 항에 의거하여 2008년 10월 16일자로 출원된 미국 가출원 제 61/196,468 호에 대해 이점 및 우선권을 주장한다. 본원의 미국 국내 단계를 위해, 상기 제 61/196,468 호 출원의 전체 내용은 완전히 기재된 것처럼 본원에 전체로서 도입된다.
본 발명은 토크 테노 바이러스(Torque teno virus, "TTV")의 신규 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(이들의 신규 유전자형을 포함함)에 관한 것으로, 이들은 모두 돼지 및 다른 동물에서 질병을 치료 및 예방하기 위한 백신의 제조에 유용하다. 본 발명의 실시에 따라 제공된 백신은 다중 돼지 TTV 유전자형 및 분리물에 대해 효과적이다. 바이러스의 증식 및 백신의 제조에 유용한 감염성 클론과 마찬가지로, 진단 및 치료용 다클론성 및 단클론성 항체도 또한 본 발명의 한 특징이다. 특히 중요하게, 단일 TTV 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF), 가장 특히는 ORF1 또는 OFR2로부터 발현된 단백질, 및 또한 전장 ORF1 및ORF2-암호화된 단백질의 단편을 항원으로 포함하는 백신이 개시되어 있다.
수혈로 전염되는 바이러스로도 지칭되는 토크 테노 바이러스("TTV")는 일반적으로 써코바이러스과(Circoviridae) 부류로 지정된다. 일반적으로, TTV는 인간 수혈 환자에서 처음 분리된 것으로 인지되어 있다(예를 들면, 문헌[Nishizawa et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. vol. 241, pp.92-97 (1997)] 참조). 이어서, TTV 또는 TTV-유사 바이러스들이 돼지를 포함한 다른 포유동물들로부터 동정되었으며, 많은 균주 또는 분리물이 발표되었다(예를 들면, 문헌[McKeown et al., Vet. Microbiol. vol. 104, pp113-117 (2004)] 참조).
후속 연구에 의해 TTV 및 TTV-유사 바이러스가 매우 보편적인 것으로 밝혀졌지만, TTV의 발병 및 다른 질병 상태(예를 들면, 다른 바이러스 및 세균에 의해 야기된 질병들)에 미칠 수 있는 연관성은 불확실하게 남아있다. 예를 들면, TTV 감염은 심지어 건강한 개개인을 포함하여 인간에서 보편적인 것으로 보이며, 상기 감염은 종종 무증상이며, 수년 동안 유지될 수 있다. 또한, 일반적으로 세포 배양물중에서 바이러스를 증식시킬 수 없다는 사실 및 임의의 명확한 질병 기작 모델의 결여로 인해 TTV 생물학의 종합적인 특징규명이 곤란하였다. TTV 바이러스혈증이 다른 바이러스 질병(예를 들면, 간염 또는 HIV/AIDS)에 걸린 인간 환자에서 증가하고 있음에도 불구하고, TTV가 사실상 무독성임을 제시하는 의료 문헌들이 또한 상당하며, 공지된 질병과 임의의 분명한 실제적인 연관성을 찾고 있다(예를 들면, 문헌[Biagini et al., Vet. Microbiol. vol. 98, pp.95-101 (2004)] 참조).
돼지에 있어서도, 상황은 유사하다. TTV 감염이 돼지 써코바이러스 질병(및 이의 다양한 임상 징후, 예를 들면, 이유후 전신성 소모성 증후군 및 폐 병변에 의해 악화된 호흡기 질환), 및 PRRSV-관련 질환(돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스)와 같은 많은 질병과 관련되며 이들 질병에 관여함을 제시하는 연구가 많다(예를 들면, 국제특허출원 공개 제 WO 2008/150275 호 및 제 WO 2008/127279 호 참조). 크래코우카 등(Krakowka et al.)은 또한 파종성 혈관내 응고의 징후로서 설명되며 혈청형 1 TTV 및 PRRSV 바이러스에 의한 복합 감염이 아마 관련되었을 PDNS(돼지 피부염 및 신경병 증후군)로 지칭되는, 돼지에서 흔한 치명적 질병에 대해 보고하고 있다(문헌[Am. J. Vet Res, vol 69(12), pp.1615-1622 (2008)]). PDNS 질병은 또한 돼지 써코바이러스 질병(특히 PCV-2) 및 또한 세균 감염과 상관되었다. 따라서, 많은 연구가 이루어졌지만, 돼지 TTV 감염을 특정 병리학과 결정적으로 상관시키는 연구는 거의 없다. 그럼에도 불구하고, TTV 감염이 많은 질병을 가능케할 수 있음이 상당히 확실해졌다. 따라서, 총체적인 TTV 생물학에 대한 이해를 보완시키고 TTV가 관여할 수 있는 많은 질병 상태에 대해 직접 또는 간접적으로 예방접종하기 위해, 다양한 부류의 TTV 시약, 예를 들면, 고친화도 항체, 및, 예를 들면, 고도로 면역화하는 TTV의 펩티드 단편 또는 전체 비리온이 필요하다.
따라서, TTV가 돼지에서 질병의 근본 원인 인자일 가능성이 존재하지만, 많은 돼지 질병이 하나보다 많은 바이러스의 존재를 필요로 하거나, 또는 특정 "주요" 병원체의 주된 효과가 TTV 감염에 의해 강화될 것으로 보인다. 언급했듯이, 돼지의 많은 질병이 감염되었거나 잠재적으로 감염된 동물에게 항-TTV 약제를 투여함으로써 치료되거나 완화될 수 있다. TTV에 대한 잘 알려진 관심에도 불구하고, 효과적인 백신은 나타나지 않았다.
TTV는 음성 극성의 단일 가닥 원형 DNA로 이루어진 소형의 비-외피(non-enveloped) 바이러스이다. 게놈은 중복되는 3개의 주 오픈 리딩 프레임, 즉 ORF1, ORF2 및 ORF3을 포함하며, ORF1은 캡시드 단백질을 암호화한다(문헌[Biagini et al., Vet. Microbiol. vol. 98, pp.95-101 (2004)]). 그 상세한 고찰을 위해서는 본원에 참고로 도입된 하기 참조문헌들을 참조한다: 문헌[Kakkola et al., Virology, vol. 382, pp.182-189 (2008); Mushahwar et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, vol 96, pp.3177-3182 (1999)]; 및 2008 년호로 2007년 12월 13일에 승인된 문헌[T. Kekarainen and J. Segales, "Torque teno virus infection in the pig and its potential role as a model of human infection", The Veterinary Journal].
비교적 단순한 게놈에도 불구하고, 바이러스를 세포 배양물중에서 또는 다른 시험관내 방법으로 증식시키는 것은 일반적으로 매우 어려웠다. 본 발명은 감염성 클론을 포함하여 TTV를 시험관내에서 증식시킬 수 있는 재조합체 구조물에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 효과적인 백신이 사실상, 가장 특히는 TTV 항원이 단일 ORF의 발현 산물 또는 이의 단편인 경우, TTV로부터 제조될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 바람직한 태양에서, 본 발명은 ORF1 단백질 백신을 제공한다.
본 발명은 TTV에 의해 직접 야기된 질병 상태 및 TTV에 관여되거나 TTV에 의해 악화될 수 있는 질병 상태를 포함하여, 동물에서 토크 테노 바이러스(TTV)에 의한 감염에 의해 야기된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직한 예에서, 치료되는 동물은 돼지이다. TTV에 의해 악화될 수 있고 또한 본 발명의 실시에 따라 치료되거나 예방될 수 있는 돼지에서의 질병 상태에는 돼지 써코바이러스(PCV), 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRS)에 의해 야기되거나 이들과 관련된 질병이 포함된다.
본 발명은 또한 적절한 보조제를 선택하여 비-TTV 병원체에 대한 생독 항원, 변형된 생독 항원 또는 불활성화 항원을 포함할 수 있는 항원들의 2가 또는 다가 조합물인 복합 백신을 투여하는 방법을 포함한다.
부분적으로 본원에 개시된 바와 같은 고유의 TTV 아미노산 서열을 근거로, 본 발명은 또한 전술한 TTV 백신으로 백신접종된 돼지와 야생 TTV 균주로 감염된 돼지를 구별하기 위한 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 대표적인 태양은 하기 (a1) 내지 (g)로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a1) 유전자형 2 서열 TTV13(서열번호: 2)의 DNA; 유전자형 2 서열 TTV10(서열번호: 1)의 DNA; 또는 TTV 캡시드 단백질 또는 이 단백질의 단편을 암호화하는 상기 DNA의 단편;
(a2) ttvg1-7(서열번호: 4), ttvGT1-17(서열번호: 5), ttvGT1-21(서열번호: 6), ttvgt1-27(서열번호: 3), ttvgt1-178(서열번호: 7)로 이루어진 군에서 선택된 유전자형 1 서열의 DNA, 또는 TTV 캡시드 단백질 또는 이 단백질의 단편을 암호화하는 상기 DNA의 단편;
(b) (a)에 기재된 폴리뉴클레오티드의 상보체;
(c) 65 ℃에서 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA 중에서 필터 결합된 DNA에 혼성화시키고 68 ℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 것으로 정의되는 엄격한 조건하에서 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드;
(d) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드;
(e) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드;
(f) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 90% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드; 및
(g) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 95% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드.
본 발명은 또한 임의의 상기 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 상보체인 RNA 폴리뉴클레오티드 분자, 및 임의의 상기 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 벡터 및 플라스미드, 및 상기 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 TTV 바이러스를 제공하며, 이때 상기 바이러스는 생바이러스이거나 또는 완전히 또는 부분적으로 약독화된 바이러스이다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열, 및 감염성 클론으로 작용하는 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 백신을 제공한다.
본 발명은 유전자형 2 TTV13(서열번호: 2) 또는 유전자형 2 TTV10(서열번호: 1) 폴리뉴클레오티드의 임의의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드 또는 이의 단편과 90% 이상 동일하고 경우에 따라 추가의 다른 동일한 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되어 있는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 (모두 혈청형 1) ttvg1-7(서열번호: 10), ttvGT1-17(서열번호: 11), ttvGT1-21(서열번호: 12), ttvgt1-27(서열번호: 13) 및 ttvgt1-178(서열번호: 9) ORF1 폴리뉴클레오티드의 임의의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드 또는 이의 단편과 90% 이상 동일하고 경우에 따라 추가의 다른 동일한 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되어 있는 폴리펩티드를 제공한다.
당해 분야에 보고된 바와 같이 계속되는 실패에도 불구하고, TTV에 대해 효과적인 백신을 제공하기 위해(또는 다른 질병을 악화시키는 TTV의 능력을 제한하기 위해), 본 발명은 바람직하게는 단일 TTV 오픈 리딩 프레임의 발현으로부터 생성된 폴리펩티드 또는 이의 혼합물을 포함하는 상기 효과적인 백신을 제공한다. 바람직한 태양에서, 폴리펩티드는 ORF1으로부터 발현되며, 바람직한 혼합물은 ORF1과 ORF2의 폴리펩티드 조합물, 및 ORF1과 ORF3의 폴리펩티드 조합물을 포함한다.
보다 바람직한 태양에서 본원에 개시된 실질적인 폴리펩티드 서열 정보의 이점을 이용할 때, 항원이 (a) TTV13(서열번호: 2) 또는 TTV10(서열번호: 1)의 캡시드 단백질의 처음 100개 N-말단 아미노산 서열; 또는 (b) 이 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열; 또는 (c) 이들의 아르기닌 풍부 영역에 의해 정의되는 폴리펩티드 백신도 제공된다.
도 1(패널 A 및 B)은 면역학적 방법에 의한 ORF1 단백질의 검출을 나타낸다.
도 2는 친화성 정제를 위해 6X His 표지를 사용하여, 이. 콜라이(E. coli)에서 코돈-최적화 TTVg1 ORF1 단백질의 성공적 발현을 입증한다.
도 3은 백신접종용 ORF1 단백질을 발현하는 (CHO 세포내의 인공 염색체내로 도입된 후) 크로모스(Chromos) 구조물 pcTV-TTV1-7 ORF1(및 효모 인버타제(invertase)) 발현 플라스미드에 대한 벡터 지도를 제공한다.
도 4는 동일성%의 편집을 포함하는 다양한 TTV 균주들에 대한 계통수를 제공한다.
도 5(패널 A, B 및 C)는 다양한 TTV 분리물로부터 발현된 바와 같은 ORF1 단백질의 공통 아르기닌 풍부 영역의 동정을 제공한다.
