MX2012002273A - Vacunas y diagnostico para torque teno virus porcino. - Google Patents

Vacunas y diagnostico para torque teno virus porcino.

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Abstract

La presente invención proporciona cuatro preparaciones purificadas que contienen una molécula de ácido polinucleico que codifica los genotipos del virus Torque teno porcino (PTTV) o subtipos PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c- VA. La presente invención también proporciona clones de ADN infecciosos, plásmido biológicamente funcional o vector vírico que contiene la molécula de genoma de ácido nucleico infeccioso de los mismos. L presente invención proporciona además vacunas víricas exterminadas o subunidad de cápsida recombinantes purificadas y expresadas por vector, atenuadas, vivas para protección contra infección PTTV. La presente invención adicionalmente proporciona vacunas de subunidad que comprenden productos del gen específico PTTV, especialmente producto del gen de ¿cápsida ORF1 para protección contra infección PTTV. Además, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar infección PTTV por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebador específico para genotipos PTTV1, PTTV2, y PTTV1 individual. Finalmente, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar infección PTTV por medio de métodos inmunológicos, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA) y Western blot usando antígenos específicos de PTTV para detectar anticuerpos específicos PTTV de suero.

Description

VACUNAS Y DIAGNÓSTICO PARA TORQUE TE O VIRUS PORCINO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vacunas para proteger contra infección por Torque teño virus (TTV) porcino, y clones de ADN infecciosos de TTV porcino (PTTV) y sus usos de los mismos. La presente invención también se refiere al diagnóstico de la infección por Torque teño virus (PTTV) porcina, particularmente diagnóstico de la infección por PTTV especifica de especie o tipo, y simultáneamente infección de cepas múltiples de diferentes genotipos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El torque teño virus (TTV) se descubrió primero en un paciente japonés con hepatitis que no era A-E después de transfusión en 1997 (Nishizawa, T., Okamoto, H. , Konishi, K., Yoshizawa, H., Miyakawa, Y., y Mayumi, M. (1997). Un virus de ADN (TTV) novedoso asociado con niveles de transaminasa elevados en hepatitis posterior a una transfusión de etiología desconocida. Biochem Biophys Res Coiranun 241(1), 92-7.). Desde entonces, un gran número de cepas TTV humanas y dos grupos de virus relacionados con TTV, designados posteriormente como Torque teño mini virus (TTMV) y Torque teño midi virus (TT DV) , se han identificado con alta prevalencia en suero y otros tejidos de humanos saludables (Hiño, S., and Miyata, H. (2007 ) . Torque teño virus (TTV) : current status. Rev Med Virol ¦ 17(1), 45-57; Okamoto, H. (2009a) . History of discoveries and pathogenicity of TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 1-20) . Los TTV, TTMV y TT DV humanos son virus esféricos no envueltos con genomas de ADN de hebra sencilla circular (ssADN) de 3.6-3.9, 2.8-2.9 y 3.2 kb en longitud, respectivamente, y se clasifican actualmente en una familia recientemente establecida Anelloviridae por el Comité Internacional en Taxonomía de Virus (ICTV; http: //www . ictvonline . org/virusTaxonomy . asp?bhcp=l) (Biagini, P. (2009) . Classification of ' TTV and related viruses (anelloviruses) . Curr Top Microbiol Immunol 331, 21-33) . Estos tres grupos de virus relacionados con TTV exhiben un alto grado de homogeneidad genética, cada uno consiste de muchos genogrupos y genotipos (Biagini, P., Gallian, P., Cantaloube, J. F., .Attoui, H., de Micco, P., y de Lamballerie, X. (2006) . Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups in French blood donors. J Med Virol 78(2), 298-304; Jelcic, I., Hotz-Wagenblatt, A., Hunziker, A., Zur Hausen, H., y de Villiers, E. M. (2004). Isolation of múltiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin 's disease patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable región. J Virol 78(14), 7498-507). La prevalencia de infecciones múltiples de TTV con genotipos diferentes asi como infecciones dobles o triples de TTV, TTMV y TTMDV se han documentado en humanos, y se consideran que son un evento común en adultos humanos saludables (Niel, C, Saback, F. L., and Lampe, E. (2000) . Coinfection with múltiple TT virus strains belonging to different genotypes is a common event in healthy Brazilian adults. J Clin Microbiol 38(5), 1926-30; Ninomiya, M., Takahashi, M . , Hoshino, Y., Ichiyama, K. , Simmonds, P., y Okamoto, H. (2009). Analysis of the entire genomes of torque. teño midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees. J Gen Virol 90 (Pt 2), 347-58; Okamoto, H. (2009a) . History of discoveries and pathogenicity of TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 1-20; Takayama, S., Miura, T., Matsuo, S., Taki, M. , and Sugii, S. (1999). Prevalence and persistence of a novel DNA TT virus (TTV) infection in Japanese haemophiliacs. Br J Haematol 104(3), 626-9) .
TTV infecta no sólo a humanos sino también a varias otras especies también incluyendo primates no humanos, túpalas, cerdos, ganado, gatos, perros y leones marinos (Biagini, P., Uch, R. , Belhouchet, M . , Attoui, H., Cantaloube, J. F. , Brisbarre, N . , y de Micco, P. (2007). Circular genomes related to anelloviruses identified in human and animal samples by using a combined rolling-circle amplification/sequence-independent single primer amplification approach-. J Gen Virol 88 (Pt 10), 2696-701; Inami, T., Obara, T., Moriyama, M. , Arakawa, Y., y Abe, . (2000). Full-length nucleotide sequence of a simian TT virus isolate . obtained from a chimpanzee: evidence for a new TT virus-like species. Virology 277(2), 330-5; Ng, T. F . , Suedmeyer, W. . , Wheeler, E . , Gulland, F. , y Breitbart, M. (2009). Novel anellovirus ' discovered from a mortality event of captive California sea lions. J Gen Virol 90 (Pt 5), 1256-61; Okamoto, H. (2009b) . TT viruses in animáis. Curr Top Microbiol Immunol 331, 35-52; Okamoto, H., Nishizawa, T., Takahashi, M . , Tawara, -A., Peng, Y., Kishimoto, J. , y Wang, Y. (2001). Genomic and evolutionary characterization of TT virus (TTV) in tupaias and comparison with species-specific TTVs in humans and non-human primates. J Gen Virol 82 (Pt 9), 2041-50; Okamoto, H., Nishizawa, T., Tawara, A., Peng, Y., Takahashi, M . , Kishimoto, J. , Tanaka, T., Miyakawa, Y., y Mayumi, M. (2000a) . Species-specific TT viruses in humans and nonhuman primates and their phylogenetic relatedness. Virology 277(2), 368-78; Okamoto, H., Takahashi, M., Nishizawa, T .' , Tawara, A., Fukai, K., Muramatsu, U., Naito, Y., y Yoshikawa, A. (2002). Genomic characterization of TT viruses (TTVs) in pigs, cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias . J Gen Virol 83 (Pt 6), 1291-7). Además, los chimpancés también se infectan con TTMV y TTMDV (Ninomiya, . , Takahashi, M., Hoshino, Y., Ichiyama, K., Simmonds, P., y Okamoto, H . (2009) . Analysis of the entire genomes of torque teño midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees. J Gen Virol 90 (Pt 2), 347-58; Okamoto et al., 2000a, supra) . Aunque los tamaños genómicos de las cepas TTV animales identificadas, especialmente los TTV de animal no primate, son relativamente más pequeñas que las de TTV humano, comparten la misma estructura genómica con un mínimo de dos estructuras de lectura abierta parcialmente traslapadas (ORF1 y ORF2 ) traducidas del ssADN negativo así como una extensión corta de región no traducida (UTR) con alto contenido de GC (-90%) (Okamoto, 2009b, supra) . La configuración de ORFs de TTV es completamente similar a la del virus de anemia del pollo (CAV) que pertenece al género Gyrovirus en la familia Circoviridae pero es diferente del circovirus porcino (PCV) tipos 1 (PCV1) y 2 (PCV2), que se clasifican también en la misma familia (Davidson, I., and. Shulman, L. M. (2008). Unraveling the puzzle of human anellovirus infections by comparison with avian infections with the chicken anemia virus. Virus Res 137(1), 1-15; Hiño, S., y Prasetyo, A. A. (2009). Relationship of Torque teño virus to chicken anemia virus. Curr Top Microbiol Immunol 331, 117-30). Los genomas de PCV1 y PCV2 son de ambos .sentidos, en los cuales el ORF1 se codifica por la hebra genómica y el ORF2 se codifica por la hebra antigenómica (Hiño y Miyata, 2007, supra) . Recientemente, el patrón de transcripción y los productos traducidos de ambos genotipos TTV humanos 1 y 6 se han identificado por transfección de los clones de ADN infecciosos de TTV respectivos en células cultivadas (Mueller, B., Maerz, A., Doberstein, K. , Finsterbusch, T., y Mankertz, A. (2008). Gene expression of the human Torque Teño Virus isolate P/1C1. Virology 381(1), 36-45; Qiu, J., Kakkola, L., Cheng, F., Ye, C, Soderlund-Venermo, M., Hedman, K. , and Pintel, D. J. (2005). Human circovirus TT virus genotype · 6 expresses six proteins following transfection of a full-length clone. J Virol 79(10), 6505-10) . La expresión de al menos seis proteínas, designadas ORF1, ORF2, ORFl/1, ORF2/2, ORF1/2 y ORF2/3, de tres o más mARNs empalmados, se han reportado (Kakkola, L., Hedman, K., Qiu, J., Pintel, D., y Soderlund-Venermo, M. (2009). Replication of and protein synthesis by TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 53-64; Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra) . En consecuencia, es posible que, cuando más datos con respecto al TTV animal estén disponibles, necesitará modificarse la estructura de genoma presumida del TTV animal.
Aunque el TTV se identificó primero en un paciente con hepatitis criptogénica, no estuvieron disponibles estudios posteriores para producir evidencia de un papel importante de TTV en la patogénesis de hepatitis u otra enfermedad (Hiño y Miyata, 2007, supra; Maggi, F . , y Bendinelli, M. (2009). Immunobiology of the Torque teño viruses and other anelloviruses . Curr Top Microbiol Immunol 331, 65-90; Okamoto, 2009a, supra) . Aunque el TTV humano no se considera que está directamente asociado con una enfermedad, el TTV porcino (PTTV) recientemente mostró contribuir parcialmente a la inducción experimental de dermatitis porcina y síndrome de neuropatía (PDNS) combinado con infección por virus de síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) (Krakowka, S., Hartünian, C, Hamberg, A., Shoup, D. , Rings, M . , Zhang, Y., Alian, G., y Ellis, J. A. (2008). Evaluation of induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirus type 2. Am J Vet Res 69(12), 1615-22), y también a la inducción experimental ' de síndrome de atrofia multisistémica posterior al destete (PMWS) combinado con infección PCV2 en un modelo de cerdo gnotobiotico (Ellis, J. A., Alian, G., and Krakowka, S. (2008). Effect of coinfection with genogroup 1 porcine Torque teño virus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pigs. Am J Vet Res 69(12), 1608-14) . Los datos sugieren que el TTV porcino es patogénico en cerdos. Sin embargo, se necesitan estudios profundos adicionales con una forma biológicamente pura de virus PTTV para caracterizar definitivamente las enfermedades y lesiones asociadas con infección por PTTV.
Comparado con el TTV humano, la información genómica de PTTV es muy limitada. Actualmente, sólo una secuencia genómica de longitud completa y dos de longitud cuasi-completa de PTTV se reportan de cerdos en Japón y Brasil, respectivamente (Niel, C., Diniz- endes , L., y Devalle, S. (2005). Rolling-circle amplification of Torque teño virus (TTV) complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup. J Gen Virol 86 (Pt 5), 1343-7; Okamoto et al., 2002, supra). Entre las tres cepas PTTV conocidas, las cepas Sd-TTV31 y TTV-lp se agruparon en conjunto en el genogrupo 1 (PTTV1), mientras que TTV-2p fue la única cepa clasificada en el genogrupo 2 (PTTV2) (Niel et al., ' 2005, supra).. Sin embargo, la clasificación del genogrupo es un concepto vago en la taxonomía de virología, y se necesita una clasificación más exacta y adicional de PTTV pero sólo puede realizarse cuando están disponibles más secuencias genómicas de longitud completa de cepas PTTV nuevas que representen genotipos múltiples.
Se demostró previamente que las infecciones por PTTV estuvieron extendidas en cerdos de seis países diferentes incluyendo los Estados Unidos de América, Canadá, España, China, Corea y Tailandia (McKeown, N. E., Fenaux, . , Halbur, P. G., y Meng, X. J. (2004). Molecular characterization of porcine TT virus, an orphan virus, in pigs from six different countries. Vet Microbiol 104(1-2), 113-7).
Todavía será debatible si los TTV porcinos juegan un papel importante en la · patogénesis de enfermedades específicas del cerdo. En un modelo de cerdo gnotobiótico, se demostró que la infección por PTTVl sola no desarrolla ninguna enfermedad clínica pero induce lesiones histológicas moderadas (Krakowka, S. and Ellis, J.A., 2008. Evaluation of the effects of porcine genogroup 1 torque teño virus in gnotobiotic swine. Am J Vet Res 69, 1623-9). Los cerdos gnotobióticos que se inocularon experimentalmente con virus de síndrome respiratorio y reproductivo tanto PTTVl y porcino (PRRSV) desarrollan dermatitis porcina clínica y síndrome de nefropatía (PDNS) (Krakowka, S., Hartunian, C, Hamberg, A., Shoup, D . , Rings, M. , Zhang, Y . , Alian, G. y Ellis, J.A., 2008. Evaluation . of induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirus type 2. Am J Vet Res 69, 1615-22), mientras que los cerdos inoculados con circovirus tipo 2 tanto PTTV1 como porcino (PCV2) desarrollan síndrome de atrofia multisistémica posterior al destete agudo (PMWS) (Ellis et al., 2008, supra). Aunque PCV2 se considera como el agente causante primario para PMWS clínico o enfermedades asociadas con PCV (PCVAD), se observó una prevalencia más alta de infección por PTTV2 en cerdos afectados con PMWS con bajo o sin PCV2 que en .cerdos no afectados con PMWS en España (Kekarainen et al. , 2006, supra) . Los datos sugieren colectivamente que los TTVs porcinos pueden servir como co-factores involucrados en disparar o exacerbar enfermedades en cerdos.
El TTV porcino se ha detectado en muestras de suero, heces, saliva, semen y tejido porcinas de cerdos infectados, lo que indica sus rutas de transmisión diversas que incluyen transmisiones tanto horizontales como verticales (Kekarainen et al., 2007, supra; Pozzuto, T., Mueller, B., Meehan, B., Ringler, S . S . , Mclntosh, K.A., Ellis, J.A., Mankertz, A. y Krakowka, S., 2009. In útero transmission of porcine Torque teño virus. Vet Microbio! 137, 375-9; Sibila, M., Martínez-Guiño, L., Huerta, E., Llorens, A., Mora, M., Grau-Roma, L., Kekarainen, T. and Segales, J .., 2009. Swine torque teño virus (TTV) infection and excretion dynamics in conventional pig farms. Vet Microbiol 139, 213-8). Sin embargo, la detección actual de infección TTV porcina se basó principalmente en ensayos PCR convencionales. Hasta ahora, ni el ensayo serológico ni el ¦ sistema ' de cultivo vírico se han establecido. En particular, las amplificaciones PCR jerarquizadas de las regiones conservadoras en el UTR de PTTV1 y PTTV2, respectivamente, desarrolladas por un grupo español, se han usado ampliamente (Kekarainen et al., 2006, supra) . Ya que la cantidad de virus posiblemente se asocia con la severidad de las enfermedades clínicas, como se demuestra por PCVAD inducido por PCV2 (Opriessnig, T., Meng, X.J. y Halbur, P.G., 2007. Porcine circovirus type 2 associated disease: update on current terminology, clinical manifestations , pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies. J Vet Diagn Invest 19, 591-615), será importante determinar la carga vírica del TTV porcino por PCR cuantitativa en tiempo real que la . presencia de ADN TTV por PCR convencional. Además, la PR en tiempo real es más confiable, rápida y menos cara que la PCR convencional. Recientemente, se describieron dos ensayos PCR en tiempo real basados en la sonda TaqMan para detección y cuantificación de dos especies de TTV porcino (Brassard, J. , Gagne, M.J., Houde, A., Poitras, E. y Ward, P., 2009. Development of a real-time TaqMan PCR assay for the detection of porcine and bovine Torque teño virus. J Appl Microbiol. Nov 14, 2009, Epub ahead of print; Gallei, A., Pesch, S., Esking, W.S., Keller, C. y Ohlinger, V.F., 2009. Porcine Torque teño virus: Determination of viral genomic loads by genogroup-specific multiplex rt-PCR, detection of frequent múltiple infections with genogroups 1 or 2, and establishment of viral full-length sequences. Vet Microbiol. Dec 21, 2009, Epub adelantado al impreso). Una desventaja principal de los ensayos de sonda es que pueden obtenerse resultados negativos falsos en las secuencias enlazadas a la sonda que contienen mutaciones (Anderson, T.P., Werno, A.M., Beynon, K.A. y Murdoch, D.R., 2003. Failure to genotype herpes simplex virus by real-time PCR assay and melting curve analysis due to sequence variation within probé binding sites. J Clin Microbiol 41, 2135-7). Considerando el alto grado de heterogeneidad entre las secuencias de cepas TTV porcinas conocidas, se esperan variaciones en las secuencias enlazadas a la sonda para cepas de campo .de PTTVs . La PCR en tiempo real basada en SYBR verde es un método alternativo que evita este problema potencial, a pesar de su especificidad relativamente inferior, que proporciona una trayectoria universal para detectar y cuantificar las variantes TTV de porcino potenciales. Por otro lado, los análisis de curva de fusión (MCA) después de PCR en tiempo real con SYBR verde aseguran una especificidad de reacción y también permite la detección multiplexada de distintos tipos de virus (Ririe, K.M., Rasmussen, R.P. y Wittwer, C.T., 1997. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 245, 154-60) . Los métodos de PCR en tiempo real de SYBR verde basados en MCA han sido aplicados exitosamente a varios virus humanos y veterinarios (Gibellini, D., Gardini, F. , Vitone, F. , Schiavone, P., Furlini, G. y Re, M.C., 2006. Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR Green real time multiplex RT-PCR technique in plasma samples. Mol Cell Probes 20, 223-9; Martínez, E . , Riera, P., Sitj a , . M . , Fang, Y., Oliveira, S. y Maldonado, J. , 2008. Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR Green. Res Vet Sci 85, 184-93; Mouillesseaux, K.P., Klimpel, K.R. and Dhar, A.K., 2003. Improvement in the specificity and sensitivity of detection for the Taura syndrome virus and yellow head virus of penaeid shrimp by increasing the amplicon size in SYBR Green real-time RT-PCR. J Virol Methods 111, 121-7; ilhelm, S., Zimmermann, P., Selbitz, H.J. y Truyen, U., 2006. Real-time PCR protocol for the detection of porcine parvovirus in field samples. J Virol Methods 134, 257-60).
Actualmente, se conoce poco acerca de la respuesta humoral especifica de PTTV. Ya que los ensayos basados en PCR no reflejan el curso de la infección por PTTV en cerdos, es necesario un ensayo inmunosorbente ligado a la enzima eficiente (ELISA) para la detección de anticuerpo de suero PTTV para evaluar la seroprevalencia de PTTV y ayudar a caracterizar el papel de PTTV en enfermedades porcinas.
Hasta ahora, no están disponibles vacunas de subunidad, eliminadoras y vivas para TTVs porcinos. Será deseable y ventajoso expresar proteínas .cápsida PTTV recombinantes de diferentes genotipos para el desarrollo de vacunas de subunidad PTTV, y construir clones de ADN molecular de PTTV infecciosos de diferentes genotipos para propagar la forma biológica pura de PTTVs en sistema de cultivo celular que se usan para desarrollar vacunas eliminadoras y vivas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico infecciosa ("clon de ADN infeccioso") de Torque teño virus porcino (PTTV) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un PTTV infeccioso que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 80% de homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos de PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los clones de ADN infecciosos de PTTV establecidos en la reivindicación 1, en donde la secuencia genómica se selecciona de secuencias establecidas en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll,. y SEQ ID NO:12.
La presente invención proporciona un plásmido biológicamente funcional o vector vírico que contiene los genomas PTTV infecciosos. ' La presente invención proporciona una célula hospedera apropiada transfectada con el plásmido de ADN de clon infeccioso o vector vírico.
La presente invención proporciona un PTTV infeccioso producido por células transfectadas con los clones de ADN infecciosos de PTTV.
La presente invención también proporciona una vacuna vírica que comprende un portador no tóxico, fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunogénica de un miembro seleccionado del grupo que consiste de (a) una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 80% de homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA, o su hebra complementaria, (b) un plásmido biológicamente funcional o vector vírico que contiene una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 80% de homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, and PTTV2c-VA, o su hebra complementaria, y (c) un PTTV no patogénico infeccioso, avirulento que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 80% de homología con una secuencia .genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la vacuna contiene virus PTTV vivos derivados de los clones infecciosos PTTV. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la vacuna contiene virus PTTV eliminadores derivados de los clones infecciosos PTTV.
La presente invención proporciona proteínas recombinantes purificadas expresadas a partir de los genes de cápsida 0RF1 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, y PTTV2c-VA en sistema de expresión bacteriana, y el uso de estas proteínas de cápsida recombinantes como vacunas de subunidad contra infecciones PTTV. En una modalidad de la presente invención, las proteínas de cápsida recombinantes para el uso como vacunas de subunidad se expresan en sistema de expresión de baculovirus y otros sistemas de vector de expresión.
De acuerdo . con un aspecto adicional de la presente invención, contiene además un adyuvante.
La presente invención proporciona además un método para inmunizar un cerdo contra infección vírica de PTTV, que comprende administrar a un cerdo una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna vírica.
De acuerdo con un' aspecto de la presente invención, el método comprende administrar la proteína cápsida de subunidad recombinante, la molécula de ácido nucleico infecciosa o virus PTTV vivos al cerdo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el método comprende administrar la vacuna parenteralmente, intranasalmente, intradérmicamente,. o transdérmicamente al cerdo. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, el método .comprende administrar la vacuna intralinfoidalmente o intramuscularmente al cerdo.
La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que consiste de la secuencia de la secuencia de nucleótido de PTTVla-VA establecida en SEQ ID NO: 9.
La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que consiste de la secuencia de la secuencia de nucleótido de PTTVlb-VA establecida en SEQ ID No: 10.
La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado que consiste de la secuencia de la secuencia de nucleótido de PTTV2b-VA establecida en SEQ ID No:ll.
La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado, que consiste de la secuencia de la secuencia de nucleótido de PTTV2c-VA establecida en SEQ ID No: 12.
La presente invención proporciona además una vacuna de subunidad que comprende un fragmento inmunogenético de una secuencia de polipéptido o una proteína completa traducida de acuerdo con una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de ORF1, ORF2, ORF1/1, y ORF2/2 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, and PTTV2c-VA, particularmente el ORF1 que codifica la proteína de cápsida.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido está seleccionada del grupo que consiste de ORFl de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido es ORFl del genotipo PTTV PTTVla-VA. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, la secuencia de polinucleótido es ORFl del genotipo PTTV PTTVlb-VA. De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido es ORFl del subtipo PTTV PTTV2c-VA.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la secuencia de polipéptido está seleccionada del grupo que consiste de la secuencia establecida en SEQ ID No: 13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, y SEQ ID No:28.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 13. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 14. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 16. En una modalidad específica de la presente invención, la secuencia de polipéptido es de región de terminal C (aa 310-625) de SEQ ID No: 16. De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No:20.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, la vacuna contiene además un adyuvante.
La presente invención proporciona además un método para inmunizar un cerdo contra infección vírica de PTTV, que comprende administrar a un cerdo una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna que comprende un fragmento inmunogenético de una secuencia de polipéptido o una proteína completa traducida de acuerdo con una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de ORF1, ORF2, ORF1/1, y ORF2/2 de los genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el método comprende administrar el fragmento inmunogenético o proteína cápsida recombinante al cerdo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el método comprende administrar la vacuna parenteralmente, intranasalmente , intradérmicamente , o transdérmicamente al cerdo. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, el método comprende administrar la vacuna de forma intralinfoidal o intramuscular al cerdo. ' La presente invención proporciona adicionalmente un método para diagnosticar infección por PTTVl y cuantificación de carga de PTTVl, que comprende extraer ADN de una muestra que se sospecha de infección por PTTVl, realizando reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, y detectar amplificación especifica, de PTTVl. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la reacción en cadena de polimerasa es una PCR en tiempo real de SYBR verde.
La presente invención proporciona además un método para diagnosticar infección por PTTV2 y cuantificación de carga de PTTV2, que comprende extraer ADN de una muestra que se sospecha de infección por PTTV2 , realizando reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, y detectar amplificación especifica de PTTV2. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la reacción en cadena de polimerasa es una PCR en tiempo real de SYBR verde.
La presente invención también proporciona un método para detectar y diagnosticar simultáneamente PTTVl e infección por PTTV2, que comprende extraer ADN de una muestra que se sospecha de infección por PTTV, realizando reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, y detectar PTTV1 y amplificación especifica de PTTV2. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la reacción en cadena de polimerasa es una PCR en tiempo real de SYBR verde .
La presente invención, además, proporciona un método para detectar y diagnosticar simultáneamente infección por PTTVla y PTTVlb, que comprende extraer ADN de una muestra que se sospecha de infección por PTTV1, realizando una primera reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, realizando una segunda PCR usando cebadores que comprende las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO : 3 , y .SEQ ID NO:38, y detectar amplificación especifica de PTTVla. y PTTVlb.
La presente invención proporciona un método para diagnosticar infección por PTTV, que comprende inmovilizar un fragmento inmunogenético de una secuencia de polipéptido traducida de acuerdo con una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo qué consiste de 0RF1, 0RF2, 0RF1/1, y ORF2/2 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA; poner en contacto una muestra de suero de un cerdo que se sospecha de infección por PTTV con el fragmento inmunogenético inmovilizado, y detectar anticuerpo capturado especifico para el fragmento inmunogenético .
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la secuencia de polinucleótido está seleccionada del grupo que consiste de 0RF1 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la secuencia de polinucleótido es 0RF1 del genotipo PTTV PTTVla-VA. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la secuencia de polinucleótido es ORF1 del genotipo PTTV PTTVlb-VA. . De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, la secuencia de polinucleótido es ORF1 del subtipo PTTV PTTV2c-VA.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polipéptido está seleccionada del grupo que consiste de la secuencia establecida en SEQ ID No: 13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15, SEQ ID. No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, y SEQ ID No:28.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 13. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 14. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 16. De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, el fragmento inmunogenético es de región de terminal C (aa 310-625) de SEQ ID No: 16. De acuerdo aún con otra modalidad de la presente invención, la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 20.
La presente invención proporciona tres ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima estandarizados (ELISA) para diagnosticar infecciones PTTV y detectar anticuerpos en el suero de cerdos infectados por genotipos PTTV PTTVla-VA, PTTVlb-VA, y todos los subtipos conocidos en especies PTTV 2.
Las pruebas de diagnóstico ELISA se basan en la proteina cápsida ORF1 recombinante expresada en baculovirus o expresada en bacterias de genotipos PTTV PTTVla-VA, PTTVlb-VA, y PTTV2c-VA.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo capturado detectado es por medio de Western blot. De acuerdo aún con otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo capturado detectado es por medio de ensayo inmunosorbente ligado a. la enzima (ELISA) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las características antes mencionadas de la invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada de la invención leída en conjunto con las figuras en las cuales: La Figura 1A y IB representa el diagrama esquemático de estructuras genómicas, estrategias para clonación genómica y ensambles de cuatro cepas de E.U.A. prototipo de cepas del virus TTV porcino grupo 1 (especie 1) and grupo 2 (especie 2) ; La Figura 2 representa distribución PASC (siglas en inglés de comparaciones de secuencia en pares) de comparaciones de secuencia de nucleótido de 121 cepas TTV disponibles en la. base de datos del GenBank. Se exhiben el género, especies, tipos, subtipos y variantes y sus correspondientes porcentajes de identidades de secuencia de nucleótido; La Figura 3A ilustra un árbol filogenético construido por el método de unir los vecinos con base en las secuencias de nucleótido genómicas de longitud completa; La Figura 3B ilustra árboles filogenéticos construidos con base en secuencias de aminoácidos deducidas de ORF1 entre siete cepas de TTV porcino; La Figura 3C ilustra árboles filogenéticos construidos con base en secuencias de aminoácidos deducidas de 0RF1/1 entre, siete cepas de TTV porcino; La Figura 3D ilustra árboles filogenéticos construidos con base en secuencias de aminoácidos deducidas de 0RF2 entre siete cepas de TTV porcino; La Figura 3E ilustra árboles filogenéticos construidos con base en secuencias de aminoácidos deducidas de ORF2/2 entre siete cepas de TTV porcino; La Figura 4 representa una alineación de las secuencias de aminoácido de longitud completa de ORFl entre siete cepas PTTV; La Figura 5 representa una alineación de las secuencias de aminoácido de longitud completa de ORF2 entre siete cepas PTTV; La Figura 6A ilustra curvas de fusión de productos PCR en tiempo real de PTTV1 después de 40 ciclos de amplificaciones de plantilla estándar respectiva (indicada en azul) y 20 muestras de suero porcino; La Figura 6B ilustra curvas de fusión de productos PCR en tiempo real de PTTV2 después de 40 ciclos de amplificaciones de plantilla estándar respectiva y 20 muestras de suero porcino; Las Figuras 7A-7E ilustran análisis de curva de fusión (MCA) de PCR en tiempo real doble basada en SYBR verde de PTTV1/PTTV2; La Figura 8 representa una alineación de secuencia de nucleótidos localizada en la parte de terminal N del ORFl supuesto entre siete cepas PTTV; Las Figuras 9A. y 9B representan perfiles de hidrofilicidad y regiones conservadas de los cuatro TTV2 porcino conocidos; Las Figuras 10A-10C ilustran la expresión y purificación de proteina cápsida ORFl de PTTV2c recombinante; Las Figuras 11A-11C muestran resultados representativos de análisis Western blot de muestras de suero porcino seleccionadas; La Figura 12 ilustra la consistencia de Western blot y ELISA basado en PTTV2c-ORFl; La Figura 13 exhibe gráficos de Box-and-Whisker (diagramas de distribución de datos) del nivel de anticuerpo en suero PTTV2 por carga vírica en 138 cerdos de fuentes diferentes; La Figura 14A ilustra una evaluación retrospectiva de la carga vírica de PTTV2 ; La Figura 14B ilustra el nivel de anticuerpo para proteina cápsida 0FR1 de PTTV2 en 10 cerdos que han crecido desde que llegaron hasta dos meses después de haber llegado; Las Figuras 15A-15C ilustran la expresión y purificación de proteina cápsida GRFl recombinante de PTTVla y PTTVlb; y La Figura 16 muestra ejemplos de análisis Western blot basados en PTTVla-ORFl de muestras de suero porcino seleccionadas de una granja de Wisconsin.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la presente invención, en un ejemplo especifico, los cuatro subtipos de TTV porcino novedosos anteriormente mencionados se aislan de un cerdo macho sencillo en Virginia.
En la Fig. 1A, se muestran ambos de los genomas PTTV1 y PTTV2 en negrita y los tamaños y direcciones de los cuatro ORFs supuestas (ORF1, ORF2, ORF1/1 y ORF2/2) se indican por flechas. Las regiones' ricas en GC también se muestran. Los arcos de linea punteada A y D representa las regiones usadas para detección de PTTV1 y PTTV2 de muestras de suero y semen por PCR anidado, respectivamente. Los arcos de linea punteada B y C representa los dos fragmentos PCR traslapados para clonación genómica de PTTV1 mientras que los arcos de linea punteada E y F representan los dos fragmentos PCR traslapados para clonación genómica de PTTV2. Las ubicaciones de los cebadores usados en el estudio- (ver Tabla 1) también se muestran en las posiciones, correspondientes .
Una muestra de suero de cerdo macho (SR#5) que se mostró que es positiva para tanto PTTVl como PTTV2 en la PCR de primera ronda, de esta manera es indicativa de carga vírica más alta, se usó para clonación genómica de longitud completa subsecuente de PTTV. Sorpresivamente, los intentos iniciales para utilizar dos conjuntos de cebador (NG372/NG373 y NG384/NG385) de una PCR inversa (Okamoto et al., 2002, supra) diseñado para la clonación de la primera cepa PTTV Sd-TTV31 para amplificar el ADN genómico del virus no fueron exitosos. No se. obtuvo producto PCR después de varios ensayos. Con base en la secuencia inicial de la región A de PTTVl y la región D de PTTV2, dos pares nuevos de cebadores (TTV1-If (SEQ ID NO: 1) /TTV1-2340R (SEQ ID NO:2) y TTV1-2311F (SEQ ID N0:3)/TTV1-IR(SEQ ID NO: 4)) se diseñaron posteriormente para amplificar las regiones B y C abarcando el genoma de PTTVl supuesto, y dos pares adicionales de cebadores (TTV2-IF(SEQ ID NO: 5) /TTV2-2316R (SEQ ID NO: 6) y TTV2-GCF(SEQ ID NO:7)/TTV2-IR(SEQ ID NO: 8)) para amplificar regiones E y F abarcando el genoma de PTTV2 supuesto, respectivamente (Fig. 1A y Tabla 1). Los cebadores TTV1-2340R ( SEQ ID NO:2) y TTV1-2311F (SEQ ID NO: 3) se dedujeron de una secuencia común en cepas PTTVl Sd-TTV31 (Okamoto et al., 2002, supra) y TTV-lp (Niel et al., 2005) que está ausente en cepa PTTV2 TTV-2p (Niel et al., 2005, supra), mientras que los cebadores TTV2-2316R ( SEQ ID NO: 6) and TTV2-GCF(SEQ ID NO: 7) se. dedujeron de una secuencia de cepa TTV-2p que está ausente en las dos cepas PTTV1. Los cuatro productos PCR diferentes resultantes con tamaños esperados cada uno se insertaron en un vector de clonación de punta roma, y los plásmidos recombinantes resultantes se transformaron en Escherichia coli. Se identificaron ocho hasta quince clones bacterianos positivos (con color blanco) para cada constructo que representa los fraqmentos B, C, E y F y posteriormente procesaron en secuencia.
Tabla 1. Cebadores de oligonucleótido usados para amplificaciones de PCR agrupada y PCR genómica de virus porcinos Cebador ID Secuencia (5' hasta 3' ) Usado para: TTVl-mF (SEQ ID NO: 45) TACACTTCCGGGTTCAGGAGGCT Detección de TTV1 de porcino TTVl-mR (SEQ ID NO: 46) ACTCAGCCATTCGGAACCTCAC Detección de TTV1 de porcino TTVl-nF (SEQ ID NO: 47) CAATTTGGCTCGCTTCGCTCGC Detección de TTV1 de porcino TTVl-nR (SEQ ID NO: 8) TACTTATATTCGCTTTCGTGGGMC Detección de TTV1 de porcino TTV2-mF (SEQ ID NO: 9) AGTTACACATAACCACCAAACC Detección de TTV2 de porcino TTV2-mR (SEQ ID NO: 50) ATTACCGCCTGCCCGATAGGC Detección de TTV2 de porcino TTV2-nF (SEQ ID NO: 51) CCAAACCACAGGAAACTGTGC Detección de TTV2 de porcino TTV2-nR (SEQ ID NO: 52) CTTGACTCCGCTCTCAGGAG Detección de TTV2 de porcino TTV1-IF (SEQ ID NO:l) CATAGGGTGTAACCAATCAGATTTAAGGCGTT Clonación genómica (fragmento B) TTV1-2340R (SEQ ID NO: 2) GGTCATCAGACGATCCATCTCCCTCAG Clonación genómica (fragmento B) TTV1-2311F (SEQ ID NO: 3) CTTCTGAGGGAGATGGATCGTCTGATGA Clonación genómica (fragmento C) TTV1-IR (SEQ ID NO: 4) TTGAGCTCCCGACCAATCAGAATTGACT Clonación genómica (fragmento C) TTV2-IF (SEQ ID NO: 5) TTGTGCCGGAGCTCCTGAGAGC Clonación genómica (fragmento E) TTV2-2316R (SEQ ID NO: 6) AGGTGCTTGAGGAGTCGTCGCTTG Clonación genómica (fragmento E) TTV2-GCF (SEQ ID NO: 7) CTCAAGCACGAGCAGTGGATCCTCTCA Clonación genómica (fragmento F) TTV2-IR (SEQ ID NO: 8) TACCCAGGCGGTTAGACACTCAGCTCT Clonación genómica (fragmento F) Inesperadamente, se identificaron dos grupos de datos de secuencia de cada constructo, lo que indica que existen dos tipos de PTTVs en el genogrupo 1 y genogrupo 2 del mismo cerdo . Con obj eto de diferenciar y ensamblar las cuatro cepas PTTV, se reali zaron comparaciones de secuencia j unto con las tres cepas PTTV conocidas, Sd-TTV31, TTV-lp y TTV-2p (Fig. IB y 1C) .
La Fig. IB ilustra la diferenciación y ensamble de secuencias genómicas de . longitud completa de cepas PTTV1 PTTVla-VA y PTTVlb-VA con fragmentos PCR B y C que se clonaron posteriormente'. Los codones de inicio de ORF1 y 0RF2 en el fragmento B asi como los codones de terminación de 0RF1 en el fragmento C se marcan por "?" o "*". Las secuencias correspondientes de dos cepas PTTV1 conocidas, Sd-TTV31 y TTV-lp, también se muestran. Se sombrean las secuencias conservadas, y las punteadas indican eliminaciones de nucleótido.
Para PTTV1, el codón ATG de inicio y el codón TGA de terminación del ORF1 .supuesto se localizaron en los fragmentos B y C, respectivamente (Fig. IB). Las posiciones de los codones fueron' diferentes en dos grupos PTTV1, el primero idéntico a Sd-TTV31 y el segundo idéntico a TTV-lp (Fig. IB). Además, los codones de inicio ORF2 en los dos grupos también se localizaron en posiciones diferentes consistentes con la de ORF1. Por otro lado, los análisis filogenéticos que usan cuatro secuencias diferentes de la región B (dos de los datos de procesado en secuencia y dos de las cepas Sd-TTV31 y TTV-lp) y cuatro secuencias diferentes de la región C soportan que la primera secuencia se agrupó con Sd-TTV31 y la segunda se agrupó con TTV-lp (datos no mostrados). Por lo tanto, los solicitantes fueron capaces de diferenciar y ensamblar dos grupos de datos de secuencia de ambos fragmentos B y C en dos. genomas PTTV1 de longitud completa que se designaron como cepas PTTVla-VA (SEQ ID NO: 9) y PTTVlb-VA (SEQ ID NO:10), respectivamente (Fig. IB).
La Fig. 1C ilustra la diferenciación y ensamble de secuencias genómicas de longitud completa de cepas PTTV2 PTTV2b-VA y PTTV2'c-VA con fragmentos PCR E y F que se clonaron posteriormente. La secuencia correspondiente de cepa TTV-2p se incluye y se sombrean las secuencias conservadas. Las punteadas indican eliminaciones de nucleótido. Los ' nucleótidos únicos dentro de la región traslapada (recuadro con linea punteada) para cada cepa (nucleótidos "AG" continuos para PTTV2b-VA (SEQ ID NO: 11) y dos nucleótidos "A" y "G" sencillos para PTTV2c-VA (SEQ ID NO: 12)) se muestran, respectivamente .
La diferenciación de las dos cepas PTTV2 fue más fácil. Los nucleótidos "AG" continuos únicos localizados en la región traslapada de dos fragmentos PCR se sombreó por dos grupos de datos de secuencia de los fragmentos E y F, respectivamente (Fig. 1C) . La secuencia genómica de longitud completa ensamblada representa una cepa PTTV2 y se designó como PTTV2b-VA (SEQ ID NO: 11) . · Similarmente , la secuencia genómica completa de una segunda cepa designada como PTTV2c-VA (SEQ ID NO: 12) se ensambló con base en dos nucleótidos sencillos únicos "A" y "G" compartidos en la región traslapada por otro, conjunto de datos de secuencia de los fragmentos E y F, respectivamente (Fig. 1C) . Los análisis filogenéticos que usan cuatro secuencias de los fragmentos E y F junto con las dos secuencias correspondientes de TTV-2p también soportan esta asignación (datos no mostrados).
La presente invención proporciona cuatro genotipos del virus TTV porcino aislado o subtipos que están asociados con infecciones víricas en. cerdos. Esta invención incluye, pero no se limita a, genotipos de virus TTV porcino o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA, los genotipos de virus o subtipos que tienen las secuencias de nucleótidos establecida en SEQ ID NO : 9 (PTTVla-VA), SEQ ID NO:10 (PTTVlb-VA), SEQ ID NO: 11 (PTTV2b-VA), y SEQ ID NO: 12 (PTTV2c-VA), su equivalente funcional o hebra complementaria. Se entenderá que los derivados de secuencia de nucleótido específicos de cualquier TTV porcino tendrán variaciones ligeras que existen naturalmente entre virus individuales. Estas variaciones en las secuencias pueden apreciarse en eliminaciones, sustituciones, inserciones y similares.
La estructura genómica propuesta para cada una de las cuatro cepas se analizó en detalle y se resume en la Tabla 2, junto con las tres cepas- PTTV conocidas, Sd-TTV31, TTV-lp y TTV-2p. Las cuatro cepas E.U.A. de PTTV tienen un tamaño genómico similar de 2,878 bp (PTTVla-VA SEQ ID NO: 9), 2,875 bp (PTTVlb-VA SEQ ID NO: 10), 2,750 bp (PTTV2b-VA SEQ ID NO: 11), y 2,803 bp (PTTV2c-VA SEQ ID NO: 12), respectivamente. Tanto PTTVla-VA (SEQ ID NO: 9) como Sd-TTV31 tienen la misma longitud genómica. Las secuencias publicadas de las cepas TTV-lp y TTV-2p todas tienen muchos nucleótidos indeterminados en la región rica en GC del UTR. Después del llenado artificial de estos nucleótidos con las secuencias de consenso correspondientes' a PTTV1 y PTTV2 , se mostró que el TTV-lp está más cercanamente relacionados a PTTVlb-VA (SEQ ID NO: 10), y que TTV-2p está más cercanamente relacionado a PTTV2b-VA (SEQ ID NO: 11) en longitud genómica, respectivamente (datos no mostrados) .
Las secuencias genómicas ensambladas de genotipos de virus TTV porcino o subtipos PTTVla-VA (SEQ ID NO: 9), PTTVlb-VA (SEQ ID NO: 10), PTTV2b-VA (SEQ ID NO: 11), y PTTV2c-VA ( SEQ ID NO: 12) se exponen al Genbank® ' (Nucleic Acids Research, enero 2008; 36 (publicación de base de datos) : D25-30) con números de acceso GU456383, GU456384, GU456385, y GU456386, respectivamente.