도 6은 조립되었을 때 TTVg1-178에 대한 벡터 지도를 제공한다.
도 7은 크로모스-발현된 g1TTV ORF1이 챌린지(challenge) 대조군에 비해 폐 병변을 상당히 감소시켰으며 또한 챌린지 대조군에 비해 g1TTV 바이러스혈증의 정도 및 기간을 감소시킴을 보여준다.
서열목록의 간단한 설명
서열번호: 1은 유전자형 gt2 TTV 10 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 2는 유전자형 2 gt2 TTV 13 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 3은 유전자형 1 ttvgt1-27 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 4는 유전자형 1 ttvgt1-7 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 5는 유전자형 1 ttvgt1-17 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 6은 유전자형 1 ttvgt1-21 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 7은 유전자형 1 ttvg1-178 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 8은 TTV 균주 AY823991 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 9는 TTV 균주 ttvgt1-178 ORF1(TTV 유전자형 1)의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 10은 TTV 균주 ttvgt1-7 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 11은 TTV 균주 ttvgt1-17 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 12는 TTV 균주 ttvgt1-21 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 13은 TTV 균주 ttvgt1-27 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 14는 TTV 균주 gt2 TTV10 ORF1(유전자형 2)의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 15는 TTV 균주 gt2 TTV13 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 16은 공지된 균주 AY823991, 유전자형 2의 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 17은 공지된 균주 AY823990, 유전자형 1의 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 18은 pUC57 젠스크립트(GenScript, 등록상표) 벡터 내에 클로닝될 때 이. 콜라이에 대해 최적화된 76057-3 TTV 캡시드 암호화 서열 코돈을 제공한다.
서열번호: 19는 인비트로겐(Invitrogen) pET101/D-토포(TOPO, 등록상표) 발현 플라스미드 내에 클로닝될 때 이. 콜라이에 대해 최적화된 76057-4 TTV 캡시드 암호화 서열, 코돈을 제공한다.
서열번호: 20은 pUC57 젠스크립트(등록상표) 벡터 내에 클로닝될 때 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 대해 최적화된 76057-5 TTV 캡시드 암호화 서열, 코돈을 제공한다.
서열번호: 21은 효모 인버타제 발현 표지(YI) 하에 ttvgt1-7 ORF1을 암호화하는 구조물에 대한 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 22는 아미드화 형태의 C-말단 아미노산과 함께 사용되는, 잔기 167 내지 185에 상응하는 ORF1 캡시드 단백질로부터의 ttvgt1 펩티드 서열(상응하는 AY823990 서열을 기준으로 번호매김)을 제공한다.
서열번호: 23은 잔기 459 내지 479에 상응하는 ORF1 캡시드 단백질로부터의 ttvgt1 펩티드 서열(상응하는 AY823990 서열을 기준으로 번호매김)을 제공한다.
서열번호: 24는 잔기 612 내지 637에 상응하는 ORF1 캡시드 단백질로부터의 ttvgt1 펩티드 서열(상응하는 AY823990 서열을 기준으로 번호매김)을 제공한다.
서열번호: 25는 TTV 균주 AY823990 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 26 내지 29는 프라이머 서열을 정의한다.
서열들에 대한 어구들과 관련하여, 당해 분야에 익숙한 어구들은 많은 약간 상이한 약자들이 일반적으로 특정 혈청형에 대해 상호교환적으로, 예를 들면, g1TTV, TTVg1, 유전자형 1 TTV, 혈청형 1 TTV, gt1TTV 등으로 사용됨을 인지할 것이다. 유전자형 2에 대해서도 유사한 상황들이 존재한다.
도 2는 친화성 정제를 위해 6X His 표지를 사용하여, 이. 콜라이(E. coli)에서 코돈-최적화 TTVg1 ORF1 단백질의 성공적 발현을 입증한다.
도 3은 백신접종용 ORF1 단백질을 발현하는 (CHO 세포내의 인공 염색체내로 도입된 후) 크로모스(Chromos) 구조물 pcTV-TTV1-7 ORF1(및 효모 인버타제(invertase)) 발현 플라스미드에 대한 벡터 지도를 제공한다.
도 4는 동일성%의 편집을 포함하는 다양한 TTV 균주들에 대한 계통수를 제공한다.
도 5(패널 A, B 및 C)는 다양한 TTV 분리물로부터 발현된 바와 같은 ORF1 단백질의 공통 아르기닌 풍부 영역의 동정을 제공한다.
도 6은 조립되었을 때 TTVg1-178에 대한 벡터 지도를 제공한다.
도 7은 크로모스-발현된 g1TTV ORF1이 챌린지(challenge) 대조군에 비해 폐 병변을 상당히 감소시켰으며 또한 챌린지 대조군에 비해 g1TTV 바이러스혈증의 정도 및 기간을 감소시킴을 보여준다.
서열목록의 간단한 설명
서열번호: 1은 유전자형 gt2 TTV 10 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 2는 유전자형 2 gt2 TTV 13 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 3은 유전자형 1 ttvgt1-27 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 4는 유전자형 1 ttvgt1-7 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 5는 유전자형 1 ttvgt1-17 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 6은 유전자형 1 ttvgt1-21 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 7은 유전자형 1 ttvg1-178 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 8은 TTV 균주 AY823991 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 9는 TTV 균주 ttvgt1-178 ORF1(TTV 유전자형 1)의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 10은 TTV 균주 ttvgt1-7 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 11은 TTV 균주 ttvgt1-17 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 12는 TTV 균주 ttvgt1-21 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 13은 TTV 균주 ttvgt1-27 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 14는 TTV 균주 gt2 TTV10 ORF1(유전자형 2)의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 15는 TTV 균주 gt2 TTV13 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 16은 공지된 균주 AY823991, 유전자형 2의 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 17은 공지된 균주 AY823990, 유전자형 1의 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 18은 pUC57 젠스크립트(GenScript, 등록상표) 벡터 내에 클로닝될 때 이. 콜라이에 대해 최적화된 76057-3 TTV 캡시드 암호화 서열 코돈을 제공한다.
서열번호: 19는 인비트로겐(Invitrogen) pET101/D-토포(TOPO, 등록상표) 발현 플라스미드 내에 클로닝될 때 이. 콜라이에 대해 최적화된 76057-4 TTV 캡시드 암호화 서열, 코돈을 제공한다.
서열번호: 20은 pUC57 젠스크립트(등록상표) 벡터 내에 클로닝될 때 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 대해 최적화된 76057-5 TTV 캡시드 암호화 서열, 코돈을 제공한다.
서열번호: 21은 효모 인버타제 발현 표지(YI) 하에 ttvgt1-7 ORF1을 암호화하는 구조물에 대한 DNA 서열을 제공한다.
서열번호: 22는 아미드화 형태의 C-말단 아미노산과 함께 사용되는, 잔기 167 내지 185에 상응하는 ORF1 캡시드 단백질로부터의 ttvgt1 펩티드 서열(상응하는 AY823990 서열을 기준으로 번호매김)을 제공한다.
서열번호: 23은 잔기 459 내지 479에 상응하는 ORF1 캡시드 단백질로부터의 ttvgt1 펩티드 서열(상응하는 AY823990 서열을 기준으로 번호매김)을 제공한다.
서열번호: 24는 잔기 612 내지 637에 상응하는 ORF1 캡시드 단백질로부터의 ttvgt1 펩티드 서열(상응하는 AY823990 서열을 기준으로 번호매김)을 제공한다.
서열번호: 25는 TTV 균주 AY823990 ORF1의 아미노산 서열을 제공한다.
서열번호: 26 내지 29는 프라이머 서열을 정의한다.
서열들에 대한 어구들과 관련하여, 당해 분야에 익숙한 어구들은 많은 약간 상이한 약자들이 일반적으로 특정 혈청형에 대해 상호교환적으로, 예를 들면, g1TTV, TTVg1, 유전자형 1 TTV, 혈청형 1 TTV, gt1TTV 등으로 사용됨을 인지할 것이다. 유전자형 2에 대해서도 유사한 상황들이 존재한다.
하기의 정의 및 소개되는 사항들은 명세서에 적용가능하다.
용어 "돼지(porcine)" 및 "돈(swine)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 예를 들면, 돼지(pig)와 같은 멧돼지과(family Suidae)의 일원인 임의의 동물을 말한다. "포유동물"은 인간을 포함하여 포유류의 임의의 온혈 척추동물을 포함한다.
본 발명에 있어서, "감염성 DNA 분자"는 바이러스 복제, 전사, 및 적당한 숙주 세포에서 기능성 비리온으로의 번역에 필수 요소를 암호화하는 DNA 분자이다.
유사하게, "분리된 폴리뉴클레오티드 분자"는, 존재하는 경우, 그의 천연 상태로부터 임의의 검출가능한 정도로 정제된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 물질의 조성물을 말한다.
본 발명에 있어서, 제 2 폴리뉴클레오티드 분자(RNA든지 또는 DNA든지)의 뉴클레오티드 서열은, 제 2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열이 유전자 코드의 동의성을 기준으로 할 때 제 1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 동일한 폴리아미노산을 암호화하는 경우, 또는 상기 제 2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열이 본 발명을 실시하기에 유용하도록 하기 위해 제 1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리아미노산과 충분히 유사한 폴리아미노산을 암호화하는 경우, 제 1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 "상동성"이거나, 또는 상기 제 1 폴리뉴클레오티드 분자와 "동일성"을 갖는다. 상동성 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 센스 및 안티-센스 가닥을 말하며, 모든 경우에서 임의의 상기 가닥들의 상보체를 말한다. 본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명을 실시하는데 유용하므로 상동성이거나 동일성을 가지며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 감염된 돼지의 체액 또는 조직 샘플에서, 예를 들면, 표준 혼성화 또는 증폭 기술에 의해, TTV 바이러스 또는 바이러스성 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 진단용 프로브로 사용될 수 있다. 일반적으로, 제 2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은, BLASTN 알고리즘(미국 국립 보건원의 국립 생물기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, 달리 NCBI로도 알려짐)(미국 메릴랜드주 베데스다))을 근거로 제 1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 경우, 제 1 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 상동성이다. 본 발명의 실시에 따른 산출을 위한 특정 예에서, BLASTP 2.2.6[Tatusova TA and TL Madden, "BLAST 2 sequences- a new tool for comparing protein and nucleotide sequences." FEMS Microbiol Lett. 174:247-250 (1999)]이 언급된다. 간략하게, 10의 끊김 벌점(gap opening penalty), 0.1의 끊김 확장 벌점(gap extention penalty) 및 헤니코프 앤 헤니코프(Henikoff and Henikoff)의 "블로섬(blosum)62" 측정 행렬[Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992)]을 사용하여 정렬 스코어를 최적화하기 위해 2개의 아미노산 서열을 정렬시킨다. 이어서, 동일한 짝들의 총 수에 100을 곱한 값을 더 긴 서열의 길이에 두 서열을 정렬시키기 위해 더 긴 서열내로 도입된 끊김의 수를 더한 값으로 나눈 값으로서 동일성%를 계산한다.
바람직하게, 상동성 뉴클레오티드 서열은 약 75% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 약 80%, 85%, 90% 및 95% 이상의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 유전자 코드가 축퇴성을 나타내기 때문에, 상동성 뉴클레오티드 서열은 임의 수의 "침묵" 염기 변화, 즉, 여전히 동일한 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다.
상동성 뉴클레오티드 서열은 또한, 서열이 제 1 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리아미노산과 약 70% 이상 동일하거나 또는 본 발명의 실시에 유용한 한, 비-침묵 돌연변이, 즉, 암호화된 폴리아미노산에 아미노산 차이를 야기하는 염기 치환, 결실 또는 부가를 함유할 수 있다. 이와 관련하여, 일반적으로 전체 단백질 기능을 불활성화시키지 않는 것으로 인지되는 특정 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다: 예를 들면, 양으로 하전된 아미노산(역으로도 가능)의 경우, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; 음으로 하전된 아미노산(역으로도 가능)의 경우, 아스파트산 및 글루탐산; 및 특정한 군의 중성으로 하전된 아미노산(모든 경우에서, 또한 역으로도 가능)의 경우, (1) 알라닌 및 세린, (2) 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘, (3) 시스테인 및 세린, (4) 글라이신 및 프롤린, (5) 이소류신, 류신 및 발린, (5) 메티오닌, 류신 및 이소류신, (6) 페닐알라닌, 메티오닌, 류신 및 티로신, (6) 세린 및 트레오닌, (7) 트립토판 및 티로신, 및 (8) 예를 들면, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌.
상동성 뉴클레오티드 서열은, 예를 들면, 상기 BLASTN을 사용하여 뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 또는, 상동성 뉴클레오티드 서열은 선별된 조건하에서의 혼성화에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 제 2 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은, 이 서열이 중등도로 엄격한 조건하에서, 예를 들면, 65 ℃에서 0.5M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 및 1mM EDTA 중에서 필터-결합 DNA에 혼성화시키고 42 ℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 것으로서 정의되는 조건하에서(문헌[Ausubel et al editors, Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, pp.6.0.3 to 6.4.10 (1994)] 참조), 또는 달리 하기에서 정의하는 바와 같은 TTV 바이러스를 암호화하는 서열들의 혼성화를 야기하는 조건하에서 서열번호: 1의 상보체에 혼성화하는 경우 서열번호: 1(또는 임의의 다른 특정 폴리뉴클레오티드 서열)에 대해 상동성을 나타낸다. 혼성화 조건의 변형은 실험적으로 결정되거나 또는 프로브의 구아노신/시토신(GC) 염기쌍의 길이 및 퍼센트를 기준으로 정확하게 계산될 수 있다. 혼성화 조건은 문헌[Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, pp. 9.47 to 9.51 (1989)]에 기술된 바와 같이 계산할 수 있다.
또 다른 태양에서, 제 2 뉴클레오티드 서열은, 이 서열이 매우 엄격한 조건하에서, 예를 들면, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 65 ℃에서 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA 중에서 필터-결합 DNA에 혼성화시키고 68 ℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 것으로서 정의되는 조건하에서 서열번호: 1의 상보체에 혼성화하는 경우 서열번호: 1(또는 본 발명의 임의의 다른 서열)에 대해 상동성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 분리된 RNA 분자는 합성 분자, 및 시험관내 클로닝 및 전사와 같은 재조합 기술을 통해 수득된 분자 둘 다를 포함하는 것임을 이해해야 한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드
본 발명의 대표적인 태양은 하기 (a1) 내지 (g)의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a1) 유전자형 2 서열 TTV13(서열번호: 2)의 DNA; 유전자형 2 서열 TTV10(서열번호: 1)의 DNA; 또는 TTV 캡시드 단백질 또는 이 단백질의 단편을 암호화하는 상기 DNA의 단편;
(a2) ttvg1-7(서열번호: 4), ttvGT1-17(서열번호: 5), ttvGT1-21(서열번호: 6), ttvgt1-27(서열번호: 3), ttvgt1-178(서열번호: 7)로 이루어진 군에서 선택된 유전자형 1 서열의 DNA; 또는 TTV 캡시드 단백질 또는 이 단백질의 단편을 암호화하는 상기 DNA의 단편;
(b) (a)에 기재된 폴리뉴클레오티드의 상보체;
(c) 65 ℃에서 0.5M NaHPO4, 7% SDS 및 1mM EDTA 중에서 필터 결합된 DNA에 혼성화시키고 68 ℃에서 0.1xSSC/0.1% SDS 중에서 세척하는 것으로 정의되는 엄격한 조건하에서 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드;
(d) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드;
(e) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 80% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드;
(f) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 90% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드; 및
(g) (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오티드와 95% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드.
본 발명은 유전자형 2 TTV13(서열번호: 2) 또는 유전자형 2 TTV10(서열번호: 1) 폴리뉴클레오티드의 임의의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드 또는 이의 단편과 90% 이상 동일하고 경우에 따라 추가의 다른 동일한 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되어 있는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 (모두 혈청형 1) ttvg1-7(서열번호: 10), ttvGT1-17(서열번호: 11), ttvGT1-21(서열번호: 12), ttvgt1-27(서열번호: 13) 및 ttvgt1-178(서열번호: 9) ORF1 폴리뉴클레오티드의 임의의 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드 또는 이의 단편과 90% 이상 동일하고 경우에 따라 추가의 다른 동일한 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되어 있는 폴리펩티드를 제공한다.
바람직한 태양에서, 폴리펩티드는 OFR1으로부터 발현되며, 바람직한 혼합물은 ORF1과 ORF2, 및 ORF1과 ORF3의 폴리펩티드의 조합을 포함한다.
또 다른 바람직한 태양에서, 항원이 하기 (a) 내지 (f)의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 정의되는 TTV 폴리펩티드-기본 백신도 제공된다:
(a) TTV13(서열번호: 2) 또는 TTV10(서열번호: 1)의 ORF1 캡시드 단백질의 처음 300개 N-말단 아미노산, 또는 (b) 그와 90% 이상 동일한 아미노산 서열;
(b) TTV13(서열번호: 2) 또는 TTV10(서열번호: 1)의 ORF1 캡시드 단백질의 처음 200개 N-말단 아미노산, 또는 (b) 그와 90% 이상 동일한 아미노산 서열;
(c) TTV13(서열번호: 2) 또는 TTV10(서열번호: 1)의 ORF1 캡시드 단백질의 처음 100개 N-말단 아미노산, 또는 (b) 그와 90% 이상 동일한 아미노산 서열;
(d) (모두 혈청형 1) ttvg1-7(서열번호: 10), ttvGT1-17(서열번호: 11), ttvGT1-21(서열번호: 12), ttvgt1-27(서열번호: 13) 및 ttvgt1-178(서열번호: 9) 중 임의의 ORF1 캡시드 단백질의 처음 300개 N-말단 아미노산 또는 그와 90% 이상 동일한 폴리펩티드;
(e) (모두 혈청형 1) ttvg1-7(서열번호: 10), ttvGT1-17(서열번호: 11), ttvGT1-21(서열번호: 12), ttvgt1-27(서열번호: 13) 및 ttvgt1-178(서열번호: 9) 중 임의의 ORF1 캡시드 단백질의 처음 200개 N-말단 아미노산 또는 그와 90% 이상 동일한 폴리펩티드; 및
(f) (모두 혈청형 1) ttvg1-7(서열번호: 10), ttvGT1-17(서열번호: 11), ttvGT1-21(서열번호: 12), ttvgt1-27(서열번호: 13) 및 ttvgt1-178(서열번호: 9) 중 임의의 ORF1 캡시드 단백질의 처음 100개 N-말단 아미노산 또는 그와 90% 이상 동일한 폴리펩티드.
추가의 유전자 조작
본 발명에 의해 제공되는 DNA 및 아미노산 서열 정보는 또한 바이러스 유전자 및 이의 암호화된 유전자 산물의 구조 및 기능의 체계적 분석을 가능하게 한다. 본 발명의 바이러스 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 지식은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 인지하고 혼성화하는 안티-센스 폴리뉴클레오티드를 이용가능하게 한다. 이 점에 있어서 전장 및 단편 안티-센스 폴리뉴클레오티드가 유용하다. 통상의 기술을 가진 당업자라면 본 발명의 단편 안티-센스 분자가 (i) 특정 RNA(본 발명의 바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 서열 비교에 의해 결정된 바와 같은)를 특이적으로 인지하고 이 RNA에 혼성화하는 분자뿐만 아니라, (ii) 암호화된 단백질의 변이체를 암호화하는 RNA를 인지하고 이 RNA에 혼성화하는 분자를 포함함을 인지할 것이다. 다른 TTV 펩티드를 암호화하는 RNA/DNA에 혼성화하는 안티센스 폴리뉴클레오티드도 또한 분자들의 부류에 특징적 또는 시그니처(signatuer) 서열을 동정하기 위해 서열 비교를 통해 동정가능하다. 상기 기술(실시예 8 참조)은 TTV 폴리펩티드에서 항원 영역의 연구에도 사용되며, 써코바이러스과의 아주 약간 관련된 비-TTV 구성원에 의한 숙주 동물의 감염을 식별하는데에도 사용될 수 있다.
실시예 4는 본 발명의 구조물에 대해 효모 및 이. 콜라이에서 증대된 발현을 위한 효과적인 코돈 최적화에 대한 지침을 제공한다.
백신 제제
본 발명의 백신은 인간(적용가능한 경우)을 포함한 동물에 허용되는 담체, 예를 들면, 표준 완충제, 안정화제, 희석제, 방부제 및/또는 가용화제를 포함하는 허용된 관례에 따라 제제화될 수 있으며, 또한 지속적 방출을 용이하게 하도록 제제화될 수 있다. 희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함된다. 등장성을 위한 첨가제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 및 특히 락토스가 포함된다, 안정화제로는 특히 알부민이 포함된다. 다른 적합한 백신 비히클 및 첨가제는 변형 생백신을 제제화하는데 특히 유용한 것을 포함하여 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있거나 친숙할 것이다(예를 들면, 본원에 참고로 도입된 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., Mack Publishing, (1990)]을 참조한다).
본 발명의 백신은 또한 하나 이상의 추가의 면역조절 성분, 예를 들면, 특히 보조제 또는 사이토카인을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신에 사용될 수 있는 보조제의 비-제한 예로는 RIBI 보조제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.), 몬타나주 해밀턴), 알룸, 무기 겔, 예를 들면, 수산화알루미늄 겔, 수중유적형 유화액, 유중수적형 유화액, 예를 들면, 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제, 블록 공중합체(시트렉스(CytRx), 조지아주 아틀란타), QS-21(캠브리지 바이오테크 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 매사추세츠주 캠브리지), SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌), 암피젠(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제, 사포닌, 퀼(Quil) A 또는 다른 사포닌 분획물, 모노포스포릴 지질 A, 이온성 폴리사카라이드 및 아브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제가 포함된다. 본 발명의 백신에 유용한 수중유적형 유화액의 비-제한 예로는 변형된 심(SEAM)62 및 심 1/2 제제가 포함된다. 변형된 심62는 5%(v/v) 스쿠알렌(시그마(Sigma)), 1%(v/v) 스판(SPAN, 등록상표) 85 붕해제(ICI 서펙턴트(ICI Surfactants)), 0.7%(v/v) 트윈(Tween, 등록상표) 80 붕해제(ICI 서펙턴트), 2.5%(v/v) 에탄올, 200 ㎍/㎖ 퀼A, 100 ㎍/㎖ 콜레스테롤 및 0.5%(v/v) 레시틴을 함유하는 수중유적형 유화액이다. 변형된 심 1/2는 5%(v/v) 스쿠알렌, 1%(v/v) 스판(등록상표) 85 붕해제, 0.7%(v/v) 트윈 80 붕해제, 2.5%(v/v) 에탄올, 100 ㎍/㎖ 퀼A 및 50 ㎍/㎖ 콜레스테롤을 포함하는 수중유적형 유화액이다. 상기 백신에 포함될 수 있는 다른 면역조절제에는, 예를 들면, 하나 이상의 인터류킨, 인터페론 또는 다른 공지된 사이토카인이 포함된다.
또 다른 보조제 시스템은 T-헬퍼 및 B-세포 에피토프의 결합을 가능케하여, 국제특허출원 공개 제 WO 2006/084319 호, 제 WO 2004/014957 호 및 제 WO 2004/014956 호에 기술된 바와 같이, 추가로 지질화될 수 있는 하나 이상의 유형의 공유 T-B 에피토프 결합 구조를 야기한다.
본 발명의 바람직한 태양에서, ORF1 TTV 단백질 또는 다른 TTV 단백질, 또는 이들의 단편은 5% 암피젠(등록상표)을 사용하여 제제화한다.
본 발명의 백신은 경우에 따라 본 발명의 바이러스, 감염성 DNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 지속적 방출을 위해 제제화될 수 있다. 상기 서방성 제제의 예로는 생체적합성 중합체, 예를 들면, 폴리(락트산), 폴리(락트산-코-글라이콜산), 메틸셀룰로스, 히알루론산, 콜라겐 등의 복합체와 함께 바이러스, 감염성 DNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 약물 전달 비히클중 분해성 중합체의 구조, 선택 및 용도는 본원에 참고로 도입된 문헌[A. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3:279-292 (1992)]을 포함하여 여러 문헌들에서 논의되어 있다. 약학 제제에서 중합체를 선택하고 사용하는데 있어서 추가의 지침은 당해 분야에 공지되어 있는 문헌들, 예를 들면, 또한 본원에 참고로 도입된 문헌[M. Chasin and R. Langer(eds), "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol. 45, M. Dekker, NY (1990)]에서 찾을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 바이러스, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 투여 및 효능을 개선하기 위해 미세캡슐화될 수 있다. 항원을 미세캡슐화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제 3,137,631 호; 제 3,959,457 호; 제 4,205,060 호; 제 4,606,940 호; 제 4,744,933 호; 제 5,132,117 호; 및 국제특허출원 공개 제 WO 95/28227 호에 기재되어 있는 기술들이 포함되며, 상기 특허들은 모두 본원에 참고로 도입된다.