Tabla 2. Comparación de la organización genómica y ORFs las siete cepas de TTV porcino T Porcino especie 1 T Porcino especie 2 Viras T¾x> la Tipo Ib Subtipo 2a Subtipo 2b Subtipo 2c Cepa PTTVla- Sd-TTV3l ' PTTVlb- TTV-lp TTV-2p PTTV2b- PTTV2C- VA VA VA VA País EUA Japón EUA Brasil Brasil EUA EUA Longitud completa 2878 2878 2875 Ircompleto Ircompleto 2750 2803 (nt) # de acceso al GU456383 AB076001 GU456384 AY823990 AY823991 GU456385 GU456386 GenBank CajaTATA 288-291 288-291 288-291 288-291 233-236 233-236 285-288 Extremo mARN 316 316 316 316 261 261 313 5' supuesto ORF1 Tamaño (aa) 635 635 639 637 624 625 625 Exon# 1 1 1 1 1 1 1 Imc 534 534 517 517 476 476 528 Terminación 2441 2441 2436 2430 2350 2353 2405 ORF2 Tamaño (aa) 73 73 72 72 68 68 68 #deExón 1 1 1 1 1 1 1 Irric 430 430 428 428 393 393 445 Termirasión 651 651 646 646 599 599 651 ORF1/1 Tamaño (aa) 174 174 182 182 178 178 178 #deExón 2 2 2 2 2 2 2 We 534 534 517 517 476 476 528 Empalmado 647/648 647/648 642/643 642643 595/596 595/596 647/648 2030 2031 2030/2031 2013/2014 2007/2008 1933/1934 1936/1937 1988 1989 Teminación 2441 2441 2436 2430 2350 2353 2405 ORF2/2(ORF3) Tamaño (aa) 224 224 228 228 199 199 199 #deExón 2 2 2 2 2 2 2 Inido 430 430 428 428 393 395 445 Empalmado 647/648 647/648 642/643 642/643 595/596 595/596 647/648 20302031 20302031 2013/2014 20072008 1933/1934 1936/1937 1988/1989 Tenrrinarión 2487 2487 2485 2479 2330 2333 2385 Señal de 2458-2463 2458-2463 2462-2467 2456-2461 2473-2478 2476-2481 2528-2533 poliadenilación (AATAAA) Los números (excepto los tamaños del genoma de longitud completa, ORFs y los números de exón) indican las posiciones de nucleótido (nt) en el genoma de cepas PTTV respectivas.
Dos estudios recientes han identificado los mARNs víricos transcritos y la expresió.n de al menos seis proteínas víricas durante la replicación TTV humana (Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra) , que es más que el número predicho de ORFs codificadas por TTV humano (Okamoto, H., Nishizawa, T., Tawara, A., Takahashi, . , Kishimoto, J., Sai, T., y Sugai, Y. (2000b). TT virus mRNAs detected in the bone marrow cells from an infected individual. Biochem Biophys Res Commun 279(2), 700-7), por lo tanto se incluye la nueva información genómica TTV humana para comparación con las secuencias PTTV. Los extremos .5' de los transcriptos de mARN de cepa TTV humana P/1C1 se mapearon a una "A" que es 25 nt cadena debajo de la caja TATA (Mueller et al., 2008, supra) . Este punto de partida, su secuencia adyacente (CGAATGGCTGAGTTTATGCCGC. (SEQ ID NO: 39); el punto de partida se subrayó) y la distancia de la caja TATA cadena arriba (24 nt; Tabla 2) están muy conservadas en las siete cepas PTTV, lo que sugiere que. PTTV y TTV humano pueden utilizar un extremo 5' común del mARN para traducción.
Se identificaron cinco' . regiones completamente conservadas adicionales en la vecindad de la caja TATA entre las siete cepas PTTV. Dos regiones de 11 nt cada una (AGTCCTCATTT (SEQ ID NO: 40) y AACCAATCAGA (SEQ ID NO: 41)) fueron localizadas en cadena arriba de la caja TATA, mientras que las tres regiones .restantes (CTGGGCGGGTGCCGGAG de 11 nt (SEQ ID NO: 42); CGGAGTCAAGGGGC de 14 nt (SEQ ID NO: 43); TATCGGGCAGG de 11 nt (SEQ ID NO:44)) se localizan entre el extremo 5' propuesto del mARN y el codón de inicio de ORF2. Estas secuencias especificas de PTTV conservadas pueden contener los elementos comunes que regulan la expresión del gen vírico.
Previamente, tres ORFs (ORFs 1-3) se propusieron en el genoma de las tres cepas PTTV conocidas, respectivamente (Niel et al., 2005, supra; Okamoto et al., 2002, supra) . Las cuatro cepas de E.U.A. -prototipo de PTTV identificado en este estudio poseen esta, estructura. El ORF3 correspondiente en TTV humano se ha renombrado como ORF2/2 ya que inicia en el mismo ATG en ORF2 · y se mantiene en el mismo ORF (ORF2 extendido) después del empalme (Fig. 1A) (Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra) . Se ha seguido la nomenclatura de TTV humano para revisar la clasificación de PTTV en este estudio. El TTV humano ORFl/1 es una proteina vírica recientemente identificada que se codifica por dos exones en ORF1 (Qiu.et al., 2005, supra). ORFl/1 comparte la parte terminal N y C con ORF1. La contraparte PTTV ORFl/1 se identificó en las siete cepas PTTV .(Fig. 1A y Tabla 2) .
El ORF1 y ORF2 se codificaron por un mARN vírico de ~2.8 kb mientras que el ORFl/1 y ORF2/2 se codificaron por un mARN vírico empalmado con ~1.2 kb en TTV humano (Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra). Ya que estos cuatro ORFs también se- dedujeron en genomas PTTV, y ya que las secuencias y posiciones del donador de empalme supuesto y sitios aceptores en las siete cepas PTTV son muy conservadas (Tabla 2), se especula que el TTV porcino probablemente también codifica los dos mARNs correspondientes.
La mayoría de las cepas TTV humanas comparten una similitud genética con el CAV, que codifica una proteína que induce la apoptósis de TTV (TAIP) en la cual su contraparte CAV se nombró apoptina (de Smit, M. H., y Noteborn, M. H. (2009) . Apoptosis-inducing proteins in chicken anemia virus and TT virus. Curr Top .Microbiol Immunol 331, 131-49) . El ORF de TAIP se incrusta, dentro del ORF2. Sin embargo, el TAIP correspondiente no existe en el TTV porcino. Un estudio reciente muestra que se requirió la expresión de apoptina o TAIP para replicación de CAV en células cultivadas (Prasetyo, A. A., Kamahora, T., Kuroishi, A., Murakami, K. , y Hiño, S. (2009) . La replicación del virus de anemia del pollo (CAV) requiere apoptina y se complementa por VP3 de torque teño virus (TTV) humano. Virology 385(1), 85-92).
Las comparaciones de secuencia en pares (PASC) es un método útil que agrupa la ¦ distribución de frecuencia de porcentajes de identidad de secuencia de nucleótido en pares a partir de la secuencia genómica disponible de virus en la misma familia (Bao, Y., Kapustin, Y., y Tatusova, T. (2008). Virus Classification by Pairwise Sequence Comparison (PASC) . En "Encyclopedia of Virology, 5 vols." (B. . J. Mahy, y M. H. V. Van Regenmortel, Eds . ) , Vol. 5, pp. 342-8. Elsevier, Oxford) . Los picos diferentes generados por el programa PASC usualmente representan grupos de géneros de virus-, . especies, tipos, subtipos y cepas (Fig. 2) . En este estudio, se ha realizado análisis PASC de- TTV que usan 121 secuencias genómicas de longitud completa de cepas relacionadas con TTV humano y animal disponibles en la base de datos del GenBank (Fig. 2) . Suponiendo que los miembros TTV se clasifican en una familia separada, Anelloviridae, los dos picos principales, a 36-55% y 55-67% de identidad de secuencia de nucleótido, representan grupos de géneros y especies, respectivamente (Fig. 2). En consecuencia, ' un tipo de TTV se define como un grupo de TTV que tiene 67-85% de identidad de secuencia de nucleótido mientras que un subtipo de- TTV puede definirse como un grupo de secuencias TTV que comparten 85-95% de identidad de secuencia de nucleótido. Las cepas TTV que comparten más del 95% de identidad de secuencia de nucleótido pueden clasificarse además en variantes (Fig. 2). Una clasificació similar se ha propuesto usando secuencias de 103 aislados TTV por Jelcic et al (Jelcic, I., Hotz-Wagenblatt, A., Hunziker, A., Zur Hausen, H., y de Villiers, E. M. (2004). Isolation of múltiple TT virus genotipos from spleen biopsy tissue from a Hodgkin's disease patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable región. J Virol 78(14), 7498-507).
Estos criterios propuestos de clasificación TTV se aplicaron a los análisis filogenéticos de las secuencias genómicas de las 4 cepas de E.U.A. prototipo de PTTV y las otras 3 cepas PTTV conocidas. La comparación en pares de secuencias de nucleótidos de longitud completa entre estas cepas demuestra que las cuatro cepas PTTV1 tienen 54.0-56.4% de identidad de secuencia de nucleótido comparado con las tres cepas PTTV2 (Tabla 3) . Por lo tanto, el "genogrupo" previamente designado de PTTV en la literatura probablemente será más apropiado para designarse como "especies", y PTTV1 y PTTV2 probablemente debieran representar especies de TTV porcino 1 y especies 2, respectivamente. Las especies PTTV 1 consisten de dos tipos de virus designados como tipo la (incluyendo Sd-TTV31 y PTTVla-VA (SEQ ID NO: 9)) y tipo Ib (incluyendo TTV-lp y PTTVlb-VA (SEQ ID NO: 10)), respectivamente, ya que la identidad de secuencia de nucleótido entre estos dos tipos de virus está entre 69.8-70.7% (Tabla 3). Se reconocen Sd-TTV31 y TTVla-VA (SEQ ID NO: 9) como cepas variantes de la misma especie debido a su identidad de secuencia más alta (95.1%). Sin embargo, las dos cepas tipo Ib, TTV-lp. y PTTVlb-VA (SEQ ID NO:10), pueden pertenecer a dos subtipos diferentes (identidad de secuencia de nucleótido=86. %) . Para especies PTTV 2, posiblemente se clasifican tres cepas en subtipos separados (TTV-2p para subtipo 2a, PTTV2b-VA (SEQ ID NO: 11) para subtipo 2b, y PTTV2c-VA (SEQ ID NO: 12) para subtipo 2c, respectivamente) con base en su 86.5-90.-9% de identidad de secuencia de nucleótido. Este sistema de clasificación nuevo propuesto para PTTV fue claramente evidente en el árbol filogenético (Fig. 3A) . Los árboles filogenéticos construidos con base en las secuencias de aminoácidos deducidas de ORFl, ORF1/1, ORF2 y ORF2/2 de PTTV también fueron consistentes con esta clasificación propuesta (Figs. 3B hasta 3E) .
Tabla 3. Comparación de secuencias en pares de la secuencia genómica de longitud completa de las siete cepas de TTV porcino TTV Porcino especie 1 TTV Porcino especie 2 Tipo la Tipo Ib Subtipo Subtipo 2b Subtipo 2c 2a PTTVla- Sd- PTTVlb- TTV-lp TTV-2p PTTV2b- PTTV2c- VA TTV31 VA VA VA Tipo la PTTVla- — 95.1 70.5 69.8 55.7 55.1 56.2 VA Sd-TTV31 70.7 70.1 55.9 56.0 56.4 Tipo Ib PTTVlb- 86.4 54.0 54.7 55.2 VA TTV- lp 55.2 54.7 55.4 Subtipo 2a TTV-2p 86.5 86.8 Subtipo 2b PTTV2b- 90.9 VA Subtipo 2c PTTV2C- VA Los datos se generaron usando el programa PASC, y los valores indican el % de identidades de secuencia de nucleótido.
Las mutaciones y eliminaciones y/o inserciones únicas se dispersaron a través de los genomas entre las especies, tipos y subtipos PTTV. Por ejemplo, la ubicación de los codones de inicio y terminación de ORF1 y los codones de inicio 0RF2 entre el PTTV tipo la y Ib, que se muestra en la Fig. IB como se menciona arriba, son diferentes. Las dos cepas PTTVlb también tienen una eliminación de 2 codones después del inicio 0RF2 comparado con PTTVla (Fig. IB).
De forma notable, tanto TTV-2p como PTTV2b-VA tienen una eliminación de 52-nt de largo, que tiene 39 nt cadena arriba de la primera secuencia conservada de 11-nt (AGTCCTCATTT (SEQ ID NO: 40) ) en el UTR, comparado con PTTV2c-VA. Debido a esta eliminación, el tamaño genómico de PTTV2b-VA (probablemente TTV-2p también) fue significativamente más pequeño que el de PTTV2c-VA (Tabla 2). Un número de clones TTV humanos "subviricos" se han aislado de las muestras de suero que se consideran como genomas TTV de longitud completa ya que los ORFs en una mayoría de estas moléculas subvíricas usualmente se mantienen intactos (de Villiers et al., 2009; Leppik et al., 2007) . Hay longitudes variables en el UTR que se eliminan completamente o parcialmente. La situación de TTV-2p y PTTV2b-VA parece semejarse a la de las moléculas subvíricas TTV humanas, lo que implica que los subtipos PTTV2a y PTTV2b pueden ser las moléculas subvíricas derivadas del subtipo PTTV2c. De notar, la secuencia de terminal 3' de un cebador PCR anidado TTV2-nF (Tabla 1) que se usa comúnmente para la detección del PTTV2 de muestras . de campo por otros grupos (Ellis et al., 2008, supra; Kekarainen et al., 2007, supra; Kekarainen et al., 2006, supra; Krakowka et al., 2008, supra) se localiza en ambos lados de la . eliminación . Por lo tanto, el ensayo PCR anidado actual para detección de PTTV2 posiblemente no sea suficiente para identificar las cepas genéticamente diversas del subtipo PTTV2c.
La fuente de cepa de virus aislados es de las muestras de suero, heces, salva, semen y tejido de cerdos que tienen la infección vírica TTV porcina. Sin embargo, se contempla que puede usarse tecnología de ADN recombinante para duplicar y sintetizar químicamente la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, el alcance de la presente invención abarca el polinucleótido aislado que comprende, pero no se limita a, una secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:ll, and SEQ ID NO:12, o su hebra complementaria; un polinucleótido que hibridiza a y es al menos al menos 67% complementario con la secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12, preferiblemente 85% complementario, o más preferiblemente 95% complementario; o un fragmento inmunogénico seleccionado del grupo que consiste de una secuencia de aminoácidos de proteína ORFl establecida en SEQ ID NO: 13 (PTTVla-VA), SEQ ID. O: 14 (PTTVlb-VA), SEQ ID NO: 15 (PTTV2b-VA), SEQ ID NO: 16 (PTTV2c-VA), una secuencia de aminoácidos de proteína ORF2 establecida en SEQ ID NO: 17 (PTTVla-VA), SEQ ID NO: 18 (PTTVlb-VA), SEQ ID NO: 19 (PTTV2b-VA) , SEQ ID NO: 20 (PTTV2c-VA), una secuencia de aminoácidos de proteina ORF1/1 establecida en SEQ ID NO: 21 (PTTVla-VA), SEQ ID NO: 22 (PTTVlb-VA), SEQ ID NO: 23 (PTTV2b-VA) , SEQ ID NO: 24 (PTTV2c-VA), una secuencia, de aminoácidos de proteina ORF2/2 establecida en SEQ ID NO:25 (PTTVla-VA), SEQ ID NO:26 (PTTVlb-VA), SEQ ID NO:27 (PTTV2b-VA), SEQ ID NO:28 (PTTV2c-VA) . Las regiones de codificación inmunogénicas o antigénicas o fragmentos pueden determinarse por técnicas conocidas en el campo y luego . usarse para hacer anticuerpo monoclonales o policlonales para selección inmunoreactiva u otros propósitos de diagnóstico. La invención abarca además la proteina inmunogénica, purificada, codificada por los polinucleótidos aislados. De forma deseable, la proteina puede ser una proteina ORFl aislada o recombinante o una proteina ORF2 de al menos uno de los subtipos TTV porcino aislados de arriba, más deseablemente la proteina ORFl.
La ORFl de TTV porcino se considera que codifica una proteina asociada con la replicación y estructural (Maggi, F., y Bendinelli, M. (2009). Immunobiology of the Torque teño viruses and other anelloviruses . Curr Top Microbiol Immunol 331, 65-90). Los productos que codifican ORFl de siete cepas PTTV tienen 624-635 aa en longitud y poseen un alto número de residuos de arginina en la ' terminal N que se piensa que tienen la actividad de enlace al ADN (Fig. 4). En la Fig. 4, se sombrean las secuencias conservadas. Las líneas punteadas indican eliminaciones de aminoácidos. Las porciones RCR se encuadran con líneas sólidas. Tres HVRs (PTTVl-HVRs 1, 2 y 3) de las cepas PTTV1 y dos HVRs (PTTV2-HVRs 1 y 2) de las cepas PTTV2 se encuadran con líneas punteadas. Los límites de conexión de 0RF1/1 se indican por flechas. Las porciones de replicación de círculo giratorio (RCR) predichas (Ilyina, T. V., y Koonin, E. V. (1992). Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling crrcle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res 20(13), 3279-85) se presentan en diferentes posiciones en diferentes tipos de PTTV y subtipos que pueden ser específicos de tipo o subtipo. La porción RCR III (YxxK) se conserva en el PTTV tipo la (posición aa 14-17 de PTTVla-VA SEQ ID NO: 13) y cepas tipo Ib (posición aa 379-382 de PTTVlb-VA SEQ ID NO: 14), respectivamente, mientras que la misma porción conservada identificada en las tres cepas PTTV2 es localizada en la posición aa 482-485 de PTTV2b-VA SEQ ID NO:15 (Fig. 4). Tanto PTTV2b-VA SEQ ID NO: 15 como PTTV2c-VA SEQ ID NO: 16 también tienen una porción RCR II (HxQ) conservada en la posición aa 331-333 de PTTV2b-VA que está ausente en TTV-2p (Fig. 4).
Las proteínas 0RF1 de cepas PTTV entre especies 1 y especies 2 comparten una identidad de secuencia aa muy baja con sólo 22.4 hasta 25.8%, lo que hace difícil identificar secuencias aa conservadas de forma importante entre las dos especies (Fig. 4). En PTTV especie 1, la identidad aa de 0RF1 entre las cepas tipo la y Ib son 50.3-52.7%. Se identificaron tres regiones hipervariables principales (HVR) , PTTVl-HVRs 1 hasta 3, con un número relativamente alto de sustituciones aa, entre las cuatro cepas PTTV1, mientras que se observaron dos HVRs (PTTV2-HVRs 1 y 2) entre las tres cepas PTTV2 (Fig. 4). Las tres cepas PTTV2 tienen una eliminación de aproximadamente 20-aa en la región PTTV1-HVR1 correspondiente. Por otro lado, los dos HVRs de PTTV2 están dentro de la región PTTV1-HVR3 correspondiente (Fig. 4) . Estos HVRs se localizan sólo en el ORF1 pero no en el ORF1/1 truncado. Posiblemente juegan un papel en evadir la sobrevivencia inmunitaria del hospedero y auxilian a PTTV a establecer una infección persistente, como se sugiere por los estudios de TTV humano.
Las secuencias aa de ORF2 difieren considerablemente entre las cuatro cepas PTTV1 (PTTVla-VA SEQ ID NO: 17; PTTVlb-VA SEQ ID NO: 18) y tres cepas PTTV2 (PTTV2b-VA SEQ ID NO: 19; PTTV2c-VA SEQ ID NO:20) (Fig. 5) . Sin embargo, comparten una porción tipo proteína tirosina fosfatasa (PTPasa) conservada (Wx7Hx3CxCx5H) en la terminal N (Fig. 4) . Esta porción también se conserva entre todas las cepas TTV, TTMV y TTMDV humanas asi como CAV. -La TTMV o proteina CAV ORF2 también exhiben una actividad de serina/treonina fosfatasa (S/T PPasa) (Peters, M. A., Jackson, D. C, Crabb, · B. S., y Browning, G. F. (2002) . Chicken anemia virus VP2 is a novel dual specificity protein phosphatase. J Biol Chem 277(42), 39566-73). La especificidad doble de la proteina ORF2 se piensa que regula la transcripción del gen hospedero, transducción de señal y respuesta citocinica durante la replicación vírica. Recientemente, los análisis de mutagénesis de dos residuos aa básicos conservados antes del último residuo de histidina de la porción en CAV revelan que los dos residuos afectan la replicación del virus, citopatología in vitro y atenuación in vivo (Peters, M. A., Crabb, B .· S., Washington, E. A., y Browning, G. F. (2006) . Site-directed mutagénesis of the VP2 gene of Chicken anemia virus affects virus replication, cytopathology and host-cell MHC class I expression. J Gen Virol 87 (Pt . 4), 823-31; Peters, M. A., Crabb, B. S., Tivendale, K. A. , . y Browning, G. F. (2007). Attenuation of chicken anemia virus by site-directed mutagénesis of VP2. J Gen Virol 88 (Pt 8), 2168-75). Los dos residuos aa básicos ("KK") se conservan en las tres cepas PTTV2. Sin embargo, sólo el primer residuo básico ("R") se mantiene en las dos cepas PTTVla mientras que ambos residuos están sustituidos en las cepas PTTVlb (Fig. ·5) . En la Fig. 5, las punteadas indica eliminaciones de aminoácidos. Los cinco aminoácidos conservados dentro de la porción común Wx7Hx3CxCx5H (subrayados) identificados en TTV, TTMV y CAV se sombrean. Las posiciones de los dos residuos aa básicos antes de la última histidina de la porción, que se han mostrado que afectan la replicación de' virus, citopatologia o atenuación in vivo en CAV, se indican por "?".
En resumen, la presente invención ha determinado las secuencias genómicas de longitud completa de cuatro cepas de TTV porcino que representan diferentes genotipos o subtipos en una muestra de suero de un cerdo macho sencillo en Virginia. El hallazgo de este estudio indica claramente que, igual gue TTV humano, las infecciones PTTV múltiples con distintos genotipos o subtipos existen y probablemente son comunes en cerdos. También se ha proporcionado información nueva con respecto a la organización genómica, el grado de variabilidad y las características de las porciones de nucleótido y aminoácido conservadas de PTTV, que mejorarán el ensayo de detección PCR actual, ayudan en desarrollar reactivos para diagnóstico serológico y auxilian a iniciar el estudio estructural y funcional de PTTV. También se proporciona una nueva clasificación de PTTV en este estudio con base en los análisis filogenéticos y genéticos de las secuencias genómicas de siete cepas PTTV conocidas.
La presente invención también proporciona métodos para el diagnóstico de infección por TTV porcino al detectar ADN vírico en muestras de cerdos infectados con TTV porcino u otros mamíferos. Una modalidad preferida de la presente invención involucra métodos para detectar secuencias de ácido nucleico de TTV porcino en una especie porcina u otro mamífero usando los cebadores de oligonucleótido para reacción en cadena de polimerasa (PCR) para auxiliar además en el diagnóstico de la infección vírica o enfermedad. Las pruebas de diagnóstico, que son útiles para detectar la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico vírico de TTV porcino en especies porcinas u otros mamíferos, comprende aislar ADN vírico de muestras de cerdos infectados con TTV porcino o cerdos que se sospecha que tienen infección de TTV, y realizar PCR cuantitativa en tiempo real de SYBR verde usando cebadores específicos de PTTV1 (SEQ ID NO: 29/ SEQ ID NO: 30) o específicos de PTTV2 (SEQ ID NO: 31/ SEQ ID NO: 32) .
En otra modalidad de la presente invención, el método de diagnóstico puede adaptarse para detectar simultáneamente PTTV1 y PTTV2 usando PCR en tiempo real doble PTTV1/PTTV2. Más específicamente, el método comprende aislar el ADN vírico de muestras de cerdos infectados con TTV porcino o cerdos que se sospecha que están infectados de TTV, realizar PCR en tiempo real usando tanto cebadores específicos de PTTV1 (SEQ ID NO: 29/ SEQ ID NO: 30) como específicos de PVVT2 (SEQ ID NO: 31/ SEQ ID NO: 32) en la' misma reacción PCR en tiempo real. Ya que el valor Tm entre PTTV1 y PTTV2 puede distinguirse MCA, la presencia de AQN PTTV1 y PTTV2 puede detectarse simultáneamente .
En una modalidad adicional de la presente invención, el método de diagnóstico puede emplear PCR de anidado doble. El método comprende aislar ADN vírico de muestras de cerdos infectados con TTV porcina o cerdos que se sospecha que tienen infección de TTV, realizar una primera ronda de PCR usando un par de cebadores Plab-mF (SEQ ID NO: 33) /Plab-mR (SEQ ID NO-.34), y realizar una segunda ronda de PCR usando una mezcla de dos pares de cebadores, Pla-nF (SEQ ID NO: 35) /Pla-nR (SEQ ID NO: 36) para detección de PTTVla, y Plb-nF (SEQ ID NO: 37) /Plb-nR (SEQ ID NO: 38) para detección de PTTVlb, y visualizar los productos PCR.
Los métodos de diagnóstico anteriores pueden optimizarse por alguien experto en la técnica de acuerdo a métodos bien conocidos en la técnica.
En consecuencia, una modalidad de la presente invención desarrolla dos ensayos PCR en tiempo real de SYBR verde de plexado sencillo novedosos para cuantificar las cargas víricas de dos especies TTV porcino, respectivamente. Se diseñaron cebadores específicos de PTTVl y PTTV2 para dirigir las regiones extremadamente conservadas a través de seis PTTVl y cuatro PTTV2 genomas de longitud completa disponibles a la fecha, respectivamente.' Otra modalidad de la presente invención combina los dos ensayos de plexado sencillo en un ensayo PCR en tiempo real doble seguido por MCA de los amplicones víricos que pueden identificarse por sus distintas temperaturas de fusión para eliminación simultánea de las dos especies de TTV porcino, PTTVla y PTTVlb. En una tercera modalidad, se desarrolló un ensayo PCR anidado doble para amplificación simultánea de los ADN víricos de dos tipos de PTTVl en PCR de primera ronda y detección diferencial de tipos la y Ib en la PCR de segunda ronda para la identificación de dos tipos de especies TTV porcino, PTTVla y PTTVlb, en una muestra sencilla-. Estos ensayos representan herramientas sencillas y prácticas para diagnóstico de TTVs porcinos específicos de- tipo y especie.
Se identificaron las secuencias cebadoras potenciales por alineaciones de secuencia múltiple de 10 genomas de longitud completa TTV porcina disponibles. Se diseñaron cebadores TTV1F (SEQ ID NO:29) y TTV1R (SEQ ID MO:30) específicos de PTTVl con base en dos regiones genómicas conservadas inmediatamente antes de la PRF2 supuesta a través de los seis genomas PTTVl, mientras que los cebadores TTV2F4 (SEQ ID NO: 31) y TTV2R4 (SEQ ID NO: 32) específicos de PTTV2 se diseñaron con base -en dos regiones genómicas conservadas inmediatamente después de la ORF2/2 supuesta a través de cuatro genomas PTTV2 (Tabla 4). Los cebadores no muestran potenciales para auto-dimerización y dimerización cruzada. Los tamaños de amplicón esperados fueron un fragmento de 118-bp de los cebadores PTTVl que corresponde al genoma PTTVlb-VA y un fragmento de 200-bp de los cebadores PTTV2 que corresponde al genoma PTTV2c-VA, respectivamente.
Tabla 4. Cebadores de oligonucleótido usados para eliminaciones por PCR en tiempo real y PCR anidada doble de TTV porcinos .
Cebador ID Secuencia (5' hasta 3') Propósito TTV1F TCCGAATGGCTGAGTTTATGC PCR en tiempo real específica de PTTVl SEQ ID NO:29 TTV1R TCCGCTCAGCTGCTCCT PCR en tiempo real específica de PTTV 1 SEQ ID NO:30 TTV2F4 GGTGGTAAAGAGGATGAA PCR en tiempo real específica de PTTV2 SEQ ID NO:31 TTV2R4 AATAGATTGGACACAGGAG PCR en tiempo real específica de PTTV2 SEQ ID NO:32 Plab-mF PCR anidada doble SEQ ID NO:33 TATCGGGCAGGAGCAGCT Plab-mR PCR anidada doble SEQ ID NO:34 TAGGGGCGCGCTCTACGT P la-nF PCR anidada doble SEQ ID NO:35 CCTACATGAAGGAGAAAGACT P la-nR PCR anidada doble SEQ ID NO:36 CCAGCGTCTCCAGGGTC Plb-nF PCR anidada doble SEQ ID NO:37 AAGCTACCAAGGGCTGG Plb-nR PCR anidada doble SEQ ID NO:38 GCGGTC(T/G)GTAGCGGTAGT De acuerdo con una modalidad especifica de la presente invención, puede usarse PCR en tiempo real sencilla de SYBR verde usando cebadores específicos de PTTV1 y PTTV2 para detectar ADN de TTV.l y TTV2 porcino, respectivamente. Para PTTV1, se estableció una curva estándar sobre un intervalo de concentraciones de ADN objetivo por 25' µ?. El intervalo lineal se mostró que abarca 4.4X101 hasta 4. X108 copias. El límite de detección mínimo (44 copias) corresponde a un ciclo de umbral (Ct) de 37.57. Para. PTTV2, también se generó una curva estándar y se usa para detectar la concentración de ADN en un intervalo desde 8.6X10° hasta 8.6X108 copias ppr 25 µ? de reacción. El Ct correspondiente de límite de detección mínimo (8.6 copias) fue 36.53..
De acuerdo con otra modalidad específica de la presente invención, se utiliza PCR en tiempo real doble de SYBR verde para la detección simultánea de ADN de TTV1 y TTV2 de porcino. La diferencia de 7 grados del valor Tm entre PTTV1 (87.0°C) y PTTV2 (80.0°C) hace posible distinguirlos de otro por el MCA. Por lo tanto, pueden acoplarse dos ensayos de plexado sencillo en un ensayo PC.R en tiempo real doble para la detección simultánea de PTTVl y PTTV2. Una muestra positiva fue una que tiene un pico de fusión simétrica con el Tm conocido para tal producto. Este nuevo ensayo primero se validó al usar una dilución de 10 veces de mezcla de estándares PTTVl y PTTV2. El control negativo no de plantilla que usa agua estéril como la plantilla muestra una amplificación no especifica causada por la dimerización cruzada entre los cebadores PTTVl y PTTV2 no apreciada en los ensayos de plexado sencillo (Fig. 7a) . Esto produce un pico de fundido distinto entre 72.0°C y 76.0°C. La Figura 7A muestra picos de fundido de estándar PTTVl (rojo; rm=87.0°C), estándar PTTV2 (verde; rm=80.0°C) y control negativo no de plantilla (causado por la dimerización cruzada del cebador; negro) . Las Figuras 7B-7E muestran los picos de fundido de muestras de suero representativos con cargas víricas distintas de PTTVl y PTTV2. La Figura 7B exhibe la muestra de suero de cerdo macho no. 5: cargas víricas relativamente altas tanto de PTTVl como PTTV2, pero PTTV2>PTTV1; la Figura 7C exhibe una muestra de suero de cerdo macho no. 12: cargas víricas relativamente altas de tanto PTTVl como PTTV2, pero PTTV1>PTTV2; la Figura 7D exhibe la muestra de suero de cerdo macho no. 14: cargas víricas bajas de tanto PTTVl como PTTV2; la Figura 7E exhibe la muestra de suero de cerdo macho no. 10: PTTV1 positivo, pero PTTV2 negativo. Las cargas víricas (unidad: copias genómicas/ml) de PTTV1 y PTTV2 en cada muestra se determinaron por PCR en tiempo real de plexado sencillo se indicaron en la parte superior del pico de fundido correspondiente.
En un ejemplo, cuando se aplicó el ensayo en tiempo real doble a las 20 muestras de suero de cerdos macho adultos, las muestras con cargas víricas relativamente altas de tanto PTTV1 como PTTV2 exhiben dos curvas de fundido distintas que corresponden a PTTVl y PTTV2 sin un pico de fundido no específico (Fig. 7B y7C) , mientras que las muestras con carga vírica baja de ya sea PTTVl o · PTTV2 muestran curvas de fundido no específicas así como específicas de virus (Fig. 7D y 7E) . Aunque los dos picos de fundido en la muestra #14 son muy pequeños, se consideraron positivos ya que exhiben una elevación simétrica y visualmente distinta y caen en el Tm apropiado de PTTVl y PTTV2 (Fig. 7D) . En contraste, la muestra #10 se consideró sólo PTTVl positiva debido a que un pico PTTV2 simétrico no se presentó evidentemente (Fig. 7E) . Estos resultados fueron consistentes con los de los dos ensayos de plexado sencillo (Tabla 5) . Por otro lado, el tamaño y la forma de los picos de fundido reflejan cualitativamente la carga vírica correspondiente en la muestra detectada.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, la PCR anidada doble se usa para detección diferencial de dos tipos de TTV porcino, PTTVla y PTTVlb.
Los inventores de la presente invención han demostrado la existencia de dos genotipos distintos, llamados tentativamente PTTVla y PTTVlb, en especies TTV porcino 1. Para determinar además si la co-infección de PTTVla y PTTVlb es común en cerdos, se desarrolló un ensayo PCR de anidado doble novedoso para distinguir rápidamente entre los dos. La alineación de las secuencias de ADN genómico TTV porcino identifican una región genómica conservada localizada en la parte de terminal N de la ÓRF1 supuesta que codifica la proteína de cápsida vírica (Fig. 8). Esta región también contiene la ORF2 completa y la UTR parcial cadena arriba. Los cebadores Plab-mF (SEQ ID NO : 33 ) /Plab-mR (SEQ ID NO:34) se diseñaron para amplificar simultáneamente los ADNs tanto PTTVla como PTTVlb en la PCR de primera ronda. Una mezcla de cebadores específicos de PTTVla Pla-nF (SEQ ID NO: 35) /Pla-nR (SEQ ID NO: 36) y cebadores específicos de PTTVlb Plb-nF (SEQ ID NO: 37) /Plb-nR (SEQ ID NO: 38) se usó para amplificar diferencialmente cada genotipo en la PCR de segunda ronda. Los productos de PCR finales de PTTVla y PTTVlb fueron de 162 bp y 96 bp en tamaño, respectivamente, que pudieran distinguirse fácilmente por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Este ensayo no se espera que detecte el ADN de PTTV2 debido a la especificidad de los cebadores (Fig. 8) . En la Fig. 8, se indicaron las secuencias conservadas- por puntos y sombras. Las punteadas indican eliminaciones de nucleótido. Las ubicaciones y direcciones de tres pares de cebadores usados para PCR anidada doble se marcaron por flechas.
En un ejemplo, las 20 muestras de suero de cerdos macho adultos que se sometieron al ensayo de PCR anidado doble se encontraron todas que son' positivas tanto para PTTVla como PTTVlb, como se determina al visualizar dos bandas de los tamaños esperados y la conformación de procesado por secuencia posterior de productos PCR (datos no mostrados) . No se amplificaron productos PCR en las 19 muestras de semen, lo que fue consistente con los resultados de ensayos PCR anidada convencional PTTVl y PCR en tiempo real descritos antes.
La infección de cerdos con las dos especies de TTV porcino se ha encontrado de vuelta en 1985 en granjas de cerdos de España de acuerdo con una investigación en retrospectiva (Segales et' al., 2009, supra) . Sin embargo, permanece evasivo si los TTV porcinos están asociados con cualquiera de las enfermedades de cerdos particulares. Ya que ambas de las especies de TTV porcino tienen una alta prevalencia en cerdos domésticos, la determinación de cargas víricas TTV presumiblemente es más importante que evaluar la presencia de ADN TTV. El nivel de cargas víricas en muestras de suero y semen se ha indicado como un marcador importante para PCVAD en infección PCV2 (Opriessnig et al., 2007, supra) . Por lo tanto, el establecimiento de ensayos PCR cuantitativos en tiempo real específicos de PTTV ayudaría a identificar las condiciones de enfermedad potencial asociados con TTV porcinos.
Se han descrito recientemente dos ensayos de PCR en tiempo real basados en sonda Taq an. El ensayo de plexado sencillo desarrollado por un grupo canadiense no fue específico de especies y sólo se diseñó para cuantificar las cargas víricas totales de las dos especies PTTV (Brassard et al., 2009, supra). El ensayo doble establecido por un grupo alemán permite la detección específica y simultánea de ambas especies (Gallei et al., 2009, supra). Las secuencias objetivo de cebadores usados en aquellos dos ensayos se determinaron al alinear las tres secuencias genómicas de TTV porcino (Sd-TTV31, TTV-lp y TTV-2p) y se localizaron en el UTR. En el estudio actual, con 7 secuencias genómicas PTTV completas adicionales disponibles (4 secuencias PTTV1 y 3 PTTV2) , se ha analizado y re-determinado las regiones conservadas a través de los 10 genomas PTTV de longitud completa. Con base en la alineación actualizada que resulta de este estudio, se desarrollaron dos ensayos PCR en tiempo real basados en SYBR verde de plexado sencillo especifico de especies para cuantificar las cargas víricas de PTTV1 y PTTV2, respectivamente. Los cebadores usados en los ensayos del solicitante se diseñaron para unirse a regiones genómicas conservadas distintas de los estudios previos, que puede incrementar la exactitud de la cuantificación . Nuestros ensayos muestra una especificidad y sensibilidad de especies considerable de detección con 44 copias genómicas para PTTV1 y 8.8 copias genómicas para PTTV2 por 25 µ? de reacción, mientras que el límite de detección de 10 copias genómicas por reacción se reportó en el- PCR en tiempo real doble basado en la sonda TaqMan (Gallei et al., 2009, supra) . Además, el ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR verde es un enfoque flexible y barato que puede llevarse a cabo directamente sin la necesidad de usar sondas fluorescentemente etiquetadas. Finalmente, al considerar que los TTVs porcinos exhiben un alto grado de diversidad genética, los resultados de ensayos basados en SYBR verde es poco probable que se afecten por los diferentes respaldos genéticos de variantes TTV porcinas que posiblemente contiene mutaciones en las secuencias enlazadas a la sonda en los ensayos basados en sonda Taq an.
A pesar de la presencia de ADN TTV, todas las muestras de suero de cerdos saludables probadas en este estudio tienen cantidades bajas de PTTV1 y PTTV2 que fueron menores que 2X106 copias/ml. Por otro lado, sólo una titulación extremadamente baja de ADN PTTV2 se detecto en tres muestras de semen. La mayoría de las muestras de suero probadas también fueron positivas para ADN PCV2 como se determina por PCR anidado convencional (datos no mostrados) . Muchos cerdos positivos en PCV2 con carga vírica baja no desarrollan PCVAD clínico. Un umbral propuesto para desarrollar PCVAD es 107 o mayor de copias genómicas PCV2/ml de suero (Opriessnig et al., 2007, supra) . Además, el ADN de PCV2 en semen positivamente también es un marcado del estado de enfermedad (Opriessnig et al., 2007, supra; Pal, N . , Huang, Y. ., Madson, D.M., Kuster, C, Meng, X.J., Halbur, P.G. y Opriessnig, T., 2008. Development and validation of a dúplex real-time PCR assay for the simultaneous detection and quantification of porcine circovirus type 2 and an infernal control on porcine semen samples. J Virol Methods 149, 217-25) . La situación de PTT.V específico de especies puede ser análoga a la de PVC2 y una titulación PTTV mayor que 107 copias/ml puede requerirse para la inducción de enfermedades porcinas. Los ensayos PCR en tiempo real específicos de especies desarrollados en este estudio ofrecerán herramientas sencillas y prácticas para investigaciones futuras de asociación PTTV con enfermedades que usan un gran número de muestras clínicas de varias condiciones de enfermedad.
Adicionalmente, al acoplar los dos ensayos de plexado sencillo específicos de especie, se ha desarrollado y validado una selección rápida, barata y confiable para la detección y diferenciación simultánea de las dos especies de TTV porcino, PTTV1 y PTTV2, en un ensayo PCR en tiempo real doble basado en MCA. Aunque este ensayo no se presenta para cuantificación exacta para ambas . especies , es un enfoque más conveniente que pudiera reemplazar la PCR anidada convencional para propósitos de detección. Én comparación con PCR de tiempo real, el ensayo de PCR anidada convencional para detección de TTVs porcinos consume tiempo (requiere un total de 4 rondas de PCR) , laborioso y propenso a contaminación de muestra que ocurre durante las rondas múltiples de procesamiento por PCR. Debido a la diferencia de valor Tm entre las especies PTTV1 y PTTV2, una amplificación PCR doble seguida por MCA es capaz de asegurar una especificidad de reacción distinta. Otra ventaja de este ensayo en tiempo real doble es que la inclusión de estándares PTTV1 y PTTV2 es dispensable cuando se realiza el protocolo descrito, lo que hace más fácil para uso mucho más amplio en cualquier laboratorio de diaqnóstico equipado con un instrumento de PCT en tiempo real automatizado.
La infección múltiple de TTVs porcinos con distintos genotipos o subtipos de la misma especies se ha demostrado (Gallei et al., 2009, supra) . En particular, los estudios previos del solicitante muestra que la especies TTV 1 consiste de dos tipos distintos, PTTVla (incluyendo cepas Sd-TTV31 y PTTVla-VA) y. PTTVlb (incluyendo cepas ' TTV-lp y PTTVlb-VA) . Los dos aislados PTTV1 recientemente publicados con genomas de longitud completo, swSTHY-TT27 (GQ120664) de Canadá y TTV1 #4718.19 (GU188045) de Alemania, ambos fueron clasificados en tipo Ib con base en el análisis filogenético (datos no mostrados) . La PCR anidada doble descrita en este estudio confirma que la infección doble de dos genotipos PTTVl ocurre frecuentemente en cerdos. Este ensayo novedoso es el primer enfoque PCR de diagnóstico desarrollado para distinguir entre PTTVla y Ib etc. Ya que actualmente no se conoce si una o ambas, de la infección por PTTVla y PTTVlb representan un factor relevante asociado con la enfermedad, en ensayo PCR diferencial del solicitante debiera ser de gran valor para asociaciones de enfermedad potencial futuras de estos dos tipos PTTV. .
De acuerdo con Otro aspecto de la invención, las proteínas ORF de TTV porcino se expresaron y usaron en ensayos de inmunodetección para detectar la presencia de anticuerpo específicos de TTV porcino. En una modalidad de la presente invención, tres proteínas ORFl etiquetadas con Histidina y truncadas de PTTVla, PTTVlb y PTTV2, se expresaron y purificaron en Escherichia coli (E. coli) , respectivamente. Adicionalmente, ambos ensayos de suero Western blot y ELISA que se basan en estos antígenos recombinantes se desarrollaron y validaron usando muestras de suero porcino de fuentes diferentes. En particular, la prueba serológica usando el ELISA específico PTTVla, PTTVlb y PTTV2 proporciona una herramienta exacta y sencilla para revelar la asociación de infección TTV porcina con enfermedades.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, las proteínas ORF TTV porcino se expresaron y unificaron como proteína cápsida ORFl recombinante en sistema de expresión de E.coli (Fig. 10, Fig. 15). Se expresaron y purificaron tres proteínas de cápsida ORFl etiquetada con His y truncadas de PTTVla, PTTVlb y PTTV2, en Escherichia coli (E. coli), respectivamente, y sirven como vacunas de subunidad cápsida recombinante contra infección por PTTV.
Cuatro cepas TTV2 de porcino, TTV-2p, TTV2#472142, PTTV2b-VA y PTTV2c-VA, tienen secuencias genómicas completas disponibles a la fecha. Aunque se clasifican filogenéticamente en tres subtipos supuestos, un análisis comparativo de perfiles de hidrofilicidad de los aminoácidos que codifican 0RF1 de cuatro PTTV2 muestran que comparten tres regiones hidrofilicas , una región rica en arginina desde aa 1-49 en la terminal N y dos dominios particulares (I y II) localizado a la mitad y la parte de terminal C, respectivamente (Fig. 9A) . La región de terminal C usada para la expresión de 0RF1 de PTTV2c-VA truncada y las regiones correspondientes compartidas en otras tres cepas PTTV2se indicaron por recuadro punteado. Las alineaciones de secuencias de aminoácidos demuestran altos niveles de conservación de secuencias de dominios I (aa 322-349) y II (aa 536-625) a través de las cuatro cepas PTTV2 (Fig. 9B) .