바이러스, 플라스미드, 바이러스 단백질 또는 바이러스 벡터의 지속적 방출을 제공하기 위해 리포솜도 또한 사용될 수 있다. 리포솜 제제를 제조하고 사용하는 방법과 관련된 세부사항은, 특히, 미국 특허 제 4,016,100 호; 제 4,452,747 호; 제 4,921,706 호; 제 4,927,637 호; 제 4,944,948 호; 제 5,008,050 호 및 제 5,009,956 호에서 찾을 수 있으며, 이들은 모두 본원에 참고로 도입된다.
임의의 전술한 백신의 효과량은 통상적인 방법에 의해, 소량의 바이러스, 바이러스 단백질 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 출발한 후 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시킴으로써 결정할 수 있다. 효과량은 백신의 단회 투여 후 또는 백신의 다회 투여 후에 수득될 수 있다. 동물당 최적 투여량을 결정할 때 공지된 요인들을 고려할 수 있다. 이들 요인에는 동물의 종, 크기, 연령 및 일반 건강상태, 동물중 다른 약물의 존재 등이 포함된다. 실제 투여량은 다른 동물 연구로부터의 결과를 고려한 후 선택하는 것이 바람직하다(예를 들면, 하기 실시예 2 및 3 참조).
적절한 면역 반응이 달성되었는지 여부를 감지하는 한가지 방법은 백신접종 후 동물에서 혈청전환 및 항체 역가를 측정하는 것이다. 백신접종의 타이밍, 및 부스터(booster)(존재하는 경우)의 횟수는 모든 관련 요인들의 분석을 기준으로 의사 또는 수의사에 의해 결정되는 것이 바람직할 것이며, 상기 요인들의 일부는 전술되어 있다.
본 발명의 바이러스, 단백질, 감염성 DNA 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 효과적인 투여량은 백신접종될 동물의 체중과 같이 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있는 요인들을 고려하여, 공지된 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명의 백신중 본 발명의 바이러스의 투여량은 바람직하게는 약 101 내지 약 109 pfu(플라크 형성 단위), 보다 바람직하게는 약 102 내지 약 108 pfu, 가장 바람직하게는 약 103 내지 약 107 pfu이다. 본 발명의 백신중 본 발명의 플라스미드의 투여량은 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게는 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 약 1 mg이다. 본 발명의 백신중 본 발명의 감염성 DNA 분자의 투여량은 바람직하게는 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 보다 바람직하게는 약 1 ㎍ 내지 약 10 mg, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 ㎍ 내지 약 1 mg이다. 본 발명의 백신중 본 발명의 바이러스 벡터의 투여량은 바람직하게는 약 101 내지 약 109 pfu, 보다 바람직하게는 약 102 내지 약 108 pfu, 훨씬 더 바람직하게는 약 103 내지 약 107 pfu이다. 적절한 투여량 범위는 약 0.5 내지 약 10 ㎖, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 5 ㎖이다.
본 발명의 실시에 따른 바이러스 단백질 또는 펩티드 백신에 적절한 투여량은 일반적으로 각각의 상기 물질과 관련하여 인지된 방법에 의해 결정될 양의 보조제와 함께, 표준 방법에 의해 측정될 수 있는 바와 같이 1회 투여 당 1 내지 50 ㎍ 또는 그 이상의 양이다. 돼지의 백신접종과 관련된 본 발명의 바람직한 예에서, 동물의 최적 연령은 약 1 내지 21 일이고, 이 연령은 이유기 이전의 다른 예정된 백신접종, 예를 들면 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae)에 대한 백신접종과 일치할 수 있다. 또는, 종돈에 대한 바람직한 백신접종 스케쥴은 매년 재백신접종 스케쥴을 이용한 유사한 투여량의 백신접종을 포함한다.
항체
본 발명의 TTV 폴리펩티드를 특이적으로 인지하는 CDR 서열을 포함하는 화합물을 포함하여, 항-TTV 항체, 예를 들면, 단클론성 및 다클론성 항체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화, 인간, 돼지 및 CDR-그래프트된 항체도 본 발명에 포함된다. 용어 "특이적인"은 본 발명의 항체의 가변 영역이 TTV 폴리펩티드만을 인지하고 결합하며(즉, 폴리펩티드 부류에서 나타난 서열 동일성, 상동성 또는 유사성에도 불구하고 관련 폴리펩티드로부터 단일 TTV 폴리펩티드를 식별할 수 있고), 항체의 가변 영역 외부의 서열, 및 특히 Ab 분자의 불변 영역 내부의 서열과의 상호작용을 통해 다른 단백질(예를 들면, 스태필로코커스 오레우스(S. aureus) 단백질 A 또는 ELISA 기술에서의 다른 항체)과 상호작용하도록 (선택적으로) 허용되는 것을 말한다. 본 발명 항체의 결합 특이성을 측정하기 위한 선별 분석법은 당해 분야에 공지되어 있으며 통상적으로 실시된다. 상기 분석법에 대한 포괄적인 고찰은 문헌[Harlow et al.(Eds), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY, Chapter 6 (1988)]을 참조한다. 본 발명의 TTV 폴리펩티드의 단편을 인지하고 결합하는 항체도 포함하되, 상기 항체들은 무엇보다 단편이 유래된 기원이 되는 본 발명의 TTV 폴리펩티드에 대해 상기 정의한 바와 같은 특이성을 나타내어야 한다.
간결함을 위해, "항체"는 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 특이적 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 말한다. 면역글로불린은 "불변" 및 "가변" 영역을 갖는 폴리펩티드 "경"쇄 및 "중"쇄로 이루어진 혈청 단백질이며, 불변 영역의 조성을 기준으로 부류된다(예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM). 항체는, 예를 들면, Fv, Fab', F(ab')2를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있을 뿐만 아니라, 단일 쇄 형태로도 존재할 수 있으며, 하나 이상의 항체 단일 쇄 폴리펩티드 서열의 전체 또는 일부를 함유하는 합성 폴리펩티드를 포함한다.
진단
키트
본 발명은 또한 진단 키트를 제공한다. 상기 키트는 TTV 바이러스의 야생 균주로 자연적으로 감염된 돼지와 본원에 기술된 임의의 TTV 백신으로 백신접종된 돼지를 구별하는데 유용할 수 있다. 상기 키트는 또한 TTV 바이러스의 야생 균주로 잠재적으로 감염된 동물을 임상 증상이 나타나기 전에 발견하여 무리로부터 옮기거나 또는 천연 또는 백신접종된 동물로부터 격리하여 유지할 수 있기 때문에 가치가 있을 수 있다. 상기 키트는 명시된 TTV 바이러스의 특정 성분에 대한 항체의 존재에 대해 돼지로부터 얻은 샘플을 분석하기 위한 시약을 포함한다. 본 발명의 진단 키트는 야생 균주에는 존재하나 당해 백신에는 존재하지 않는 ORF1, 2 또는 3으로부터 유래된 펩티드, 또는 반대로 당해 백신에는 존재하나 야생 균주에는 존재하지 않는 ORF1, 2 또는 3으로부터 유래된 펩티드를 성분으로 포함할 수 있으며, 상기 적절한 펩티드 영역의 선별은 명세서의 실시예 1 및 2에 제공된 바와 같은 광범위 아미노산 서열분석에 의해 가능해진다. 당해 분야에 공지되어 있듯이, 본 발명의 키트는 대안적으로 융합 단백질을 통해 제공되는 펩티드를 성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 용어 "융합 펩티드" 또는 "융합 단백질"은 TTV 바이러스 단백질, 바람직하게는 ORF1의 적어도 일부분 및 이종 펩티드 또는 단백질로 이루어진 단일 폴리펩티드 쇄를 의미한다.
실시예
실시예
1: 돼지
TTV
전체 게놈의
클로닝
A.
TTV
유전자형 2
제조사의 프로토콜에 따라 DNA 혈액 미니 키트(퀴아젠(Qiagen))를사용하여 돼지 혈청으로부터 DNA를 정제하였다. DNA를 50 ㎕ 트리스-EDTA 완충액중에서 컬럼으로부터 용출시켰다. 이어서, 랜덤 프라임 회전 환 증폭(random primed rolling circle amplification)을 통해 DNA를 증폭시켰다. 이어서, 간략하게, 5 ㎕의 정제된 DNA 및 100 ng의 랜덤 육량체(hexamer)(인비트로겐)를 71 ㎕의 물에 첨가하고 95 ℃에서 3 분간 가열하고 얼음상에서 냉각시켰다. 그 다음, 1mM dNTP, 100 ng의 랜덤 육량체(인비트로겐), 1X phi29 폴리머라제 완충액 및 1 ㎕의 파이(phi)29 폴리머라제를 첨가하고 반응물을 30 ℃에서 밤새 배양하였다.
전체 부피의 1/5을 EcoRI로 절단하고 0.8% E-겔(인비트로겐) 상에서 전기영동하여 2.7 kB 단편의 존재를 검출하였다. EcoRI 절단된 물질을 제조사의 프로토콜에 따라 퀴아젠 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 정제 키트를 사용하여 정제하고, EcoRI 절단/새우 알칼리성 포스파타제-처리된 pGem3zf(+) 벡터(프로메가(Proemga))에 라이게이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 사용하여 화학적 반응능(chemically competent) 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환된 이. 콜라이를 LB/amp 아가 플레이트 상에서 선별하였다.
플라스미드 DNA를 형질전환 콜로니로부터 분리하고 EcoRI로 절단하여 약 2.7 kB 삽입물의 존재를 확인하였다. 4개의 클론(4, 7, 10 및 13)을 선택하고 서열분석을 위해 ACGT 인코포레이티드(ACGT, Inc.)에 제출하였다. 서열 데이터 정렬 결과 클론 10 및 13이 TTV 공개 서열에 상동성을 나타내었으며 TTV 유전자형 1보다 유전자형 2에 보다 근접하게 정렬된 것으로 나타났다. 이들 클론을 이후에 TTV10 및 TTV13으로 명명하였다.
PAH
TTV
유전자형 2에 대한 서열분석 데이터 분석
공개된
TTV
유전자형 2
AY823991
DNA
서열(서열번호: 16)에 대한
TTV13
(서열번호: 2) 및
TTV10
(서열번호: 1)의 뉴클레오티드 정렬
뉴클레오티드 동일성
TTV 13은 이미 공개된 AY823991 서열과 비교할 때 92% 동일성을 나타낸다. 그러나, TTV10은 AY823991 또는 TTV13 간에 단지 76% 유사성만을 나타내며, 별개의 유전자형으로 간주될 수 있다.
AY823991
ORF1
(서열번호: 8)을 이용한
TTV10
(서열번호: 14) 및
TTV13
(서열번호: 15)에 대한
PAH
TTV
유전자형
ORF1
의 아미노산 정렬
공개 서열을 이용한 TTV10 TTV13 ORF의 아미노산 정렬
아미노산 수준에 있어서, TTV10 ORF는 공개된 서열에 단지 65%의 상동성을 나타내며, TTV의 고유의 표현형을 나타낼 수 있다.
배큘로바이러스
(
baculovirus
) 발현을 위한
TTV
유전자형 2
ORF1
의
클로닝
상기 유도된 서열 데이터를 기준으로, 인비트로겐 게이트웨이(Gateway, 등록상표) 시스템을 사용하여 배큘로바이러스에서의 발현을 위해 TTV10 및 TTV13으로부터 ORF를 클로닝하기 위해 프라이머를 설계하였다.
TTV13 ORF의 경우: Ttv13역방향1211: 5' cgt act cga gtc aca gta ttt tca tcc(서열번호: 26); TTV13정방향1211: 5' cta ggt acc atg cct tac aga cgc tat(서열번호: 27)
TTV10 ORF의 경우: tt10정방향1207: 5' cta ggt acc atg cct ttc cac cgc tat(서열번호: 28) 및 ttv역방향1207: cgt act cga gct ata ggg tcc tga at(서열번호: 29)
pGem으로의 EcoRI 클로닝이 ORF1의 오픈 리딩 프레임을 중단시켰기 때문에, pGem내의 TTV 삽입물을 EcoRI 절단에 의해 분리하고 겔 정제하고 표준 라이게이션 조건을 이용하여 재-원형화하였다. 4 ℃에서 밤새 라이게이션시킨 후, 리가제(ligase)를 65 ℃에서 불활성화시키고 반응물을 제조사의 프로토콜에 따라 퀴퀵(QuiQuick) 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다.
1X 하이 피델리티(Hi Fidelity) 효소 완충액 중에서 전술한 TTV13 정방향 및 역방향 프라이머(각각 0.15μM), 0.2mM dNTP를 사용하여 익스팬드 하이-피델리티(Expand Hi-Fidelity, 등록상표) 효소(로슈(Roche))와 함께 재-원형화된 TTV13 게놈 DNA를 사용하여 TTVORF13을 PCR 증폭시켰다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95 ℃에서 4 분간 1 주기; 94 ℃에서 15 초 변성, 55 ℃에서 30 초 어닐링 및 68 ℃에서 1.5 분 연장 35 주기; 및 72 ℃에서 7 분 연장 1 주기.
유사하게, 1X 하이 피델리티 효소 완충액 중에서 전술한 TTV10 정방향 및 역방향 프라이머(각각 0.15μM) 및 0.2mM dNTP를 사용하여 익스팬드 하이-피델리티(등록상표) 효소(로슈)와 함께 재-원형화된 TTV10 게놈 DNA를 사용하여 TTVORF10을 PCR 증폭시켰다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95 ℃에서 4 분간 1 주기; 94 ℃에서 15 초 변성, 56 ℃에서 30 초 어닐링 및 68 ℃에서 1.5 분 연장 35 주기; 및 72 ℃에서 7 분 연장 1 주기.
PCR 산물은 제조사의 프로토콜에 따라 키아퀵(QiaQuick) PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하였다. PCR TTV10Orf1 및 TTV13Orf1 산물 둘 다, 및 게이트웨이 유입 플라스미드 pENTR3C를 KpnI으로 절단하였다. 절단된 DNA를 키아퀵 PCR 증폭 키트를 사용하여 정제하고 이어서 XhoI으로 절단하였다. 키아퀵으로 정제한 후, TTV10ORF1 또는 TTV13ORF1 DNA를 표준 라이게이션 절차를 사용하여 pENTR3C 내에 라이게이션시켰다. 실온에서 2 시간 동안 라이게이션시킨 후, 라이게이션된 DNA를 사용하여 화학적 반응능 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니를 카나마이신(Kanamycin)을 사용하여 선별하였다. 형질전환된 이. 콜라이로부터 플라스미드를 정제하고, 제한효소 단편 분석에 의해 ORF1 DNA 삽입을 확인하였다.
이어서, TTV10 ORF1 또는 TTV13 ORF1을 함유하는 pENTR3C 플라스미드를, TTV Orf1 오픈 리딩 프레임에 대한 His6X 또는 GST 단백질 N-말단을 암호화하는 인비트로겐 데스티네이션(destination) 벡터 pDEST10 또는 pDEST20 내에 삽입하였다. TTV Orf1의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 재조합 pDEST 벡터를 사용하여 DH10Bac 이. 콜라이를 형질전환시켰다. 재조합 백미드(bacmid) DNA를 분리하고 표준 프로토콜에 따라 SF9 세포의 형질감염에 사용하였다. 천연 Orf1을 함유하는 재조합 배큘로바이러스를 플라크 정제에 의해 분리하였다. PCR을 사용하여 재조합 배큘로바이러스를 확인하였다.
배큘로바이러스
발현을 위한 천연
TTVOrf1
구축
표준 PCR을 이용하여 BamH1 제한효소 부위를 TTV10 Orf1 중 개시 코돈으로부터 상류에 삽입하거나 또는 XbaI 제한효소 부위를 TTV Orf13 중 개시 코돈으로부터 상류에 삽입하였다. 이들 구조물은 pFastBac 전이 벡터내에 클로닝하고 이. 콜라이 DH10Bac를 형질전환시키는데 사용하였다. 이어서, 생성된 재조합 백미드를 사용하여 SF9 세포를 형질감염시켰다. 천연 Orf1을 함유하는 재조합 배큘로바이러스를 플라크 정제에 의해 분리하였다. PCR을 사용하여 재조합 배큘로바이러스를 확인하였다.
이.
콜라이
발현을 위한
TTV
유전자형 2
ORF1
의
클로닝
세균 시스템에서 GST-융합 단백질의 발현을 위해 전장 TTVOrf10을 또한 PGex-6p-1에 클로닝하였다. TTV ORF는 아르기닌 풍부 아미노 말단을 함유한다. 단백질 생성이 세균 발현 시스템에서 증가될 수 있는 지를 측정하기 위해, 아르기닌 풍부 단편을 Orf1 오픈 리딩 프레임의 368번 뉴클레오티드에 위치한 편리한 제한효소 부위(EcoR1)에서 TTVOrf13으로부터 절단하여 pGex-6p-1의 GST 암호화 영역에 인 프레임으로 연결시켰다. 상기 클론은 매우 증대된 아르기닌 단편을 함유하는 100개 아미노-말단 아미노산의 제거를 야기하였다.
B.
TTV
유전자형 1
단일-가닥 결합 단백질을 첨가하여 증폭 반응의 효율을 개선한 것을 제외하고 전술한 바와 같은 절차에 따라 회전환 증폭에 의해 돼지 골수로부터 전체 세포 DNA를 증폭시켰다. 증폭 산물을 EcoR1으로 절단하고, 키아퀵 PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하고, 새우 알칼리성 포스파타제로 미리 처리된 pGem3zf(+) 벡터에 라이게이션시켰다. 추정되는 TTV 게놈 DNA를 함유하는 재조합 벡터를 EcoR1 및/또는 BamH1을 사용한 제한효소 절단을 근거로 선별하였다. 대략 2.7 kB 삽입물을 함유하는 플라스미드를 정제하고, 유전자형을 확인하기 위해 ORF1 서열의 서열분석을 위해 ACGT 인코포레이티드에 제출하였다. 완전 게놈, 즉 고도의 G/C 풍부 영역을 함유하는 영역이 전체적으로 서열분석되지는 않았다.
PAH
TTV
유전자형 1에 대한 서열분석 데이터 분석
공개 서열 AY823990(서열번호: 17)을 사용한 PAH TTV7(서열번호: 4), TTV17(서열번호: 5), TTV21(서열번호: 6) 및 TTV27(서열번호: 3)의 뉴클레오티드 정렬.
PAH TTV 및 공개 서열중 뉴클레오티드 동일성
TTVgt1-27은 공개 서열 AY823990과 최대 상동성을 나타내어 91% 동일성을 보인다. TTVgt1-7, 17 및 21은 85 내지 87%의 동일성을 나타낸다. TTVgt1-7 및 TTVgt1-21은 99% 뉴클레오티드 동일성을 공유한다.
Orf1
아미노산 정렬
다음은 공개된 AY823990 서열(서열번호: 25)과 TTV7(서열번호: 10), TTV17(서열번호: 11), TTV21(서열번호: 12) 및 TTV27(서열번호: 13)에 대한 상응하는 아미노산 서열의 비교를 제공한다.
단백질의 소수성 구획은 5개의 친수성 구역을 나타내며, 이것은 잠재적으로 항원성인 표면-노출된 영역을 가리킬 수 있다. 이들 영역중 두 영역은 아미노 말단 및 카복시 말단에 존재하며, 둘 다 아르기닌이 풍부하고 고도로 보존된다. 아미노산 190과 232 사이의 고도로 보존된 친수성 영역이 관찰되었으며 잠재적으로 항원 부위로 작용할 수 있다. 아미노산 295 내지 316 사이의 친수성 영역, 및 아미노산 415 내지 470 사이의 남은 친수성 영역도 항원성을 나타낸다.
또한, ORF1에 대한 추정 출발 코돈 및 암호화 영역은 다음과 같은 것으로 확인되었다: ttvgt1-27 nt517-2435; ttvg1-7 nt517-2435; ttvgt1-17 nt517-2436; ttvgt1-21 nt517-2439; ttv10 nt487-2346; 및 ttv13 nt477-2363. ORF2에 대한 추정 출발 코돈 및 암호화 영역은 다음과 같다: ttvgt1-27 nt428-646; ttvg1-7 nt428-643; ttvgt1-17 nt428-643; ttvgt1-21 nt428-646; ttv10 nt404-610; 및 ttv13 nt394-597.
재조합
배큘로바이러스를
이용한
TTV
ORF1
단백질 발현
이어서, 곤충 세포 및 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 유전자형 2 TTV ORF1 단백질을 발현하기 위해 일련의 실험을 착수하였다. 단백질 발현의 최적화는 3개의 세포주(SF9, SF21 및 하이 파이브(Hi Five)), 다중 배지 구성(엑셀(ExCell) 420, SF900 III SFM, 익스프레스 파이브(Express Five) SFM), 다양한 세포 밀도(5e5, 1e6, 2e6 및 4e6 세포/㎖) 및 다양한 감염 다중도(MOI; 0.005, 0.1, 0.5, 2.0) 하에서 수행하였으며, 생성된 배양물을 감염 후 7 일의 기간에 걸쳐 매일 모니터링하였다.
세포 밀도 및 생존도에 대해 과정을 모니터링하였으며, 세포 크기 및 바이러스 역가측정을 모니터링링함으로써 감염을 모니터링하였다. 단백질 발현은 SDS-PAGE, 쿠마시(Coomassie) 겔 분석 및 웨스턴 블롯팅을 통해 모니터링하였다. 적절한 제어를 보장하기 위해, 모든 실험 전체에 걸쳐 음성 및 양성 대조군을 유지시켰다. 모든 실험이 표적 단백질의 발현을 확인할 수 있었지만, 2x106 세포/㎖의 세포 밀도 및 0.1의 MOI 하에 엑셀 420 배지(시그마, SAFC)에서 유지된 SF9 세포를 사용하였을 때 최적 조건이 찾아졌으며, 과정은 감염 3일 후에 종료하였다. 재조합 발현 단백질의 대부분은 세포 펠릿내에 위치할 수 있지만, 일부는 생성된 상등액중에 존재한다.
웨스턴
블롯팅(GST-표지)을
사용한 단백질 발현의 확인
인비트로겐 데스티네이션 벡터(pDEST10)가 TTV Orf1 오픈 리딩 프레임의 N-말단에서 GST 단백질 N-말단을 함유하였기 때문에, 약 95 kD의 생성 GST-ORF1 융합 단백질이 생성되었으며, 이것은 상업적으로 시판하는 토끼 항-GST(칼바이오켐(CALBIOCHEM)) 항체를 사용하여 검출하였다. 95 kD 융합 단백질 중에서, 약 68 kD는 ORF1인 것으로 간주되고, 25 kD는 GST 단백질인 것으로 간주된다. TTV ORF1 단백질의 표준화 검출에 어떤 상업적 항체도 사용할 수 없었으며, 항-GST 항체를 사용하는 것이 필수적이었다.
토끼 항-
TTV
ORF1
항체의 생산
공지된 TTV 시약의 입수가능성이 애초에 없음으로 인해, 항-TTV ORF1 항체를 생성하기 위해 노력하였다. TTV ORF1 재조합 단백질을 제조하기 위한 최적화된 발현 프로토콜에 따라, 생성된 물질을 상업적으로 시판하는 바큘로골드(Baculogold) GST 정제 키트를 사용하여 더 정제하였다. 이어서, 정제된 TTV10 및 TTV13 ORF1 단백질을 사용하여 ORF1 재조합 단백질에 대한 항체의 후속 생성을 위해 토끼를 과면역화시켰다.
단백질 검출과 관련하여, 도 1A의 샘플 레인들은 다음과 같았다(우측에서 좌측으로).
샘플:
레인 2, 4 및 6은 정제된 95 kD TTV13 ORF1 융합 단백질을 나타내었으며, 이것은 후에 토끼 면역화에 사용되었다(도 1a 참조).
토끼 항-
ORF1
단백질을 사용한 천연
TTV
ORF1
의 검출
천연 TTV ORF1 재조합 배큘로바이러스를 사용하여 추가의 발현 실험을 수행하였다. 상기 재조합 배큘로바이러스는 6xHis 또는 GST 융합 표지 없이 제작되었기 때문에 특정 항-TTV ORF1 항체를 필요로 한다. 따라서, 토끼 항-TTV ORF1 항체를 사용하여 발현 후 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 천연 단백질의 발현을 확인하고 시약 반응성을 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과는 대략적으로 TTV ORF1의 예상 크기인 약 69 kD에서 미약한 반응을 나타내었고 약 49 kD의 추가의 밴드에서 반응을 나타내었다(도 1b 참조). 49 kD 단백질 밴드는 알려진 바 없다. 69 kD에서의 미약한 밴드형성은 천연 TTV ORF1 구조물에서 낮은 단백질 발현 또는 토끼 면역화로부터 불량한 항체 수율의 작용일 것으로 추정된다. 상기 특정 분석에서 항원 또는 항체의 정제는 수행하지 않았음을 주지해야 한다. 레인 5(도 1b에서 화살표 참조)는 항-TTV ORF1 토끼 다클론성 항체를 사용한 천연 TTV ORF1 발현에서 약 69 kD 및 49 kD 단백질에 대한 고유의 반응을 나타낸다.