Ya que los dominios hidrofilicos se consideran que son importantes para la antigenicidad de muchas proteínas, la región de terminal 0· (aa 310-625) de la ORFl de PTTV2c-VA SEQ ID NO: 16 que contiene los dos dominios se eligió para expresión de próteína, que debiera usarse como antígeno para la detección de anticuerpo específico de PTTV2 en suero porcino. De acuerdo con un aspecto de la invención, la expresión de ORFl de PTTV2c fue suficiente para la detección de todos los subtipos d PTTV2 (2a, 2b y 2c; también ver Fig. 3A) .
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la parte de terminal C del' gen ORFl de PTTV2c fusionado con 8 X etiquetas His se construyó y expresó en E.coli. La proteina recombinante fue insoluble y se expresa dentro de los cuerpos de inclusión bacterianos. La Figura 10A muestra SDS-PAGE de productos 2c-ORFl no purificados. La Figura 10B muestra SDS-PAGE de productos 2c-0RFl purificados. La Figura 10C muestra análisis Western blot de productos 2c-0RFl purificados usando un mAb etiquetado con anti-His. Las puntas de flecha blancas indican la proteina ORFl con el tamaño esperado y su producto truncado mientras que las puntas de flecha negras muestras los dimeros supuestos de las proteínas esperadas y truncadas. M: marcadores de proteina. En la Fig. 10A, se producen dos polipéptidos importantes (puntas de flechas blancas) en la muestra no purificada de 2c-0RFl en comparación con la mue'stra de control. La banda de ~40 KDa fue consistente con el tamaño esperado de 2c-0RFl mientras que el polipéptido de ~30 KDa probablemente fue un producto truncado de terminal N del anterior. Después de la purificación con una columna de afinidad en níquel, se mostraron cuatro polipéptidos incluyendo las dos bandas importantes descritas en SDS-PAGE. (Fig. 10B) . También se detectaron por western blot usando un mAb etiquetado con anti-His (Fig. 10C) . Dos bandas de alta masa molecular (puntas de flecha negras) fueron los homodímeros formados por los dos polipéptidos de ~40 KDa y ~30 KDa, respectivamente, con base en los tamaños predichos (~80 KDa y ~60 KDa) . Los resultados demuestran que el PTTV2c-0RFl de terminal C purificado se produjo exitosamente y debiera usarse para detección de anticuerpo TTV2 de porcino en suero de porcino.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, los anticuerpos TTV2 porcinos en varias muestras de suero de porcino pueden detectarse · por Western blot usando PTTV2c-0RFl de terminal C purificado. Las puntas de flechas blancas indican la proteina ORF1 con el tamaño esperado y su producto truncado. Debe señalarse que sólo las bandas en color verde se reconocieron como positivas. Se recolectaron un total de más de 200 muestras de suero de cerdos convencionales (saludables o enfermos), cerdos CD/CD y cerdos gnotobióticos de diferentes fuentes. Las muestras se seleccionaron aleatoriamente para detección de anticuerpos IgG anti-PTTV2c-ORF1 usando el PTTV2c-ORFl de terminal C purificado como antigeno. La Figura 11A · muestra los -resultado de análisis Western blot de muestras, de suero porcinas seleccionadas de cerdos convencionales, la Figura 11B muestra cerdos CD/CD, y la Figura 11C muestra cerdos gnotobióticos. Se usaron productos PTTV2c-0RFl purificados como los antigenos. Las dos bandas ~40 KDa y ~30 KDa marcadas se detectaron en la mayoría de las muestras de los cerdos convencionales (Fig. HA) y cerdos CD/CD (Fig. 11B)-, indicando ampliamente infección PTTV2 en estos cerdos. Sin embargo, todos los cerdos gnotobióticos de dos fuentes diferentes (Blacksburg, VA y Ames, IA) no tienen anticuerpo PTTV2 detectable (Fig. 11C) . También se observaron bandas de masa molecular baja adicionales (Fig. 11A y 11B) . Fueron probables de reactividad no especifica en el Western blot.
De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, ELISA especifico de PTTV2 puede usarse como una prueba serológica TTV2 porcino. Los resultados seronegativos también se mostraron en unas pocas muestras de cerdos convencionales de una granja de Wisconsin (Fig. 12). Estas muestras negativas se agruparon y usaron como una referencia negativa en el desarrollo de un ELISA especifico de PTTV2. Las muestras restantes de esta fuente fueron positivas (Fig. 12, los cuatro carriles a la izquierda) . Además, el suero porcino de una compañía comercial usado en cultivo celular (supuesto para estar libre de enfermedades OIE) también muestra positividad anti-PTTV2-ORF2 fuerte (Fig. 12), que se usó como un control positivo para ELISA. Las concentraciones de antígeno 2c-ORFl purificado, el suero porcino y conjugado IgG se determinaron por titulación con tabla de revisión para presentar señal de fondo baja y dar la diferencia más alta del valor OD405 entre los controles positivos y negativos. La cantidad de antígeno óptima fue 69 ng por pozo, y los resultados ELISA óptimos se obtuvieron por uso de una dilución 1:100 de muestras de suero y una dilución 1:4000 de conjugados IgG. Los valores de corte ELISA en el intervalo desde 0.25 hasta 0.5 en cada prueba. La Figura 4 muestra un resultado representativo que refleja la consistencia de western blot de suero y el ELISA desarrollado.
Se eligieron 138 muestras de sueros de cerdo convencional de 3 manadas para analizar la correlación entre carga vírica PTTV2 por PCR en tiempo real y nivel de anticuerpo IgG anti-PTTV2 por ELISA. Los resultados muestran que cerdos con carga vírica PTTV2 superior o no detectable (108 copias/ml) fuer.on más probables para tener una titulación de anticuerpo PTTV2 de suero inferior que cerdos con valores medios de carga vírica PTTV2 (Fig. 13).
En particular, . los sueros de 10 cerdos en la misma manada también se analizaron al comparar las cargas víricas PTTV2 y niveles de anticuerpo an'ti-PTTV2 de sus sueros a su llegada en la nueva instalación a dos meses después de la llegada. Nueve de los 10 cerdos tienen cargas víricas disminuidas (tres tienen virus no detectable) después de 2 meses aunque las titulaciones de anticuerpo anti-PTTV2 incrementan en nueve de 10 cerdos (Fig. 14A y 14B) . Los resultados sugieren que los 10 cerdos adquieren infección PTTV2 en etapa temprana, lo que induce respuesta humoral y produce anticuerpo IgG de cápsida anti-ORFl progresivamente. El anticuerpo IgG PTTV2-ORF1 fue capaz de neutralizar o aún eliminar el virus, indicando que el ORF1 en efecto codifica una proteina cápsida ' vírica y puede contener epitopos neutralizantes contra PTTV2.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, las proteínas PTTVla y PTTVlb-ORFl de terminal C se expresaron y purificaron en un sistema de E. coli, respectivamente. SDS-PAGE y análisis western blot usando un mAb etiquetado anti His muestra que tanto los productos la como lb-ORF tienen dos polipéptidos , uno con tamaño esperado (-40 KDa) y otro como el homodímero supuesto (-80 KDa) (Fig. 15A-C) . La Figura 15A muestra SDS-PAGE de productos la-ORFl purificados y no purificados. La Figura 15B muestra SDS-PAGE de productos purificados lb-ORFl y lb-ORFlctruc . La Figura 15C muestra análisis Western blot de productos la y lb-ORFl purificados usando un mAb etiquetado anti-His. Las puntas de flecha blancas indican la proteína ORF1 con el tamaño esperado mientras que las puntas de flechas negras muestran el dímero supuesto de las proteínas ORF1. Comparado con la expresión 2c-ORFl, no se observó polipéptido truncado. Como un control comparativo, la expresión de una región lb-ORFl truncada de terminal C ( lb-ORFlctruc) resulta en un polipéptido de masa molecular inferior comparado con su lb-0RF1 de contraparte no truncada de terminal C (Fig. 15B) .
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, las proteínas PTTVla- y PTTVlb-ORFl de terminal C purificadas se usaron para desarrollar Western blots y ELISA de suero específico de genotipo como se describe para PTTV2 de arriba. La Figura 16 muestra ejemplos negativos (carriles 1-2) y positivos (carriles 3-5) de Western blot de suero usando la-ORFl como antígeno. La misma cantidad de antígeno (69 ng) , dilución de suero (1:100) y dilución de conjugado IgG (1:4000) como PTT 2-ORF1 se usaron en ELISA específica de PTTVla y PTTVlb (datos, no mostrados) .
Adicionalmente, la presenté .invención proporciona un reactivo de diagnóstico útil para detectar la infección TTV porcino que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal purificado de un hospedero natural tal como, por ejemplo, al inocular un cerdo con el TTV porcino o la composición inmunogénica de la invención en una cantidad inmunogénica efectiva para producir una infección vírica y recuperar el anticuerpo del suero del cerdo infectado. Alternativamente, los anticuerpos pueden elevarse en animales experimentales contra los polipéptidos naturales o sintéticos derivados o expresados de las secuencias de aminoácidos o fragmentos inmunogénicos codificados por la secuencia de nucleótidos del TTV porcino aislado. . Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse de células de hibridoma que se obtienen de ratones tales como, por ejemplo, Balb/c, inmunizados con un antigeno de polipéptido derivado de la secuencia de nucleótidos del TTV porcino aislado. La selección de las células de hibridoma se hace por crecimiento en hipoxantina, timidina y aminopterina en un medio de cultivo celular estándar tipo medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o medio esencial mínimo. Las células de hibridoma que producen anticuerpos pueden clonarse de acuerdo con procedimientos conocidos, en la técnica. Luego, las colonias discretas que se forman pueden transferirse en pozos separados de placas de cultivo para cultivo en un medio de cultivo adecuado. La identificación de células que secretan anticuerpo se hace por métodos de selección convencionales con el antígeno o inmunógeno apropiado. Cultivar las células de hibridoma in vitro o in vivo al obtener fluido de ascitos en ratones después de inyectar el hibridoma produce el anticuerpo monoclonal deseado por medio de técnicas bien conocidas.
Para otro método alternativo, la proteína de cápsida de TTV porcino puede expresarse en un sistema de expresión baculovirus o sistema de expresión E. coli de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. La proteína de cápsida de TTV porcino recombinante expresada puede usarse como el antígeno para diagnóstico en un Ensayo inmunoabsorbente¦ ligado a la enzima (ELISA). El ensayo ELISA basado en el antígeno de cápsida recombinante porcino, por ejemplo, puede usarse para detectar anticuerpos para TTV porcino en especie porcina y mamífera. Aunque el ensayo ELISA se prefiere, otras pruebas de diagnóstico conocidas pueden emplearse tal como ensayo de · inmunofluorescencia (IFA), ensayo de inmunoperoxidasa. (IPA), etc.
De forma deseable, un ensayo de diagnóstico ELISA comercial de acuerdo con la presente invención puede usarse para diagnosticar infección TTV porcino en cerdos. Los ejemplos se ilustran usando proteínas ORFl y 0RF2 purificadas de TTV porcino para desarrollar un ensayo ELISA para detectar anticuerpos anti-TTV en cerdos. El suero recolectado de cerdos infectados con TTV porcino, y el suero negativo de cerdos de control se usan para validar el ensayo. Los anticuerpos específicos de PTTV2, específicos de PTTVla, y específicos de PTTVlb · se demostraron para reconocer específicamente proteínas ORF PTTV. La estandarización adicional de la prueba por técnicas conocidas para aquellos experimentados en la técnica puede optimizar la comercialización de un ensayo de diagnóstico para TTV porcino.
Otro aspecto de la presente invención es la composición inmunogénica única que comprende el TTV porcino aislado o una proteina antigénica codificada por un polinucleótido aislado descrito anteriormente y su uso para levantar o producir anticuerpos. La composición contiene un portador no tóxico, fisiológicamente aceptable y, opcionalmente, uno o más adyuvantes. Los portadores adecuados, tales como, por ejemplo, agua, solución salina, etanol, etilenglicol , glicerol, etc., se seleccionan fácilmente de excipientes convencionales y pueden agregarse co-formulantes . Las pruebas de -rutina pueden realizarse para asegurar compatibilidad física y estabilidad de la composición final.
De acuerdo con la presente invención, se proporcionan además moléculas de ácido nucleico y moleculares infecciosas de Torque teño porcino (TTV) , virus vivos producidos de la molécula de ácido nucleico y vacunas veterinarias para proteger cerdos de infección vírica TTV porcino o enfermedad provocada por co-infección TTV porcino con otros virus. La invención proporciona además productos de expresión de polipéptido inmunogénico que pueden usarse como vacunas.
La molécula de ADN infecciosa novedosa de TTV porcino comprende una molécula de ácido nucleico que codifica al menos una porción de un genoma PTTVla-VA infeccioso (SEQ ID NO: 9), PTTVlb-VA (SEQ ID NO : 10 ) , PTTV2C-VA (SEQ ID NO: 11), o PTTV2C-VA (SEQ ID NO: 12). El clon de ADN de PTTV infeccioso preferiblemente contiene al menos uno del gen ORF1, ORF2, ORF1/1, y ORF2/2 del PTTV1 o PTTV2. Múltiples copias del genoma PTTVla-VA (SEQ ID NO: 9), PTTVlb-VA (SEQ ID NO: 10), PTTV2C-VA (SEQ ID NO: 11), o PTTV2c-VA (SEQ ID NO: 12) pueden insertarse en una molécula de ADN sencilla para construir clones PTTV infecciosos en tándem.
El ADN genómico clonado de PTTV, particularmente PTTVla- VA, PTTVlb-VA, PTTV2c-VA, y PTTV2b-RR tándem, PTTV2c-RR, descrito en la presente se muestra para ser infeccioso in vitro o in vivo cuando se transfecta en células PK-15 y se da a cerdos. Este agente. patogénico nuevo, fácilmente reproducible se deja por si mismo para el desarrollo de un programa de vacunación adecuado para prevenir infección PTTV en cerdos.
De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, tres clones de ADN de PTTV de copia de un genoma se derivaron de los PTTVla-VA, PTTVlb-VA- y PTTV2c-VA aislados US de prototipo por PCR de fusión, respectivamente. Cada uno del ADN genómico de longitud completa se insertó en un vector de clonación pSC-B-amp/kan por ligación del extremo romo. Este sitio de restricción BamH I es el sitio único en los tres genomas PTTV, que se prepararon por ingeniería en ambos extremos de los tres genomas para facilitar la generación de concatémeros y de esta manera imita el genoma circular TTV. Las digestiones sencillas BamH I del ADN plásmido seleccionado de cada clon claramente resulta en dos fragmentos diferentes de 4.3-Kb y 2.8-Kb en tamaño (Fig. 18A) . Los fragmentos 4.3-Kb representan el vector de fondo mientras que los fragmentos 2.8-Kb representan el ADN genómico PTTV insertado. El vector vacio pSC-B-amp/kan digerido con la misma enzima sólo muestra una banda 4.3-Kb (Fig. 18A) . Los clones PTTV resultantes se designaron pSC-PTTVla, pSC-PTTVlb y pSC-PTTV2c, respectivamente (Fig. 17A-C) .
Adicionalmente, dos copias del genoma PTTV2c-VA de longitud completa derivadas del clon pSC-PTTV2c se ligaron en tándem en el vector pSC-B-amp/kan para generar el clon pSC-2PTTV2c-RR (Fig. 17D) . La comparación de los patrones de digestión sencillos Afl II entre pSC-PTTV2c y pSC-2PTTV2c-RR muestra que el último plásmido tiene un fragmento 2.8-Kb adicional que representa . la segunda copia del genoma PTTV2c (Fig. 18B, panel derecho) . Posteriormente, se utilizó la misma estrategia, de clonación para producir un clon de ADN PTTV2b dimerizado por tándem derivado del clon TTV de Alemania TTV2-#471942-completo . Un fragmento 2.8-Kb adicional que representa la segunda copia del genoma PTTV2b se presentó en este constructo, designado pSC-2PTTV2b-RR (Fig. 17F) , que se digirió con el Hind III solo cuando se compara con su contraparte de un genoma de copia (Fig. 18B, panel izquierdo), confirmando la construcción exitosa.
Las competencias de replicación de los clones infecciosos PTTV construidos se probaron por transfección in vitro de células PK-15. IFA usando los anticuerpos policlonales de conejo comercialmente generados contra PTTV2c ORFl confirma que tanto los concatémeros de clones TTV2-#471942-completo y pSC-PTTV2c fueron competentes de replicación, respectivamente (Fig. 19A y Fig. 20A) . El paso de las células transfectadas no elimina ni reduce las señales fluorescentes (Fig. 19B y Fig. 20B) , sugiriendo que la expresión de proteínas ORFl fue resultado de los concatémeros PTTV2 que imitan las moléculas circulares PTTV2b o PTTV2c naturales. No se observó señales fluorescentes en células transfectadas simuladas o células transfectadas por ADN usando suero de conejo pre-inmúnitario como el anticuerpo para detección IFA (datos no mostrados) . Los concatémeros del clon pSC-PTTVla también se muestran para ser competentes de replicación usando un anticuerpo ORFl anti-PTTVla (Fig. 21) . Las señales fluorescentes positivas se localizaron en el núcleo de células transfectadas o pasadas, indicando que TTVs porcinos probablemente se replican en el núcleo celular. No es inesperado debido a que el circovirus porcino (PCV, por sus siglas en inglés) tiene un patrón de expresión similar in vitro.
La transfección directa del clon dimerizado por tándem pSC-2PTTV2b-RR o pSC-2PTTV2c-RR en células PK-15 resulta en replicación vírica y produce el antígeno de cápsida ORF1. IFA usando anticuerpos contra PTTV2 ORF1 confirma que ambos clones también fueron competentes en replicación y los antígenos ORF1 positivos se localizaron en el núcleo (Fig. 22? y B) .
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, los clones infecciosos de TTV porcino pueden usarse para inocular cerdos, que .luego producirán una respuesta inmunitaria del animal hospedero y estimulan la producción de anticuerpos neutralizantes. En una modalidad particular de la presente invención, los dos clones PTTV2 dimerizados por tándem fueron infecciosos cuando se inyectan en los ganglios linfáticos y músculos de cerdos convencionales.
Para probar la infectividad in vivo de clones moleculares PTTV2, se inocularon cerdos convencionales con el clon pSC-2TTV2b-RR o pSC-2TTV2c-RR .. Las muestras de suero se recolectaron de animales en los días 0, 7, 14, 21 y 28 después de la inoculación (DPI) . Se detectó ADN de PTTV2 en cerdos inoculados con pSC-2TTV2c-RR iniciando en 7 DPI (#92), 14 DPI (#188 y #191) y 21 DPI (#180), respectivamente (Fig. 23A, panel derecho) . El PTTV viremia apareció al final para cerdos inoculados con el clon pSC-2TTV2b-RR: dos inician en 14 DPI (#189 y #192), uno en 21 DPI (#181) y uno en 28 DPI (#193) (Fig. 23A, panel izquierdo) . Las cargas víricas incrementan durante el curso en todos los cerdos inoculados que tienen las cargas víricas más altas en 28 DPI antes de la necropsia, como se determina por PCR de tiempo real específico de PTTV2 (Fig. 23A) . Los productos PCR de tiempo real amplificados de cerdos seleccionados se procesaron por secuencia y encontraron para tener secuencias idénticas a las regiones correspondientes de pSC-2TTV2b-RR o pSC-2TTV2c-RR (datos no mostrados).
Todos los cerdos inoculados fueron negativos para anticuerpos PTTV2 ORF1 en 0 y 7 DPI. En 14 DPI, todos los cuatro cerdos inoculados por pSC-2TTV2b-RR se seroconvirtieron a IgG ORF1 anti-PTTV2, mientras que los cerdos en el grupo inoculado por pSC-2TTV2c-RR se seroconvierte en 14 (#92 y #180), 21 (#191) y 28 (#188) DPI, respectivamente (Fig. 23B) . Los resultados indican que la infección TTV2b porcino o TTV2c activa ha ocurrido.
Las vacunas de los clones de ADN moleculares infecciosos y víricos infecciosos, y métodos para usarlos, también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Los cerdos inoculados se protegen de infección vírica y enfermedades asociadas provocadas por infección o coinfección TTV2. El método novedoso protege a cerdos que necesitan de protección contra infección vírica al administrar al cerdo una cantidad inmunológicamente efectiva de una vacuna de acuerdo, con la invención, tal como, por ejemplo, una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica del ADN de PTTV infeccioso, un plásmido o vector vírico que contiene el clon de ADN infeccioso de PTTV, el ADN de PTTV recombinante, los productos de expresión del polipéptido, la proteína de cápsida 0RF1 recombinante purificada expresada por baculovirus o expresada por bacterias, etc. Otros antígenos tales como PRRSV, PPV, otros agentes del puerco infeccioso y estimulante inmunitarios pueden darse concurrentemente al cerdo para' proporcionar un espectro amplio de protección contra infecciones víricas.
Las vacunas comprenden, por ejemplo, los clones de ADN moleculares y víricos infecciosos, el genoma de ADN infeccioso de PTTV clonado en plásmidos o vectores adecuados tales como, por ejemplp, el vector pSC-B, una no virulenta, virus vivo, un virus inactivado, vacuna de subunidad de cápsida recombinante expresada, etc. en combinación con un portador no tóxico, fisiológicamente aceptable y, opcionalmente, uno o más adyuvantes. La vacuna también puede comprender el clon de ADN molecular TTV2 infeccioso descrito en la presente. El ADN de. PTTV infeccioso, el ADN de plásmido que contiene el genoma vírico infeccioso y el virus vivo se prefieren con el virus vivo siendo el más preferido. La vacuna vírica viva, no virulenta de la presente invención proporciona una ventaja sobre vacunas víricas tradicionales que usan ya sea virus vivos, atenuados que corren el riesgo de revertirse de nuevo al estado virulento o virus completo propagado de cultivo celular exterminado que no puede inducir respuesta inmunitaria de anticuerpo suficiente para protección contra la enfermedad vírica.
Las vacunas y métodos para usarlos también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Las especies mamíferas inoculadas sé protegen de infección vírica seria, también pueden proporcionar protección para enfermedad relacionada con co-infección de PTTV, tal como dermatitis porcina y síndrome de nefropatía (PDNS, por sus siglas en inglés), síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete (PMWS, por sus siglas en inglés), y otra enfermedad relacionada. Las vacunas comprenden, por ejemplo, un virus TTV porcino inactivado o atenuado, un portador no tóxico, fisiológicamente aceptable y, opcionalmente, uno o más adyuvantes .
El adyuvante, que puede administrarse en conjunto con la vacuna de la presente invención., es una sustancia que incrementa la respuesta inmuno.lógica del cerdo para la vacuna. El adyuvante puede administrarse al mismo tiempo y en el mismo sitio que la vacuna, o en un tiempo diferente, por ejemplo, como un refuerzo. Los adyuvantes también pueden administrarse ventajosamente al cerdo en una manera o en un sitio diferente de la manera o sitio en -el cual la vacuna se administra. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de aluminio (alum) , complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), polímeros o copolímeros de bloque no iónico, citocinas ' (tipo. IL-1, IL-2, IL-7, IFN-a, IFN-ß, IFN-?, etc.), saponinas,¦ monofosforilo de lípido A (MLA) , dipéptidos de muramilo (MDP) y similares. Otros adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, sulfato de aluminio potasio, enterotoxina inestable al calor o estable al calor aislada de Escherichia coli, toxina de cólera o la subunidad B de la misma, toxina de difteria, toxina de tétanos, toxina de tos ferina, adyuvante completo o incompleto de Freund, etc. Los adyuvantes basados en toxina, tales como toxina de difteria, toxina de tétanos y toxinas de tos ferina pueden inactivarse antes- del uso, por ejemplo, por tratamiento con formaldehido .
Las vacunas pueden contener además antigenos adicionales para promover la actividad inmunologica de los clones de ADN PTTV infecciosos tales como, por ejemplo, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV, por sus siglas en inglés), parvovirus porcino (PPV, por sus siglas en inglés), otros agentes del puerco infecciosos y estimulantes inmunitarios .
Las vacunas nuevas de esta invención no se restringen a cualquier tipo o método particular de preparación. Las vacunas víricas clonadas incluyen, pero no se limitan a, vacunas de ADN infecciosas (esto es, usando plásmidos, vectores u otros portadores convencionales para inyectar directamente ADN en cerdos), vacunas vivas, vacunas vivas modificadas, vacunas inactivadas, vacunas de subunidad, vacunas atenuadas, vacunas genéticamente preparadas por ingeniería, etc. Estas vacunas se prepararon por métodos estándares conocidos en la técnica.
Como un beneficio adicional, el virus vivo preferido de la presente invención proporciona una vacuna genéticamente estable que es más fácil de hacer, almacenar y suministrar que otros tipos de vacunas atenuadas.
Otra vacuna preferida de la presente invención utiliza plásmidos adecuados' para suministrar el clon de ADN no patogénico a cerdos. En contraste a la vacuna tradicional que usa cultivo celular exterminado o vivo propagados de virus completo, esta invención se proporciona para la inoculación directa de cerdos con el ADN plásmido que contiene el genoma vírico infeccioso.
Las vacunas genéticamente preparadas por ingeniería adicionales, que son deseables en la presente invención, se producen por técnicas conocidas en la técnica. Tales técnicas involucran, pero no se limitan a, manipulación adicional de ADN recombinante, modificación de o sustituciones a las secuencias de aminoácidos de las proteínas recombinantes y similares.
Las vacunas genéticamente preparadas por ingeniería basadas en tecnología de ADN recombinante se hacen, por ejemplo, al identificar porciones alternativas del gen vírico que codifica proteínas responsables para inducir una respuesta protectora o inmunitaria más fuerte en cerdos (por ejemplo, proteínas derivadas de ORF1, ORF1/1, ORF2, ORF2/2, etc.). Tales genes identificados o fragmentos inmuno-dominantes pueden clonarse en vectores de expresión de proteína estándar, tal como el vector de baculovirus, y usarse para infectar células hospederas apropiadas (ver, por ejemplo, O'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992). Las células hospederas se cultivan, de esta manera expresando las proteínas de vacuna deseadas, que pueden purificarse a la extensión deseada y formularse en un producto de vacuna adecuado. Las vacunas de subunidad recombinantes. están basadas en proteínas de cápsida 0RF1 expresadas por bacterias (Fig. 10, Fig. 15) o expresadas por baculovirus de PTTVla, PTTVlb y PTTV2.
Si los clones . retienen cualquiera de las capacidades naturales indeseables de la enfermedad provocada, también es posible señalar las secuencias de. nucleótido en el genoma vírico responsable para cualquier virulencia residual, y genéticamente preparar por ingeniería el virus no virulento a través de, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. La mutagénesis dirigida al sitio es capaz de agregar, eliminar o cambiar uno o más nucleótidos (ver, por ejemplo, Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984). Un oligonucleótido se sintetiza que contiene la mutación deseada y alineado a una porción de ADN vírico de hebra sencilla. La molécula híbrida, que resulta de tal procedimiento, se emplea para transformar bacterias. Luego el ADN de hebra doble, que se aisla contiene la mutación apropiada, se' usa para producir ADN de longitud completa por ligación a un fragmento de restricción del último que se transfecta posteriormente en un cultivo celular adecuado. La ligación del genoma en el vector adecuado para transferencia puede realizarse a través de cualquier técnica estándar conocida , para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. La transfección del vector en células hospederas para la producción de progenie vírica puede hacerse usando cualquiera de los métodos convencionales tales como transfección mediada por calcio-fosfato o DEAE-dextrano, electroporación, fusión de protoplastos y otras técnicas bien conocidas (por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . El virus clonado luego muestra la mutación deseada. Alternativamente, dos oligonucleótidos pueden sintetizarse que contienen la mutación apropiada. Estos pueden combinarse en sus pares de bases para formar ADN de hebra doble que puede insertarse en el ADN vírico para producir ADN de longitud completa.
Una cantidad inmunológicamente efectiva de las vacunas de la presente invención se administra a un cerdo que necesita de protección contra infección vírica. La cantidad inmunológicamente efectiva o la cantidad inmunogénica que inocula el cerdo puede determinarse fácilmente o titularse fácilmente por prueba de rutina. Una cantidad efectiva es una en la cual una respuesta inmunológica suficiente para la vacuna se logra para proteger al cerdo expuesto al virus PTTV. Preferiblemente, el cerdo está protegido a una extensión en la cual uno hasta todos de los síntomas fisiológicos adversos o efectos de la enfermedad vírica se reducen significativamente, alivian o previenen totalmente.
La vacuna puede, administrarse en una dosis sencilla o en dosis repetidas. Las dosis pueden estar en el intervalo, por ejemplo, desde alrededor de 1 microgramo hasta alrededor de 1,000 microgramos del ADN plásmido que contiene el genoma de ADN quimérico infeccioso (dependiente de la concentración del componente inmuno-activo de la vacuna) , preferiblemente 100 hasta 200 microgramos del clon de ADN de TTV porcino, pero no debe contener una cantidad de antígeno basado en virus suficiente para resultar en una reacción adversa o síntomas fisiológicos de la infección vírica. Los métodos se conocen en la técnica para determinar o titular dosificaciones adecuadas de agente antigénico activo para encontrar dosificaciones efectivas mínimas basadas en el peso del cerdo, concentración del antígeno y otros factores típicos. Preferiblemente, el clon de ADN vírico infeccioso se usa como una vacuna, o un virus infeccioso vivo puede generarse in vitro y luego el virus vivo se usa como una vacuna. En tal caso, desde alrededor de 50 hasta alrededor de 10,000 de la dosis infectiva del cultivo de tejido al 50% (TCID 50) de virus vivo, por ejemplo, puede darse a un cerdo.
Las nuevas vacunas de esta invención no se restringen a ningún tipo o método particular de preparación. Las vacunas incluyen, pero no se limitan a, vacunas vivas modificadas, vacunas inactivadas, vacunas de subunidad, vacunas atenuadas, vacunas genéticamente preparadas por ingeniería, etc.
Las ventajas de vacunas vivas son que todas las respuestas inmunitarias posibles se activan en el receptor de la vacuna, incluyendo respuestas inmunitarias mediadas sistémicas, locales, humoral y por células. Las desventajas de vacunas de virus vivos, que pueden ser mayores que las ventajas, radican en el potencial para contaminación con agentes víricos extraños vivos o el riesgo que el virus puede revertir la virulencia en el campo.
Para preparar vacunas de virus inactivados, por ejemplo, la propagación de virus y producción de virus puede ocurrir en líneas celulares porcinas cultivadas tales como, sin limitación células PK-15. La inactivación del virus en serie luego se optimiza por protocolos generalmente conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica o, preferiblemente, por los métodos descritos en la presente.
Las vacunas de virus inactivadas pueden prepararse al tratar el TTV porcino con agentes inactivados tales como formalina o solventes hidrofóbicos, ácidos, etc., por irradiación con luz ultravioleta o rayos X, por calentamiento, etc. La inactivación se conduce en una manera entendida en la técnica. Por ejemplo, en inactivación química, una muestra de suero o muestra de virus adecuada que contiene el virus se trata durante una longitud suficiente de tiempo con una concentración o cantidad suficiente de agente inactivado a una temperatura suficientemente alta (o baja, dependiendo del agente inactivado) o pH para inactivar el virus. La inactivación por calentamiento se conduce a una temperatura y durante una longitud de tiempo suficiente para inactivar el virus. La inactivación por irradiación se conduce usando una longitud de onda de luz u otra fuente de energía durante una longitud de tiempo suficiente para inactivar el virus. El virus se. considera inactivado si es incapaz de infectar una célula susceptible a infección.
La preparación de vacunas de subunidad típicamente difiere de la preparación de una vacuna viva modificada o una vacuna inactivada. Antes de la preparación de una vacuna de subunidad, los componentes antigénicos o protectores de la vacuna deben identificarse. En la presente invención, los componentes antigénicos de PTTV se identificaron como las proteínas de cápsida ORFl de PTTVla, PTTVlb y PTTV2 , que se expresaron y purificaron en' Escherichia coli (E. coli) en esta invención, y otro sistema de expresión, tal como sistema de expresión de baculovirus, para uso como vacunas de cápsida recombinantes de subunidad. Tales componentes antigénicos o protectores incluyen ciertos segmentos o fragmentos de aminoácido de las proteínas de cápsida víricas que levantan una respuesta inmunológica o protectora particularmente fuerte en cerdos; proteínas de cápsida víricas múltiples o sencillas por sí mismas, oligómeros de los mismos, y asociaciones de orden superior de las proteínas de cápsida víricas que forman subestructuras de virus o partes o unidades identificables de tales subestructuras; oligoglicósidos , glicolípidos o glicoproteínas presentes en o cerca de la superficie del virus o en subestructuras víricas tales como las lipoproteínas o grupos de lipido asociados con el virus, etc. Preferiblemente, la proteína ORF1 se emplea como el componente antigénico de la vacuna de subunidad. Otras proteínas también pueden usarse tales como aquellas codificadas por la secuencia de nucleótidos en el gen ORF2, ORF1/1, y ORF2/2. Estos componentes inmunogénicos se identifican fácilmente por métodos conocidos en la técnica. Una vez identificados, las porciones protectoras o antigénicas del virus (esto es, la "subunidad") se purifican y/o clonan posteriormente por procedimientos conocidos en la técnica. La vacuna de subunidad proporciona una ventaja sobre otras vacunas basadas en el virus vivo ya que la subunidad, tal como subunidades altamente purificadas del virus, es menos tóxica que el virus completo.
Si la vacuna de subunidad se produce a través de técnicas genéticas recombinantes, la expresión de la subunidad clonada tal como los 0RF1, 0RF2. 0RF1/1, y ORF2/2, por ejemplo, pueden expresarse por el método proporcionado arribo, y también pueden optimizarse por métodos conocidos para aquellos en la técnica (ver, por ejemplo, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Mass. (1989)). Por otro lado, si la subunidad se emplea representa una característica estructural intacta del virus, tal como una proteína de cápsida completa, el procedimiento para su aislamiento del virus luego debe optimizarse. En cualquier caso, después de la optimización del protocolo de inactivación, el protocolo de purificación de la subunidad puede optimizarse antes de la' fabricación.
Para preparar vacunas atenuadas, el virus patogénico, vivo primero se atenúa (no patogénicas prestadas o inofensivas) por métodos conocidos en la técnica o, preferiblemente, como se describe en la presente. Por ejemplo, los virus atenuados pueden prepararse por la técnica de la presente invención que involucra el paso en serie novedoso a través de huevos de cerdo embrionados. Los virus atenuados pueden encontrarse en la naturaleza y pueden tener eliminaciones de gen que se presentan naturalmente o, alternativamente, los virus patogénicos pueden atenuarse al hacer eliminaciones de gen o produciendo mutaciones de gen. Las vacunas de virus inactivados y atenuados comprenden las vacunas preferidas de la presente invención.
Las vacunas genéticamente preparadas por ingeniería, que también son deseables en la presente invención, se producen por técnicas conocidas en la técnica. . Tales técnicas involucran, pero no se limitan a, el uso de ARN, ADN recombinante, proteínas recombinantes , virus vivos y similares.
Por ejemplo, después de la purificación, el virus tipo natural puede aislarse de muestras biológicas, clínicas adecúas tales como muestras de suero, fecal, saliva, semen y tejido por métodos conocidos en la técnica, preferiblemente por el método enseñado en la presente usando cerdos infectados o líneas celulares adecuadas infectadas. El ADN se extrae del agente infeccioso o virus biológicamente puro por métodos conocidos en la técnica, y purificados por métodos conocidos en la técnica, preferiblemente por ultracentrifugación en un gradiente CsCl. El cADN de genoma vírica se clona en un hospedero adecuado por métodos conocidos en la técnica (ver Maniatis et al., id.), y el genoma de virus luego se analiza para determinar regiones esenciales del genoma para producir porciones antigénicas del virus. De aquí en adelante, el procedimiento es generalmente el mismo como aquel para la vacuna viva modificada, una vacuna inactivada o una. vacuna de subunidad.
Se hacen vacunas genéticamente preparadas por ingeniería basadas en tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, al identificar la porción del gen vírico que se codifica para proteínas responsables para inducir una respuesta protectora o inmunitaria más fuerte en cerdos (por ejemplo, . proteínas derivadas de 0RF1, 0RF2, 0RF1/1, y ORF2/2, etc.). Tales genes identificados o fragmentos inmuno-dominantes pueden clonarse en vectores de expresión de proteína estándar, tal como el vector de baculovirus, y usarse para infectar células hospederas apropiadas (ver, por ejemplo, O'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co. (1992)). Las células hospederas se cultivan, de esta manera expresan las proteínas de vacuna deseadas, que pueden purificarse a la extensión deseada y formularse en un producto de vacuna adecuado.
Las proteínas genéticamente preparadas por ingeniería, útiles en vacunas, por ejemplo, pueden expresarse en células de insecto, células de levadura o células mamíferas. Las proteínas genéticamente preparadas por ingeniería, que pueden purificarse o aislarse por métodos convencionales, pueden inocularse directamente en una especie porcina o mamífera para conferir protección contra TTV porcino.
Una linea celular de insecto (tipo sf9, sf21, o HIGH-FIVE) puede transformarse con un vector de transferencia que contiene ácidos polinucleótidos obtenidos del virus o copiados del genoma vírico que codifica una o más de las proteínas inmuno-dominantes del virus. El vector de transferencia incluye, por ejemplo, ADN de baculovirus linealizado y un plásmido que contiene los polinucleótidos deseados. La línea celular hospedera puede co-transfectarse con el ADN de baculovirus linealizado y un plásmido con objeto de hacer un baculovirus recombinante .
Alternativamente, el ADN del TTV porcino aislado que codifica una o más proteínas cápsida puede insertarse en los vectores vivos, tales como un poxvirus o un adenovirus y usarse como una vacuna.
Una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna de la presente invención se · administra a una especie porcina o mamífera que necesita de protección contra la infección o síndrome. La "cantidad inmunológicamente efectiva" puede determinarse fácilmente o titularse fácilmente por prueba de rutina. Una cantidad efectiva es una en la cual una respuesta inmunológica suficiente para la vacuna se logra para proteger al cerdo u otro mamífero expuesto al virus TTV porcino, o co-infección TTV porcino, que puede provocar dermatitis porcina y síndrome de nefropatia (PDNS) , síndrome de desgaste multisistémico posterior al destete (PMWS) o enfermedad relacionada. Preferiblemente, el cerdo u otra especie mamífera están protegidos para una extensión en la cual uno hasta todos de los síntomas fisiológicos adversos o efectos de la enfermedad vírica se encuentran para reducirse significativamente, aliviarse o prevenirse totalmente.
La vacuna puede administrarse en una dosis sencilla o en dosis repetidas. Las dosificaciones pueden contener, por ejemplo, desde 1 hasta 1,000 microgramos de antígeno basado en virus (dependiente de la concentración del componente inmuno-activo de la vacuna) , pero no debe contener una cantidad de antígeno basado en virus suficiente para resultar en una reacción adversa o síntomas fisiológicos de infección vírica. Los métodos se conocen en la técnica para determinar o titular dosificaciones adecuadas de agente antigénico activo basado en el peso del pájaro o mamífero, concentración del antígeno y otros factores típicos.
La vacuna puede administrarse a cerdos. También, la vacuna puede darse a humanos tales como criadores de cerdos quienes están en riesgo alto de infectarse por el agente vírico. Es contempla que una vacuna basada en el TTV porcino puede diseñarse para proporcionar protección amplia contra tanto TTV porcino como humano. En otras palabras, la vacuna basada en el TTV porcino puede diseñarse preferencialmente para proteger contra infección TTV humana a través del asi llamado "enfoque Jenneriano" (esto es, vacuna del virus de la viruela bovina puede usarse contra la viruela humana por Edward Jenner) . Deseablemente, la vacuna se administra directamente a un porcino u otra especie mamifera sin aún exponerse al virus TTV. La vacuna puede convenientemente administrarse oralmente, intrabucalmente, intranasalmente, transdérmicamente, parenteralmente, etc. La ruta parenteral de administración incluye, pero no se limita a, rutas intramusculares, intravenosas, intraperitoneales y subcutáneas.
Cuando se administra como un liquido, la vacuna actual puede prepararse en la forma de una solución acuosa, un jarabe, un elixir, una tintura y similares. Tales formulaciones se conocen en la técnica y se preparan típicamente por disolución del antígeno y otros aditivos típicos en los sistemas de solvente o portador apropiados. Los solventes o portadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, etanol, etilenglicol, glicerol, etc. Los aditivos típicos son, por ejemplo, pigmentos certificados,, sabores, edulcorantes y conservadores antimicrobianos tales como timerosal (etilmercuritiosalicilato de sodio) . Tales soluciones pueden estabilizarse, por ejemplo, por adición de gelatina parcialmente hidrolizada, sorbitol o medio de cultivo celular, y pueden amortiguarse por métodos convencionales usando reactivos conocidos en la técnica, tales como fosfato ácido de sodio, fosfato diácido de sodio, fosfato ácido de potasio, fosfato diácido de potasio, una mezcla de los mismos, y similares.
Las formulaciones liquidas también pueden incluir suspensiones y emulsiones que contienen agentes de suspensión o emulsionantes en combinación con otros co-formulantes estándares. Estos tipos de formulaciones liquidas pueden prepararse por métodos convencionales. Las suspensiones, por ejemplo, pueden prepararse usando un molino de coloide. Las emulsiones, por ejemplo, pueden prepararse usando un homogenizado.
Las formulaciones parenterales, diseñarse para inyección en sistemas de fluido .corporales, requieren isotonicidad apropiada y solución amortiguadora de pH para los niveles correspondiente de 'fluidos corporales mamíferos. La isotonicidad puede ajustarse apropiadamente con cloruro de sodio y otras sales como sean necesarias. Los solventes adecuados, tales como etanol o propilenglicol , pueden usarse para incrementar la solubilidad de los ingredientes en la formulación y la estabilidad de la preparación liquida. Los aditivos adicionales que pueden emplearse en la vacua actual incluyen, pero no se limitan a, dextrosa, antioxidantes convencionales y agentes quelantes convencionales tales como ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) . Las formas de dosificación parenterales también deben esterilizarse antes del uso.
Los siguientes ejemplos demuestran ciertos aspectos de la presente invención. Sin embargo, es para entenderse que estos ejemplos son para ilustración solamente y no aparentan para ser completamente definitivos en cuanto a las condiciones y alcance de esta invención. Debe apreciarse que cuando las condiciones de reacción típicas (por ejemplo, temperatura, tiempos de reacción, etc.)' se han dado, también pueden usarse las condiciones tanto de arriba como de debajo de los intervalos específicos, aunque generalmente menos conveniente. Los ejemplos se conducen a temperatura ambiente (alrededor de 23°C. hasta alrededor de 28°C.) y a presión atmosférica. Todas las partes de porcentajes referidos en la presente son en una base en peso y todas las temperaturas se expresan en grados centígrados, a menos que se especifique de otra manera .
Ejemplo 1.
Extracción de ADN vírica, PCR anidado y PCR genómico: Las muestras de semen y suero convenientes de 20 cerdos adultos convencionales de un criadero de cerdos de Virginia se usaron en el estudio. El ADN total se aisló de 20 muestras de suero y 19 de semen usando mini kit de ADN QIAamp (Qiagen) . Para seleccionar las muestras que contienen PTTV positivas, amplificaciones PCR anidadas de las regiones conservadas en el UTR de PTTVl y PTTV2 se realizaron inicialmente al usar polimerasa AmpliTag Gold (Applied Biosystems) . Los dos pares de cebador usados para amplificar el fragmento A de PTTVl fueron TTVl-mF (SEQ ID NO : 5 ) /TTVl-mR (SEQ ID NO: 46) (para el PCR de primera ronda) y TTVl-nF (SEQ ID NO: 47) /TTVl-nR . (SEQ ID NO:48) (para el PCR de segunda ronda) , mientras que los dos pares de cebador usados para amplificar el fragmento D de PTTV2 fueron TTV2 -mF (SEQ ID NO: 49) /TTV2-mR (SEQ ID NO: 50) (para el PCR de primera ronda) y TTV2-nF (SEQ ID NO : 51 ) /TTV2-nR (SEQ ID NO: 52) (para el PCR de segunda ronda; Fig. 1A y Tabla' 1) .
Con objeto de amplificar la secuencias genómicas de longitud completa de tanto PTTVl como PTTV2, se realizaron primero en PCR genómico inverso usando un par de cebadores específicos del gen conservado TTVl-IF (SEQ ID NO : 1 ) /TTV1-IR (SEQ ID NO: ) localizado en la región A para PTTVl y otro par de cebadores específicos del gen'TTV2-IF (SEQ ID NO:5)/TTV2-IR (SEQ ID NO: 8) localizado en la región D para PTTV2, respectivamente, con polimerasa de ADN de Fusión Herculase II (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No se detectaron productos PCR con. tamaños esperados. Posteriormente se diseñaron nuevos conjuntos de cavadores para amplificar dos regiones que cubren los genomas PTTV1 y PTTV2 completos en el PCR de segunda ronda, respectivamente (Fig. 1A) . Los pares de cebador usados para amplificar fragmentos B y C de PTTV1 fueron TTV1-IF (SEQ ID N0:1)/TTV1-2340R (SEQ ID NO:2) y TTV1-2311F (SEQ ID NO : 3 ) /TTV1-IR (SEQ ID NO: 4), respectivamente,' mientras que los pares de cebador usados para amplificar fragmentos E y F de PTTV2 fueron TTV2-IF (SEQ ID NO: 5) /TTV2-2316R (SEQ ID NO: 6) y TTV2-GCF (SEQ ID NO: 7) /TTV2-IR (SEQ ID NO : 8 ) , respectivamente (Fig. 1A y Tabla 1). Los fragmentos C y- F contienen las regiones ricas en GC de PTTV1 y PTTV2, respectivamente. Los productos PCR amplificados se eliminaron individualmente, purificaron y clonaron posteriormente en un vector pSC-B-amp/kan (Stratagene) por estrategia de clonación PCR StrataClone Blunt PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene) seguido por procesado por secuencia de ADN.
Ejemplo 2.
Cribado para muestras positivas de TTV porcino recolectadas de cerdos en una granja de Virginia: El ADN de TTV porcino se detectó previamente de cerdos en regiones geográficas diferentes por PCR anidado basado en la secuencia UTR de una PTTVl japonesa de cepa Sd-TTV31 (McKeown et al., 2004, supra) . Con la identificación reciente de PTTV2, dos diferentes conjuntos de cebadores PCR anidados se han usado para amplificar la región A de PTTVl y región D de PTTV2, respectivamente (Fig. 1A) (Ellis et al., 2008, supra; Kekarainen, T., Sibila, M. , y Segales, J. (2006). Prevalence of swine Torque teño virus in post-weaning multisystemic wasting syndrome ( PMWS ) -affected y non-PMWS-affected cerdos in Spain. J Gen Virol 8 (Pt 4), 833-7; Krakowka et al., 2008, supra). Un enfoque de detección similar también se utilizó en el estudio actual para identificar cepas PTTV de cerdos en los Estados Unidos. Con objeto de seleccionar de muestras positivas PTTVl- o PTTV2 indígenas para uso posterior para determinar las secuencias genómicas de longitud completa, 20 muestras de suero (SR#1-20) y 19 de semen (SM#1-18, y S #20) recolectadas de 20 cerdos en una granja de Virginia se sometieron a análisis PCR anidados. De manera sorpresiva, todas las 20 muestras de suero fueron positivas para PTTVl y 19 también fueron positivas para PTTV2 (excepto para SR#18) . En contraste, sólo 1 muestra de semen (SM#6). fue PTTVl-positiva y 3 muestras de semen (SM#8, 9 y 20) fueron PTTV2-positivas . El resultado fue consistente con un estudio reciente en tales muestras de semen del cerdo se mostraron para ser positivas para ADN de PTTV en España (Kekarainen, T., Lopez-Soria, S., y Segales, J. (2007). Detection of swine Torque teño virus genogroups 1 y 2 in boar sera y semen.. Theriogenology 68(7), 966-71), y de esta manera sugiere una transmisión vertical potencial de PTTV. Sin embargo, las tasas de prevalencia de tanto PTTV1 como PTTV2 en semen fueron mucho inferiores que en suero, sugiriendo que no existe asociación directa para la presencia de ADNs de PTTV en suero y semen del mismo cerdo.
Ejemplo 3.
Análisis de secuencias y filogenético : Los análisis genéricos y la alineación de secuencias de ADN y de aminoácidos se realizaron usando el paquete Lasergene (DNASTAR Inc., Madison, WI). Las secuencias genómicas de tres cepas PTTV conocidas y sus números de acceso al GenBank correspondientes usados para la alineación y comparación son Sd-TTV31 (AB076001), TTV-lp (AY823990) y TTV-2p (AY823991). Las comparaciones de secuencia en pares (PASC) se realizaron usando 121 secuencias genómicas de longitud completa de cepas relacionadas con TTV de animal y humanas disponibles en el GenBank con un programa en linea PASC (http : //www . ncbi . nlm. nih . gov/sutils/pasc/viridty . cgi?textpage =overview) (Bao et al., 2008).
Los árboles filogenéticos se construyeron por el método de uniones vecinas en el programa PAUP 4.0 (David Swofford, Smithsonian Institute, Washington, DC, distribuido por Sinauer Associate Inc.) basado en las secuencias genómicas de longitud completa y las secuencias de aminoácido deducidas de 4 ORFs de siete cepas PTTV. Los datos se obtuvieron de 1000 re-muestreos .
Ejemplo 4.
Diseño de cebadores PCR para infección PTTV porcina diagnosticada Los análisis y alineación de secuencias de ADN se realizaron usando paquete Lasergene (DNASTAR Inc., adison, WI) . Las secuencias genómicas dé longitud completa de diez cepas TTV porcino . y sus números de acceso al GenBank correspondientes usados para la alineación fueron como sigue. Especie PTTV1 : Sd-TTV31 (AB076001), PTTVla-VA (GU456383), TTV-lp (AY823990), PTTVlb-VA (GU456384), swSTHY-TT27 (GQ120664) y TTV1 #471819 (GU188045). Especie PTTV2 : PTTV2b- VA (GU456385), PTTV2c-VA (GU456386) , TTV-2p (AY823991) y TTV2 #472142 (GU188046) . Las secuencias conservadas entre los genomas 6 PTTVl y 4 PTTV2 se identificaron, respectivamente, y posteriormente se usaron para guiar las selecciones del cebador PCR en tiempo real usando el programa Beacon Designer (PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA) . Los cebadores usados para el PCR anidado doble de PTTVl se diseñaron por el paquete Lasergene.
Ejemplo 5.
Curvas estándar de PCR en tiempo real de PTTVl y PTTV2 Una región de 2091 bp correspondiente al fragmento PCR B de genoma PTTVlb-VA se volvió a amplificar del mismo fragmento PCR usando cebadores TTV1-IF (5'-CATAGGGTGTAACCAATCAGATTTAAGGCGTT-3 ' ) y TTV1-2340R (5*-GGTCATCAGACGATCCATCTCCCTCAG-3 ' ) como se describen previamente (Huang et al.,. 2010). El amplicón resultante fue gel purificado por Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y cuantificado por un espectrofotómetro NanoDrop que se usó para la plantilla estándar PCR en tiempo real de TTV porcino especie 1. Un clon de ADN de longitud completa de cepa PTTV2C-VA, pSC-PTTV2c, se construyó al ensamblar fragmentos PCR E y F de PTTV2c-VA en el vector pSC-B-amp/kan (Huang et al., datos no publicados). El pSC-PTTV2c plásmido (7082 bp) se usó para la plantilla estándar PCR en tiempo real de TTV porcino especie 2 y la concentración de ADN plásmido se midió por un espectrofotómetro NanoDrop. Una serie de dilución 10 veces de las dos plantillas se usó para generar las curvas estándares PCR en tiempo real, respectivamente.
Ejemplo 6.
Extracción de ADN. vírico para ensayos PCR El ADN total se aisló de 20 muestras de suero y 19 de semen recolectadas de 20 cerdos adultos convencionales (sin síntomas clínicos) de un criadero de cerdos en Virginia usando mini kit de ADN QIAamp ' (Qiagen) como se describe previamente (Huang et al.-, 2010). Un volumen de muestra de 400 µ? para suero y semen se usó para extraer ADN con un eluido final de 50 µ? de agua estéril. Todas las muestras de ADN extraídas se almacenaron a -20°C hasta la prueba PCR en tiempo real. La detección de TTV porcinos en estas muestras por PCR anidado convencional se ha descrito previamente (Huang et al., 2010). El ADN total extraído de una muestra de suero de cabra con el mismo procedimiento se usó como el control negativo.
Ejemplo 7.
Ensayos PCR cuantitativos en tiempo real para SYBR verde Se realizaron PCR en tiempo real específicos de PTTV1 y PTTV2, respectivamente, usando kit de fluoresceína y SensiMix SYBR (Quantace Ltd) y el instrumento PCR en Tiempo Real MyiQ iCYCLER (BIO-RAD Laboratories) . Cada 25-µ1 de reacción contiene 12.5 µ? de Mezcla Maestra verde SYBR, 4 µ? de ADN extraído, 0.5 µ? de cada cebador (10 nM) y 7.5 µ? de agua estéril. La condición PCR para PTTV1 fue 10 min a 95°C seguido por 40 ciclos de amplificación (15 seg a 95°C, 30 seg a 59.4°C, 10 seg a 72°C) . Esto se siguió inmediatamente por un análisis de punto de fusión obtenido al incrementar gradualmente la temperatura desde 55°C hasta 95°C con la señal de fluorescencia siendo medida cada 0.5°C. La condición PCR para PTTV2 fue el mismo como PTTV1 excepto que la. temperatura de combinación de los pares de bases fue 56°C. Las plantillas estándares PTTV1 y PTTV2 se incluyeron como controles positivos en cada corrida. Se llevaron a cabo análisis de datos y amplificación usando software MyiQ System (BIO-RAD Laboratories) . Todas las muestras se corrieron por duplicado en la misma placa.
Ejemplo 8.
Especi icidad y sensibilidad de dos ensayos de plexado senci 1 lo Las temperaturas -óptimas de combinación de los pares de bases para amplificación de ensayos específicos de PTTV1 y PTTV2 fueron 59.4°C y 56°C, respectivamente, como se determina por una dilución de 10 veces de amplificaciones usando un gradiente de temperaturas de combinación de pares de bases. La amplificación del producto 118-bp usando cebadores TTV1 F/TTV1R se obtuvo solamente como plantilla PTTV1 mientras que la amplificación del producto 20'0-bp con plantilla PTTV2 sólo se observó cuando se usaron cebadores TTVF4 /TTVR4. Ningún ensayo proporciona ninguna amplificación cruzada de la otra, confirmando la especificad de los cebadores y objetivos (datos no mostrados) .
Una curva estándar PTTV1 se estableció sobre un intervalo de concentraciones de ADN objetivas por 25 µ?. El intervalo lineal se mostró para abarcar 4.4x1o1 hasta 4.4xl08 copias. El límite de detección mínimo (44 copias) corresponde a un ciclo de umbral (Ct) de 37.57. Las muestras probadas con Ct>37.57 se consideraron como abajo del límite de detección y no fueron cuantificables . Similarmente, una curva estándar PTTV2 se generó y usó para detectar concentración de ADN en el intervalo desde 8.6x10° hasta 8.6xl08 copias por 25 µ? de reacción. El Ct correspondiente del limite de detección mínimo (8.6 copias) fue 36.53. Todas las muestras que se consideraron como PTTV1 o PTTV2 positivas tienen números de copias menores que el limite de detección máximo respectivo. Las curvas de fusión usando una dilución de 10 veces de plantilla estándar PTTV1 o PTTV2 (Fig. 6a y 6b; curvas azules), así como 20 muestras de suero de cerdo, muestran temperaturas de fusión (Tm) de .87.0°C para PTTV1 y 80.0°C para PTTV2, respectivamente (Fig. 6a y 6b; curvas rojas). No se observaron picos para los controles negativos usando agua estéril o ADN de suero de cabra como plantillas (Fig. 6a y 7b; líneas negras).
Ejemplo 9.
Cuantificacion de TTV 1 y TTV2 porcino en muestras de suero y semen dé cerdo Se expresó la carga vírica como números de copia de genomas PTTV1 o PTTV2 por' mi de muestras de suero de cerdo originales. El ADN de PTTV1 se detectó en todas las 20 muestras de suero en el intervalo desde 1.91xl03 hasta 3.25xl05 copias/ml mientras que el ADN de PTTV2 se detectó en 19 muestras de suero (excepto #10) en el intervalo desde 3.59xl02 hasta 1.39xl06 copias/ml. El resultado fue consistente para nuestro estudio previo al usar PCR anidado convencional (Tabla 5) . Ninguna de las muestras de semen, fueron PTTVl-posit ivas mientras que tres muestras de semen fueron PTTV2-positivas con cargas víricas muy bajas (230, '244 y 357 copias/ml, respectivamente).
Tabla 5. Comparación de detección de TTVs porcinos por diferentes ensayos en 20 muestras de suero y 19 de semen de cerdos adultos en una granja de Virginia.
Ejemplo 10.
Ensayo PCR en tiempo real doble PTTV1/PTTV2 El ensayo PCR ' en tiempo real doble PTTV1 /PTTV2 se realizó en un sistema PCR de 25-µ1 que contiene 12.5 µ? de Mezcla Maestra verde SYBR, 0.5 µ? de cada cebadores PTTV1, 0.5 µ? de cada cebadores PTTV2, 4 µ? de ADN y 6.5 µ? de agua estéril. La condición PCR doble y análisis del punto de fusión fueron el mismo como PTTV1 excepto que la temperatura de combinación de los pares de bases fue 58°C. Los picos de fusión se analizaron · para distinguir los amplicones específicos de PTTV1 y PTTV2.
Ejemplo 11.
PCR anidado doble Se realizó el PCR de primera ronda con una Supermezcla Platinum PCR HiFi (Invitrogen) usando 4 µ? de ADN extraído en un volumen total de 50 µ?. La condición PCR fue 30 ciclos de 94°C durante 30 seg, 55°C durante 30 seg, 72°C durante 30 seg con una desnaturalización inicial del ADN de plantilla a 94 °C durante 2 min. Una alícuota de 4-µ1 del producto PCR de primera ronda se usó para el PCR de segunda ronda con la misma condición y reactivos PCR. Un par de cebadores Plab-mF/Plab-mR se usó en el PCR de primera ronda mientras que una mezcla de dos pares de cebadores, Pla-nF/Pla-nR para detección de PTTVla, y . Plb-nF/Plb-nR para detección de PTTVlb, se usaron en el PCR de segunda ronda (Tabla 1) . Los productos de amplificación se visualizaron por electroforesis de gel en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio y dos bandas especificas para cada tipo se diferenciaron por luz UV.
Ejemplo 12.
Construcción de plásmidos de expresión PTTVl y PTTV2 ORF Las partes de terminal C de ORF1 de PTTVla, PTTVlb y PTTV2c se amplificaron de los clones de ADN de longitud completa respectivos (pSC-PTTVla pSC-PTTVlb y pSC-PTTV2c; descritos en cualquier lugar) . Los fragmentos amplificados se esperaron para codificar productos de proteina con 319 aa durante PTTVla (OR.F1 aa posiciones 317-635 (SEQ ID NO: 13); no de acceso al GenBank GU456383) , 318 aa para PTTVlb (ORF1 aa posiciones 322-639 (SEQ ID NO: 14); no. de acceso al GenBank GU456384), y 316 aa para PTTV2c (ORF1 aa posiciones 310-625 (SEQ ID NO: 16); no. de acceso al GenBank GU456386), respectivamente. Un fragmento truncado de terminal C de PTTVlb que codifica 248 aa (0RF1 aa posiciones 322-569 (SEQ ID NO: 14)) también se amplificó y usó como un control de comparación para análisis SDS-PAGE. Todos los plásmidos se construyeron por clonación de los productos PCR en un vector de expresión triple de E . coli/baculovirus/células mamíferas pTriExl .1-Neo (Novagen) entre los sitios de restricción Ncol y Xhol para generar proteínas de fusión etiquetadas 8 x His de terminal C. Los cuatro plásmidos recombinantes se designaron pTri-PTTVla-ORFl , pTri-PTTVlb-ORFl , pTri-PTTVlb-ORFlctruc y pTri-PTTV2c-0RFl . Todas las secuencias clonadas se confirmaron por procesador por secuencia de ADN.
Ejemplo 13.
Expresión de proteínas PTTVl y PTTV2 recombinantes Los cuatro plásmidos de expresión se transformaron en células competentes Rosetta 2 (DE3) pLacI (Novagen), respectivamente, y las bacterias se colocaron en placas en placas de agar LB que contienen 100 g/ml de ampicilina durante la noche a 37°C. Una colonia de transformación sencilla para cada constructo se usó para inocular 3 mi de medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina (LB/amp) , y creció 6-8 horas a 37°C. El cultivo de 3 mi turbio para cada constructo luego se usó para hacer reservas bacterianas al agregar glicerol esterilizado de filtro al 25%, y congelar el cultivo completamente a -80°C. Antes de la purificación, 10 µ? de la reserva bacteriana congelada para cada constructo se usó para inocular un cultivo iniciador de 3 mi de LB/amp, y creció durante 6-8 horas a 37 °C. Unos 100 mi de Medio TB Exprés Durante la Noche (Novagen) se inocularon con el cultivo iniciador para inducir expresión de proteina, y se hizo crecer 16-18 horas a 37°C. Después de la incubación, el cultivo de , autoinducción se sometió a centrifugación a 3400 rpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante resultante para cada constructo se descartó, y cada uno de los peletizados bacterianos se reservó a -20°C hasta el uso.
Ejemplo 14.
Purificación y diálisis de proteínas recombinantes Las proteínas recombinantes fueron insolubles y expresadas dentro de los cuerpos de inclusión bacterianos. Cada uno de los peletizados bacterianos se trató con BugBuster y rLysozyme de acuerdo con el protocolo del fabricante (Novagen) , y Nucleasa Benzonasa (Novagen) se agregó para degradación de ADN y AR . Cada uno de los peletizados del cuerpo de inclusión se volvió a suspender posteriormente con 840 µ? de solución amortiguadora de lisis (clorhidrato de Guanidina 6 , fosfato de sodio 0.1 , Tris-Cloruro de 0.01M, imidazol 0.0.1M, pH 8.0), y congeló a -80°C durante al menos 30 minutos. Luego se descongeló, diluyó con unos 2.5 mi adicionales de solución amortiguadora de lisis y giró suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes de Usado se recolectaron por centrifugación a 15,000 x. g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Una mezcla espesa de enlace HIS Ni-NTA al 50% (Novagen) se agregó ' a cada ¦ uno de los sobrenadantes decantados, y las mezclas se agitaron durante 60 minutos a temperatura ambiente para promover enlace his-tag. Las mezclas de lisado/resina se cargaron en una columna de cromatografía al vació. Después del flujo inicial a través de, unos 7 mi de solución amortiguadora de lisis se agregó a la columna y se permitió fluir a través. Cada columna luego se lavó 2 veces con 7 mL de solución amortiguadora de lavado (Urea 8M, fosfato de sodio 0.1M, cloruro de sodio 0.15 , imidazol 0.02M, pH 8.0). La elución de la proteína objetivo se alcanzó al agregar 4 alícuotas de 1 mi separadas de solución amortiguadora de elución (Urea 8M, fosfato de sodio 0.05M, cloruro de sodio 1M, Imidazol 0.5M, pH 8.0) a la columna. Las cuatro fracciones de elución se analizaron por SDS Page y Tinción con azul de Coomasie.
Las eluciones que contienen concentraciones importantes de la proteína objetivo se inyectaron en un cásete de diálisis 0.5ml - 3mi con un corte de peso molecular de 20,000 (Pierce). Una serie de 4 soluciones amortiguadoras de diálisis se usaron para diálisis; solución amortiguadora de diálisis 1 (Urea 6M, fosfato de sodio 0.05M, cloruro de sodio 0.8M, Imidazol 0.3M, pH 8.0), solución amortiguadora de diálisis 2 (Urea 4M, fosfato de sodio 0.033M, cloruro de sodio 0.533M, Imidazol 0.2 , pH 8.0), solución amortiguadora de diálisis 3 (Urea 2.-67M, fosfato de sodio 0.022 , cloruro de sodio 0.356M, Imidazol 0.133M, pH 8.0) y solución amortiguadora de diálisis 4 (Urea 1.5M, fosfato de sodio 0.0148, cloruro de sodio 0.237M, Imidazol 0.089M, pH 8.0). El cásete de diálisis se sumergió y giró secuencialmente en cada solución amortiguadora de diálisis durante 6 horas a 4°C. Cuando la diálisis se completó, las proteínas de fusión etiquetadas His recombinantes cada una se removió de los casetes,. cuantificadas usando un NanoDrop y congeladas a -80°C.
Ejemplo 15.
SDS-PAGE y Western blot etiquetado anti-His Un western blot se desarrolló para detectar proteínas recombinantes purificadas al usar un anticuerpo monoclonal etiquetado anti-6 x His (Rockland) . Los volúmenes iguales de cada una de las proteínas ORF1 truncadas purificadas y LDS / 10% ß-?? se mezclaron, e hirvieron a 95°C durante 10 minutos. Unos 10-µ1 de la muestra hervida se agregó a cada pozo apropiado de un gel de poliacrilamida Bis-Tris al .4-12% ( Invitrogen) , y se corrió en 200 volts durante 43 minutos en 1 x solución amortiguadora de corrida MES ( Invi trogen ) . Las proteínas se transfectaron a una membrana PVDF (Bio-Rad) usando un aparato de transferencia semi seco Trans blot y 1 x de solución amortiguadora de transferencia ( Invitrogen ) . Una vez que la transferencia se completó, la membrana PVDF se incubó en solución amortiguadora de bloqueo Odyssey (Li-Cor) a temperatura ambiente durante 1 hora. El Mab etiquetado anti^6 x His se diluyó en 1:1000 en solución amortiguadora de bloqueo Odyssey / tween 20 al 0.2%, y transfirió a la membrana después de que se removió la solución amortiguadora de bloqueo Odyssey previa. El MAb se dejo en un balancín para incubarse con la membrana durante ya sea 2 horas a temperatura ambiente o 4°C durante la noche, y luego la membrana se lavó 3 veces con solución amortiguadora salina tris / tween 20 al 0.05% (TBS-T, Sigma) . Un anticuerpo IRDye 800 IgG anti-conejo de cabra (Li-Cor) se diluyó en 1:5000 en solución amortiguadora de bloqueo Odyssey / tween 20 al 0.2% / SDS al 0.1%. Se transfirió a la membrana PVDF frescamente lavada, y se permitió incubar durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se balanceó suavemente. La membrana se lavó 3 veces con TBS-T, 1 vez con TBS y se formó en imagen con el Li-Cor Odyssey.
Ejemplo 16.
Western blot de suero Un western blot de suero se desarrolló, y usó para identificar controles de suero positivos y negativos para desarrollo ELISA. Después del SDS-PAGE como se describe arriba, las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF que se incubó posteriormente en solución amortiguadora de bloqueo Odyssey (Li-Cor) a temperatura ambiente durante 1 hora. Una muestra de suero seleccionada se diluyó en 1:100 en solución amortiguadora de bloqueo Odyssey / tween 20 al 0.2%, y transfirió a la membrana después de que se removió la solución amortiguadora de bloqueo Odyssey previa. La muestra de suero se dejó en. un balancín para incubarse con la membrana durante 2 horas a temperatura ambiente, y luego la membrana se lavó 3 veces con solución amortiguadora salina tris / tween 20 al 0.05% (TBS-T, Sigma) . Un anticuerpo IRDye 800 IgG anti-cerdo de cabra (Rockland) se diluyó en 1:2500 en solución amortiguadora de bloqueó Odyssey / tween 20 al 0.2% / SDS al 0.1%. Se transfirió a la membrana PVDF frescamente lavada, y se permitió incubar durante 1 hora a temperatura ambiente mientras se balanceó suavemente. La membrana se lavó 3 veces con TBS-T, 1 vez con TBS y se formó en imagen con el Li-Cor Odyssey. .
Ejemplo 17.
ELISA específico de PTTVl , PTTVlb y PTTV2 indirecto Las concentraciones óptimas de los antigenos usados para recubrir las placas y diluciones de antisuero y conjugados se determinaron por titulación de la tabla de revisión. El ELISA se inició al diluir cada una de las proteínas de fusión etiquetadas His recombinantes purificadas (PTTVla, PTTVlb y PTTV2c, respectivamente) a 680 ng/ml en lx de solución amortiguadora de Recubrimiento de Carbonato (CCB) a un pH de 9.6, y placas ELISA de enlace de medio de recubrimiento (Greiner) con 100 µ?/????. Las placas se recuperaron, y permitieron para incubar a 3 °C durante 2 horas. Después del recubrimiento, las proteínas diluidas se removieron, y cada pozo se lavó 3 veces con. 300 µ? de 1 x TBS-T. La solución amortiguadora de bloqueo libre de proteína (Pierce) luego se agregó en un volumen' de 300 µ?/????, y las placas se permitieron incubar a 37°C durante 1 hora. Mientras tanto, en un bloque de dilución de 96 pozos, las muestras de suero se diluyeron en 1:100 en 150 µ? de solución amortiguadora de bloqueo libre de proteína. El bloque luego se removió, y 100 µ? de cada muestra de suero diluida se transfirió para cada pozo correspondiente en las placas ELISA. Las placas se permitieron incubar a 37 °C durante 2 horas, después de lo cual cada pozo se lavó 3 veces con 300 µ? de TBS-T. Después, el anticuerpo IgG anti-cerdo conjugado HRP (Rockland) se diluyó en 1:4000 en.12 mi de bloque libre de proteina, y 100 µ? se agregó a cada pozo de las placas. Esto se incubó a 37 °C durante 1 hora, y luego cada pozo se lavó 3 veces con 300 µ? de TBS-T. Con objeto de desarrollar el ELISA, 100 µ? de Componente de Reserva 1 Sure Blue (KPL) se agregó a cada pozo de las placas. Después de 20 minutos, 100 µ? de HCL 1N se agregó a cada pozo para detener el desarrollo. Las placas luego se leyeron en 450. nm.
Ejemplo 18.
Análisis de datos Los sueros porcinos usados en la investigación del cultivo celular de una compañía, comercial (fabricada en Nueva Zelanda y considerada libre de todas las enfermedades OIE) se usaron como un control positivo para los tres protocolos ELISA debido a que el suero fueron todos los PTTVla, PTTVlb y PTTV2 positivos como se detecta por western blot de suero y muestra valores OD altos (> 2.0) . Inicialmente se usa suero de cerdo gnotobiótico agrupado como un control negativo ya gue fueron negativos. en detección western blot. Posteriormente, en comparación del suero de cerdo gnotobiótico negativo, se selección algún suero porcino recolectado de un criadero de cerdos convencional en Wisconsin. También fueron negativos en detección western blot y sus valores OD corresponden a aquellos de suero de cerdo gnotobiótico negativo. Estos sueros porcinos convencionales se agruparon y usaron como un control negativo. El valor de corte para cada ELISA se calculó como el valor OD medio para el. grupo de control negativo (n=4) más 3 veces de la desviación estándar.
Ejemplo 19.
Construcción de clones de ADN genómicos de longitud completa de TTVla, Ib y 2c porcino Los fragmentos B y C de PCR del PTTVla-VA aislado US (no. de acceso al GenBank GU456383) se volvieron a amplificar de los constructos descritos previamente, y se ensamblaron posteriormente en un ADN genómico. de longitud completa con un sitio BamH I en los ambos extremos del genoma por PCR de traslape usando la polimerasa de ADN de Fusión Herculase II (Stratagene) en el vector pSC-B-amp/kan (Stratagene) . El constructo resultante se designó pSC-PTTVla (Fig. 17A) . Usando la misma estrategia, el clon pSC-PTTVlb (Fig. 17B) originado del PTTVlb-VA aislado US (no. de acceso al GenBank GU456384) y el clon pSC-PTTV2c (Fig. 17C) originado del PTTV2C-VA aislado US (no. de acceso al GenBank GU456386) se construyeron con los mismos sitios de restricción (BamH I) en el mismo vector de fondo. El TTV2-#471942-completo de plásmido (Fig. 17E) que contiene un ADN genómico de longitud completa originado de un aislado TTV2 porcino patogénico de Alemania. TTV2-#471942 ' fue un regalo del Dr. Andreas Gallei (BIVI, Alemania) . TTV2-#471942 se clasificó en el TTV porcino subtipo 2b junto con el PTTVlb-VA aislado US basado en el análisis filogenético (datos no mostrados).
Ejemplo 20.
Construcción de clones de ADN dimerizados por tándem de TTV2b y 2c porcino El genoma PTTV2c de longitud completa se elimina del clon pSC-PTTV2c por digestión BamH I, purifica y liga para formar concatémeros . Los concatémeros ligados se clonaron en el vector BamH I-pre-digerido pSC-B-amp/kan para producir un clon de ADN dimerizado por tándem, pSC-2PTTV2c-RR (Fig. ID) . Similarmente, un clon de ADN dimerizado por tándem, pSC-2PTTV2b-RR, se generó del clon TTV2-#471942-completo usando sitios de restricción EcoR V (Fig. 1F) .
Ejemplo 21.
Generación de anticuerpos policlonales anti-ORFl específicos de PTTVla, PTTVlb y PTTV2 El producto que codifica 0RF1 es la proteina cápsida supuesta de TTV. Para generar anticuerpos policlonales anti-ORFl específicos de PTTVla, PTTVlb y PTTV2 para detectar la expresión de proteínas 0RF1 PTTV y para determinar la infectividad de clones de ADN PTTV, las tres proteínas 0RF1 de PTTVla, PTTVlb y. PTTV2c se expresaron en E.coli, purificaron y se usaron posteriormente para inmunizar conejos blancos de Nueva Zelanda, respectivamente, como un servicio de producción de anticuerpo de costumbre en Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA) . Cada anticuerpo policlonal anti-ORFl se produjo de suero de conejos inmunizados.
Ejemplo 22.
Transfección in vítro de clones infecciosos PTTV Se sembraron células PK-15 en 2xl05 células por pozo en una placa de 6 pozos y se hicieron crecer hasta 60%-70% de confluencia antes de la transfección . Los clones de ADN pSC-2PTTV2b-RR y pSC-2 PTTV2c-RR se transfectaron directamente en células PK-15, respectivamente, usando Lipofectamina LTX (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para clones pSC-PTTVla, pSC-PTTV2c y TTV2-#471942-completo, sus concatémeros ligados, producidos como se describe arriba, se usaron para transfección, respectivamente. Las células se cultivaron durante 3 hasta 5 días, y luego se aplicaron a un ensayo de inmunof-luorescencia (IFA) para detectar la expresión de 0RF1 de TTVs porcinos. Alternativamente, las células transfectadas se pasaron en placas de 6 pozos nuevas y continuaron para cultivo durante 3 días antes de la detección IFA.
Ejemplo 23.
Ensayo de inmunofluorescencia (IFA) Las células transfectadas o pasadas se lavaron 2 veces con PBS y fijaron con acetona. Quinientos microlitros de los anticuerpos, específicos para PTTVla o PTTV2 en dilución 1:500 en PBS, se agregaron sobre las células e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con PBS y 500 µ? de IgG anti-conejo de cabra etiquetado Alexa Flúor 488 o rojo Texas (Invitrogen) en dilución 1:200 luego se agregó. Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente y lavado con PBS, las células se tiñeron con' 500 µ? DAPI (KPL, Inc.) en dilución 1:1000 y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia.
Ejemplo 24.
Inoculación in vivo de cerdos convencionales con los clones TTV2 porcino dimerizados con tándem.
Se realizó un estudio de inoculación en cerdos para determinar las infectividades de los dos clones TTV2 porcino dimerizados con tándem: pSC-2TTV2b-RR y pSC-2TTV2c-RR . Brevemente, ocho cerdos convencionales de 4 semanas de edad que fueron seronegativos y negativos de ADN virico para TTV2 porcino se asignaron aleatoriamente en dos grupos de cuatro cada uno. Cada grupo de cerdos se alojó separadamente y mantuvo bajo condiciones que cumplen todos los requerimientos del Comité Institucional en el Cuidado y Uso Animal.
Todos los cerdos en- cada grupo se inyectaron por una combinación de tanto la ruta intramuscular como ruta intra-ganglio. Los cuatro cerdos (nos. 181, 189, 192 y 193) se inyectaron cada uno con 200 g del ADN plásmido pSC-2TTV2b-RR mientras que otros cuatro cerdos (nos. 92, 180, 188 y 191) se inocularon cada uno con 200 µg del clon pSC-2TTV2c-RR . Los cerdos se vigilaron diariamente para signos clínicos de enfermedad para un total de 28 días. Todos los cerdos se les aplico la necropsia en 28 días después de la inoculación.
Aunque la presente invención se ha ilustrado por descripción de varias modalidades y aunque las modalidades ilustrativas se han descrito en detalle, no es la intención de los solicitantes restringir o de ninguna manera limitar el alcance de las reivindicaciones anexas para tal detalle. Las modificaciones adicionales fácilmente aparecerán para aquellos experimentados eñ la técnica. La invención en sus aspectos más amplios por lo tanto no se limita a los detalles específicos, aparatos y métodos representativos, y los ejemplos ilustrativos se muestran y describe. En consecuencia, las salidas pueden hacerse de tales detalles sin alejarse del espíritu o alcance del concepto inventivo general de los solicitantes.

Claims (66)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico infecciosa de virus Torque teño porcino (PTTV) caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un PTTV infeccioso que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 85% de . homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
2. La molécula de ácido nucleico infecciosa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 95% de homología con la secuencia genómica es seleccionada del grupo que consiste de PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
3. La molécula de ácido nucleico infecciosa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia genómica se selecciona de secuencias establecidas en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12.
4. Un plásmido biológicamente funcional o vector vírico caracterizado porque contiene la molécula de ácido nucleico infecciosa de conformidad . con la reivindicación 3.
5. El plásmido biológicamente funcional o vector vírico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque contiene más de una copia de la molécula de ácido nucleico infecciosa.
6. Una célula hospedera apropiada transfectada por el vector, caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico infecciosa de conformidad con la reivindicación 4.
7. Un PTTV infeccioso, no .virulento producido por células caracterizado porque contiene la molécula de ácido nucleico infecciosa de conformidad con la reivindicación 6.
8. Una vacuna caracterizada porque comprende un portador fisiológicamente aceptable, no tóxico y una cantidad inmunogénica de un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 80% de homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos PTTV o subtipos. PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA, o su hebra complementaria; (b) un plásmido biológicamente funcional o vector vírico que contiene una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una copia de secuencia genómica que tiene al menos 80% de homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA, o su hebra complementaria; (c) un virus Torque teño porcino no patogénico infeccioso, no virulento, que se deriva de y contiene una secuencia genómica que tiene al menos 85% de homología con una secuencia genómica seleccionada del grupo que consiste de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2C-VA; y (d) un fragmento inmunogénico de una secuencia de polipéptido o una proteína completa traducida de acuerdo con una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de ORF1, ORF2, ORFl/1, y ORF2/2 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2C-VA.
9. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la vacuna contiene virus PTTV vivo.
10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la vacuna contiene virus PTTV exterminados.
11. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el fragmento inmunogénico de una secuencia de polipéptido o una proteína completa que comprende' proteínas recombinantes expresadas por baculovirus o expresadas bacterianas purificadas expresadas de 0RF1, 0RF2, ORFl/1 y ORF2./2 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
12. La vacuna de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el fragmento inmunogénico de una secuencia de polipéptido o una proteina completa que comprende proteínas recombinantes expresadas por baculovirus o expresadas bacterianas purificadas expresadas de 0RF1 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2C-VA.
13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además contiene un adyuvante.
14. Un método para inmunizar un cerdo contra infección vírica PTTV, caracterizado porque comprende administrar a un cerdo una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna de conformidad con la reivindicación. 8.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque ¦ comprende administrar la vacuna parenteralmente , intranasalmente , intradérmicamente , o transdérmica al cerdo.
16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende administrar la vacuna por vía intralinfoide o intramuscular al cerdo.
17. Un polinucleótido aislado caracterizado porque consiste de una secuencia de ácido polinucleico que tiene 85% de homología con una secuencia de nucleótidos de PTTVla-VA establecida en la SEQ ID NO: 9.
18. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico que tiene 95% de homología con la .secuencia de nucleótidos de PTTVla-VA establecida en SEQ ID NO: 9.
19. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico consiste de la secuencia de nucleótidos de PTTVla-VA establecida en SEQ ID NO: 9.
20. Un polinucleótido aislado caracterizado porque consiste de una secuencia de ácido polinucleico que tiene 85% de homología con una secuencia de nucleótidos de PTTVlb-VA establecida en SEQ ID NO: 10.
21. El polinucleótido aislado de conformidad con ' la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico que tiene 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de PTTVlb-VA establecida en SEQ ID NO: 10.
22. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico consiste de la secuencia de nucleótidos de PTTVlb-VA establecida en SEQ ID NO: 10.
23. Un polinucleótido aislado caracterizado porque consiste de una secuencia de ácido polinucleico que tiene 85% de homología con una secuencia de nucleótidos de PTTV2b-VA establecida en SEQ ID NO: 11.
24. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico que tiene 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de PTTV2b-VA establecida en SEQ ID NO: 11.
25. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico consiste de la secuencia de nucleótidos de PTTV2b-VA establecida en SEQ ID NO: 11.
26. Un polinucleótido aislado caracterizado porque consiste de una secuencia de ácido polinucleico que tiene 85% de homología con una secuencia de . nucleótidos de PTTV2c-VA establecida en SEQ ID NO: 12.
27. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico que tiene' 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de PTTV2C-VA establecida en SEQ ID NO: 12.
28. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de ácido polinucleico consiste de la secuencia de nucleótidos de PTTV2c-VA establecida en SEQ ID NO: 12.
29. Una vacuna caracterizada porque comprende un fragmento inmunogénético de una secuencia de polipéptido o una proteina completa traducida de acuerdo con una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de ORFl, 0RF2, 0RF1/1,- y ORF2/2 de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
30. La vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el fragmento inmunogénico o proteina completa es una proteina cápsida de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
31. La vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque 'la secuencia de polinucleótido es seleccionada del grupo que consiste de ORFl de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA.
32. La vacuna de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de polinucleótido es ORFl del genotipo PTTV PTTVla-VA.
33. La vacuna de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de polinucleótido es ORFl del genotipo PTTV PTTVlb-VA.
34. La vacuna de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de polinucleótido es ORFl de subtipo PTTV PTTV2c-VA.
35. La vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la secuencia de polipéptido es seleccionada del grupo que consiste de la secuencia establecida en SEQ ID No: 13, SEQ ID No:14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, y SEQ ID No:28.
36. La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 13.
37. La vacuna de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la secuencia, de polipéptido es una región de terminal C (aa 317-635) de SEQ ID No: 13.
38. La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 14.
39. La vacuna de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la secuencia de polipéptido es una región de terminal C (aa 322-639) de SEQ ID No: 14.
40. La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 16.
41. La vacuna de 'conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque¦ la secuencia de polipéptido es la región de terminal C (aa 310-625) de SEQ ID No: 16.
42. La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No:20.
43. La vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque además contiene un adyuvante.
44. Un método para inmunizar un cerdo contra infección vírica PTTV, caracterizado porque comprende administrar a un cerdo una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna de conformidad con la reivindicación 29.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende administrar el fragmento inmunogenético o proteína completa para un cerdo.
46. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende administrar la vacuna parenteralmente, intranasalmente, intradérmicamente , o transdérmicamente al cerdo-
47. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque comprende administrar la vacuna por vía intralinfoide o intramuscular al cerdo.
48. Un método para diagnosticar infección PTTVl y cuantificación de carga PTTVl, caracterizado porque comprende: extraer el ADN de una muestra sospechada de infección PTTVl; realizar reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:30; y detectar amplificación especifica PTTVl.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la reacción en cadena de polimerasa es una PCR en tiempo real verde SYBR.
50. Un método para diagnosticar infección PTTV2 y cuantificación de carga PTTV2, caracterizado porque comprende: extraer el ADN de una muestra sospechada de infección PTTV2 ; realizar la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32; y detectar amplificación especifica de PTTV2.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la reacción en cadena de polimerasa es una PCR en tiempo real por SYBR verde.
52. Un método' para detectar y diagnosticar simultáneamente infección por PTTVl y PTTV2, caracterizado porque comprende: extraer ADN de una muestra sospechosa de infección por PTTV; realizar la reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32; y detectar amplificación especifica de PTTVl y PTTV2.
53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la reacción en cadena de polimerasa es una PCR en tiempo real por SYBR verde.
54. Un método para detectar y diagnosticar simultáneamente infección por. PTTVla y PTTVlb, caracterizado porque comprende: extraer el ADN de una muestra sospechosa de infección PTTVl ; realizar una primera reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores, que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34; realizar una segunda PCR usando cebadores que comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, y SEQ ID NO: 38; y detectar amplificación especifica de PTTVla y PTTVlb.
55. Un método para · diagnosticar infección por PTTV, caracterizado porque comprende inmovilizar un fragmento inmunogenético o una proteina completa de una secuencia de polipéptido traducida de acuerdo con una secuencia- de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de ORFl, 0RF2 , 0RF1/1, y ORF2/2 de subtipos PTTV PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2c-VA; poner en contacto una muestra de suero de un cerdo sospechoso de infección PTTV con el fragmento inmunogenético inmovilizado o proteina completa; y detectar el anticuerpo capturado especifico para el fragmento inmunogenético.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido es seleccionada del grupo -que consiste de ORFl de genotipos PTTV o subtipos PTTVla-VA, PTTVlb-VA, PTTV2b-VA, y PTTV2.C-VA.
57. La vacuna de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la secuencia de polinucleótido es ORFl del genotipo PTTV PTTVla-VA.
58. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la secuencia de polinucleótido es ORFl del genotipo PTTV PTTVlb-VA.
59. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque la secuencia de polinucleótido es 0RF1 de subtipo de PTTV, PTTV2c-VA.
60. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la secuencia de polipéptido es seleccionada del grupo que consiste de la secuencia establecida en SEQ ID No:13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No: 19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, 'SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, y SEQ ID No: 28.
61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No:13.
62. La vacuna de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 16.
63. La vacuna de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada porque el fragmento inmunogenético es la región de terminal C (aa 317-635) de SEQ ID No: 13, (aa 322-639) de SEQ ID No:14, o (aa 310-625) of SEQ ID No:16.
64. La vacuna de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la secuencia de polipéptido está establecida en SEQ ID No: 20.
65. El método de .conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el anticuerpo capturado detectado es por medio de Western blot.
66. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el anticuerpo capturado detectado es por medio de ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) .
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