따라서, 항원으로서 캡시드 단백질에 대한 항체의 결합이 입증되었으며, 이때 항원은 오직 TTV 서열만을 제공하였으며 표지화하지 않았다.
도 6b 샘플 레인은 다음과 같았다(우측에서 좌측으로):
실시예
2: 백패싱(
backpassing
)
제왕절개-유도된 초유 박탈(CDCD) 돼지로부터 간을 무균적으로 회수하였다. 간 조직을 고유 qPCR 분석으로 g1 및 g2 TTV에 대해 검사하였으며 g1TTV에 대해서만 양성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이어서, 항생물질 및 항진균제를 함유하는 배지중에서 10%(w/v) 간 균질액을 제조하였다. 마지막으로, 균질액을 원심분리에 의해 정화시키고 g1TTVp0로 표시하고 -70 ℃에서 냉동시켰다. 생성된 g1TTV 균질액을 통상적인 검사를 통해 외인성 바이러스, 세균 및 마이코플라즈마가 없는지 검사하였다. 충분한 검사 후에, 2 ㎖의 새로 해동한 g1TTVp0를 6마리의 11일령 무균 자돈 각각에 복강내 접종하였다. 접종한지 약 12 일 후에, 돼지를 안락사시키고, 골수, 비장 및 간을 무균적으로 회수하였다. 수득된 간은 각각 qPCRdp 의해 g1TTV가 풍부하고 g2TTV에 대해 음성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이어서, 간 균질액을 전술한 바와 같이 수득된 간 각각으로부터 제조하고 표지를 붙이고 g1TTVp1으로 할당하고 -70 ℃에 두었다. g1TTVp1으로부터 추가의 2차 계대(g1TTVp2)가 생성되었다.
실시예
3: 어린
돼지에서
3가지 토크
테노
바이러스(
TTV
) 백신의 효능 평가
본 연구는 약 7 일령에 투여되고 다시 이유기(약 21 일령)에 이어 약 5 주령에 투여된 3개의 TTV 백신 후보의 효능을 평가하기 위해 수행하였다.
본 연구는 TTV 제제로 근육내 주사한 돼지에서 예비 면역원성 평가를 제공하였다. 전술한 바와 같이, TTV는 음성 극성의 단일 가닥 원형 DNA 게놈을 갖는 소형의 비-외피 바이러스이다. 게놈은 미번역 영역 및 3개 이상의 주요 중복 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 돼지 TTV는 매우 흔하며 다양한 지역에서 수거한 혈청 샘플중 바이러스의 PCR-검출은 33 내지 100% 범위에 이르는 돼지에서 유병률을 나타낸다(문헌[McKeown et al., Vet. Microbiol. 104:113-117 (2004)]). 문헌[Krakowka et al., AJVR 69:1623-1629 (2008)]은 g1-TTV 접종 돼지가 임상적 징후는 갖지 않았지만 접종 후에 간질성 폐렴, 일시적 흉선 위축, 막성 신병증, 및 간에서 적당한 림프구 내지 조직구 침윤을 나타내었음을 보고하였다. 본 연구는 3개의 상이한 TTV 백신 제제의 비교를 제공하며, 이들 원형 제제중 어느 제제가 챌린지 대조군과 비교할 때 수치적으로 또는 통계적으로 구별될 수 있는 지를 평가하였다.
재료 및 방법
동물: PRRSV 또는 M 하이오(M hyo)(또는 동일 유기체에 대한 백신접종)에 의해 야기된 병력이 없는 6 마리의 임상적으로 건강한 잡종의 임신한 PRRSV 및 M 하이오 혈청음성 암컷을 일리노이주 올튼의 링컨 트레일/퓨어제닉 포크(Lincoln Trail/Puregenic Pork)에서 공급받고, 대략 출산 3 주 전에 미시간주 리치랜드 소재의 화이자 동물 건강 연구 농장(Pfizer Animal Health Research Farm)으로 이송하였다. 필요한 경우, 주사용 프로스타글란딘(루타라이즈(Lutalyse), 등록상표)을 사용하여 2 또는 3 일의 기간 이내에 모돈의 분만을 유도하였다. 상기 모돈들로부터 정상적인 자돈들을 할당 계획에 따라 연구하기 위해 할당하였다. 돼지들을 깔짚에 의한 처리에 무작위로 배치하였으며 각각의 깔짚은 처리 각각에 할당된 하나 이상의 자돈을 수용하였다.
수용: 백신접종 기간 동안, 돼지들은 BL-2 격리 시설에서, 교차-위탁양육 없이 이들의 어미들과 함께 수용하였다. 돼지들은 2차 백신접종 시기까지 계속 깔짚에 수용되었다. 2차 백신접종 후에 돼지를 다른 시설로 옮기고 2개의 방(한 방은 NTX(비-백신접종 및 비-챌린지 대조군) 동물을 포함하고, 두번째 방은 백신을 접종한다)에서 수용하였으며, 각각의 방은 우리당 4 또는 8 마리의 돼지를 포함한다.
먹이: 분만 후에, 모돈에게 적절한 수유 모돈 먹이를 공급하였다. 자돈들은 이유에 앞서 이유기 보조 사료 및 대용유를 공급받았다. 일단 이유기에 들어가면, 자돈들은 선택의 자유를 제공받으면서 연령에 적합한 먹이를 공급받았다. 물은 모든 동물에게 임의로 이용가능하였다.
할당/무작위로 배치: 돼지들을 깔짚에 의한 처리에 무작위로 배치하였다. 각각의 깔짚은 각 처리에 배정된 한 마리 이상의 돼지를 수용하였다.
연구 계획
마스킹: 백신접종에 앞서 숫자 코드를 이용하여 백신을 마스킹하였다. 조사원, 백신 투여자 및 연구원을 처리에 대해 마스킹하고 동물 관리에 처리 정보가 필요하지 않는 한 마스킹 코드에 접근시키지 않았다.
연구의 수의학적 성과
[표 1]
IVP 제제
챌린지 물질 제조: qPCR에 의해 g1TTV에 대해 양성(7.6x10e8 내지1.6x10e9 DNA 복사체/2 ㎖) 및 g2TTV에 대해 음성으로 검사된 간 균질액으로부터 g1TTV 계대 1을 유도하였다. 냉동기에서 적절한 수의 병을 꺼내고 챌린지 직전에 해동하였다. 이어서, 병들중 하나에서 분취량을 꺼내고, 나중에 재역가측정을 위해 유지하였다. 챌린지 저장액을 얼음상에서 연구 시설로 이동시키고 챌린지 절차 동안 얼음상에 유지하였다. 챌린지 투여량은 저장액 2.0 ㎖(2.0 ㎖ 복강내)와 동등하다. 상기 투여량을 각각의 돼지에 전달하였고, 따라서 7.6x10e8 내지 1.6x10e9 DNA 복사체/2 ㎖인 것으로 예상된다. 챌린지 후에, 챌린지 저장액 분취량을 챌린지 투여량을 확인하기 위한 역가측정을 위해 유지하였다.
일반적 건강상태 관찰: 자격을 갖춘 자가 동물들을 매일 관찰하고, 일반적 건강상태 관찰내용을 기록하였다.
체중: 모든 돼지를 제 0 일, 챌린지 당일(제 28 일) 및 부검일에 계량하였다. 모든 체중을 기록하였다.
백신접종: 약 7 일령에서(제 0 일), 처리군(군 T01 내지 T04) 당 약 10 마리의 무작위로 할당된 돼지를 표 1에 기술된 바와 같이 백신접종하였다. 돼지를 우측 목에 단회 투여량 주사기(2.0 ㎖ 근육내(IM) 투여량)의 IVP, 또는 2 ㎖ IM 투여량의 대조군을 할당량에 따라 주사하였다. 제 2 투여량의 동일 IVP 또는 대조군을 이유기(약 21 일령)에 좌측 목에 투여하였다.
채혈: 제 0 일 이전, 챌린지 이전 제 14 일(백신접종 전) 및 제 28 일(및 제 31, 34, 37 및 40 일)에 5 ㎖ 또는 9 ㎖ 혈청 분리기 관(체중에 따라)을 사용하여, g1TTV 상태 분석을 위해 모든 돼지들로부터 혈액 샘플을 채취하였다(qPCR-화이자-VMRD 래버러토리 사이언시즈). 현장 조사원이 혈청 샘플을 3개 이상의 별도의 관에 분취하고 -80 ℃에서 저장하였다.
[표 2]
일정 시점까지 혈청에 수행될 g1TTV qPCR 분석
챌린지: 약 5 주령에서, 할당량에 따라 2.0 ㎖(IP 또는 IN) 투여량의 TTV 분리물을 자돈에 접종하였다. 마스킹을 위해 처리 코드에 의해 확인된 시설로 챌린지 물질을 옮겼다.
챌린지 후 직장 온도를 챌린지 이전 제 28 일, 제 31 일, 제 34 일, 제 37 일 및 40 일에 하루에 한번 기록하였다.
부검: 제 40 일에 모든 동물을 안락사시키고 부검하였다. 부검 시, 다음의 방법을 이용하여 폐 병변의 스코어를 기록했다: 1) 수치적 스코어(0, 1, 2, 3) 및 2) 각 엽(좌측 두개골, 좌측 몸통, 좌측 꼬리, 우측 두개골, 우측 몸통, 우측 꼬리, 및 부속기관)에 대한 경화 %를 스코어를 기록하고 병변이 관찰된 엽의 %로서 기록하였다. 간, 신장, 흉선 및 림프절도 또한 스코어를 기록하였다. 안락사시키기 전에 혈액 샘플도 또한 취하였다. 조직은 하기 표에 나타낸 바와 같이 수거하였다:
안전성 및/또는 효능의 평가와 관련하여, 혼동시키는 2차 질병 상태는 발견되지 않았다. 동물들을 프로토콜에 따라 백신접종 및 챌린지하였다. 결과 기준과 관련하여, 하기중 일부 또는 전부의 감소를 이용하였다: 감소된 비대 또는 미세 병변; qPCR에 의한 감소된 바이러스혈증; 및 발열, 체중손실 또는 사망의 감소된 발생빈도(양쪽 검증).
분석 방법
부검 시, 다음의 방법을 이용하여 폐 병변의 스코어를 기록하였다: 1) 수치적 스코어(0 = 병변없음, 1 = 약간의 병변, 2 = 중간정도의 병변, 3 = 심각한 병변), 및 2) 각 엽(좌측 두개골, 좌측 몸통, 좌측 꼬리, 우측 두개골, 우측 몸통, 우측 꼬리, 및 부속기관)에 대한 경화 %를 스코어를 기록하고 병변이 관찰된 엽의 %로서 기록하였다.
병변이 있는 전체 폐의 %를 고정 요인, 처리, 및 임의 요인 깔짚과 함께 일반적인 선형 혼합 모델을 이용하여 변환시키고 분석하였다. 유의성 있는(P≤0.10) 처리 효과에 대해 검사한 후 사전 비교분석에 파라미터 추정치의 선형 조합을 사용하였다. 10% 수준의 유의성(P≤0.10)을 이용하여 통계적 차이를 평가하였다.
qPCR 데이터는 적절한 로그 변환을 이용하여 분석에 앞서 변환시킨다. 변환시킨 역가는 일반 선형 반복 측정 혼합 모델 분석을 이용하여 분석한다. 쌍별 처리 비교는, 처리 또는 시점까지의 처리 상호작용 효과가 유의성(P≤0.10)이 있는 경우 각 시점에서 이루어진다. 처리 최소 제곱 평균, 90% 신뢰 구간, 최소치 및 최대치를 각 시점에서 계산하고 역-변환시킨다. 기술 통계치, 평균, 표준 편차 및 범위들을 챌린지 이전, 각각의 처리 및 연구일에 대해 계산한다.
연구 결과 및 고찰
폐 병변
관찰된 전체 폐 병변 %가 모든 처리 군 전체에 걸쳐 낮았지만, 유의차가 나타났다. T01(크로모스 발현된 g1TTV ORF1)은 T02(배큘로바이러스 발현된 g2TTV ORF1) 및 T04(챌린지 대조군) 둘 다와 비교할 때 훨씬 더 낮은 폐 병변을 나타내었다. 챌린지 바이러스는 감염성 g1TTV로 이루어졌기 때문에, 배큘로바이러스로부터의 유전자형 2 ORF1이 챌린지 대조군과 비교하여 매우 더 낮은 폐 병변을 제공하지 않은 것이 놀라운 것이 아닐 수 있다. 그러나, 충분하지는 않지만, 챌린지 대조군에 비해 수치적으로 더 낮은 폐 병변 스코어를 제공함으로써, 투여량 및 보조제 선택의 최적화 시 상이한 TTV 유전자형 사이에 일정 수준의 교차 보호가 가능함을 지적하고 있음을 주지하는 것은 흥미롭다. T03과 T04 사이에 임의의 통계적 차이의 결여로 입증되듯이 불활성화 챌린지 바이러스(T03, g1TTVp1 사멸 바이러스)가 생 g1TTV 챌린지 바이러스에 대해 교차-보호를 제공하지 않은 것은 놀라웠다. 이러한 놀라운 교차 보호의 결여는 또한 본 발명의 신규 백신, 예를 들면, g1TTV ORF1(T01 크로모스)의 수의학적 중요성을 더욱 증대시킨다.
g1TTV
qPCR
TTV qPCR 바이러스혈증 데이터의 분석(도 7)은 T01(크로모스 g1TTV ORF1)이 T04(챌린지 대조군)과 비교하여 수치상 더 낮은 TTV qPCR 값을 가짐을 보여준다. 바이러스혈증 정도와 기간의 감소가 나타나는데, 이것은 폐 병변의 감소와 함께 효능의 지표이다. 또한, T02(배큘로바이러스 g2TTV ORF1)는 T04(챌린지 대조군)와 비교하여 보다 단기간이지만 바이러스혈증 정도와 기간에 수치상의 감소를 나타낸다. 이것은 수치상 더 낮은 폐 병번과 함께, 일부 유전자형 교차 보호(g2TTV ORF1 백신 대 g1TTV 챌린지 바이러스)가 관찰되었음을 말해준다. 최적화된 투여량 및 보조제를 사용하여 상기 광범위한 유전자형 교차 보호가 실현될 수 있다로 말할 수 있다. 상기 (T03) g1TTVp1 KV가 챌린지 대조군과 비교하여 TTV qPCR 바이러스혈증에 감소를 제공하지 않았음을 주지하는 것도 또한 흥미롭다. 폐 병변 데이터와 함께 상기 관찰결과는 또한 재조합적으로 발현된 g1TTV ORF1(T01)이 백신으로서 효능을 제공한다는 새로운 발견을 예시한다.
실시예
4: 6
His
표지를 갖는 전장 단백질로서
g1TTV
ORF1
의 코돈 최적화 및 재조합 발현, 및 항체에 의한 이의 검출
이. 콜라이와 사카로마이세스 세레비지에 둘 다에 대해 코돈 최적화 및 유전자 합성을 위해 TTVg1 뉴클레오티드 서열을 젠스크립트(미국 뉴저지주 피스카타웨이)에 제출하였다. 두 경우 모두에서, 코돈 최적화된 유전자를 젠스크립트 pUC57 벡터내에 산물로서 클로닝하였다. 젠스크립트 옵티멈진(OptimumGene, 등록상표) 코돈 최적화 분석은, 코돈 사용빈도 편향, GC 함량, CpG 다이뉴클레오티드 함량, mRNA 이차 구조, 가능한 부정확한 스플라이싱 부위의 확인, 미성숙 폴리A 부위의 존재, 내부 chi 부위 및 리보솜 결합 부위, 음성 CpG 섬, RNA 불안정성 모티프(ARE), 억제 부위(INS), 다양한 종류의 반복 서열(직접, 역 및 이분자(dyad) 서열 포함), 및 또한 클로닝을 방해할 수 있는 제한효소 부위를 포함하여 많은 파라미터들의 분석을 수반한다. 번역 성능은 번역 개시 코작(Kozak) 서열, 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열, 및 정지 코돈을 통한 번역 말단의 효율을 증가시키는 것을 통해 더 개선될 수 있다.
서열번호: 18 내지 20은 에스케리키아 콜라이(서열번호: 18 내지 19) 및 사카로마이세스 세레비지에(서열번호: 20) 모두에 대해 코돈 최적화된 TTV 캡시드 유전자를 제공한다. 이. 콜라이에 대한 서열은 매우 유사하지만, 유전자를 상업적 pET101/D-TOPO 발현 벡터(인비트로겐) 내에 클로닝하여 76057-4(서열번호: 19)를 생성하기 위해, 추가의 CA 뉴클레오티드를 N-말단에 부가시켜야 했다. pET101/D-TOPO 발현 벡터는 또한 정제를 위해 C-말단 V5 표지 및 6X-His를 갖지만, 그외에는 76057-3(서열번호: 18) 및 76057-4에 대한 서열은 동일하다. 발현된 코돈-최적화된 TTVg1 단백질은, 아미노 말단에서의 10개 아미노산 보호 펩티드 및 카복시 말단에서 V5 에피토프 및 6X His 표지에 상응하는 32개 아미노산의 부가로 인해, 63 kD 단백질에 비례하여, 크기가 약 68 kD이다(도 2).
76057-5(서열번호: 20)에 대한 서열은 사카로마이세스 세레비지에에 대해 코돈 최적화되었으며, 따라서 이. 콜라이 서열과 약간 다르다. 또한, 상기 서열은 N-말단에서 10개 아미노산 보호 펩티드(이. 콜라이 서열에 부가된)가 결여되어 있으며, 또한 효모 벡터내로의 유전자의 서브클로닝을 위해, N-말단에 측면 제한 엔도뉴클레아제 부위, NotI 및 C-말단에 AatII를 갖는다.
또한, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 TTVg1 서열의 N-말단에 10개 아미노산의 보호 펩티드가 부가된 것을 주지해야 하는데, 왜냐하면 이것이 아미노 말단에 융합될 때 단백질 안정성을 증가시키는 것으로 나타났기 때문이다. 제한효소 부위는 전장 단백질의 평가를 위해 펩티드를 제거할 수 있도록 조작되었다. 코돈 최적화된 TTVg1의 발현은 보호 펩티드 N-말단 융합의 존재 및 부재하에 pET101/D-TOPO 벡터에서 평가하였다. 또한, 사카로마이세스 세레비지에에 대해 코돈 최적화된 TTVg1 서열을 생체내에서 항체 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있는 효모에서 표면-발현된 단백질을 생성할 가능성이 있는 pESC-Trp 벡터내에 서브클로닝하였다.
실시예
5:
TTV
펩티드 접합(
conjugation
) 및 항체 생성(
다클론성
및
단클론성
)
실시예 2에서 제조된 배큘로바이러스 발현된 g2 TTV GST-ORF1 단백질에 대해 토끼의 다클론성 항체를 생성하였다. 2마리 토끼를 과면역화시켰으나, 한마리 토끼만 반응을 보였다. 토끼 항혈청은 돼지에서 증식시킨 g1 TTV 전(whole) 바이러스의 다양한 제제에 교차반응하며, 또한 면역화 항원, 배큘로바이러스 발현된 g2TTV ORF1에 대해서도 반응한다. 그러나, 토끼 항체는 실시예 2에서 기술된 바와 같이 아미노 말단으로부터 제거된 100개 아미노산 N-말단 아르기닌-풍부 영역을 갖는 이. 콜라이 발현된 g2TTV ORF1에는 반응하지 않았다. 이것은 주 항원 에피토프가 절두된(truncated) g2 TTV ORF1에서 소실된 100개 아미노산 영역에 존재할 수 있으며 이 영역에서 g1 및 g2 TTV 사이에 상동성이 있음을 시사할 수 있다.
전장 g1 TTV ORF1 또는 다른 g1 TTV 항원에 대해 단클론성 항체를 생성할 수 있다. 다른 가능한 면역화 항원으로는 g1 TTV 전 바이러스, g2 TTV GST-ORF1(배큘로바이러스), g1 TTV GST-절두형 ORF1(이. 콜라이) 및 g2 TTV GST-절두형 ORF1(이 콜라이)이 포함된다. 항원성인 선형 에피토프를 확인하기 위해 펩티드 라이브러리를 제작할 수 있다. 예를 들면, 10개 아미노산 중복을 갖는 18-량체(18mer) 펩티드를 사용하여 TTV 게놈을 다룰 수 있다. 이어서, 상기 펩티드를 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 사용하여 g1TTV ORF1 또는 g2TTV ORF1 단클론성 및/또는 다클론성 항체에 대한 상기 펩티드의 전체 반응성을 측정하여, 면역원성 영역을 더 확인할 수 있다.
KLH에 가교된 3개의 g1 TTV ORF1 펩티드에 대해 토끼 다클론성 항체를 또한 생성한 후, 펩티드-난백알부민 접합체를 사용하여 선별할 수 있다. 펩티드-KLH 접합체는 또한 단클론성 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 한 태양에서, 다중 g1 TTV ORF1 펩티드 복사체(상이한 균주로부터 유래된 것을 포함함)를 서로 접합시킬 수 있다.
특정 예에서, 펩티드가 일단 생성되면(CPC 사이언티픽(CPC Scientific)), 이들을 KLH 또는 난백알부민(프로테오스 캄파니(Proteos Co.))에 접합시켰다. KLH-접합 펩티드는 토끼의 면역화에 사용한 반면, 난백알부민 접합 펩티드는 혈청을 선별하는데(즉, 운반 단백질의 검출이 아니라 펩티드에 대한 항체를 검출하는데) 사용된다.
실시예
6:
다클론성
항체 생성을 위한 펩티드 서열
다클론성 항체 생성을 위해 TTVg1(AY823990을 기준으로 번호매김)으로부터 하기 펩티드 서열을 선택하고, 각각 서열번호: 22 내지 24로 나타낸다.
1) [L167C]TTV(167-185)-NH2: CKDQDYWFWWDTDFKELYA-NH2 (19개 아미노산, pl 4);
2) TTV(459-479): DFGHHSRFGPFCVKNEPLEFQ (21개 아미노산, pl 6.9); 및
3) [Cys612]-TTV(612-637): CTWKRLRRMVREQLDRRMDHKRQRLH (26개 아미노산, pl 13).
상기 3개 펩티드는 각각 서열에 존재하는 단일 시스테인 잔기를 가져 운반 단백질에 대한 선택적 펩티드 커플링을 가능케 한다. [L167C]TTV(167-185)-NH2 및 [Cys612]-TTV(612-637)에서, 추가 시스테인 잔기가 N-말단에 부가된 반면, TTV(459-479)에서는 470번 위치에 천연 cys가 존재한다. 또한, [L167C]TTV(167-185)-NH2는 아미드화 C-말단을 가져 산성도가 낮은 펩티드를 제공한다. 펩티드는 상이한 TTV 분리물에 대한 서열 동일성을 기준으로 선택하였다. 또한, C-말단 단편 [Cys612]-TTV(612-637)은 표면 노출된 것으로 보인다. 펩티드는 CPC 사이언티픽에서 고체상 펩티드 합성에 의해 통상적으로 제조되었으며 95%보다 높은 순도로 수득되었다.
실시예
7:
크로모스
시스템을 사용한
TTV
g1
ORF1
단백질 발현
크로모스 ACE 시스템은 3개의 주 성분들로 이루어진 단백질 발현 플랫폼이다. 제 1 성분은 플랫폼 ACE로 불리는 중성의 작용성 포유류 인공 염색체로서, 이것은 변형된 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포주의 유전 물질에 속한다. 제 2 성분은 ACE 표적화 벡터로서, 이것은 표적 유전자를 플랫폼 ACE 상에 적재하기 위해 사용되는 플라스미드이다. 제 3 성분은 부위-특이적 단일방향성 인테그라제(integrase)로서, 이것은 플랫폼 ACE 상으로의 표적 유전자의 직접 및 특이적 적재를 촉진한다. ACE 시스템에 관한 추가의 정보는 캐나다의 크로모스 몰레큘라 시스템즈, 인코포레이티드(Chromos Molecular Systems, Inc.)의 웹사이트에서 찾을 수 있거나, 또는 기술이 허가되어 이용가능한 604-415-7100에서 회사와 직접 접촉함으로써 얻을 수 있다.
크로모스 ACE 시스템은 통상적인 단백질 생산 플랫폼에 비해 많은 중요한 이점을 갖는다. 이들중 첫 번째는 속도이다. 크로모스 ACE 시스템은 선택된 유전자의 신속하고 효과적이며 재생가능한 삽입을 가능케 한다. 두 번째 이점은 발현이다. 높은 수준의 단백질이 달성가능하며 시간 경과에 따라 구조적으로 발현된다. 세 번째 이점은 안정성이다. 크로모스 ACE 시스템은 선택적이고 제어된 단백질 발현을 가능케 한다. 간략하게, PCR을 사용하여 TTV7 ORF1 g1DNA의 양쪽 말단에 제한효소 부위를 부가하였다. 또한, 효모 인버타제에 대한 서열을 별도의 PCR 제조물의 5' 말단에 부가하였다. 이어서, 증폭된 서열을 제한 효소로 처리하고 플라스미드 pCTV927 내에 서브클로닝하였다. DNA 서열은 ACGT 인코포레이티드에 의해 입증되었다. 이어서, CHk2(차이니즈 햄스터 난소) 세포를 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(인비트로겐)을 사용하여 플라스미드로 형질감염시키고, 하이그로마이신 B를 사용하여 선택 압력을 가하였다. SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 이용하여 10개의 단일-세포 클론을 TTV 단백질 생산에 대해 분석하였다.
보다 구체적으로, ACE 표적화 벡터 pCTV-TTV7ORF1+YI는 다음과 같이 제작하였다(도 3 참조). 유전자 TTV7ORF1을 PCR 산물로서 수득하였다. 유전자의 5' 말단에 효모 인버타제 분비 신호 및 제한효소 부위 EcoRV를 함유하도록 프라이머를 설계하였다. 유전자의 3' 말단에 제한효소 부위 KpnI를 함유하도록 제 2의 프라이머를 설계하였다. 이들 서열을 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 유전자 TTV7ORF1에 부가시켰다. 이어서, 후속 항생물질 선택에 적합한 하이그로마이신 내성 마커를 함유하는 ACE 표적화 벡터 ATVCHS4Hyg 내에 변형된 유전자를 서브클로닝하였다. 새로운 플라스미드를 pCTV-TTV7ORF1+YI로 명명하였다.
각각 TTV7ORF1/효모 인버타제 및 단일방향성 람다 인테그라제를 암호화하는 플라스미드 pCTV-TTV7ORF1+YI 및 pSIO343을, 플랫폼 ACE를 함유한 Chk2 세포주 내에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 Chk2-TTV7ORF1+YI로 명명하였다. 이들 세포를 96-웰 플레이트에 시딩(seeding)하고 단일-세포 클론의 형성을 모니터링하였다. 하이그로마이신을 함유하는 배지를 각각의 96-웰 플레이트에 첨가하여 ACE 표적화 벡터를 함유하는 세포 클론을 선별하였다. 일단 단일-세포 클론이 확인되면, 이들중 12개를 24-웰 플레이트 내로 확장시킨 후 6-웰 플레이트로 확장시켰다. 마지막으로, 클론을 현탁 세포 배양액 중에 확장시켰다. 배양 Chk2-TTV7ORF1+YI #75를사용하여 후속 실험적 백신 제조를 위한 무세포 상등액을 생성하였다.
도 7은 크로모스-발현된 g1TTV ORF1이 챌린지 대조군에 비해 폐 병변을 상당히 감소시켰으며, 또한 챌린지 대조군에 비해 g1TTV 바이러스혈증의 수치적 정도와 기간을 감소시켰음을 보여준다. 백신접종은 제 0 일 및 제 14 일에 수행하였고, 제 28 일에 챌린지하였다. 검출된 g1TTV 복사체의 기하 평균을 지수로 기록하였다: 즉, 1.00E+00은 1이고, 4.25E+00은 4.25이고, 4.42E+01은 44.2이다.
실시예
8: 핵 편재 신호(
NLS
)
도 4 및 5는 본 발명의 5개 TTV gt1 바이러스 및 본 발명의 2개 TTV gt2(또는 gt2-유사) 바이러스로부터 ORF1(캡시드 단백질)의 7-방향 아미노산 정렬을 제공한다. gt1 캡시드는 gt2 캡시드에 단지 약 22.3 내지 23.2%만 동일하기 때문에 많은 격차와 불일치가 존재함은 물론이다. 그러나, 5개의 gt1 캡시드는 그들 중에서 85.6 내지 99.7% 동일하다. 2개의 gt2 캡시드(TTV10 및TTV13)도 마찬가지로 66.8% 동일하다.
2개의 공지된 유형의 NLS 신호(Pat7 및 Pat4, 예를 들면, 미국 특허 제 7,544,362 호 참조)를 정밀검사에 의해 확인하였다. 도 5에서, NLS 신호는 밑줄쳐 있다. 7개 캡시드 모두 pat7 및 pat4 유형 둘 다의 다중 NLS를 함유하고 있음을 유의한다. 일부는 유전자형 사이에서 보존되고, 일부는 유전자형 내에서 보존되며, 일부는 보존되지 않는다. 대부분이 N-말단 부근에 존재하는데, 여기서 중복 폴리-NLS 영역을 형성하는 경향이 있다. 많은 이들 아르기닌-풍부 모티프는 실질적으로 포유동물에서 면역원성을 나타내며, 이들을 함유하는 펩티드는 항-TTV 항체의 생성에 유용하다.
실시예
9: 감염성 클론 구축을 위한 클론 단편
다음은 아미노산 서열을 서열번호: 9로 나타낸 TTV 유전자형 1 균주 ttvgt1-178(서열번호: 7 참조)의 중복 클론으로부터의 구축에 대한 기준을 제공한다.
요약하면, 함께 전체 TTV 원형 게놈에 걸쳐있는 2개의 TTV 단편(1900bp 및 2200bp)을 별도의 pCR 2.1 TA(인비트로겐) 클로닝 벡터에 따로 클로닝하였다. 클론 단편은 다음과 같았다: 클론 1:680s 내지 2608a= 약 1900bp, 및 클론 2: 1340s 내지 764a= 약 2200bp.
이것을 수행하기 위해, 본 발명의 균주(ttvgt1-27, -7, -17 및 -21)로부터 및 또한 공개 서열(AY823990(g1) 및 AB076001-(Sd-TTV31))로부터 생성된 공통(consensus) 서열을 사용하여 PCR 프라이머를 설계하였다. 680s 및 2608a 또는 1340s 및 764a에서의 서열에 상응하는 프라이머 쌍을 사용하여 TTV 챌린지 균주로 감염된 돼지의 간 균질액 샘플로부터 추출된 DNA로부터의 PCR 산물을 증폭시켰다. 이들 PCR 단편을 키트에 제공된 지시를 이용하여 인비트로겐의 pCR2.1-TOPO TA 벡터 내에 클로닝하였다. 이어서, 클론들을 사용하여 전체 2880 염기 게놈 전체에 걸쳐 DNA 서열을 생성하였으며, 상기 서열은 공개 서열 GQ120664.1 및AY823990.1에 대해 86% 상동성을 나타내는 것으로 나타났다.
완전히 정확한 서열들을 이제 전장 감염성 클론의 구축을 위해 조합될 것이다.
실시예
10:
g1TTV
를 위한 감염성 클론
g1TTV
dsDNA
단편의
클로닝
g1TTV는 단일-가닥 DNA(ssDNA) 바이러스이다. g1TTV의 단편을 PCR을 이용하여 이중-가닥 DNA(dsDNA)로 전환시킨다. 이어서, g1TTV의 dsDNA 단편을 pUC-기본 플라스미드 클로닝 벡터 내에 클로닝하고 이. 콜라이에 형질전환시켰다. g1TTV의 단편은 g1TTV 게놈의 1개의 전장 dsDNA 등가물보다 작다.
g1TTV
dsDNA
연쇄체(concatemer)의
증폭
전장 g1TTV dsDNA 게놈 등가물의 연쇄체를 Φ29 폴리머라제 증폭 키트(예를 들면, 일러스트라 템플리파이(illustra TempliPhi))를 사용하여 생성하였다. 연쇄체를 적절한 제한 엔도뉴클레아제(RE) 부위에서 절단하여 전장 g1TTV dsDNA 단편을 생성하였다. 이들 전장 g1TTV dsDNA 단편들은 플라스미드 벡터에 클로닝될 수 있다. 또는, 연쇄체 또는 비클로닝 단편(RE 절단으로부터 생성된)은 즉시 클로닝하지 않고 후속 분자 생물학 구조물에 사용될 수 있다(하기 참조).
g1TTV
게놈의 탠덤 중복
다음으로 g1TTV 게놈의 탠덤 중복을 암호화하는 플라스미드 구조물을 제작한다. 구조물에서 텐덤 중복(tandem duplication)은 g1TTV 게놈의 전장 dsDNA 등가물의 1.2배 복사체보다 대략 더 크다. 플라스미드에서의 텐덤 중복은 (1) 적절한 RE 부위를 이용한 서브클로닝, (2) 텐덤 중복의 PCR 조립, 또는 (3) 다른 분자 생물학적 방법을 이용하여 생성하였다. 텐덤 중복 생성을 위한 주형은 g1TTV dsDNA 단편 및/또는 전장 g1TTV dsDNA 클론(Φ29 폴리머라제 증폭에 의해 수득됨)이다.
gqTTV
바이러스의
생체내
재조합 및 생성
텐덤 중복 플라스미드 구조물은 g1TTV 바이러스와 동일하지 않다. 텐덤 중복 구조물은 dsDNA인 반면, 상기 바이러스는 ssDNA이고, 구조물은 g1TTV 게놈의 전장의 1.2배를 초과하는 dsDNA 등가물을 암호화하는 반면, 상기 바이러스는 단지 전장 등가물만을 가지며, 구조물이 차단 플라스미드 서열을 함유하는 반면, 바이러스는 바이러스 서열만을 갖는다. 진짜 g1TTV 바이러스를 생성하기 위해, 텐덤 중복 플라스미드 구조물을 (접종, 주사, 전기천공 또는 기타 도입 방법으로) 돼지 내에 도입하거나, 또는 (형질감염, 전기천공 또는 다른 도입 방법으로) 조직 배양 세포 내에 도입하였는데, 여기서 플라스미드 구조물은 상동성 서열에서 재조합되어 g1TTV 게놈의 단위-길이 dsDNA 등가물을 재생한다. g1TTV 게놈의 dsDNA 등가물은 g1TTV 바이러스 생명 주기의 추정 복제 중간체이다. 상기 추정 dsDNA 복제 중간체의 존재는 실제 ssDNA g1TTV의 생산을 유도할 것이다.
g1TTV
ORF
-발현 구조물의 동시-형질감염에 의한
g1TTV
바이러스의
생체내
생성
가능화
원형 dsDAN g1TTV 게놈은 바이러스 생성을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. g1TTV의 dsDNA 형태가 복제-반응능이 아니라는 예기치 못한 경우에서, g1TTV ORF의 즉시 발현은 dsDNA 복제 중간체로부터 g1TTV 복제의 개시를 필요로 할 수 있다. 예를 들면, g1TTV ORF로의 전사 프로모터(예를 들면, CMV)의 융합에 의해, g1TTV ORF의 생체내 전사를 이끄는 플라스미드 구조물이 제조될 수 있다. 또는, 예를 들면, g1TTV ORF로의 전사 프로모터(예를 들어, T7)의 융합 후 시험관내 전사 키트의 사용에 의해, g1TTV ORF 전사체의 시험관내 생성을 이끄는 플라스미드 구조물을 제조할 수 있다. g1TTV ORF-발현 플라스미드 또는 g1TTV ORF-발현 RNA 전사체는 텐덤 중복 플라스미드 구조물과 함께 돼지에 동시-주입되거나 세포내에 동시-혈질감염되어 g1TTV 바이러스를 제공할 수 있다.
g1TTV
바이러스 생성 검출
지금까지, 전체 g1TTV 바이러스는 조직 배양 세포에서 증식될 수 없었다. g1TTV 바이러스의 생성은 면역 시약(예를 들면, α-g1TTV 항체)에 의해 또는 분자 방법(예를 들면, qPCR)에 의해 검출된다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (14)
- 하기로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자:
(a) 서열 번호: 4; 및
(b) (a)의 상보체. - 제 1 항에 따른 DNA 폴리뉴클레오티드 서열의 상보체인 RNA 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제 1 항에 따른 뉴클레오티드 서열로부터 발현되는 생바이러스, 또는 완전히 또는 부분적으로 약독화된 바이러스.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A201 | Request for examination | ||
| A107 | Divisional application of patent | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |