KR20120063489A - 돼지 토크 테노 바이러스 백신 및 진단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 토크 테노 바이러스 (porcine Torque teno virus: PTTV) 유전형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 를 코딩하는 폴리핵산 분자를 함유하는 4 개의 정제된 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 상기의 감염성 핵산 게놈 분자를 함유하는 감염성 DNA 클론, 생물학적으로 기능성인 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 제공한다. 추가로 본 발명은 PTTV 감염에 대한 보호를 위한 생, 약화된, 벡터-발현된 및 정제된 재조합 캡시드 서브유닛 또는 치사 바이러스 백신을 제공한다. 본 발명은 부가적으로 PTTV 감염에 대항하는 보호를 위해 PTTV 특이적 유전자 산물, 특히 ORF1 캡시드 유전자 산물을 포함하는 서브유닛 백신을 제공한다. 추가로, 본 발명은 PTTV1, PTTV2, 및 개개의 PTTV1 유전형에 대한 특이적 프라이머를 사용하는 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 통해 PTTV 감염을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 혈청 PTTV 특이적 항체를 검출하기 위해 PTTV 특이적 항원을 사용하는 면역학적 방법, 예를 들어, 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 및 웨스턴 블롯을 통해 PTTV 감염을 진단하기 위한 방법을 제공한다.

Description

돼지 토크 테노 바이러스 백신 및 진단 {PORCINE TORQUE TENO VIRUS VACCINES AND DIAGNOSIS}
관련 출원에 대한 참조
본 특허 출원은 2009 년 8 월 21 일에 출원된 미국 가특허 출원 제 61/235,833 호 및 2010 년 3 월 23 일에 출원된 미국 가특허 출원 제 61/316,519 호의 우선권을 주장하며, 이의 기재는 본 특허 출원에 전체가 참조로서 인용된다.
기술 분야
본 발명은 돼지 토크 테노 바이러스 (Torque teno virus: TTV) 감염에 대항하여 보호하기 위한 백신, 및 돼지 TTV (PTTV) 의 감염성 DNA 클론 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돼지 토크 테노 바이러스 (porcine Torque teno virus: PTTV) 감염의 진단, 특히 종- 또는 유형-특이적 PTTV 감염, 및 상이한 유전자형으로부터의 다중 균주의 동시 감염의 진단에 관한 것이다.
토크 테노 바이러스 (Torque teno virus: TTV) 는 1997 년에 수혈후 비-A-E 간염이 있는 일본인 환자에서 처음 발견되었다 (Nishizawa, T., Okamoto, H., Konishi, K., Yoshizawa, H., Miyakawa, Y., and Mayumi, M. (1997). A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun 241(1), 92-7.). 이 후, 많은 수의 인간 TTV 균주 및 이후에 토크 테노 미니 바이러스 (Torque teno mini virus: TTMV) 및 토크 테노 미디 바이러스 (Torque teno midi virus: TTMDV) 로서 지정된 2 개 그룹의 TTV-관련 바이러스가 건강한 인간으로부터의 혈청 및 다른 조직에서 높은 유병률로 확인되었다 (Hino, S., and Miyata, H. (2007). Torque teno virus (TTV): current status. Rev Med Virol 17(1), 45-57; Okamoto, H. (2009a). History of discoveries and pathogenicity of TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 1-20). 인간 TTV, TTMV 및 TTMDV 는 길이가 각각 3.6-3.9, 2.8-2.9 및 3.2 kb 인 환형 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 갖는 비-외피 구형 바이러스이고, 이들은 현재, 바이러스 학명 국제 위원회에 의해 새롭게 설립된 아넬로비리다에 (Anelloviridae) 족으로 분류되었다 (ICTV; http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?bhcp=1) (Biagini, P. (2009). Classification of TTV and related viruses (anelloviruses). Curr Top Microbiol Immunol 331, 21 -33). 상기 TTV-관련 바이러스의 3 개 그룹은 각각 많은 유전그룹 및 유전자형으로 이루어진 높은 정도의 유전적 이질성을 나타낸다 (Biagini, P., Gallian, P., Cantaloube, J. F., Attoui, H., de Micco, P., and de Lamballerie, X. (2006). Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups in French blood donors. J Med Virol 78(2), 298-304; Jelcic, I., Hotz-Wagenblatt, A., Hunziker, A., Zur Hausen, H., and de Villiers, E. M. (2004). Isolation of multiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin's disease patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable region. J Virol 78(14), 7498-507). 상이한 유전자형으로의 TTV 의 다중 감염 뿐 아니라, TTV, TTMV 및 TTMDV 의 이중 또는 삼중 감염의 유병률은 인간에서 문서에 제시되어 있고, 건강한 성인에서 통상적인 사건인 것으로 고려된다 (Niel, C, Saback, F. L., and Lampe, E. (2000). Coinfection with multiple TT virus strains belonging to different genotypes is a common event in healthy Brazilian adults. J Clin Microbiol 38(5), 1926-30; Ninomiya, M,, Takahashi, M., Hoshino, Y., Ichiyama, K., Simmonds, P., and Okamoto, H. (2009). Analysis of the entire genome of torque teno midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees. J Gen Virol 90(Pt 2), 347-58; Okamoto, H. (2009a). History of discoveries and pathogenicity of TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 1-20; Takayama, S., Miura, T., Matsuo, S., Taki, M., and Sugii, S. (1999). Prevalence and persistence of a novel DNA TT virus (TTV) infection in Japanese haemophiliacs. Br J Haematol 104(3), 626-9).
TTV 는 인간 뿐 아니라, 비-인간 영장류, 나무타기쥐, 돼지, 소, 고양이, 개 및 바다사자를 비롯한 다양한 다른 동물 종도 감염시킨다 (Biagini, P., Uch, R., Belhouchet, M, Attoui, H., Cantaloube, J. F., Brisbarre, N., and de Micco, P. (2007). Circular genomes related to anelloviruses identified in human and animal samples by using a combined rolling-circle amplication/sequence-independent single primer amplication approach. J Gen Virol 88(Pt 10), 2696-701; Inami, T., Obara, T., Moriyama, M., Arakawa, Y., and Abe,. (2000). Full-length nucleotide sequence of a simian TT virus isolate obtained from a chimpanzee: evidence for a new TT virus-like species. Virology 277(2), 330-5; Ng, T. F., Suedmeyer, W. K., Wheeler, E., Gulland, F., and Breitbart, M. (2009). Novel anellovirus discovered from a mortality event of captive California sea lions. J Gen Virol 90(Pt 5), 1256-61; Okamoto, H. (2009b). TT viruses in animals. Curr Top Microbiol Immunol 331, 35-52; Okamoto, H., Nishizawa, T,, Takahashi, M., Tawara, A., Peng, Y., Kishimoto, J., and Wang, Y. (2001). Genomic and evolutionary characterization of TT virus (TTV) in tupaias and comparison with species-specific TTVs in humans and non-human primates. J Gen Virol 82(Pt 9), 2041-50; Okamoto, H., Nishizawa, T., Tawara, A., Peng, Y., Takahashi, M, Kishimoto, J., Tanaka, T., Miyakawa, Y., and Mayumi, M. (2000a). Species-specific TT viruses in humans and nonhuman primates and their phylogenetic relatedness. Virology 277(2), 368-78; Okamoto, H., Takahashi, M., Nishizawa, T., Tawara, A., Fukai, K., Muramatsu, U., Naito, Y., and Yoshikawa, A. (2002). Genomic characterization of TT viruses (TTVs) in pigs, cats and dogs and their relatedness with species-specific TTVs in primates and tupaias. J Gen Virol 83(Pt 6), 1291-7). 부가적으로, 침팬지도 또한 TTMV 및 TTMDV 로 감염된다 (Ninomiya, M., Takahashi, M., Hoshino, Y., Ichiyama, K., Simmonds, P., and Okamoto, H. (2009). Analysis of the entire genomes of torque teno midi virus variants in chimpanzees: infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees. J Gen Virol 90(Pt 2), 347-58; Okamoto et al., 2000a, supra).
비록 확인된 동물 TTV 균주, 특히 비-영장류 동물 TTV 의 게놈 크기는 인간 TTV 의 게놈 크기보다 비교적 작지만, 이들은 음성 ssDNA 뿐 아니라, 높은 GC 함량 (-90%) 을 갖는 미번역된 영역 (UTR) 의 짧은 신장으로부터 번역된, 최소 2 개의 부분적으로 중복되는 오픈 리딩 프레임 (ORF1 및 ORF2) 을 갖는 동일한 게놈 구조를 공유한다 (Okamoto, 2009b, supra). TTV ORF 의 배열은 써코비리다에 (Circoviridae) 족에서 기로바이러스 (Gyrovirus) 속에 속하는 닭 빈혈증 바이러스 (CAV) 의 것과 꽤 유사하나, 또한 같은 족으로 분류되는 돼지 써코바이러스 (PCV) 유형 1 (PCV1) 및 2 (PCV2) 와는 상이하다 (Davidson, I., and Shulman, L. M. (2008). Unraveling the puzzle of human anellovirus infections by comparison with avian infections with the chicken anemia virus. Virus Res 137(1), 1-15; Hino, S., and Prasetyo, A., A., (2009). Relationship of Torque teno virus to chicken anemia virus. Curr Top Microbiol Immunol 331, 117-30). PCV1 및 PCV2 의 게놈은, ORF1 은 게놈 가닥에 의해 코딩되고 ORF2 는 항원 가닥에 의해 코딩되는 것인, 양쪽극성 (ambisense) 이다 (Hino and Miyata, 2007, supra). 최근, 인간 TTV 유전자형 1 및 6 모두의 전사 패턴 및 번역 산물이 배양된 세포 내로의 각각의 TTV 감염성 DNA 클론의 트랜스펙션에 의해 확인되었다 (Mueller, B., Maerz, A., Doberstein, K., Finsterbusch, T., and Mankertz, A. (2008). Gene expression of the human Torque Teno Virus isolate P/1C1. Virology 381(1), 36-45; Qiu, J., Kakkola, L., Cheng, F., Ye, C, Soderlund-Venermo, M, Hedman, K., and Pintel, D. J. (2005). Human circovirus TT virus genotype 6 expresses six proteins following transfection of a full-length clone. J Virol 79(10), 6505-10). 3 개 이상의 스플라이싱된 mRNA 로부터의, ORF1, ORF2, ORF1/1, ORF2/2, ORF1/2 및 ORF2/3 으로 지칭되는 적어도 6 개의 단백질의 발현이 보고되었다 (Kakkola, L., Hedman, K., Qiu, J., Pintel, D., and Soderlund-Venermo, M. (2009). Replication of and protein synthesis by TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 53-64; Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra). 따라서, 동물 TTV 와 관련된 더 많은 데이터가 이용가능한 경우, 동물 TTV 의 추정되는 게놈 구조는 개질될 필요가 있을 것 같다.
TTV 가 원인불명의 간염 환자에서 처음으로 확인되었지만, 후속 연구가 간염 또는 다른 질환의 발병에서 TTV 의 중요한 역할의 증거를 제공할 수 없었다 (Hino and Miyata, 2007, supra; Maggi, F., and Bendinelli, M. (2009). Immunobiology of the Torque teno viruses and other anelloviruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 65-90; Okamoto, 2009a, supra). 인간 TTV 는 질환과 직접 연관되는 것으로 고려되지 않은 반면, 돼지 TTV (PTTV) 는 최근에 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 감염과 조합된 돼지 피부염 및 신장병 증후군 (PDNS) 의 실험적 유도 (Krakowka, S., Hartunian, C, Hamberg, A., Shoup, D., Rings, M., Zhang, Y., Allan, G., and Ellis, J. A. (2008). Evaluation of induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirus type 2. Am J Vet Res 69(12), 1615-22), 및 또한 무균동물 돼지 모델에서 PCV2 감염과 조합된 이유후 전신성 소모 증후군 (PMWS) 의 실험적 유도 (Ellis, J. A., Allan, G., and Krakowka, S. (2008). Effect of coinfection with genogroup 1 porcine torque teno virus on porcine circovirus type 2-associated postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic pigs. Am J Vet Res 69(12), 1608-14) 에 부분적으로 기여하는 것으로 제시되었다. 데이터는 돼지 TTV 가 돼지에서 병원성이라는 것을 암시하였다. 그러나, PTTV 감염과 연관된 질환 및 병반을 명확하게 특징화하기 위한 PTTV 바이러스의 생물학적으로 순수한 형태로의 추가의 심층적인 연구가 필요하다.
인간 TTV 와 비교하여, PTTV 의 게놈 연구는 매우 제한된다. 현재, PTTV 의 오직 1 개의 전장 및 2 개의 거의 전장 게놈 서열이 각각 일본 및 브라질에서 돼지로부터 보고되었다 (Niel, C., Diniz-Mendes, L., and Devalle, S. (2005). Rolling-circle amplication of Torque teno virus (TTV) complete gemone from human and swine sera and identification of a novel swine TTV genogroup. J Gen Virol 86(Pt 5), 1343-7; Okamoto et al., 2002, supra). 3 개의 공지된 PTTV 균주 중에서, Sd-TTV31 및 TTV-1p 균주는 유전그룹 1 (PTTV1) 로 함께 무리지어진 반면, TTV-2p 는 유전그룹 2 (PTTV2) 로 분류된 단독 균주였다 (Niel et al., 2005, supra). 그러나, 유전그룹 분류는 바이러스학의 분류학의 모호한 개념이고 PTTV 의 추가의 및 더욱 정확한 분류가 필요하나, 복합 유전자형을 나타내는 신규 PTTV 균주의 더 많은 전장 게놈 서열이 이용가능해지는 경우 오직 수행될 수 있다.
PTTV 감염이 미국, 캐나다, 스페인, 중국, 한국 및 태국을 비롯한 6 개의 상이한 국가로부터 돼지에 널리 퍼진것이 이미 제시되었다 (McKeown, N. E., Fenaux, M., Halbur, P. G., and Meng, X. J. (2004). Molecular characterization of porcine TT virus, an orphan virus, in pigs from six different countries. Vet Microbiol 104(1-2), 113-7).
돼지 TTV 가 특정 돼지 질환의 발병에서 중요한 역할을 하는지는 여전히 논란이 있다. 무균 돼지 모델에서, PTTV1 감염 단독이 임의의 임상적 질환을 발달시키지는 않았으나, 경미한 조직학적 병반을 유도하는 것이 제시되었다 (Krakowka, S. and Ellis, J.A., 2008. Evaluation of the effects of porcine genogroup 1 torque teno virus in gnotobiotic swine. Am J Vel Res 69, 1623-9). PTTV1 및 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV) 모두로 실험적으로 접종되었던 무균 돼지는 임상적 돼지 피부염 및 신장병 증후군 (PDNS) 을 발달시켰던 반면 (Krakowka, S., Hartunian, C, Hamberg, A., Shoup, D., Rings, M., Zhang, Y., Allan, G. and Ellis, J. A., 2008. Evaluation of induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcine circovirus type 2. Am J Vet Res 69, 1615-22), PTTV1 및 돼지 써코바이러스 유형 2 (PCV2) 모두로 접종되었던 돼지는 급성 이유후 전신성 소모 증후군 (PMWS) 을 발달시켰다 (Ellis et al., 2008, supra). PCV2 가 임상적 PMWS 또는 PCV-연관 질환 (PCVAD) 에 대한 일차적 원인 작용제로서 고려되기는 하지만, 비-PMWS-영향 돼지에서 보다, PCV2 가 적은 또는 없는 PMWS-영향 돼지에서 보다 높은 PTTV2 감염 유행이 스페인에서 관찰되었다 (Kekarainen et al., 2006, supra). 데이터는 집합적으로 돼지 TTV 가 돼지에서 질환을 유발하거나 악화시키는데 관여하는 보조-인자로서 담당할 수 있다는 것을 암시한다.
돼지 TTV 는 감염된 돼지의 돼지 혈청, 배설물, 타액, 정액 및 조직 샘플에서 검출되어, 수평적 및 수직적 전염 모두를 포함하는 다양한 전염 경로를 나타낸다 (Kekarainen et al., 2007, supra; Pozzuto, T., Mueller, B., Meehan, B., Ringler, S.S., Mcintosh, K.A., Ellis, J.A., Mankertz, A. and Krakowka, S., 2009. In utero transmission of porcine torque teno viruses. Vet Microbiol 137, 375-9; Sibila, M., Martinez-Guino, L., Huerta, E., Llorens, A., Mora, M., Grau-Roma, L., Kekarainen, T. and Segales, J., 2009. Swine torque teno virus (TTV) infection and excretion dynamics in conventional pig farms. Vet Microbiol 139, 213-8). 그러나, 돼지 TTV 감염의 현형 검출은 주로 통상의 PCR 어세이에 근거하였다. 그러므로, 지금까지 혈청학적 어세이 또는 바이러스 배양 시스템 중 어느 것도 성립되어 있지 않았다. 특히, 스페인 그룹에 의해 개발된 PTTV1 및 PTTV2 각각의 UTR 내 보존 영역의 네스트 (nested) PCR 증폭이 널리 사용되어 왔다 (Kekarainen et al., 2006, supra). 바이러스의 양이 PCV2-유도 PCVAD 에 대해 증명되는 바와 같이, 임상적 질환의 경중도와 연관되는 것 같으므로, (Opriessnig, T., Meng, X.J. and Halbur, P.G., 2007. Porcine circovirus type 2 associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies. J Vet Diagn Invest 19, 591-615), 통상의 PCR 에 의한 TTV DNA 의 존재보다는 정량적 실시간 PCR 에 의한 돼지 TTV 의 로딩량을 측정하는 것이 중요할 것이다. 또한, 실시간 PCR 는 통상의 PCR 보다 더욱 신뢰성있고, 빠르고 덜 비싸다. 최근, 2 개의 TaqMan 탐침-기반 실시간 PCR 어세이가 돼지 TTV 종의 검출 및 정량화를 위해 기재되었다 (Brassard, J., Gagne, M.J., Houde, A., Poitras, E. and Ward, P., 2009. Development of a real-time TaqMan PCR assay for the detection of porcine and bovine Torque teno virus. J Appl Microbiol. Nov 14, 2009, Epub ahead of print; Gallei, A., Pesch, S., Esking, W.S., Keller, C. and Ohlinger, V.F., 2009. Porcine Torque teno virus: Determination of viral genomic loads by genogroup-specific multiplex rt-PCR, detection of frequent multiple infections with genogroups 1 or 2, and establishment of viral full-length sequences. Vet Microbiol . Dec 21, 2009, Epub ahead of print). 탐침-기반 어세이의 주요 단점은 탐침-결합 서열이 돌연변이를 함유하는 경우 가-음성 결과가 수득될 수 있다는 것이다 (Anderson, T.P., Werno, A.M., Beynon, K.A. and Murdoch, D.R., 2003. Failure to genotype herpes simplex virus by real-time PCR assay and melting curve analysis due to sequence variation within probe binding sites. J Clin Microbiol 41, 2135-7). 공지된 돼지 TTV 균주의 서열 간에 높은 정도의 이질성을 고려하면, 탐침-결합 서열 내 변이가 PTTV 의 필드 균주에 대해 예상된다. SYBR 그린-기반 실시간 PCR 은 이의 비교적 적은 특이성에도 불구하고, 잠재적인 돼지 TTV 변이체를 검출하고 정량화하기 위한 보편적인 방식을 제공하는, 상기 잠재적인 문제를 회피하는 대안적인 방법이다. 게다가, SYBR 그린 실시간 PCR 후 용융 곡선 분석 (MCA) 은 반응 특이성을 확보하고, 또한 구별되는 유형의 바이러스의 복합 검출을 가능하게 한다 (Ririe, K.M., Rasmussen, R.P. and Wittwer, C.T., 1997; Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 245, 154-60). MCA-기반 SYBR 그린 실시간 PCR 방법은 다양한 인간 및 수의학적 바이러스에 성공적으로 적용가능하다 (Gibellini, D., Gardini, F., Vitone, F., Schiavone, P., Furlini, G. and Re, M.C., 2006. Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR green real time multiplex RT-PCR technique in plasma samples. Mol Cell Probes 20, 223-9; Martinez, E., Riera, P., Sitja, M., Fang, Y., Oliveira, S. and Maldonado, J., 2008. Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) by real-time RT-PCR and amplicon melting curve analysis using SYBR green. Res Vet Sci 85, 184-93; Mouillesseaux, K.P., Klimpel, .R. and Dhar, A.K., 2003. Improvement in the specificity and sensitivity of detection for the Taura syndrome virus and yellow head virus of penaeid shrimp by increasing the amplicon size in SYBR green real-time RT-PCR. J Virol Methods 111, 121-7; Wilhelm, S., Zimmermann, P., Selbitz, H.J. and Truyen, U., 2006. Real-time PCR protocol for the detection of porcine parvovirus in field samples. J Virol Methods 134, 257-60).
현재, PTTV-특이적 호르몬 반응에 대해 알려진 것이 거의 없다. PCR-기반 어세이가 돼지에서의 PTTV 감염 과정을 반영하지 않으므로, PTTV 혈청 항체의 검출을 위한 효과적인 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 는 PTTV 의 혈청 반응 양성 (seroprevalence) 을 평가하고 돼지 질환에서 PTTV 의 역할을 특징화하는 것을 돕는데 필요하다.
그러므로 지금까지, 돼지 TTV 에 대한 서브유닛, 치사 및 생 백신이 이용가능하지 않다. PTTV 서브유닛 백신의 개발을 위해 상이한 유전자형으로부터 재조합 PTTV 캡시드 단백질을 발현하는 것, 및 치사 및 생 백신 개발에 사용되는 세포 배양 시스템에서 PTTV 의 생물학적 순수 형태를 증식시키기 위해 상이한 유전자형으로부터 감염성 PTTV 분자 DNA 클론을 제작하는 것이 바람직하고 유리할 것이다.
발명의 요약
본 발명은 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 유전자형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는, 감염성 돼지 토크 테노 바이러스 (porcine Torque teno virus: PTTV) 를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 돼지 토크 테노 바이러스 (PTTV) 의 감염성 핵산 분자 ("감염성 DNA 클론") 를 제공한다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 게놈 서열이 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 및 SEQ ID NO:12 에 언급된 서열로부터 선택되는, 제 1 항에 언급된 PTTV 의 감염성 DNA 클론이다.
본 발명은 감염성 PTTV 게놈을 함유하는 생물학적으로 기능성인 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명은 감염성 클론 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 트랜스펙션된 적합한 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 PTTV 감염성 DNA 클론으로 트랜스펙션된 세포에 의해 생성되는 감염성 PTTV 를 제공한다.
본 발명은 또한 무독성, 생리학적으로 허용가능한 담체 및 면역원성 양의, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 멤버를 포함하는 백신을 제공한다: (a) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA, 또는 이의 상보성 가닥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는 핵산 분자, (b) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA, 또는 이의 상보성 가닥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는 핵산 분자를 함유하는 생물학적으로 기능성인 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 및 (c) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA 및 PTTV2c-VA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는 무독력, 감염성 비병원성 PTTV.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 백신은 PTTV 감염성 클론 유래의 생 PTTV 바이러스를 함유한다. 본 발명의 또다른 양상에 따르면, 백신은 PTTV 감염성 클론 유래의 치사 PTTV 바이러스를 함유한다.
본 발명은 박테리아 발현 시스템 내 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1 캡시드 유전자로부터 발현된 정제된 재조합 단백질, 및 PTTV 감염에 대항하는 서브유닛 백신으로서의 상기 재조합 캡시드 단백질의 용도를 제공한다. 하나의 본 발명의 구현예에서, 서브유닛 백신으로서 사용하기 위한 재조합 캡시드 단백질이 배큘로바이러스 발현 시스템 및 기타 발현 벡터 시스템에서 발현된다,
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 아쥬반트를 추가로 함유한다.
본 발명은 돼지에게 면역학적으로 유효한 양의 바이러스 백신을 투여하는 것을 포함하는, PTTV 바이러스 감염에 대항하여 돼지를 면역화하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 방법은 재조합 서브유닛 캡시드 단백질, 감염성 핵산 분자 또는 생 PTTV 바이러스를 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 방법은 백신을 비경구로, 비강내로, 피부내로, 또는 경피로 돼지에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 방법은 백신을 림프구내로 또는 근육내로 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:9 에 언급된 PTTV1a-VA 의 뉴클레오티드 서열의 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID No:10 에 언급된 PTTV1b-VA 의 뉴클레오티드 서열의 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:11 에 언급된 PTTV2b-VA 의 뉴클레오티드 서열의 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID No:12 에 언급된 PTTV2c-VA 의 뉴클레오티드 서열의 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 추가로 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2, 특히 캡시드 단백질을 코딩하는 ORF1 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 번역된 폴리펩티드 서열 또는 완전한 단백질의 면역원성 절편을 포함하는 서브유닛 백신을 제공한다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 유전자형 PTTV1a-VA 의 ORF1 이다. 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 유전자형 PTTV1b-VA 의 ORF1 이다. 본 발명의 더욱 또다른 양상에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 서브유형 PTTV2c-VA 의 ORF1 이다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, 및 SEQ ID No:28 에 언급된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:13 에 언급된다. 본 발명의 또다른 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:14 에 언급된다. 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:16 에 언급된다. 본 발명의 하나의 특이적 구현예에서, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:16 의 C-말단 영역 (aa 310-625) 이다. 본 발명의 더욱 또다른 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:20 에 언급된다.
본 발명의 부가적인 양상에 따르면, 백신은 아쥬반트를 추가로 함유한다.
본 발명은 추가로 돼지에게, PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 번역된 폴리펩티드 서열 또는 완전한 단백질의 면역원성 절편을 포함하는 면역학적으로 유효한 양의 백신을 투여하는 것을 포함하는, PTTV 바이러스 감염에 대항하여 돼지를 면역화하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 방법은 면역원성 절편 또는 재조합 캡시드 단백질을 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 방법은 백신을 비경구로, 비강내로, 피부내로, 또는 경피로 돼지에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 방법은 백신을 림프구내로 또는 근육내로 돼지에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 부가적으로 하기 단계를 포함하는, PTTV1 감염의 진단 및 PTTV1 로딩량의 정량을 위한 방법을 제공한다: PTTV1 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계; SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; 및 PTTV1 특이적 증폭을 검출하는 단계. 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 폴리머라아제 연쇄 반응은 SYBR 그린 실시간 PCR 이다.
본 발명은 추가로 하기 단계를 포함하는, PTTV2 감염의 진단 및 PTTV2 로딩량의 정량을 위한 방법을 제공한다: PTTV2 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계; SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; 및 PTTV2 특이적 증폭을 검출하는 단계. 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 폴리머라아제 연쇄 반응은 SYBR 그린 실시간 PCR 이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, PTTV1 및 PTTV2 감염을 동시에 검출 및 진단하기 위한 방법을 제공한다: PTTV 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계; SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; 및 PTTV1 및 PTTV2 특이적 증폭을 검출하는 단계. 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 폴리머라아제 연쇄 반응은 SYBR 그린 실시간 PCR 이다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는, PTTV1a 및 PTTV1b 감염을 동시에 검출 및 진단하기 위한 방법을 제공한다: PTTV1 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계; SEQ ID NO:33 및 SEQ ID NO:34 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 1 차 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, 및 SEQ ID NO:38 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 2 차 PCR 을 수행하는 단계; 및 PTTV1a 및 PTTV1b 특이적 증폭을 검출하는 단계.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, PTTV 감염을 진단하기 위한 방법을 제공한다: PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 번역된 폴리펩티드 서열의 면역원성 절편을 부동화시키는 단계; PTTV 감염이 의심되는 돼지로부터의 혈청 샘플을 부동화된 면역원성 절편과 접촉시키는 단계; 및 면역원성 절편에 특이적인 포획된 항체를 검출하는 단계.
본 발명의 하나의 양상에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 유전자형 PTTV1a-VA 의 ORF1 이다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 유전자형 PTTV1b-VA 의 ORF1 이다. 본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오티드 서열은 PTTV 서브유형 PTTV2c-VA 의 ORF1 이다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, 및 SEQ ID No:28 에 언급된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:13 에 언급된다. 본 발명의 또다른 양상에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:14 에 언급된다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:16 에 언급된다. 본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 면역원성 절편은 SEQ ID No:16 의 C-말단 영역 (aa 310-625) 이다. 본 발명의 더욱 또다른 구현예에 따르면, 폴리펩티드 서열은 SEQ ID No:20 에 언급된다.
본 발명은 PTTV 감염을 진단하고, PTTV 유전자형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, 및 PTTV 종 2 에서 모두 공지된 서브유형에 의해 감염된 돼지의 혈청에서 항체를 검출하기 위한 3 개의 표준화된 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 를 제공한다.
ELISA 진단 시험은 PTTV 유전자형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 박테리아-발현 또는 배큘로바이러스-발현 재조합 ORF1 캡시드 단백질에 근거한다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 포획된 항체의 검출은 웨스턴 블롯을 통해 수행된다. 본 발명의 더욱 또다른 양상에 따르면, 포획된 항체의 검출은 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 를 통해 수행된다.
본 발명의 상기 언급된 특징은 하기 도면과 함께 판독되는 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백하게 이해될 것이다:
도 1A 및 1B 는 돼지 TTV 바이러스 그룹 1 (종 1) 및 그룹 2 (종 2) 균주의 4 개의 원형 (prototype) U.S. 균주의 게놈 구조, 게놈 클로닝 전략 및 어셈블리의 도식 다이아그램을 나타낸다;
도 2 는 GenBank 데이터베이스에서 이용가능한 121 개 TTV 균주의 뉴클레오티드 서열 비교의 PASC (쌍방식 서열 비교) 분포를 나타낸다. 속, 종, 유형, 서브유형 및 변이체 및 이들의 상응하는 뉴클레오티드 서열 일치성의 백분율이 표시된다;
도 3A 는 전장 게놈 뉴클레오티드 서열에 근거한 이웃-연결 방법에 의해 제작된 계통발생적 분지도를 나타낸다;
도 3B 는 7 개의 돼지 TTV 균주 중에서 ORF1 의 추론된 아미노산 서열에 근거해 제작된 계통발생적 분지도를 나타낸다;
도 3C 는 7 개의 돼지 TTV 균주 중에서 ORF1/1 의 추론된 아미노산 서열에 근거해 제작된 계통발생적 분지도를 나타낸다;
도 3D 는 7 개의 돼지 TTV 균주 중에서 ORF2 의 추론된 아미노산 서열에 근거해 제작된 계통발생적 분지도를 나타낸다;
도 3E 는 7 개의 돼지 TTV 균주 중에서 ORF2/2 의 추론된 아미노산 서열에 근거해 제작된 계통발생적 분지도를 나타낸다;
도 4 는 7 개의 PTTV 균주 중에서 ORF1 의 전장 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다;
도 5 는 7 개의 PTTV 균주 중에서 ORF2 의 전장 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다;
도 6A 는 각각의 표준 주형 (파란색으로 표시됨) 및 20 개의 돼지 혈청 샘플의 40 회 사이클 증폭 후 PTTV1 실시간 PCR 생성물의 용융 곡선을 나타낸다;
도 6B 는 각각의 표준 주형 및 20 개의 돼지 혈청 샘플의 40 회 사이클 증폭 후 PTTV2 실시간 PCR 생성물의 용융 곡선을 나타낸다;
도 7A-7E 는 PTTV1/PTTV2 SYBR 그린-기반 양방향 실시간 PCR 의 용융 곡선 분석 (MCA) 을 나타낸다;
도 8 는 7 개의 PTTV 균주 중에서 추정 ORF1 의 N-말단 부분에 위치한 뉴클레오티드 서열의 정렬을 나타낸다;
도 9A 및 9B 는 4 개의 공지된 돼지 TTV2 의 친수성 프로파일 및 보존 영역을 나타낸다;
도 10A-10C 는 재조합 PTTV2c ORF1 캡시드 단백질의 발현 및 정제를 나타낸다;
도 11A-11C 는 선택된 돼지 혈청 샘플의 웨스턴 블롯 분석의 대표적인 결과를 보여준다;
도 12 는 PTTV2c-ORF1-기반 웨스턴 블롯 및 ELISA 의 일치를 나타낸다;
도 13 은 상이한 기원 유래의 138 마리의 돼지에서 바이러스 로딩량에 의한 PTTV2 혈청 항체 수준의 Box-and-Whisker-플롯을 보여준다;
도 14A 는 PTTV2 의 바이러스 로딩량의 소급적 평가를 나타낸다;
도 14B 는 도착에서 도착 후 2 개월까지 성장한 10 마리의 돼지에서 PTTV2 ORP1 캡시드 단백질에 대한 항체 수준을 나타낸다;
도 15A-15C 는 PTTV1a 및 PTTV1b 재조합 ORF1 캡시드 단백질의 발현 및 정제를 나타낸다; 및
도 16 은 위스콘신의 농장으로부터 선택된 돼지 혈청 샘플의 PTTV1a-ORF1-기반 웨스턴 블롯 분석의 예를 보여준다.
본 발명에 따르면, 하나의 구체적인 예에서, 상기 언급된 4 개의 신규 돼지 TTV 서브유형은 버지니아에서 단일 수퇘지로부터 단리되었다.
도 1A 에서, PTTV1 및 PTTV2 게놈 모두는 굵은 글씨로 제시되고, 4 개의 추정 ORF (ORF1, ORF2, ORF1/1 및 ORF2/2) 의 크기 및 방향은 화살표에 의해 표시된다. GC-풍부 영역이 또한 제시된다. 점선으로 된 둥근모양 A 및 D 는 각각 네스트 PCR 에 의해 혈청 및 정액 샘플로부터의 PTTV1 및 PTTV2 의 검출에 사용된 영역을 나타낸다. 점선으로 된 둥근모양 B 및 C 는 PTTV1 의 게놈 클로닝을 위한 2 개의 중복 PCR 절편을 나타내는 반면, 점선으로 된 둥근모양 E 및 F 는 PTTV2 의 게놈 클로닝을 위한 2 개의 중복 PCR 절편을 나타낸다. 연구에 사용된 프라이머의 장소 (표 1 참조) 는 또한 상응하는 위치에 제시된다.
1 회차 PCR 에서 PTTV1 및 PTTV2 모두에 양성으로 제시되었던, 그러므로 높은 바이러스 로딩량의 지표인 1 개의 수퇘지 혈청 샘플 (SR#5) 을 PTTV 의 후속 전장 게놈 클로닝을 위해 사용하였다. 놀랍게도, 바이러스 게놈 DNA 를 증폭하기 위한 첫번째 PTTV 균주 Sd-TTV31 의 클로닝을 위해 디자인된 역방향 PCR 의 2 개의 프라이머 세트 (NG372/NG373 및 NG384/NG385) 을 이용한 초기 시도 (Okamoto et al., 2002, supra) 는 성공적이지 않았다. 여러 번의 시도 후에도 PCR 생성물이 수득되지 않았다. PTTV1 의 영역 A 및 PTTV2 의 영역 D 의 초기 서열에 근거하여, 가정된 PTTV1 게놈에 걸친 영역 B 및 C 를 증폭시키기 위해 2 개의 신규 쌍의 프라이머 (TTV1-If(SEQ ID NO:1)/TTV1-2340R(SEQ ID NO:2) 및 TTV1-231 1F(SEQ ID NO:3)/TTV1-IR(SEQ ID NO:4)), 및 가정된 PTTV 2 게놈에 걸친 영역 E 및 F 를 증폭시키기 위해 2 개의 부가적인 쌍의 프라이머 (TTV2-IF(SEQ ID NO:5)/TTV2-2316R(SEQ ID NO:6) 및 TTV2-GCF(SEQ ID NO:7)/TTV2-IR(SEQ ID NO:8)) 를 각각 이어서 디자인하였다 (도 1A 및 표 1). 프라이머 TTV1-2340R(SEQ ID NO:2) 및 TTV1-2311F(SEQ ID NO:3) 을 PTTV1 균주 Sd-TTV31 (Okamoto et al., 2002, supra) 및 PTTV2 균주 TTV-2p (Niel et al., 2005, supra) 에 부재한 TTV-1p (Niel et a , 2005) 내 공통 서열로부터 추론한 반면, 프라이머 TTV2-2316R(SEQ ID NO:6) 및 TTV2-GCF(SEQ ID NO:7) 는 2 개의 PTTV1 균주에 부재한 균주 TTV-2p 의 서열로부터 추론하였다. 예상되는 크기를 갖는 수득된 4 개의 상이한 PCR 생성물을 각각 블런트-말단 클로닝 벡터 내에 삽입하고, 수득되는 재조합 플라스미드를 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) 내로 형질전환하였다. 절편 B, C, E 및 F 를 나타내는 각각의 제작물에 대해 8 내지 15 개의 양성 (백색을 가짐) 박테리아 클론을 확인하고 이어서 서열분석하였다.
표 1. 돼지 TT 바이러스의 네스트 PCR 및 게놈 PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머
프라이머 ID 서열 (5' 에서 3') 용도:
돼지 TTV1 의 검출
돼지 TTV1 의 검출
돼지 TTV1 의 검출
돼지 TTV1 의 검출
돼지 TTV2 의 검출
돼지 TTV2 의 검출
돼지 TTV2 의 검출
돼지 TTV2 의 검출
게놈 클로닝 (절편 B)
게놈 클로닝 (절편 B)
게놈 클로닝 (절편 C)
게놈 클로닝 (절편 C)
게놈 클로닝 (절편 E)
게놈 클로닝 (절편 E)
게놈 클로닝 (절편 F)
게놈 클로닝 (절편 F)
예상치 않게, 동일한 돼지로부터의 유전그룹 1 및 유전그룹 2 에서 2 가지 유형의 PTTV 가 존재하는 것을 나타내는, 각각의 제작물로부터 2 개 그룹의 서열 데이터가 확인되었다. 4 개 PTTV 균주의 분화 및 어셈블리를 위해, 3 개의 공지된 PTTV 균주, Sd-TTV31, TTV-1p 및 TTV-2p 와 함께 서열 비교를 수행하였다 (도 1B 및 1C).
도 1B 는 후속하여 클로닝되었던 PCR 절편 B 및 C 가 있는 PTTV1 균주 PTTV1a-VA 및 PTTV1b-VA 의 전장 게놈 서열의 분화 및 어셈블리를 예증한다. 절편 B 내 ORF1 및 ORF2 의 개시 코돈 뿐 아니라 절편 C 내 ORF1 의 종결 코돈이 "＾" 또는 "*" 로 표시된다. 2 개의 공지된 PTTV1 균주, Sd-TTV31 및 TTV-1p 의 상응하는 서열이 또한 제시된다. 보존 서열은 음영처리되고, 점선은 뉴클레오티드 결실을 나타낸다.
PTTV1 의 경우, 추정 ORF1 의 개시 코돈 ATG 및 종결 코돈 TGA 는 절편 B 및 C 에 각각 위치하였다 (도 1B). 코돈의 위치는 2 개의 PTTV1 그룹에서 상이하였고, 첫번째 것은 Sd-TTV31 과 일치하고 두번째 것은 TTV-1p 와 일치하였다 (도 1B). 또한, 2 개 그룹 내 ORF2 개시 코돈은 또한 ORF1 과 일관된 상이한 위치에 위치하였다. 게다가, 영역 B 의 4 개의 상이한 서열 (서열분석 데이터로부터 2 개 및 균주 Sd-TTV31 및 TTV-1p 로부터 2 개) 및 영역 C 의 4 개의 상이한 서열을 사용하는 계통발생 분석은 첫번째 서열은 Sd-TTV31 과 무리지어 있고, 두번째는 TTV-1p 와 무리지어 있음을 지지하였다 (데이터는 제시되지 않음). 그러므로, 절편 B 및 C 모두로부터의 2 개 그룹의 서열 데이터의 2 개의 전장 PTTV1 게놈 내로의 분화 및 어셈블리가 가능하였고 이들은 각각 균주 PTTV1a-VA (SEQ ID NO:9) 및 PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10) 로서 지정되었다 (도 1B).
도 1C 는 후속하여 클로닝되었던 PCR 절편 E 및 F 가 있는 PTTV2 균주 PTTV2b-VA 및 PTTV2c-VA 의 전장 게놈 서열의 분화 및 어셈블리를 예증한다. TTV-2p 균주의 상응하는 서열이 포함되고 보존 서열은 음영처리된다. 점선은 뉴클레오티드 결실을 나타낸다. 각각의 균주에 대해 중복되는 영역 (점선으로 쳐진 박스) 내의 독특한 뉴클레오티드 (PTTV2b-VA (SEQ ID NO:11) 에 대해 연속 "AG" 뉴클레오티드 및 PTTV2c-VA (SEQ ID NO:12) 에 대해 2 개의 단일 "A" 및 "G" 뉴클레오티드) 가 각각 제시된다.
2 개의 PTTV2 균주의 분화는 더욱 용이하였다. 2 개의 PCR 절편의 중복 영역 내에 위치한 독특한 연속 "AG" 뉴클레오티드는 각각 절편 E 및 F 로부터의 2 개 그룹의 서열 데이터에 의해 공유되었다 (도 1C). 어셈블리된 전장 게놈 서열은 PTTV2 균주를 나타냈고, PTTV2b-VA (SEQ ID NO:11) 로서 지정되었다. 유사하게는, PTTV2c-VA (SEQ ID NO:12) 로 지정된 두번째 균주의 완전한 게놈 서열은 절편 E 및 F, 각각으로부터의 또다른 세트의 서열 데이터에 의해 중복 영역에서 공유되는 2 개의 독특한 단일 "A" 및 "G" 뉴클레오티드에 근거하여 어셈블리되었다 (도 1C). TTV-2p 로부터의 2 개의 상응하는 서열과 함께 절편 E 및 F 로부터의 4 개의 서열을 사용하는 계통발생 분석은 또한 본 과제를 지지하였다 (데이터는 제시되지 않음).
본 발명은 돼지에서 바이러스 감염과 연관된 4 개의 단리된 돼지 TTV 바이러스 유전자형 또는 서브유형을 제공한다. 본 발명은 SEQ ID NO:9 (PTTV1a-VA), SEQ ID NO:10 (PTTV1b-VA), SEQ ID NO:11 (PTTV2b-VA), 및 SEQ ID NO:12 (PTTV2c-VA) 에 언급된 뉴클레오티드 서열, 이들의 기능적 동등한 또는 상보성 가닥을 갖는 바이러스 유전자형 또는 서브유형인, 돼지 TTV 바이러스 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 임의의 돼지 TTV 유래의 특이적 뉴클레오티드 서열이 개별적인 바이러스 사이에서 자연적으로 존재하는 약간의 변형을 가질 것으로 이해될 것이다. 서열 내 상기 변형은 결실, 치환, 삽입 등에서 볼 수 있다.
4 개의 PTTV 균주 각각에 대해 제안된 게놈 구조가 상세히 분석되었고, 3 개의 공지된 PTTV 균주, Sd-TTV31, TTV-1p 및 TTV-2p 와 함께, 표 2 에 요약되었다. PTTV 의 4 개의 U.S. 균주 모두는 각각 2,878 bp (PTTV1a-VA SEQ ID NO:9), 2,875 bp (PTTV1b-VA SEQ ID NO:10), 2,750 bp (PTTV2b-VA SEQ ID NO:11), 및 2,803 bp (PTTV2c-VA SEQ ID NO:12) 의 유사한 게놈 크기를 갖는다. PTTV1a-VA (SEQ ID NO:9) 및 Sd-TTV31 모두는 동일한 게놈 길이를 갖는다. 균주 TTV-1p 및 TTV-2p 의 공개된 서열은 모두 UTR 의 GC-풍부 영역 내 많은 미결정된 뉴클레오티드를 갖는다. 상기 뉴클레오티드를 PTTV1 및 PTTV2 에 상응하는 일치 서열로 인위적으로 채운 후, 게놈 길이에서 각각 TTV-1p 가 PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10) 와 더욱 가깝게 관련되어 있고, TTV-2p 가 PTTV2b-VA (SEQ ID NO:11) 와 더욱 가깝게 관련되어 있다는 것이 제시된다 (데이터는 제시되지 않음).
돼지 TTV 바이러스 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA (SEQ ID NO:9). PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10). PTTV2b-VA (SEQ ID NO:11) 및 PTTV2c-VA(SEQ ID NO:12) 의 어셈블리된 게놈 서열은 Genbank® (Nucleic Acids Research, 2008 Jan; 36(Database issue):D25-30) 에 접근 번호 GU456383, GU456384, GU456385, 및 GU456386 으로 각각 제출된다.
표 2. 7 개의 돼지 TTV 균주의 게놈 조직 및 ORF 비교
바이러스 돼지 TTV 종 1 돼지 TTV 종 2
유형 1a 유형 1b 서브유형 2a 서브유형 2b 서브유형 2c
균주
국가 일본 브라질 브라질
전장 (nt) 불완전 불완전
Genbank 접근#
TATA 박스
추정 mRNA 5'-말단
ORF1
크기 (aa)
엑손 #
개시
종결
ORF2
크기 (aa)
엑손 #
개시
종결
ORF1/1
크기 (aa)
엑손 #
개시
스플라이싱
종결
ORF2/2 (ORF3)
크기 (aa)
엑손#
개시
스플라이싱
종결
폴리아데닐화 신호
숫자 (전장 게놈의 크기, ORF 및 엑손 수를 제외한) 는 각각의 PTTV 균주의 게놈 상의 뉴클레오티드 (nt) 위치를 나타낸다.
2 개의 최근 연구는 인간 TTV 복제 동안 6 개 이상의 바이러스 단백질의 전사된 바이러스 mRNA 및 발현을 확인하였고 (Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra), 이것은 인간 TTV 에 의해 코딩된 ORF 의 예상되는 수보다 많은 것이며 (Okamoto, H., Nishizawa, T., Tawara, A., Takahashi, M, ishimoto, J., Sai, T., and Sugai, Y. (2000b). TT virus mRNAs detected in the bone marrow cells from an infected individual. Biochem Biophys Res Commun 279(2), 700-7), 그러므로 PTTV 서열과의 비교를 위한 신규 인간 TTV 게놈 정보를 포함시켰다. 인간 TTV 균주 P/1C1 의 mRNA 전사물의 5'-말단을 TATA-박스의 25 nt 다운스트림인 "A" 에 대해 맵핑하였다 (Mueller et al., 2008, supra). 상기 출발점, 이의 인접 서열 (CGAATGGCTGAGTTTATGCCGC (SEQ ID NO:39); 출발점은 밑줄쳐 있음) 및 업스트림 TATA-박스까지의 거리 (24 nt; 표 2) 는 모든 7 개의 PTTV 균주에서 매우 보존되어 있으며, PTTV 및 인간 TTV 가 번역을 위해 mRNA 의 공통의 5'-말단을 이용할 수 있다는 것을 암시한다.
모든 7 개의 PTTV 균주 중에서 TATA-박스의 공간에서 5 개의 부가적인 완전하게 보존된 영역을 확인하였다. 각각 11 nt 의 2 개 영역 (AGTCCTCATTT (SEQ ID NO:40) 및 AACCAATCAGA (SEQ ID NO:41)) 은 TATA-박스의 업스트림에 위치하는 반면, 나머지 3 개의 영역 (17 nt 의 CTGGGCGGGTGCCGGAG (SEQ ID NO:42); 14 nt 의 CGGAGTCAAGGGGC (SEQ ID N0:43); 11 nt 의 TATCGGGCAGG (SEQ ID NO:44)) 은 mRNA 의 제안된 5'-말단과 ORF2 의 개시 코돈 사이에 위치한다. 상기 보존된 PTTV-특이적 서열은 바이러스 유전자 발현을 조절하는 공통의 요소를 함유할 수 있다.
이전에, 3 개의 ORF (ORF 1-3) 가 3 개의 공지된 PTTV 균주 각각의 게놈에서 제안되었다 (Niel et al., 2005, supra; Okamoto et al., 2002, supra). 본 연구에서 확인된 PTTV 의 4 개의 원형 U.S. 균주가 상기 구조를 갖는다. 인간 TTV 에서 상응하는 ORF3 은 ORF2/2 로 다시 이름이 불리는데, 이는 이것이 ORF2 내 동일한 ATG 에서 개시되고 스플라이싱 후에도 동일한 ORF (확장 ORF2) 에 남아있기 때문이다 (도 1A) (Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra). 본 연구에서는 PTTV 분류를 개정하기 위한 인간 TTV 의 명명법을 따른다. 인간 TTV ORF1/1 은 ORF1 중 2 개의 엑손에 의해 코딩된 새롭게 확인된 바이러스 단백질이다 (Qiu et al., 2005, supra). ORF1/1 은 ORF1 과 일치하는 N- 및 C-말단 부분을 공유한다. PTTV ORF1/1 반대부분은 모든 7 개의 PTTV 균주에서 쉽게 확인되었다 (도 1A 및 표 2).
ORF1 및 ORF2 는 ~2.8 kb 바이러스 mRNA 에 의해 코딩되는 반면, ORF1/1 및 ORF2/2 는 인간 TTV 에서 ~1.2 kb 의 스플라이싱된 바이러스 mRNA 에 의해 코딩된다 (Mueller et al., 2008, supra; Qiu et al., 2005, supra). 상기 4 개의 ORF 가 또한 PTTV 게놈에서 추론되었으므로, 그리고 7 개의 PTTV 균주에서 추정 스플라이싱 기증체 및 수용체 부위의 서열 및 위치가 매우 보존되므로 (표 2), 돼지 TTV 가 아마도 또한 2 개의 상응하는 mRNA 를 코딩하는 것으로 추측된다.
대부분의 인간 TTV 균주는 TTV 세포자멸사-유도 단백질 (TAIP) 을 코딩하는 CAV 와 유전적 유사성을 공유하고, CAV 반대부분은 아폽틴이라고 불렸다 (de Smit, M. H., and Noteborn, M. H. (2009). Apoptosis-inducing protein in chicken anemia virus and TT virus. Curr Top Microbiol Immunol 331, 131-49). TAIP 의 ORF 는 ORF2 내에 내포된다. 그러나, 상응하는 TAIP 는 돼지 TTV 에 존재하지 않는다. 최근의 연구는 아폽틴 또는 TAIP 의 발현이 배양된 세포 내 CAV 복제에 필요했다는 것을 보여주었다 (Prasetyo, A. A., Kamahora, T., Kuroishi, A., Murakami, K., and Hino, S. (2009). Replication of chicken anemia virus (CAV) requires apoptin and is complemented by VP3 of human torque teno virus (TTV). Virology 385(1), 85-92).
쌍방식 서열 비교 (PASC) 는 동일한 족 내 바이러스의 모든 이용가능한 게놈 서열로부터의 쌍방식 뉴클레오티드 서열 일치성 백분율의 빈도 분포를 플롯팅하는 유용한 방법이다 (Bao, Y., Kapustin, Y., and Tatusova, T. (2008). Virus Classification by Pairwise Sequence Comparison (PASC). In "Encyclopedia of Virology, 5 vols." (B. W. J. Mahy, and M. H. V. Van Regenmortel, Eds.), Vol. 5, pp. 342-8. Elsevier, Oxford). PASC 프로그램에 의해 생성되는 상이한 피크는 통상적으로 바이러스 속, 종, 유형, 서브유형 및 균주의 그룹을 나타낸다 (도 2). 본 연구에서, GenBank 데이터베이스에서 이용가능한 인간 및 동물 TTV-관련 균주의 121 개의 전장 게놈 서열을 사용하는 TTV 의 PASC 분석을 수행하였다 (도 2). TTV 일원이 별도의 족 아넬로비리다에 (Anelloviridae) 로 분류되는 것을 가정하면, 36-55% 및 55-67% 뉴클레오티드 서열 일치성에서의 2 개의 주요 피크는 속 및 종의 그룹을 각각 나타낸다 (도 2). 따라서, TTV 유형은 67-85% 뉴클레오티드 서열 일치성을 갖는 TTV 의 그룹으로서 정의되는 반면, TTV 서브유형은 85-95% 뉴클레오티드 서열 일치성을 공유하는 TTV 서열의 그룹으로 정의될 수 있다. 95% 초과의 뉴클레오티드 서열 일치성을 공유하는 TTV 균주는 변이체로 추가로 분류될 수 있다 (도 2). 유사한 분류가 Jelcic 등에 의해 103 개 TTV 단리물의 서열을 사용하여 제안되었다 (Jelcic, L, Hotz-Wagenblatt, A., Hunziker, A., Zur Hausen, H., and de Villiers, E. M. (2004). Isolation of multiple TT virus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin's disease patient: genome reorganization and diversity in the hypervariable region. J Virol 78(14), 7498-507).
TTV 분류의 상기 제안된 기준을 PTTV 의 4 개의 원형 U.S. 균주 및 3 개의 다른 공지된 PTTV 균주의 게놈 서열의 계통발생 분석에 적용하였다. 상기 균주 중 전장 뉴클레오티드 서열의 쌍방식 비교는 3 개의 PTTV2 균주와 비교하여 4 개의 PTTV1 균주가 54.0-56.4% 뉴클레오티드 서열 일치성을 갖는다는 것을 보여주었다 (표 3). 그러므로, 문헌에 이전에 지정된 PTTV 의 "유전그룹" 은 아마도 "종" 으로서 지정되는 것이 더욱 적합할 것이고, PTTV1 및 PTTV2 는 아마도 돼지 TTV 종 1 및 종 2 각각을 나타내야만 한다. PTTV 종 1 은 유형 1a (Sd-TTV31 및 PTTV1a-VA (SEQ ID NO:9) 포함) 및 유형 1b (TTV-1p 및 PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10) 포함) 로서 각각 지정되는 2 개 유형의 바이러스로 이루어지는데, 상기 2 개 유형의 바이러스 사이의 뉴클레오티드 서열 일치성이 69.8-70.7% 이기 때문이다 (표 3). Sd-TTV31 및 TTV1a-VA (SEQ ID NO:9) 는 이들의 높은 서열 일치성 (95.1%) 으로 인해 동일한 종의 변이체 균주로서 인지된다. 그러나, 2 개의 유형 1b 균주, TTV-1p 및 PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10) 는 2 개의 상이한 서브유형 (뉴클레오티드 서열 일치성=86.4%) 에 속할 수 있다. PTTV 종 2 의 경우, 3 개의 균주는 이들의 86.5-90.9% 뉴클레오티드 서열 일치성에 근거해 별도의 서브유형 (서브유형 2a 의 경우 TTV-2p, 서브유형 2b 의 경우 PTTV2b-VA (SEQ ID NO:11), 및 서브유형 2c 의 경우 PTTV2c-VA (SEQ ID NO:12), 각각) 로 분류될 것 같다. PTTV 에 대한 상기 제안된 신규 분류 시스템은 계통발생적 분지도에서 명백하게 증명되었다 (도 3A). PTTV 의 ORF1, ORF1/1, ORF2 및 ORF2/2 의 추론된 아미노산 서열에 근거하여 제작된 계통발생 분지도는 또한 상기 제안된 분류와 일관되었다 (도 3B 내지 3E).
표 3. 7 개의 돼지 TTV 균주의 전장 게놈 서열의 쌍방식 서열 비교
돼지 TTV 종 1 돼지 TTV 종 2
유형 1a 유형 1b 서브유형 2a 서브유형 2b 서브유형 2c
유형 1a
유형 1b
서브유형 2a
서브유형 2b
서브유형 2c
데이터는 PASC 프로그램을 사용하여 생성되었고, 값은 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타낸다.
독특한 돌연변이 및 결실 및/또는 삽입이 PTTV 종, 유형 및 서브유형 사이의 게놈 전반에 산재한다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이 도 1B 에 제시된 PTTV 유형 1a 및 1b 사이의 ORF1 개시 및 종결 코돈 및 ORF2 개시 코돈의 위치는 상이하다. 2 개의 PTTV1b 균주는 또한 PTTV1a 와 비교해 ORF2 개시 후 2-코돈 결실을 갖는다 (도 1B).
현저하게는, TTV-2p 및 PTTV2b-VA 모두는 PTTV2c-VA 와 비교하여, UTR 내 첫번째 11-nt 보존된 서열 (AGTCCTCATTT (SEQ ID NO:40)) 의 39 nt 업스트림인 큰 52-nt 결실을 갖는다. 상기 결실로 인해, PTTV2b-VA 의 게놈 크기 (아마도 TTV-2p 도 또한) 는 PTTV2c-VA 의 게놈 크기보다 상당히 작았다 (표 2). 다수의 "서브바이러스" 인간 TTV 클론은 대부분의 상기 서브바이러스 분자 내 ORF 가 통상 미손상된 채로 남아있으므로 전장 TTV 게놈으로서 간주되는 혈청 샘플로부터 단리되었다 (de Villiers et al., 2009; Leppik et al., 2007). 이들은 완전히 또는 부분적으로 결실된 UTR 내 가변 길이를 갖는다. TTV-2p 및 PTTV2b-VA 의 상황은 인간 TTV 서브바이러스 분자의 상황을 닮은 것으로 보여, 서브유형 PTTV2a 및 PTTV2b 가 서브유형 PTTV2c 유래의 서브바이러스 분자일 것이라는 것을 암시한다. 흥미롭게는, 다른 그룹에 의해 필드 샘플로부터의 PTTV2 의 검출에 통상 사용되는 네스트-PCR 프라이머 TTV2-nF 의 3'-말단 서열 (표 1) (Ellis et al., 2008, supra; Kekarainen et al., 2007, supra; Kekarainen et al., 2006, supra; Krakowka et al., 2008, supra) 은 결실의 양 면에 위치한다. 그러므로, PTTV2 검출을 위한 현행의 네스트-PCR 어세이는 PTTV2c 서브유형의 유전적으로 다양한 균주를 확인하기에는 충분하지 않은 것 같다.
단리된 바이러스 균주의 공급원은 돼지 TTV 바이러스 감염이 있는 돼지의 혈청, 배설물, 타액, 정액 및 조직 샘플이다. 그러나, 재조합 DNA 기술이 뉴클레오티드 서열을 복제하고 화학적으로 합성하는데 사용될 수 있다는 것으로 고려된다. 그러므로, 본 발명의 범주는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 및 SEQ ID NO:12 에 언급된 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보성 가닥을 포함하나 이에 제한되지 않는 단리된 폴리뉴클레오티드; SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 및 SEQ ID NO:12 에 언급된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하고 이에 대해 적어도 67% 상보성, 바람직하게는 85% 상보성, 또는 더욱 바람직하게는 95% 상보성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 또는 SEQ ID NO:13 (PTTV1a-VA), SEQ ID NO:14 (PTTV1b-VA), SEQ ID NO:15 (PTTV2b-VA), SEQ ID NO:16 (PTTV2c-VA) 에 언급된 ORF1 단백질의 아미노산 서열, SEQ ID NO; 17 (PTTV1a-VA), SEQ ID NO:18 (PTTV1b-VA), SEQ ID NO:19 (PTTV2b-VA), SEQ ID NO:20 (PTTV2c-VA) 에 언급된 ORE2 단백질의 아미노산 서열, SEQ ID NO:21 (PTTV1a-VA), SEQ ID NO:22 (PTTV1b-VA), SEQ ID NO:23 (PTTV2b-VA), SEQ ID NO:24 (PTTV2c-VA) 에 언급된 ORF1/1 단백질의 아미노산 서열, SEQ ID NO:25 (PTTV1a-VA), SEQ ID NO:26 (PTTV1b-VA), SEQ ID NO:27 (PTTV2b-VA), SEQ ID NO:28 (PTTV2c-VA) 에 언급된 ORF2/2 단백질의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역원성 절편을 포함한다. 면역원성 또는 항원 코딩 영역 또는 절편은 당업계에 공지된 기술에 의해 측정될 수 있고, 면역반응성 스크리닝 또는 다른 진단 목적을 위한 단일클론 또는 폴리클론 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 정제된, 면역원성 단백질을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 단백질은 하나 이상의 상기 단리된 돼지 TTV 서브유형의 단리된 또는 재조합 ORF1 단백질 또는 ORF2 단백질, 더욱 바람직하게는 ORF1 단백질일 수 있다.
돼지 TTV 의 ORF1 은 구조적 및 복제-연관 단백질을 코딩하는 것으로 여겨진다 (Maggi, F., and Bendinelli, M. (2009). Immunobiology of the Torque teno viruses and other anelloviruses. Curr Top Microbiol Immunol 331, 65-90). 7 개의 PTTV 균주의 ORF1-코딩 생성물은 길이가 624-635 aa 이고, DNA-결합 활성을 갖는 것으로 생각되는 N-말단에 다수의 아르기닌 잔기를 소유한다 (도 4). 도 4 에서, 보존된 서열은 음영처리된다. 점선은 아미노산 결실을 나타낸다. RCR 모티프는 직선으로 박스로 표시된다. PTTV1 균주의 3 개의 HVR (PTTV1-HVR 1, 2 및 3) 및 PTTV2 균주의 2 개의 HVR (PTTV2-HVR 1 및 2) 은 점선으로 박스로 표시된다. ORF1/1 의 연결 경계는 화살표로 표시된다. 예측되는 회전-환형 복제 (RCR) 모티프 (Ilyina, T. V,, and Koonin, E. V. (1992). Conserved sequence motifs in the initiator protein for rolling circle DNA replication encoded by diverse repHcons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res 20(13), 3279-85) 는 유형- 또는 서브유형-특이적일 수 있는 상이한 PTTV 유형 및 서브유형 내 상이한 위치에 제시된다. RCR 모티프-III (YxxK) 는 PTTV 유형 1a (PTTV1a-VA SEQ ID NO:13 의 aa 위치 14-17) 및 유형 1b 균주 (PTTV1b-VA SEQ ID NO:14 의 aa 위치 379-382) 에서 각각 보존되는 반면, 모든 3 개의 PTTV2 균주에서 확인되는 동일한 보존된 모티프는 PTTV2b-VA SEQ ID NO:15 의 aa 위치 482-485 에 위치한다 (도 4). PTTV2b-VA SEQ ID NO:15 및 PTTV2c-VA SEQ ID NO:16 모두는 또한 TTV-2p 에 부재하는 PTTV2b-VA 의 aa 위치 331-333 에서 보존된 RCR 모티프-II (HxQ) 를 갖는다 (도 4).
종 1 과 종 2 사이의 PTTV 균주의 ORF1 단백질은 오직 22.4 내지 25.8% 의 매우 낮은 aa 서열 일치성을 공유하고, 이것은 2 개의 종 사이에 유의하게 보존된 aa 서열을 확인하는 것을 어렵게 한다 (도 4). PTTV 종 1 에서, 유형 1a 와 1b 균주 사이의 ORF1 의 aa 일치성은 50.3-52.7% 이다. 비교적 많은 수의 aa 치환을 갖는 3 개의 주요 과가변 영역 (HVR), PTTV1-HVR 1 내지 3 이 4 개의 PTTV1 균주 중에서 확인되었던 반면, 2 개의 HVR (PTTV2-HVR 1 및 2) 이 3 개의 PTTV2 균주 중에서 관찰되었다 (도 4). 3 개의 PTTV2 균주는 상응하는 PTTV1-HVR1 영역에서 대략 20-aa 결실을 갖는다. 게다가, PTTV2 의 2 개의 HVR 은 상응하는 PTTV1-HVR3 영역 내에 있다 (도 4). 상기 HVR 은 ORF1 뿐 아니라 절단된 ORF1/1 에도 위치한다. 이들은 인간 TTV 의 연구에 의해 제안되는 바와 같이, 숙주 면역 감시를 모면하고 지속적인 감염을 달성하도록 PTTV 를 돕는데 중요한 역할을 할 것 같다.
ORF2 의 aa 서열은 4 개의 PTTV1 (PTTV1a-VA SEQ ID NO:17; PTTV1b-VA SEQ ID NO:18) 과 3 개의 PTTV2 (PTTV2b-VA SEQ ID NO:19; PTTV2c-VA SEQ ID NO:20) 균주 사이에 상당히 차이가 있었다 (도 5). 그러나, 이들은 N-말단에서 보존된 단백질-티로신 포스파타아제 (PTPase)-유사 모티프 (Wx7Hx3CxCx5H) 를 공유한다 (도 4). 상기 모티프는 또한 모든 인간 TTV, TTMV 및 TTMDV 균주 뿐 아니라 CAV 중에서 보존된다. TTMV 또는 CAV ORF2 단백질은 또한 세린/트레오닌 포스파타아제 (S/T PPase) 활성을 나타냈다 (Peters, M. A., Jackson, D. C, Crabb, B. S., and Browning, G. F. (2002). Chicken anemia virus VP2 is a novel dual specificity protein phosphatase. J Biol Chem 277(42), 39566-73). ORF2 단백질의 이중 특이성은 바이러스 복제 동안 숙주 유전자 전사, 신호 전달 및 사이토카인 반응을 조절하는 것으로 생각된다. 최근에, CAV 내 모티프의 마지막 히스티딘 잔기 전의 2 개의 보존된 염기성 aa 잔기의 돌연변이생성 분석은 2 개의 잔기가 바이러스 복제, 시험관 내에서 세포병리학 및 생체 내에서 감쇠에 영향을 준다는 것을 밝혀냈다 (Peters, M. A,, Crabb, B. S., Washington, E. A., and Browning, G. F. (2006). Site-directed mutagenesis of the VP2 gene of Chicken anemia virus affects virus replication, cytopathology and host-cell MHC class I expression. J Gen Virol 87(Pt 4), 823-31; Peters, M. A., Crabb, B. S., Tivendale, K. A., and Browning, G. F. (2007). Attenuation of chicken anemia virus by site-directed mutagenesis of VP2. J Gen Virol 88(Pt 8), 2168-75). 2 개의 염기성 aa 잔기 ("KK") 가 3 개의 PTTV2 균주에서 보존된다. 그러나, 오직 첫번째 염기성 잔기 ("R") 만이 2 개의 PTTV1a 균주에 유지되는 반면, 두 염기성 잔기는 PTTV1b 균주에서 치환된다 (도 5). 표 5 에서, 점선은 아미노산 결실을 나타낸다. TTV, TTMV 및 CAV 에서 확인된 공통의 모티프 Wx7Hx3CxCx5H (밑줄쳐짐) 내의 5 개의 보존된 아미노산은 음영처리된다. CAV 에서 바이러스 복제, 세포병리학 또는 생체 내 감쇠에 영향을 주는 것으로 제시된 모티프의 마지막 히스티딘 전 2 개의 염기성 aa 잔기의 위치는 "＾" 로 표시된다.
요약하면, 본 발명은 버지니아에서 단일 수퇘지의 혈청 샘플 중 상이한 유전자형 또는 서브유형을 나타내는 4 개의 돼지 TTV 균주의 전장 게놈 서열을 측정하였다. 본 연구로부터의 발견은 인간 TTV 와 유사하게, 구별되는 유전자형 또는 서브유형으로의 다중 PTTV 감염이 존재하고 아마도 돼지에서도 공통적이라는 것을 명백하게 나타낸다. 또한 PTTV 의 게놈 조직, 다양성 정도 및 보존된 뉴클레오티드 및 아미노산 모티프의 특성과 관련된 새로운 정보를 제공하였으며, 이것은 현행 PCR 검출 어세이를 개선시키고, 혈청학적 진단을 위한 시약 개발을 돕고, PTTV 의 구조적 및 기능적 연구 개시를 도울 것이다. PTTV 의 새로운 분류가 또한 7 개의 공지된 PTTV 균주의 게놈 서열의 계통발생적 및 유전적 분석에 기반한 본 연구에서 제안된다.
본 발명은 또한 돼지 TTV 감염된 돼지 또는 기타 포유동물의 샘플에서 바이러스 DNA 를 검출함으로써 돼지 TTV 감염의 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예는 바이러스 감염 또는 질환의 진단을 추가로 돕기 위한 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 돼지 또는 기타 포유동물 종에서 돼지 TTV 핵산 서열을 검출하기 위한 방법을 수반한다. 돼지 또는 기타 포유동물 종에서 돼지 TTV 바이러스 핵산 서열의 존재 또는 부재를 검출하는데 유용한 진단 시험은, 돼지 TTV 감염된 돼지 또는 TTV 의 감염이 의심되는 돼지의 샘플로부터 바이러스 DNA 를 단리하는 것, 및 PTTV1-특이적 (SEQ ID NO:29/ SEQ ID NO:30) 또는 PTTV2-특이적 (SEQ ID NO:31/ SEQ ID NO:32) 프라이머를 사용하는 SYBR 그린 실시간 정량적 PCR 을 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 진단 방법은 PTTV1/PTTV2 양방향 실시간 PCR 을 사용함으로써 PTTV1 및 PTTV2 를 동시에 검출하기 위해 채택될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 방법은 돼지 TTV 감염된 돼지 또는 TTV 의 감염이 의심되는 돼지의 샘플로부터 바이러스 DNA 를 단리하는 것, 동일한 실시간 PCR 반응에서 PTTV1-특이적 (SEQ ID NO:29/ SEQ ID NO:30) 또는 PVVT2-특이적 (SEQ ID NO:31/ SEQ ID NO:32) 프라이머 모두를 사용하는 실시간 PCR 을 수행하는 것을 포함한다. PTTV1 과 PTTV2 사이의 Tm 값이 MCA 에 의해 구별될 수 있으므로, PTTV1 및 PTTV2 DNA 의 존재가 동시에 검출될 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 진단 방법은 양방향 네스트 PCR 을 사용할 수 있다. 본 방법은 돼지 TTV 감염된 돼지 또는 TTV 의 감염이 의심되는 돼지의 샘플로부터 바이러스 DNA 를 단리하는 것, 한 쌍의 프라이머 Plab-mF (SEQ ID NO:33)/Plab-mR (SEQ ID NO:34) 를 사용하는 1 회차 PCR 을 수행하는 것, 및 두 쌍의 프라이머, PTTV1a 의 검출을 위한 Pla-nF (SEQ ID NO:35)/Pla-nR (SEQ ID NO:36), 및 PTTV1b 의 검출을 위한 Plb-nF (SEQ ID NO:37)/Plb-nR (SEQ ID NO:38) 의 혼합물을 사용하는 2 회차 PCR 을 수행하는 것, PCR 생성물을 가시화시키는 것을 포함한다.
상기 진단 방법은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 당업자에 의해 최적화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 구현예는 2 가지 돼지 TTV 종, 각각의 바이러스 로딩량을 정량화하기 위한 2 개의 신규 단방향 SYBR 그린 실시간 PCR 어세이를 개발한다. PTTV1- 및 PTTV2-특이적 프라이머를, 각각 지금까지 이용가능한 6 개의 PTTV1 및 4 개의 PTTV2 전장 게놈을 가로질러 극히 보존된 영역을 표적하기 위해 디자인하였다. 본 발명의 또다른 구현예는 2 개의 단방향 어세이를 양방향 실시간 PCR 어세이와 조합한 후 2 개의 돼지 TTV 종, PTTV1a 및 PTTV1b 의 동시 검출에 대한 이들의 구별되는 용융 온도에 의해 확인될 수 있는 바이러스 앰플리콘의 MCA 가 후속된다. 제 3 구현예에서, 1 회차 PCR 에서의 2 가지 유형의 PTTV1 로부터의 바이러스 DNA 의 동시 증폭 및 2 회차 PCR 에서의 유형 1a 및 1b 의 차등 검출을 위한 양방향 네스트 PCR 어세이가, 단일 샘플에서 2 개 유형의 돼지 TTV 종, PTTV1a 및 PTTV1b 의 확인을 위해 개발되었다. 상기 어세이는 종- 또는 유형-특이적 돼지 TTV 의 진단을 위한 간단하고 실시적인 도구를 나타낸다.
잠재적인 프라이머 서열이 10 개의 이용가능한 돼지 TTV 전장 게놈의 다중 서열 정렬에 의해 확인되었다. PTTV1-특이적 프라이머 TTV1F (SEQ ID NO:29) 및 TTV1R (SEQ ID NO:30) 을 6 개의 PTTV1 게놈을 가로질러 추정 ORF2 바로 전 2 개의 보존된 영역에 근거하여 디자인한 반면, PTTV2-특이적 프라이머 TTV2F4 (SEQ ID NO:31) 및 TTV2R4 (SEQ ID NO:32) 를 4 개의 PTTV2 게놈을 가로질러 추정 ORF2/2 바로 후 2 개의 보존된 게놈 영역에 근거하여 디자인하였다 (표 4). 프라이머는 자가- 및 교차-이량체화에 대한 잠재력을 보이지 않았다. 예상되는 앰플리콘 크기는 각각 PTTV1b-VA 게놈에 상응하는 PTTV1 프라이머로부터 118-bp 절편 및 PTTV2c-VA 게놈에 상응하는 PTTV2 프라이머로부터 200-bp 절편이었다.
표 4. 돼지 TTV 의 실시간 PCR 및 양방향 네스트 PCR 검출에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 .
프라이머 ID 서열 (5' 에서 3') 목적
PTTV1-특이적 실시간 PCR
PTTV1-특이적 실시간 PCR
PTTV2-특이적 실시간 PCR
PTTV2-특이적 실시간 PCR
양방향 네스트 PCR
양방향 네스트 PCR
양방향 네스트 PCR
양방향 네스트 PCR
양방향 네스트 PCR
양방향 네스트 PCR
본 발명의 하나의 특이적 구현예에 따르면, PTTV1- 및 PTTV2-특이적 프라이머를 사용하는 SYBR 그린 심플렉스 실시간 PCR 은 특이적으로 돼지 TTV1 및 TTV2 DA 를 각각 검출하기 위해 사용될 수 있다. PTTV1 의 경우, 표준 곡선을 25 ㎕ 당 표적 DNA 농도의 범위에 걸쳐 달성하였다. 선형 범위는 4.4 × 101 내지 4.4 × 108 개의 복사본에 걸쳐 제시되었다. 최소 검출 한계 (44 개의 복사본) 는 37.57 의 역치 사이클 (Ct) 에 상응하였다. PTTV2 의 경우, 표준 곡선을 또한 생성하고 25 ㎕ 반응 당 8.6 × 100 내지 8.6 × 108 개의 복사본의 범위의 DNA 농도를 검출하기 위해 사용하였다. 최소 검출 한계의 상응하는 Ct (8.6 개의 복사본) 은 36.53 이었다.
본 발명의 또다른 특이적 구현예에 따르면, SYBR 그린 양방향 실시간 PCR 을 돼지 TTV1 및 TTV2 DNA 의 동시 검출에 대해 이용한다. PTTV1 (87.0℃) 내지 PTTV2 (80.0℃) 사이의 Tm 값의 7-도 차이는 이들을 MCA 에 의해 서로 구별하는 것을 실현가능하게 한다. 그러므로, 2 개의 단방향 어세이는 PTTV1 및 PTTV2 의 동시 검출을 위해 양방향 실시간 PCR 어세이와 커플링될 수 있다. 양성 샘플은 해당 생성물에 대한 공지된 Tm 내 대칭 용융 피크를 갖는 것이었다. 상기 신규한 어세이는 PTTV1 및 PTTV2 표준 혼합물의 10 배 희석을 사용함으로써 처음 입증되었다. PTTV1 과 PTTV2 프라이머 사이의 교차-이량체화에 의해 야기되는 비-특이적 증폭을 보인 주형으로서 멸균수를 사용하는 비-주형 음성 대조군은 단방향 어세이에서 관찰되지 않았다 (도 7a). 이것은 72.0℃ 내지 76.0℃ 사이의 구별되는 용융 피크를 생성했다. 도 7A 는 PTTV1 표준 (적색; Tm=87.0℃), PTTV2 표준 (녹색; Tm=80.0℃) 및 비-주형 음성 대조군 (프라이머 교차-이량체화에 의해 야기됨; 검은색) 의 용융 피크를 보인다. 도 7B-7E 는 PTTV1 및 PTTV2 의 구별되는 바이러스 로딩량을 갖는 각각의 혈청 샘플의 용융 피크를 나타낸다. 도 7B 는 수퇘지 혈청 샘플 no. 5 를 보여주고: PTTV1 및 PTTV2 모두 비교적 높은 바이러스 로딩량, 그러나 PTTV2>PTTV1; 도 7C 는 수퇘지 혈청 샘플 no. 12 를 보여주며: PTTV1 및 PTTV2 모두 비교적 높은 바이러스 로딩량, 그러나 PTTV1>PTTV2; 도 7D 는 수퇘지 혈청 샘플 no. 14 를 보이고: PTTV1 및 PTTV2 모두 적은 바이러스 로딩량; 도 7E 는 수퇘지 혈청 샘플 no. 10 을 보여준다: PTTV1 양성, 그러나 PTTV2 음성. 단방향 실시간 PCR 에 의해 측정된 각 샘플 중 PTTV1 및 PTTV2 의 바이러스 로딩량 (유닛: 게놈 복사본/ml) 은 상응하는 용융 피크의 상부에 표시되었다.
하나의 예에서, 양방향 실시간 어세이가 성체 수퇘지의 20 개의 혈청 샘플에 적용된 경우, PTTV1 및 PTTV2 모두의 비교적 높은 바이러스 로딩량을 갖는 샘플은 비-특이적 용융 피크 없이 PTTV1 및 PTTV2 에 상응하는 2 개의 구별되는 용융 곡선을 나타내는 반면 (도 7B & 7C), PTTV1 또는 PTTV2 의 적은 바이러스 로딩량을 갖는 샘플은 바이러스-특이적 뿐 아니라 비-특이적 용융 곡선을 나타냈다 (도 7D & 7E). 샘플 #14 에서 2 개의 용융 곡선이 매우 적음에도 불구하고, 시각적으로 구별되고 대칭인 상승을 나타내고 PTTV1 및 PTTV2 의 적합한 Tm 에 놓이므로 이들은 양성인 것으로 고려되었다 (도 7D). 반대로, 샘플 #10 은 대칭 PTTV2 용융 피크가 명백하게 존재하지 않았기 때문에 오직 PTTV1 양성인 것으로 고려되었다 (도 7E). 상기 결과는 2 개의 단방향 어세이의 결과와 일치하였다 (표 5). 게다가, 용융 피크의 크기 및 형상은 검출된 샘플 중의 상응하는 바이러스 로딩량을 질적으로 반영하였다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 양방향 네스트 PCR 은 2 개의 돼지 TTV 유형, PTTV1a 및 PTTV1b 의 차등 검출에 사용된다.
본 발명의 발명자는 돼지 TTV 종 1 에서 시험적으로 명명된 PTTV1a 및 PTTV1b 의 2 개의 구별되는 유전자형의 실재를 증명하였다. PTTV1a 및 PTTV1b 의 동시감염이 돼지에게 공통적인지를 추가로 측정하기 위해, 둘 사이를 빠르게 구별하기 위한 신규 양방향 네스트 PCR 어세이를 개발하였다. 돼지 TTV 게놈 DNA 서열의 정렬로 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 추정 ORF1 의 N-말단 부분에 위치하는 보존된 게놈 영역을 확인하였다 (도 8). 상기 영역은 또한 업스트림 내에 전체 ORF2 및 일부 UTR 을 포함한다. 프라이머 Plab-mF (SEQ ID NO:33)/Plab-mR (SEQ ID NO:34) 을 1 회차 PCR 에서 PTTV1a 및 PTTV1b DNA 를 모두 동시에 증폭하기 위해 디자인하였다. PTTV1a-특이적 프라이머 Pla-nF (SEQ ID NO:35)/Pla-nR (SEQ ID NO:36) 및 PTTV1b-특이적 프라이머 Plb-nF (SEQ ID NO:37)/Plb-nR (SEQ ID NO:38) 의 혼합물을 2 회차 PCR 에서 각각의 유전자형을 상이하게 증폭시키기 위해 사용하였다. PTTV1a 및 PTTV1b 의 최종 PCR 생성물은 크기가 각각 162 bp 및 96 bp 였고, 이것은 에티듐 브로마이드로 염색된 1 % 아가로오스 젤 상의 젤 전기영동에 의해 쉽게 구분될 수 있을 것이다. 상기 어세이는 프라이머의 특이성으로 인해 PTTV2 DNA 를 검출하는 것은 예상되지 않았다 (도 8). 도 8 에서, 보존된 서열을 점으로 표시하고 음영표시하였다. 점선은 뉴클레오티드 결실을 나타냈다. 양방향 네스트 PCR 에 사용된 3 개 쌍의 프라이머의 위치 및 방향을 화살표로 표시하였다.
하나의 구현예에서, 양방향 네스트 PCR 어세이에 적용되었던 성체 수퇘지로부터의 20 개의 혈청 샘플은 정확한 크기의 2 개의 밴드의 가시화 및 PCR 생성물의 후속적 서열분석 확인에 의해 측정된 바와 같이, PTTV1a 및 PTTV1b 모두에 대해 모두 양성인 것으로 발견되었다 (데이터는 제시되지 않음). 19 개의 정액 샘플에서 PCR 생성물이 증폭되지 않았고, 이것은 상기 기재된 PTTV1 통상의 네스트 PCR 및 실시간 PCR 어세이의 결과와 일치하였다.
돼지 TTV 의 2 개의 종으로의 돼지의 감염은 소급적 조사에 따라 스페인 돼지 농장에서 1985 년에 발견되었다 (Segales et al.5 2009, supra). 그러나, 돼지 TTV 가 임의의 특정 돼지 질환과 관련되었는지의 여부는 모른 채 남아있다. 두 돼지 TTV 종이 자국 돼지에서 높은 유병률을 보였으므로, TTV 바이러스 로딩량의 측정이 아마 TTV DNA 의 존재를 평가하는 것보다 더욱 중요하다. 혈청 및 정액 샘플 내 바이러스 로딩량 수준은 PCV2 감염에서 PCVAD 에 대한 중요한 마커로서 표시되었다 (Opriessnig et al., 2007, supra). 그러므로, 정량적 PTTV-특이적 실시간 PCR 어세이의 성립은 돼지 TTV 와 관련된 잠재적인 질환 조건을 확인하는 것을 도울 것이다.
2 개의 TaqMan 탐침-기반 실시간 PCR 어세이가 최근에 기재되었다. 캐나다 그룹에 의해 개발된 단방향 어세이는 종-특이적이 아니었고, 2 개의 PTTV 종의 총 바이러스 로딩량을 정량하기 위해서만 디자인되었다 (Brassard et al., 2009, supra). 독일 그룹에 의해 성립된 양방향 어세이는 두 종의 특이적이고 동시적인 검출을 가능하게 하였다 (Gallei et al,, 2009, supra). 상기 2 개의 어세이에서 사용된 프라이머의 표적 서열은 3 개의 돼지 TTV 게놈 서열 (Sd-TTV31, TTV-1 및 TTV-2p) 의 정렬에 의해 측정되었고, UTR 내에 위치했다. 본 연구에서, 이용가능한 7 개의 부가적인 완전한 PTTV 게놈 서열 (4 개의 PTTV1 및 3 개의 PTTV2 서열) 로, 10 개의 전장 PTTV 게놈에 걸친 보존된 영역을 분석하고 다시 결정하였다. 본 연구로부터 업데이트된 정렬 결과에 기반하여, PTTV1 및 PTTV2, 각각의 바이러스 로딩량을 정량하기 위해 2 개의 종-특이적 단방향 SYBR 그린-기반 실시간 PCR 어세이를 개발하였다. 본 어세이에 사용된 프라이머는 이전 연구와 구별되는 보존된 게놈 영역에 결합하도록 디자인되었으며, 이것은 정량화의 정확성을 증가시킬 수 있다. 본 어세이는 25 ㎕ 반응 당 PTTV1 의 경우 44 개의 게놈 복사본 및 PTTV2 의 경우 8.8 개의 게놈 복사본으로의 검출의 상당한 종-특이성 및 민감성을 보였던 반면, 반응 당 10 개의 게놈 복사본의 검출 한계가 TaqMan 탐침-기반 양방향 실시간 PCR 에서 보고되었다 (Gallei et al., 2009, supra). 또한, SYBR 그린-기반 실시간 PCR 어세이는 형광 표지된 탐침을 사용할 필요 없이 직접 수행될 수 있는 융통성 있고 저비용의 접근법이다. 마지막으로, 돼지 TTV 가 높은 정도의 유전적 다양성을 나타내는 것을 고려하면, SYBR 그린-기반 어세이로부터의 결과는 TaqMan 탐침-기반 어세이에서 탐침-결합 서열 내 돌연변이를 함유할 것 같은 돼지 TTV 변이체의 상이한 유전적 백그라운드에 의해 영향을 받을 것 같지 않다.
TTV DNA 의 존재에도 불구하고, 본 연구에서 시험된 건강한 돼지로부터의 모든 혈청 샘플은 2 × 106 복사본/ml 미만이었던 적은 양의 PTTV1 및 PTTV2 를 가졌다. 게다가, 오직 극히 적은 적정농도의 PTTV2 DNA 가 3 개의 정액 샘플에서 검출되었다. 대부분의 시험된 혈청 샘플은 또한 통상의 네스트 PCR 에 의해 측정되는 바와 같이 PCV2 DNA 에 대해 양성이었다 (데이터는 제시되지 않음). 적은 바이러스 로딩량을 갖는 많은 PCV2-양성 돼지는 임상적인 PCVAD 를 발달시키지 않는다. PCVAD 개발을 위한 제안된 역치는 107 이상의 PCV2 게놈 복사본/혈청 ml 이다 (Opriessnig et al., 2007, supra). 게다가, 정액 PCV2 DNA-양성은 또한 질환 상태의 주목할만한 마커이다 (Opriessnig et al., 2007, supra; Pal, N., Huang, Y.W., Madson, D.M., Kuster, C, Meng, X.J., Halbur, P.G. and Opriessnig, T., 2008. Development and validation of a duplex real-time PCR assay for the simultaneous detection and quantification of porcine circovirus type 2 and an internal control on porcine semen samples. J Virol Methods 149, 217-25). 종-특이적 PTTV 의 상황은 PCV2 의 상황과 유사할 수 있고, 107 복사본/ml 을 초과하는 높은 PTTV 적정농도는 돼지 질환의 유도를 위해 필요할 것이다. 본 연구에서 개발된 종-특이적 실시간 PCR 어세이는 다양한 질환 상태로부터의 다수의 임상적 샘플을 사용하여 질환과의 PTTV 연관성의 미래 연구를 위한 간단하고 실제적인 도구를 제공할 것이다.
게다가, 2 개의 종-특이적 단방향 어세이를 커플링함으로써, MCA-기반 양방향 실시간 PCR 어세이에서 2 개의 돼지 TTV 종, PTTV1 및 PTTV2 의 동시 검출 및 분화를 위한 빠르고, 비싸지 않고 실현성 있는 스크리닝을 개발 및 입증하였다. 상기 어세이가 두 PTTV 종의 정확한 정량화에 대해 의도되지 않았더라도, 이것은 검출 목적을 위한 통상의 네스트 PCR 을 대체할 수 있을 것인 더욱 편리한 접근법이다. 실시간 PCR 과 비교하여, 돼지 TTV 검출을 위한 통상의 네스트 PCR 어세이는 시간 소모적이고 (총 4 회의 PCR 을 필요로 함), 노동적이고 다중 회차의 PCR 처리 동안 샘플 오염 발생이 쉽다. PTTV1 과 PTTV2 종 사이의 Tm 값의 차이로 인해, MCA 후 양방향 PCR 증폭은 구별되는 반응 특이성을 확보할 수 있다. 상기 양방향 실시간 어세이의 또다른 장점은 기재된 프로토콜을 수행할 때 PTTV1 및 PTTV2 표준의 혼입이 불필요하다는 것이고, 이것은 자동화 실시간 PCR 기구가 구비된 임의의 진단 실험실에서 사용을 더욱 폭넓게 용이하게 할 수 있다.
동일한 종의 구별되는 유전자형 또는 서브유형으로의 돼지 TTV 의 다중 감염이 입증되었다 (Gallei et al., 2009, supra). 특히, 본 출원인의 이전 연구는 돼지 TTV 종 1 이 2 개의 구별되는 유형, PTTV1a (균주 Sd-TTV31 및 PTTV1a-VA 포함) 및 PTTV1b (균주 TTV-1p 및 PTTV1b-VA 포함) 로 이루어진다는 것을 보여주었다. 전장 게놈을 갖는 2 개의 새롭게 공개된 PTTV1 단리물, 캐나다로부터의 swSTHY-TT27 (GQ120664) 및 독일로부터의 TTV1 #471819 (GU188045) 는 모두 계통발생적 분석에 근거하여 유형 1b 로 분류되었다 (데이터는 제시되지 않음). 본 연구에 기재된 양방향 네스트 PCR 은 2 개의 PTTV1 유전자형의 이중 감염이 돼지에서 종종 발생한다는 것을 확인시켜주었다. 상기 신규 어세이는 지금까지 PTTV1a 와 1b 사이를 구별하기 위해 개발된 첫번째 진단 PCR 접근법이다. 현재 PTTV1a 및 PTTV1b 감염 중 하나 또는 모두가 질환과 연관된 관련 인자를 나타내는지의 여부를 알지 못하므로, 본 차등 PCR 어세이는 상기 2 개의 PTTV 유형의 미래 잠재적 질환 연관성에 대해 매우 가치가 있어야만 한다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 돼지 TTV 특이적 항체의 존재를 검출하기 위해 돼지 TTV ORF 단백질이 발현되고 면역검출 어세이에서 사용되었다. 본 발명의 하나의 구현예에서, PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2 의 3 개의 절단된 및 히스티딘-태그 ORF1 단백질을 각각 에스케리챠 콜라이 (E. coli) 에서 발현하고 정제하였다. 게다가, 상기 재조합 항원에 기반한 혈청 웨스턴 블롯 및 ELISA 어세이 모두는 상이한 기원 유래의 돼지 혈청 샘플을 사용하여 개발되고 입증되었다. 특히, PTTV1a-, PTTV1b- 및 PTTV2-특이적 ELISA 를 사용하는 혈청학적 시험은 질환과의 돼지 TTV 감염의 연관성을 밝히기 위한 정확하고 간단한 도구를 제공한다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 돼지 TTV ORF 단백질은 E. 콜라이 발현 시스템에서 재조합 ORF1 캡시드 단백질로서 발현되고 정제되었다 (도 10, 도 15). PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2 의 3 개의 절단되고 His-태그된 ORF1 캡시드 단백질을 각각 에스케리챠 콜라이 (E. coli) 에서 발현하고 정제하였고, PTTV 감염에 대항하는 재조합 캡시드 서브유닛 백신으로서 담당하였다.
4 개의 돼지 TTV2 균주, TTV-2p, TTV2#472142, PTTV2b-VA 및 PTTV2c-VA 는 지금까지 이용가능한 완전한 게놈 서열을 가졌다. 이들이 3 개의 추정 서브유형으로 계통발생적으로 분류됨에도 불구하고, 4 개의 PTTV2 로부터 아미노산을 코딩하는 ORF1 의 친수성 프로파일의 비교 분석은 이들이 3 개의 친수성 영역, N-말단에 aa 1-49 로부터의 아르기닌-풍부 영역 및 중앙 및 C-말단 부분에 위치한 2 개의 특정 도메인 (I 및 II) 을 각각 공유하는 것으로 제시되었다 (도 9A). 절단된 PTTV2c-VA ORF1 발현에 사용되는 C-말단 영역 및 다른 3 개의 PTTV2 균주에서 공유된 상응하는 영역은 점선 박스에 의해 표시되었다. 아미노산 서열의 정렬은 4 개의 PTTV2 균주를 가로질러 도메인 I (aa 322-349) 및 II (aa 536-625) 의 높은 수준의 서열 보존을 입증하였다 (도 9B).
친수성 도메인이 많은 단백질의 항원성에 중요한 것으로 여겨지므로, 2 개의 도메인을 함유하는 PTTV2c-VA ORF1 SEQ ID NO:16 의 C-말단 영역 (aa 310-625) 이 단백질 발현을 위해 선택되었고, 이것은 돼지 혈청에서 PTTV2-특이적 항체 검출을 위한 항원으로서 사용될 것이다. 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 절단된 PTTV2c ORF1 의 발현은 모든 PTTV2 서브유형의 검출에 충분하였다 (2a, 2b 및 2c; 또한 도 3A 참조).
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 8 x His-태그가 융합된 PTTV2c ORF1 유전자의 C-말단 부분을 제작하고 E. 콜라이에서 발현시켰다. 재조합 단백질은 불용성이었고 박테리아 봉입체 내에서 발현시켰다. 도 10A 은 미정제된 2c-ORF1 생성물의 SDS-PAGE 를 보여준다. 도 10B 은 정제된 2c-ORF1 생성물의 SDS-PAGE 를 보여준다. 도 10C 는 항-His-태그된 mAb 를 사용하는 정제된 2c-ORF1 생성물의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 흰색 화살표는 예상되는 크기의 ORF1 단백질 및 그의 절단된 생성물을 나타내는 반면, 검은색 화살표는 예상되는 및 절단된 단백질의 추정 이량체를 나타낸다. M: 단백질 마커. 도 10A 에서, 2 개의 유의한 폴리펩티드 (흰색 화살표) 는 대조군 샘플과 비교해 2c-ORF1 미정제된 샘플에서 생성되었다. ~40 KDa 의 밴드는 2c-ORF1 의 예상되는 크기와 일치했던 반면, ~30 KDa 폴리펩티드는 아마도 2c-ORF1 로부터 N-말단이 절단된 생성물이었다. 니켈-친화성 컬럼으로의 정제 후, 2 개의 기재된 뚜렷한 밴드를 포함하는 4 개의 폴리펩티드가 SDS-PAGE 에서 제시되었다 (도 10B). 이들은 또한 항-His-태그된 mAb 를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다 (도 10C). 2 개의 고분자량 밴드 (검은색 화살표) 는 각각, 예상되는 크기 (~80 KDa 및 ~60 KDa) 에 근거하여 ~40 KDa 및 ~30 KDa 의 2 개의 폴리펩티드에 의해 형성된 동종이량체였다. 결과는 정제된 C-말단 PTTV2c-ORF1 이 성공적으로 생성되었고, 돼지 혈청에서 돼지 TTV2 항체 검출에 사용될 수 있었다는 것을 증명하였다.
본 발명의 또다른 양상에 따르면, 다양한 돼지 혈청 샘플 중의 돼지 TTV2 항체는 정제된 C-말단 PTTV2c-ORF1 을 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있다. 흰색 화살표는 예상되는 크기의 ORF1 단백질 및 이의 절단된 생성물을 나타냈다. 오직 녹색의 밴드만이 양성인 것으로 인지되었음을 유념해야만 한다. 통상의 돼지 (건강한 또는 질환이 있는), CD/CD 돼지 및 상이한 기원 유래의 무균 돼지의 총 200 개 초과의 혈청 샘플을 수집하였다. 샘플은 항원으로서 정제된 C-말단 PTTV2c-ORF1 을 사용하는 항-PTTV2c-ORF1 IgG 항체의 검출을 위해 랜덤으로 선택되었다. 도 11A 는 통상의 돼지의 선택된 돼지 혈청 샘플의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내고, 도 11B 는 CD/CD 돼지를 나타내고, 도 11C 는 무균 돼지를 나타낸다. 정제된 PTTV2c-ORF1 생성물이 항원으로서 사용되었다. 2 개의 표시된 ~40 KDa 및 ~30 KDa 밴드가 통상의 돼지 (도 11A) 및 CD/CD 돼지 (도 11B) 의 대부분의 샘플에서 검출되었고, 상기 돼지에서 PTTV2 감염이 널리 있었다는 것을 나타낸다. 그러나, 상이한 기원 유래의 모든 무균 돼지 (Blacksburg, VA and Ames, IA) 는 검출가능한 PTTV2 항체가 없었다 (도 11C). 부가적인 저분자량 밴드가 또한 관찰되었다 (도 11A 및 11B). 이들은 웨스턴 블롯 내 비-특이적 반응성으로 인한 것 같았다.
본 발명의 더욱 또다른 양상에 따르면, PTTV2-특이적 ELISA 가 돼지 TTV2 혈청학적 시험으로서 사용될 수 있다. 혈청학음성 결과는 또한 위스콘신 농장의 통상의 돼지로부터의 몇몇 샘플에서 제시되었다 (도 12). 상기 음성 샘플을 모으고, PTTV-특이적 ELISA 의 개발에서 음성 참조로서 사용하였다. 상기 기원 유래의 나머지 샘플은 양성이었다 (도 12, 좌측의 4 개 라인). 부가적으로, 세포 배양에 사용된 영리 회사로부터의 돼지 혈청 (OIE 질환이 없는 것으로 가정됨) 은 또한 강한 항-PTTV2-ORF2 양성을 나타냈고 (도 12), 이것은 ELISA 에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다. 정제된 2c-ORF1 항원, 돼지 혈청 및 IgG 컨쥬게이트의 농도를 낮은 백그라운드 신호를 나타내고 양성과 음성 대조군 사이에 OD405 값의 최대 차이를 제공하는 점검판 적정에 의해 측정하였다. 최적 항원 양은 웰 당 69 ng 이었고, 최적 ELISA 결과를 혈청 샘플의 1:100 희석 및 IgG 컨쥬게이트의 1:4000 희석을 사용하여 수득하였다. ELISA 컷오프 값은 각각의 시도에서 0.25 내지 0.5 의 범위였다. 도 4 는 혈청 웨스턴 블롯 및 개발된 ELISA 의 일관성을 반영하는 각각의 결과를 나타낸다.
3 개 무리로부터의 138 개의 통상적인 돼지 혈청 샘플을 실시간 PCR 에 의한 PTTV2 바이러스 로딩량과 ELISA 에 의한 항-PTTV2 IgG 항체 사이의 연관성을 분석하기 위해 선택하였다. 결과는 미검출성 또는 높은 PTTV2 바이러스 로딩량 (108 복사본/ml) 을 갖는 돼지가 중간 값의 PTTV2 바이러스 로딩량을 갖는 돼지보다 낮은 혈청 PTTV2 항체 적정농도를 가질 것 같다는 것을 보여주었다 (도 13).
특히, 동일한 무리에서 10 마리의 돼지로부터의 혈청을 또한 새로운 시설에 도착했을 때부터 도착 후 2 개월까지 이들의 혈청의 PTTV2 바이러스 로딩량 및 항-PTTV2 항체 수준을 비교함으로써 분석하였다. 10 마리 돼지 중 9 마리가 2 개월 후 감소된 바이러스 로딩량 (3 마리는 검출가능 바이러스가 없었다) 을 가졌으며, 항-PTTV2 항체 적정농도는 10 마리의 돼지 중 9 마리에서 증가하였다 (도 14A 및 14B). 결과는 10 마리의 돼지가 초기 단계의 PTTV2 감염을 획득하였고, 이것이 계속적으로 호르몬 반응을 유도하고 항-ORF1 캡시드 IgG 항체를 생성한다는 것을 암시한다. PTTV2-ORF1 IgG 항체는 바이러스를 중화시키거나 심지어 소멸시킬 수 있었고, 이는 ORF1 이 실제로 바이러스 캡시드 단백질을 코딩하고 PTTV2 에 대항하는 중화 에피토프를 함유할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, C-말단 PTTV1a- 및 PTTV1b-ORF1 단백질을 E. 콜라이 시스템에서 각각 발현시키고 정제하였다. 항 His-태그 mAb 를 사용하는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 1a- 및 1b-ORF 생성물이 2 개의 폴리펩티드 (하나는 정확한 크기의 것 (~40 KDa) 및 다른 하나는 추정 동종이량체 (~80 KDa)) 를 갖는다는 것을 보여주었다 (도 15A-C). 도 15A 는 미정제된 및 정제된 1a-ORF1 생성물의 SDS-PAGE 를 보여준다. 도 15B 는 정제된 1b-ORF1 및 1b-ORF1 ctruc 생성물의 SDS-PAGE 를 보여준다. 도 15C 는 항-His-태그 mAb 를 사용하는 정제된 1a- 및 1b-ORF1 의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 흰색 화살표는 정확한 크기의 ORF1 단백질을 나타내는 반면, 검은색 화살표는 ORF1 단백질의 추정 이량체를 보여준다. 2c-ORF1 발현과 비교하여, 절단된 폴리펩티드는 관찰되지 않았다. 비교 대조군으로서, C-말단-절단된 1b-ORF1 영역 (lb-ORF1 ctruc) 의 발현은 C-말단-비-절단된 대응부분 1b-ORF1 에 비해 저분자량 폴리펩티드를 야기하였다 (도 15B).
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 정제된 C-말단 PTTV1a- 및 PTTV1b-ORF1 단백질은 상기 PTTV2 에 대해 기재된 바와 같은 유전자형-특이적 혈청 웨스턴 블롯 및 ELISA 를 개발하는데 사용되었다. 도 16 은 항원으로서 1a-ORF1 을 사용하는 혈청 웨스턴 블롯의 음성 (라인 1-2) 및 양성 (라인 3-5) 샘플을 보여준다. 동일한 항원 양 (69 ng), 혈청의 희석 (1:100) 및 PTTV2-ORF1 로서 IgG 접합체의 희석 (1:4000) 이 PTTV1a- 및 PTTV1b-특이적 ELISA 에 사용되었다 (데이터는 제시되지 않음).
부가적으로는, 본 발명은 예를 들어, 돼지를 유효한 면역원성 양의 돼지 TTV 또는 본 발명의 면역원성 조성물로 접종하여 바이러스 감염을 생성하고 감염된 돼지의 혈청으로부터 항체를 회수함으로써, 자연적 숙주로부터 정제된 단일클론 또는 폴리클론 항체를 포함하는 돼지 TTV 감염을 검출하기 위한 유용한 진단 시약을 제공한다. 대안적으로는, 항체는 단리된 돼지 TTV 의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열 또는 면역원성 절편으로부터 유래되거나 발현된 천연 또는 합성 폴리펩티드에 대항하여 실험 동물에서 유발될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 단리된 돼지 TTV 의 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 폴리펩티드 항원으로 면역화된, 예를 들어, Balb/c 와 같은 마우스로부터 수득되는 하이브리도마 세포로부터 생성될 수 있다. 하이브리도마 세포의 선별은 둘베코 개질 이글 (Dulbecco's modified Eagle's) 배지 (DMEM) 또는 최소 필수 배지와 같은 표준 세포 배양 배지에서 하이프로잔틴, 티미딘 및 아미노프테린에서의 성장에 의해 이루어진다. 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 절차에 따라 클로닝될 수 있다. 그 다음, 형성된 별개의 콜로니를 적합한 배양 배지에서 배양하기 위해 배양 플레이트의 별도의 웰로 이동시킬 수 있다. 항체 분비 세포의 확인은 적합한 항원 또는 면역원으로의 통상의 스크리닝 방법에 의해 수행된다. 하이브리도마의 주사 후 마우스에서 복수액을 수득함으로써 하이브리도마 세포를 시험관 내 또는 생체 내에서 배양하는 것은 잘 알려진 기술을 통해 바람직한 단일클론 항체를 생성한다.
또다른 대안적인 방법의 경우, 돼지 TTV 캡시드 단백질은 당업계에 공지된 절차에 따라 배큘로바이러스 발현 시스템 또는 E. 콜라이 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 발현된 재조합 돼지 TTV 캡시드 단백질은 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 에서의 진단용 항원으로서 사용될 수 있다. 돼지 재조합 캡시드 항원 기반의 EL1SA 어세이가, 예를 들어, 돼지 및 포유동물 종에서 돼지 TTV 에 대한 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. ELISA 어세이가 바람직하지만, 면역형광 어세이 (IFA), 면역퍼옥시다아제 어세이 (IPA), 등과 같은 다른 공지된 진단 시험도 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 시판 ELISA 진단 어세이가 돼지에서 돼지 TTV 감염을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 예는 돼지에서 항-TTV 항체를 검출하기 위한 ELISA 어세이를 개발하기 위해 돼지 TTV 의 정제된 ORF1 및 ORF2 단백질을 사용하는 것을 예증한다. 돼지 TTV 로 감염된 돼지로부터 수집된 혈청, 및 대조군 돼지로부터의 음성 혈청이 어세이를 입증하는데 사용된다. PTTV2 특이적, PTTV1a 특이적, 및 PTTV1b 특이적 항체가 PTTV ORF 단백질을 특이적으로 인지하는 것을 입증하였다. 당업자에게 공지된 기술에 의한 시험의 추가 표준화는 돼지 TTV 에 대한 진단 어세이의 상업화를 최적화할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 상기 본원에 기재된 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단리된 돼지 TTV 또는 항원 단백질을 포함하는 독특한 면역원성 조성물 및 항체를 유발 또는 생성하기 위한 이의 용도이다. 조성물은 무독성, 생리학적으로 허용가능한 담체 및 임의로, 하나 이상의 아쥬반트를 함유한다. 적합한 담체, 예를 들어, 물, 식염수, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 글리세롤, 등이 통상의 부형제로부터 용이하게 선택되고, 조-제형이 첨가될 수 있다. 최종 조성물의 물리적 적합성 및 안정성을 확보하기 위해 정규 시험이 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 돼지 토크 테노 (TTV) 의 감염성 분자 및 핵산 분자, 기타 바이러스로의 돼지 TTV 동시-감염에 의해 야기된 돼지 TTV 바이러스 감염 또는 질환으로부터 돼지를 보호하기 위한, 핵산 분자 및 수의학적 백신으로부터 제조된 생 바이러스가 추가로 제공된다. 본 발명은 추가로 백신으로서 사용될 수 있는 면역원성 폴리펩티드 발현 생성물을 제공한다.
돼지 TTV 의 신규한 감염성 DNA 분자는 감염성 PTTV1a-VA (SEQ ID NO:9), PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10), PTTV2c-VA (SEQ ID NO:11), 또는 PTTV2c-VA (SEQ ID NO:12) 게놈의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 감염성 PTTV DNA 클론은 바람직하게는 PTTV1 또는 PTTV2 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2 유전자의 적어도 하나를 함유한다. PTTV1a-VA (SEQ ID NO:9), PTTV1b-VA (SEQ ID NO:10), PTTV2c-VA (SEQ ID NO:11), 또는 PTTV2c-VA (SEQ ID NO:12) 게놈의 다중 복사본은 탠덤 감염성 PTTV 클론을 제작하기 위해 단일 DNA 분자 내로 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 PTTV, 특히 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2c-VA, 및 탠덤 PTTV2b-RR, PTTV2c-RR 의 클로닝된 게놈 DNA 는 PK-15 세포 내에 트랜스펙션되고 돼지에 제공되는 경우 시험관 내 또는 생체 내 감염성인 것으로 제시된다. 상기 새로운, 쉽게 재현가능한 병원성 작용제는 돼지에서 PTTV 감염을 예방하기 위한 적합한 백신화 프로그램의 개발 그 자체에 도움을 준다.
본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 3 개의 1-게놈-복사본 PTTV DNA 클론은 융합 PCR 에 의해 각각 원형 US 단리물 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA 및 PTTV2c-VA 로부터 유래되었다. 각각의 전장 게놈 DNA 를 블런트-말단 라이게이션에 의해 클로닝 벡터 pSC-B-amp/kan 내로 삽입하였다. 제한 부위 BamH I 은 3 개의 PTTV 게놈 상의 독특한 부위이고, 이것은 연쇄동일체 (concatemer) 의 생성을 용이하게 하고 그러므로 TTV 환형 게놈을 모방하기 위해 3 개의 게놈의 양 말단에서 조작되었다. 각각의 클론의 선택된 플라스미드 DNA 의 BamH I 단일 소화는 명백하게 크기가 4.3-Kb 및 2.8-Kb 인 2 개의 상이한 절편을 산출하였다 (도 18A). 4.3-Kb 절편은 골격 벡터를 나타내는 반면, 2.8-Kb 절편은 삽입된 PTTV 게놈 DNA 를 나타냈다. 동일한 효소로 소화된 빈 벡터 pSC-B-amp/kan 은 오직 4.3-Kb 밴드를 보였다 (도 18A). 산출된 PTTV 클론을 pSC-PTTV1a, pSC-PTTV1b 및 pSC-PTTV2c 로 각각 지정하였다 (도 17A-C).
게다가, 클론 pSC-PTTV2c 으로부터 유래된 전장 PTTV2c-VA 게놈의 2 개의 복사본을 pSC-B-amp/kan 벡터 내로 탠덤으로 라이게이션하여 클론 pSC-2PTTV2c-RR 을 생성시켰다 (도 17D). pSC-PTTV2c 와 pSC-2PTTV2c-RR 사이의 Afl II 단일 소화 패턴의 비교는 나중 플라스미드가 PTTV2c 게놈의 두번째 복사본을 나타내는 부가적인 2.8-Kb 절편을 가졌다는 것을 보였다 (도 18B, 우측 패널). 이어서, 독일 TTV 클론 TTV2-#471942-full 로부터 유래된 탠덤-이량체화 PTTV2b DNA 클론을 생성하기 위해 동일한 클로닝 전략을 이용하였다. PTTV2b 게놈의 두번째 복사본을 나타내는 부가적인 2.8-Kb 절편이 pSC-2PTTV2b-RR 로 지정된 상기 제작물에서 제시되었고 (도 17F), 이것을 이의 1-게놈-복사본 대응부분과 비교하는 경우 Hind III 단독으로 소화하여 (도 18B, 좌측 패널), 성공적인 제작을 확인하였다.
제작된 PTTV 감염성 클론의 복제 역량 (competencies) 을 PK-15 세포의 시험관 내 트랜스펙션에 의해 시험하였다. PTTV2c ORF1 에 대항하는 시판 생성된 토끼 폴리클론 항체를 사용하는 IFA 는 클론 TTV 2-#471942-full 및 pSC-PTTV2c 의 연쇄동일체 모두가 각각 복제 역량이 있음을 확인시켜주었다 (도 19A 및 도 20A). 트랜스펙션된 세포의 계대는 형광 신호를 제거하거나 감소시키지 않았고 (도 19B 및 도 20B), 이는 ORF1 단백질의 발현이 천연 PTTV2b 또는 PTTV2c 환형 분자를 닮은 PTTV2 연쇄동일체로부터 산출되었다는 것을 암시한다. IFA 검출을 위한 항체로서 예비-면역 토끼 혈청을 사용하는 mock-트랜스펙션된 세포 또는 DNA-트랜스펙션된 세포에서 형광 신호가 관찰되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 클론 pSC-PTTV1a 의 연쇄동일체가 또한 항-PTTV1a ORF1 항체를 사용하여 복제-역량이 있음을 나타냈다 (도 21). 양성 형광 신호는 트랜스펙션된 또는 계대된 세포의 핵에 위치했고, 돼지 TTV 가 세포 핵에서 복제될 것 같음을 나타낸다. 돼지 써코바이러스 (PCV) 가 시험관 내 유사한 발현 패턴을 갖기 때문에 예상치 못하지는 않았다.
PK-15 세포에서 탠덤-이량체화 클론 pSC-2PTTV2b-RR 또는 pSC-2PTTV2c-RR 의 직접 트랜스펙션은 바이러스 복제를 야기하고 ORF1 캡시드 항원을 생성한다. PTTV2 ORF1 에 대항하는 항체를 사용하는 IFA 는 두 클론이 또한 복제-역량이 있었고, 양성 ORF1 항원이 핵 내에 위치하였음을 확인시켰다 (도 22A 및 B).
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 돼지 TTV 의 감염성 클론은 돼지를 접종하는데 사용될 수 있고, 이것은 숙주 동물의 면역 반응을 도출하고 중화 항체의 생성을 촉진할 것이다. 본 발명의 하나의 특정한 구현예에서, 2 개의 탠덤-이량체화 PTTV2 클론은 통상의 돼지의 림프절 및 근육 내로 주사되는 경우 감염성이었다.
PTTV2 분자 클론의 생체 내 감염성을 시험하기 위해, 통상의 돼지를 클론 pSC-2TTV2b-RR 또는 pSC-2TTV2c-RR 로 접종하였다. 접종 후 0, 7, 14, 21 및 28 일 (DPI) 에 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 7 DPI (#92), 14 DPI (#188 및 #191) 및 21 DPI (#180), 각각에 시작하여 pSC-2TTV2c-RR-접종된 돼지에서 PTTV2 DNA 를 검출하였다 (도 23A, 우측 패널). 클론 pSC-2TTV2b-RR 로 접종된 돼지에 대해 후에 PTTV 빈혈증이 나타났다: 2 개는 14 DPI (#189 및 #192), 하나는 21 DPI (#181) 및 하나는 28 DPI (#193) (도 23 A, 좌측 패널) 에 시작하였다. 바이러스 로딩량은 PTTV2-특이적 실시간 PCR 에 의해 측정된 바와 같이, 부검 전 28 DPI 에 최고 바이러스 로딩량을 가졌던 모든 접종된 돼지에서 과정 동안 증가하였다 (도 23A). 선택된 돼지로부터 증폭된 실시간 PCR 생성물을 서열분석하여 pSC-2TTV2b-RR 또는 pSC-2TTV2c-RR 의 상응하는 영역에 일치하는 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 제시되지 않음).
모든 접종된 돼지는 0 및 7 DPI 에 PTTV2 ORF1 항체에 대해 음성이었다. 14 DPI 에, 모든 4 마리의 pSC-2TTV2b-RR-접종된 돼지는 항-PTTV2 ORF1 IgG 로 혈청전환되었던 반면, pSC-2TTV2c-RR-접종된 그룹은 14 (#92 및 #180), 21 (#191) 및 28 (#188) DPI 에 각각 혈청전환되었다 (도 23B). 결과는 활성 돼지 TTV2b 또는 TTV2c 감염이 발생하였음을 나타냈다.
감염성 바이러스 및 감염성 분자 DNA클론의 백신, 및 이의 사용 방법이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 접종된 돼지는 TTV2 감염 또는 동시-감염에 의해 야기되는 바이러스 감염 및 관련 질환으로부터 보호된다. 신규 방법은 돼지에게 면역학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 백신, 예를 들어, 면역원성 양의 감염성 PTTV DNA, PTTV 의 감염성 DNA 클론을 함유하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 재조합 PTTV DNA, 폴리펩티드 발현 생성물, 박테리아-발현된 또는 배큘로바이러스-발현된 정제된 재조합 ORF1 캡시드 단백질 등을 포함하는 백신을 투여함으로써 바이러스 감염에 대항하여 보호가 필요한 돼지를 보호한다. 기타 항원, 예컨대 PRRSV, PPV, 기타 감염성 돼지 작용제 및 면역 자극제는 바이러스 감염에 대항하는 광범위한 스펙트럼의 보호를 제공하기 위해 돼지에게 동시에 제공될 수 있다.
백신은 예를 들어, 감염성 바이러스 및 분자 DNA 클론, 적합한 플라스미드 또는 벡터 예를 들어, pSC-B 벡터 내 클로닝된 PTTV 감염성 DNA 게놈, 무독력, 생 바이러스, 비활성된 바이러스, 발현된 재조합 캡시드 서브유닛 백신, 등을 무독성, 생리학적으로 허용가능한 담체 및 임의로, 하나 이상의 아쥬반트와 조합으로 포함한다. 백신은 또한 본원에 기재된 감염성 TTV2 분자 DNA 클론을 포함할 수 있다. 감염성 PTTV DNA, 감염성 바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드 DNA 및 생 바이러스가 바람직하고, 생 바이러스가 가장 바람직하다. 본 발명의 무독력, 생 바이러스 백신은 맹독성 상태로 되돌아가는 위험이 있는 약화된, 생 바이러스 또는 바이러스 질환에 대항하여 보호하기 위한 충분한 항체 면역 반응을 유도할 수 없는 치사 세포 배양물 증식 전체 바이러스를 사용하는 종래의 바이러스 백신에 비해 장점을 제공한다.
백신 및 이를 사용하는 방법이 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다. 접종된 포유동물 종은 심각한 바이러스 감염으로부터 보호되고, PTTV 의 동시-감염과 관련된 질환, 예컨대 돼지 피부염 및 신장병 증후군 (PDNS), 이유후 전신성 소모 증후군 (PMWS), 및 기타 관련 질병에 대한 보호를 제공할 수 있다. 백신은 예를 들어, 비활성화된 또는 약화된 돼지 TTV 바이러스, 무독성, 생리학적으로 허용가능한 담체 및 임의로, 하나 이상의 아쥬반트를 포함한다.
본 발명의 백신과 함께 투여될 수 있는 아쥬반트는, 백신에 대한 돼지의 면역학적 반응을 증가시키는 성분이다. 아쥬반트는 동시에 그리고 백신과 동일한 부위에, 또는 상이한 시간에, 예를 들어, 부스터로서 투여될 수 있다. 아쥬반트는 또한 유리하게는 백신이 투여되는 방식 또는 부위와 상이한 방식 또는 부위에 돼지에 투여될 수 있다. 적합한 아쥬반트에는 수산화알루미늄 (alum), 면역자극 복합체 (ISCOMS), 비-이온성 블록 중합체 또는 공중합체, 사이토카인 (예를 들어 IL-1, IL-2, 1L-7, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 등), 사포닌, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 무라밀 디펩티드 (MDP) 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 기타 적합한 아쥬반트에는, 예를 들어, 알루미늄 칼륨 술페이드, 에스케리챠 콜라이로부터 단리된 열-불안정한 또는 열-안정한 엔테로톡신, 콜레라 독소 또는 이의 B 서브유닛, 디프테리아 독소, 테타누스 독소, 페르투시스 독소, 프로이드 (Freund) 불완전 또는 완전 아쥬반트, 등이 포함된다. 독성-기반 아쥬반트, 예컨대 디프테리아 독소, 테타누스 독소 및 페르투시스 독소는 예를 들어, 포름알데하이드로의 처리에 의해 사용 전 불활성화될 수 있다.
백신은 예를 들어, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 돼지 파르보바이러스 (PPV), 기타 감염성 돼지 작용제 및 면역 자극원과 같은 감염성 PTTV DNA 클론의 면역학적 활성을 촉진하기 위해 부가적인 항원을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 신규 백신은 임의의 특정 유형 또는 제조 방법에 제한되는 것은 아니다. 클로닝된 바이러스 백신에는 감염성 DNA 백신 (즉, 돼지에 DNA 를 직접 주사하기 위한 플라스미드, 벡터 또는 기타 통상의 담체를 사용함), 생 백신, 개질된 생 백신, 불활성화된 백신, 서브유닛 백신, 약화된 백신, 유전적으로 조작된 백신 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 백신은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 제조된다.
추가 장점으로서, 본 발명의 바람직한 생 바이러스는 다른 유형의 약화된 백신보다 저장 및 전달을 더욱 용이하게 만드는 유전적으로 안정한 백신을 제공한다.
본 발명의 또다른 바람직한 백신은 비병원성 DNA 클론을 돼지에게 전달하기 위해 적합한 플라스미드를 이용한다. 생 또는 치사 세포 배양 증식 전체 바이러스를 사용하는 종래의 백신과 반대로, 본 발명은 감염성 바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드 DNA 로의 돼지의 직접 접종을 제공한다.
본 발명에서 바람직한, 부가적인 유전적으로 조작된 백신은 당업계에 공지된 기술에 의해 제조된다. 이러한 기술에는 재조합 DNA 의 추가 조작, 재조합 단백질의 아미노산 서열에 대한 개질 또는 치환 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
재조합 DNA 기술을 기반으로 한 유전적으로 조작된 백신은 예를 들어, 돼지에서 강한 면역 또는 보호 반응을 유도하는 것을 담당하는 단백질 (예를 들어, ORF1, ORF1/1, ORF2, ORF2/2, 등 유래의 단백질) 을 코딩하는 바이러스 유전자의 대안적인 부분을 확인함으로써 제조된다. 이러한 확인된 유전자 또는 면역-우세 절편은 표준 단백질 발현 벡터, 예컨대 배큘로바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 적합한 숙주 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, O'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual," Freeman & Co., 1992 참조). 숙주 세포를 배양하고, 그러므로 원하는 백신 단백질을 발현하고, 이것을 원하는 범위로 정제하고 적합한 백신 생성물로 제형화할 수 있다. 재조합 서브유닛 백신은 PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2 의 박테리아-발현된 (도 10, 도 15) 또는 배큘로바이러스-발현된 ORF1 캡시드 단백질에 기반한다.
클론이 질환을 유발하는 임의의 바람직하지 않은 자연적 능력을 보유하는 경우, 임의의 잔류 병독성을 담당하는 바이러스 게놈 내 뉴클레오티드 서열을 정확히 찾아내고, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이생성을 통해 바이러스를 무독력으로 유전적으로 조작하는 것이 또한 가능하다. 부위-지정 돌연변이생성은 하나 이상의 뉴클레오티드를 첨가, 결실 또는 변화하는 것을 가능하게 한다 (예를 들어, Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984 참조). 올리고뉴클레오티드는 원하는 돌연변이를 함유하여 합성되고 단일 가닥 바이러스 DNA 의 일부에 어닐링된다. 상기 절차로부터 산출된 혼성 분자는 박테리아를 형질전환하는데 사용된다. 그 다음, 적합한 돌연변이를 함유하도록 단리된 이중 가닥 DNA 는, 적합한 세포 배양 내로 후속하여 트랜스펙션되는 전장 DNA 의 제한 절편에 대한 라이게이션에 의해 전장 DNA 를 생성하기 위해 사용된다. 이동을 위한 적합한 벡터 내 게놈의 라이게이션은 당업자에게 공지된 임의의 표준 기술을 통해 달성될 수 있다. 바이러스 자손의 생성을 위한 숙주 세포 내로의 벡터의 트렌스펙션은 통상적인 방법, 예컨대 칼슘-포스페이트 또는 DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 전기천공, 원형질 융합 및 기타 잘-공지된 기술 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 그 다음 클로닝된 바이러스는 원하는 돌연변이를 나타낸다. 대안적으로는, 2 개의 올리고뉴클레오티드는 적합한 돌연변이를 함유하여 합성될 수 있다. 이들은 전장 DNA 를 생성하기 위해 바이러스 DNA 에 삽입될 수 있는 이중 가닥 DNA 를 형성하도록 어닐링될 수 있다.
면역학적으로 유효한 양의 본 발명의 백신은 바이러스 감염에 대항하는 보호가 필요한 돼지에 투여된다. 돼지에 접종되는 면역학적으로 유효한 양 또는 면역원성 양이 정규 시험에 의해 쉽게 측정되거나 순조롭게 적정될 수 있다. 유효한 양은 PTTV 바이러스에 노출된 돼지를 보호하기 위해 백신에 대한 충분한 면역학적 반응을 획득하는 양이다. 바람직하게는, 돼지는 바이러스 질환의 하나 내지 모든 부정적인 생리학적 증상 또는 영향이 유의하게 감소되는, 경감되는 또는 전적으로 예방되는 범위로 보호된다.
백신은 단일 투여량 또는 반복 투여량으로 투여될 수 있다. 투여량은 예를 들어, 감염성 키메라 DNA 게놈을 함유하는 플라스미드 DNA 약 1 마이크로그램 내지 약 1,000 마이크로그램 (백신의 면역-활성 성분의 농도에 따라 다름), 바람직하게는 돼지 TTV DNA 클론 100 내지 200 마이크로그램의 범위일 수 있으나, 바이러스 감염의 부정적인 반응 또는 생리학적 증상을 야기하는데 충분한 바이러스-기반 항원의 양을 함유하지는 않아야만 한다. 돼지의 중량, 항원 농도 및 기타 전형적인 인자에 기반한 최소 유효 투여량을 찾기 위해 활성 항원제의 적합한 투여량을 측정하고 적정하기 위해 당업계에 알려져 있다. 바람직하게는, 감염성 바이러스 DNA 클론이 백신으로서 사용되거나, 또는 생 감염성 바이러스가 시험관 내에서 생성될 수 있어, 생 바이러스가 백신으로서 사용될 수 있다. 이 경우, 생 바이러스의 50% 조직 배양 감염성 투여량 (TCID 50) 의 약 50 내지 약 10,000 을 예를 들어, 돼지에 제공할 수 있다.
본 발명의 신규한 백신은 임의의 특정한 유형 또는 제조 방법에 제한되지 않는다. 백신에는, 비제한적으로, 개질된 생 백신, 불활성화 백신, 서브유닛 백신, 약독화 백신, 유전자조작 백신 등이 포함된다.
생 백신의 장점은, 백신 수령시 전신적, 국소적, 체액 및 세포-매개 면역 반응을 포함한 모든 가능한 면역 반응이 활성화된다는 점이다. 생 바이러스 백신의 장점을 모두 덮어 버리는 단점은, 살아있는 외래의 바이러스 인자에 의한 오염 가능성 또는 실제 사용시 바이러스가 병독성으로 다시 돌아갈 위험성에 있다.
불활성화 바이러스 백신을 제조하기 위해 예를 들어, 바이러스 증식 및 바이러스 생산을 배양된 돼지 세포주 예컨대, 비제한적으로, PK-15 세포 내에서 실시할 수 있다. 그 후, 일련의 바이러스 불활성화를 당업자에게 일반적으로 공지된 프로토콜에 의해 또는, 바람직하게는, 본원에 기재된 방법으로 최적화한다.
불활성화 바이러스 백신은, 돼지 TTV 를 불활성화제 예컨대, 포르말린 또는 소수성 용매, 산 등으로 처리하여, 자외선광 또는 X-선을 조사하여, 가열 처리 등을 하여 제조할 수 있다. 불활성화는 당업계에서 이해되는 방식으로 수행한다. 예를 들어, 화학적 불활성화에서, 적합한 바이러스 샘플 또는 바이러스를 함유하는 혈청 샘플은 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 충분한 양의 또는 충분한 농도의 불활성화제를 충분히 높은 (또는 불활성화제에 따라, 낮은) 온도 또는 pH에서 처리한다. 가열에 의한 불활성화는 소정의 온도에서 그리고 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 수행한다. 조사에 의한 불활성화는 바이러스를 불활성화시키기에 충분한 시간 동안 광 또는 다른 에너지 원의 소정의 파장을 사용하여 수행한다. 바이러스는 감염에 취약한 세포를 감염시킬 수 없다면 불활성화된 것으로 생각한다.
서브유닛 백신의 제조는 개질된 생 백신 또는 불활성화 백신의 제조와 통상적으로 상이하다. 서브유닛 백신을 제조하기 전에, 백신의 보호성 또는 항원성 구성요소를 확인해야 한다. 본 발명에서, 서브유닛 재조합 캡시드 백신으로서 사용하기 위한 PTTV 의 항원성 구성요소는, 본 발명에서 E. 콜라이, 및 다른 발현 시스템 예컨대, 배큘로바이러스 발현 시스템 내에서 발현되고 정제된 PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2 의 ORF1 캡시드 단백질로 확인되었다. 이러한 보호성 또는 항원성 구성요소에는 돼지에서 특히 강한 보호성 또는 면역성 반응을 일으키는 바이러스 캡시드 단백질의 특정 아미노산 단편 또는 절편; 단일 또는 다중 바이러스 캡시드 단백질, 그의 올리고머, 및 바이러스 서브구조 또는 이러한 서브구조의 확인가능한 부분 또는 단위를 형성하는 바이러스 캡시드 단백질의 상급 관련물; 바이러스의 표면 상에 또는 그 근처에 또는 바이러스 서브구조 예컨대, 리포단백질 또는 바이러스와 관련된 지질 기 내에 존재하는 올리고글리코시드, 당지질 또는 당단백질 등이 포함된다. 바람직하게는, ORF1 단백질은 서브유닛 백신의 항원성 구성요소로서 사용된다. ORF2, ORF1/1 및 ORF2/2 유전자 내에서 뉴클레오티드 서열에 코딩된 것과 같은 다른 단백질을 또한 사용할 수 있다. 이러한 면역원성 구성요소는 당업계에 공지된 방법으로 용이하게 확인된다. 일단 확인되면, 바이러스의 보호성 또는 항원성 부분 (즉, "서브유닛") 은 당업계에 공지된 절차로 후속하여 정제 및/또는 클로닝된다. 서브유닛 백신은, 서브유닛 예컨대, 바이러스의 고도로 정제된 서브유닛이 전체 바이러스보다 덜 독성이므로, 생 바이러스를 기재로 하는 다른 백신과 비교하여 장점을 제공한다.
서브유닛 백신이 재조합 유전자 기술을 통해 제조되면, 클로닝된 서브유닛 예컨대, ORF1, ORF2, ORF1/1 및 ORF2/2 유전자의 발현은 예를 들어, 상기 제공된 방법에 의해 발현될 수 있고, 또한 당업계에 공지된 방법으로 최적화될 수 있다 (예를 들어, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual." Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. Mass. (1989)) 참조). 반면, 사용되는 서브유닛이 바이러스의 손상되지 않은 구조적 특징부 예컨대, 전체 캡시드 단백질을 나타낸다면, 바이러스로부터의 그의 단리를 위한 공정을 최적화시켜야 한다. 어떠한 경우라도, 불활성화 프로토콜의 최적화 이후, 서브유닛 정제 프로토콜을 생산 전에 최적화할 수 있다.
약독화 백신을 제조하기 위해, 살아있는 병원성 바이러스를 먼저 당업계에 공지된 방법, 바람직하게는 본원에 기재된 방법으로 약독화시킨다 (비병원성으로 또는 무해하게 만듦). 예를 들어, 약독화 바이러스는 돼지 발육란을 통한 신규한 일련의 계대를 포함하는 본 발명의 기술로 제조할 수 있다. 약독화 바이러스는 자연에서 찾을 수 있으며, 자연-발생적으로 유전자가 제거될 수 있거나, 대안적으로는, 병원성 바이러스는 유전자를 제거하거나 유전자 돌연변이를 제조하여 약독화시킬 수 있다. 약독화 및 불활성화 바이러스 백신은 본 발명의 바람직한 백신에 포함된다.
본 발명에서 역시 바람직한 유전자 조작 백신은, 당업계에 공지된 기술로 제조된다. 이러한 기술은, 비제한적으로, RNA, 재조합 DNA, 재조합 단백질, 생 바이러스 등의 사용을 포함한다.
예를 들어, 정제한 후, 야생형 바이러스를 적합한 임상학적, 생물학적 샘플 예컨대, 혈청, 배설물, 타액, 정액 및 조직 샘플로부터 당업계에 공지된 방법, 바람직하게는 본원에 교시된 감염된 돼지 또는 감염된 적합한 세포주를 사용하는 방법으로 단리할 수 있다. DNA 는 생물학적으로 순수한 바이러스 또는 감염성 인자로부터 당업계에 공지된 방법으로 추출되고, 당업계에 공지된 방법으로, 바람직하게는 CsCl 구배내에서의 초원심분리로 정제된다. 바이러스 게놈의 cDNA 는 적합한 숙주 내로 당업계에 공지된 방법으로 클로닝되고 (Maniatis et al., id. 참조), 그 후 바이러스 게놈을 분석하여 바이러스의 항원성 부분을 제조하기 위한 게놈의 본질적 영역을 결정한다. 그 후, 절차는 개질된 생 백신, 불활성화 백신 또는 서브유닛 백신과 일반적으로 동일하다.
재조합 DNA 기술을 기반으로 하는 유전자 조작 백신은 예를 들어, 돼지에서 보다 강한 면역성 또는 보호성 반응 유도를 담당하는 단백질을 코딩하는 바이러스 유전자의 부분 (예, ORF1, ORF2, ORF1/1 및 ORF2/2 등 유래의 단백질) 을 확인함으로써 제조된다. 이러한 확인된 유전자 또는 면역-우세 절편은 표준 단백질 발현 벡터 예컨대, 배큘로바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 적합한 숙주 세포를 감염시키는데 사용된다 (예를 들어, O'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual." Freeman & Co. (1992) 참조). 숙주 세포를 배양하여, 목적하는 백신 단백질을 발현시키고 이를 목적하는 정도로 정제하여 적합한 백신 제품으로 제형화시킬 수 있다.
백신에서 유용한 유전자 조작 단백질은 예를 들어, 곤충 세포, 이스트 세포 또는 포유류 세포 내에서 발현될 수 있다. 통상의 방법으로 정제 또는 단리할 수 있는 유전자 조작 단백질을 돼지 또는 포유류 종에 직접 접종하여 돼지 TTV 에 대한 보호력을 부여할 수 있다.
바이러스로부터 수득되는 또는 바이러스의 하나 이상의 면역-우세 단백질을 코딩하는 바이러스 게놈으로부터 복사한 다중핵산을 함유하는 전이 벡터를 사용하여 곤충 세포주 (예컨대, sf9. sf21 또는 HIGH-FIVE) 를 형질전환시킬 수 있다. 전이 벡터에는 예를 들어, 목적하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 선형화 배큘로바이러스 DNA 및 플라스미드가 포함된다. 재조합 배큘로바이러스를 만들기 위해, 숙주 세포주에 선형화 배큘로바이러스 DNA 및 플라스미드를 동시-트랜스펙션시킬 수 있다.
대안적으로는, 하나 이상의 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 돼지 TTV 로부터의 DNA 는 생 벡터 예컨대, 폭스바이러스 또는 아데노바이러스 안에 삽입하고 백신으로 사용할 수 있다.
면역학적으로 유효한 양의 본 발명의 백신을 상기 감염 또는 증후군에 대항하여 보호해야하는 돼지 또는 포유류 종에 투여한다. "면역학적으로 유효한 양"은 쉽게 결정되거나 루틴한 시험으로 용이하게 적정할 수 있다. 유효한 양은, 백신에 대한 충분한 면역학적 반응이 달성되어 돼지 피부염 및 신장병 증후군 (PDNS), 이유후 전신성 소모 증후군 (PMWS) 또는 관련 질병을 야기할 수 있는 돼지 TTV 바이러스 또는 돼지 TTV 동시감염에 노출된 돼지 또는 다른 포유류를 보호하는 양이다. 바람직하게는, 돼지 또는 다른 포유류 종은 하나 내지 모든 해로운 바이러스성 질환의 생리학적 증상 또는 효과가 유의하게 감소되거나, 완화되거나, 완전한 예방이 확인되는 정도로 보호된다.
백신은 단일 투여량 또는 반복 투여량으로 투여할 수 있다. 투여량은 예를 들어, 1 내지 1,000 마이크로그램의 바이러스-기반 항원을 함유할 수 있으나 (백신의 면역-활성 구성요소의 농도에 따라), 바이러스 감염의 해로운 반응 또는 생리학적 증상을 초래할 만큼 충분한 양의 바이러스-기반 항원을 함유하지 않아야 한다. 활성 항원성 인자의 적합한 투여량을 결정 또는 적정하는 방법은, 새 또는 포유류의 체중, 항원의 농도 및 다른 통상의 요소를 기준으로, 당업계에 공지되어 있다.
백신은 돼지에게 투여할 수 있다. 또한, 백신은 바이러스 인자에 의해 감염될 위험이 높은 인간 예컨대, 돼지 농장주에 투여할 수 있다. 돼지 TTV 를 기재로하는 백신은 돼지 및 인간 TTV 둘 다에 대항하여 넓은 보호를 제공하도록 설계할 수 있는 것으로 고려된다. 환언하면, 돼지 TTV 기재 백신은 바람직하게는, 소위 "제너 접근법" (즉, 에드워드 제너에 의해 우두 바이러스 백신을 인간 천연두에 대항하여 사용할 수 있음) 을 통해 인간 TTV 감염에 대항하여 보호하도록 설계할 수 있다. 바람직하게는, 백신은 TTV 바이러스에 아직 노출되지 않은 돼지 또는 다른 포유류 종에 직접 투여한다. 백신은 편리하게는 경구, 협내, 비강내, 경피, 비경구 등으로 투여할 수 있다. 투여의 비경구 경로에는, 비제한적으로, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 경로가 포함된다.
액체로 투여하는 경우, 본 백신은 수용액, 시럽, 엘릭시르, 팅크제 등의 형태로 제조할 수 있다. 이러한 제형은 당업계에 공지되어 있고, 항원 및 다른 통상의 첨가제를 적합한 담체 또는 용매 시스템 중에 용해시켜 통상적으로 제조한다. 적합한 담체 또는 용매에는, 비제한적으로, 물, 염수, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 글리세롤 등이 포함된다. 통상의 첨가제는 예를 들어, 공인된 염료, 향료, 감미료 및 항미생물 방부제 예컨대, 티메로살 (나트륨 에틸머큐리티오살리실레이트) 이다. 이러한 용액은 예를 들어, 부분 가수분해된 젤라틴, 소르비톨 또는 세포 배양 배지를 첨가하여 안정화시킬 수 있고, 당업계에 공지된 시약 예컨대, 인산수소나트륨, 인산이수소나트륨, 인산수소칼륨, 인산이수소칼륨, 이의 혼합물 등을 사용하는 통상의 방법으로 완충시킬 수 있다.
액체 제형에는 또한, 다른 표준 부형제와의 조합으로 현탁제 또는 유탁제를 함유하는 현탁액 및 유탁액이 포함될 수 있다. 이러한 유형의 액체 제형은 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 콜로이드 밀을 사용하여 제조할 수 있다. 유탁액은 예를 들어, 균질화기를 사용하여 제조할 수 있다.
체액 시스템 내로 주사하기 위해 설계되는 비경구 제형에는, 포유류 체액의 상응하는 수준으로의 pH 완충 및 적절한 등장성이 요구된다. 등장성은 염화나트륨 및 필요에 따라 다른 염으로 적합하게 조절할 수 있다. 적합한 용매 예컨대, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜을 사용하여 제형 중 성분의 용해도 및 액체 제제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 본 백신에 사용할 수 있는 추가적 첨가제에는, 비제한적으로, 덱스트로오스, 통상의 산화방지제 및 통상의 킬레이팅제 예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 이 포함된다. 비경구 투여 형태는 또한 사용 전에 멸균시켜야 한다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 측면을 실증한다. 그러나, 이러한 실시예는 오직 예시를 위한 것이며 본 발명의 조건 및 범주를 전적으로 한정하지 않음을 이해해야 한다. 통상의 반응 조건 (예, 온도, 반응 시간 등) 이 주어졌을 때, 특정 범위 초과 및 미만의 조건도 모두 사용할 수 있으나, 일반적으로 덜 편리하게 사용할 수 있음을 인지해야 한다. 실시예는 실온 (약 23℃ 내지 약 28℃) 에서 그리고 대기압에서 수행한다. 달리 명시되지 않는 한 본원에서 언급되는 모든 부 및 백분율은 중량을 기준으로 하고, 모든 온도는 섭씨로 표현한다.
실시예 1.
바이러스 DNA 추출, 네스트 PCR 및 게놈 PCR :
버지니아 돼지 농장의 20 마리의 통상의 성체 수퇘지로부터의 편리한 혈청 및 정액 샘플을 연구에 사용하였다. QIAamp DNA 미니 키트 (Qiagen) 를 사용하여 총 DNA 를 20 개의 혈청 및 19 개의 정액 샘플로부터 단리하였다. 양성 PTTV-함유 샘플을 스크리닝하기 위해, PTTV1 및 PTTV2 의 UTR 내의 보존된 영역의 네스트 PCR 증폭을 AmpliTag Gold 폴리머라아제 (Applied Biosystems) 를 사용하여 처음으로 수행하였다. PTTV1 의 절편 A 를 증폭시키는데 사용된 2 개의 프라이머 쌍은 TTV1-mF (SEQ ID NO:45)/TTV1-mR (SEQ ID NO:46) (1 회차 PCR 에 대해) 및 TTV1-nF (SEQ ID NO:47)/TTV1-nR (SEQ ID NO:48) (2 회차 PCR 에 대해) 이었던 반면, PTTV2 의 절편 D 를 증폭시키는데 사용된 2 개의 프라이머 쌍은 TTV2-mF (SEQ ID NO:49)/TTV2-mR (SEQ ID NO:50) (1 회차 PCR 에 대해) 및 TTV2-nF (SEQ ID NO:51)/TTV2-nR (SEQ ID NO:52) (2 회차 PCR 에 대해; 도 1A 및 표 1) 이었다.
PTTV1 및 PTTV2 둘 다의 전장 게놈 서열을 증폭시키기 위해, 먼저 PTTV1 에 대해 영역 A 에 위치한 보존된 유전자-특이적 프라이머 TTV1-IF (SEQ ID NO:1) TTV1-IR (SEQ ID NO:4) 의 쌍 및 PTTV2 에 대해 영역 D에 위치한 유전자-특이적 프라이머 TTV2-IF (SEQ ID NO:5)/TTV2-IR (SEQ ID NO:8) 의 또 다른 쌍을 각각 사용하는 역 게놈 PCR 을, Herculase II Fusion DNA 폴리머라아제 (Stratagene) 를 제조자의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. 예상한 크기의 PCR 산물은 검출되지 않았다. 후속하여 2 회차 PCR에서 완전한 PTTV1 및 PTTV2 게놈을 커버하는 두 영역을 증폭시키기 위한 프라이머의 새로운 세트를 각각 설계하였다 (도 1A). PTTV1 의 절편 B 및 C 를 증폭시키는데 사용된 프라이머 쌍은 각각 TTV1-IF (SEQ ID NO:1)/TTV1-2340R (SEQ ID NO:2) 및 TTV1-2311F (SEQ ID NO:3)/TTV1-IR (SEQ ID NO:4) 인 반면, PTTV2 의 절편 E 및 F 를 증폭시키는데 사용된 프라이머 쌍은 각각 TTV2-1F (SEQ ID NO:5)/TTV2-2316R (SEQ ID NO:6) 및 TTV2-GCF (SEQ ID NO:7)/TTV2-IR (SEQ ID NO:8) 이었다 (도 1A 및 표 1). 절편 C 및 F 는 각각 PTTV1 및 PTTV2 의 GC-풍부 영역을 함유한다. 증폭된 PCR 산물을 개별적으로 자르고, 정제하고 후속하여 StrataClone Blunt PCR 클로닝 전략으로 pSC-B-amp/kan 벡터 (Stratagene) 내로 제조자 (Stratagene) 의 지침에 따라 클로닝한 후, DNA 를 서열분석하였다.
실시예 2.
버지니아 농장의 수퇘지로부터 수집된 돼지 TTV 양성 샘플의 스크리닝:
돼지 TTV DNA 는 일본 PTTV1 균주 Sd-TTV31 의 UTR 서열을 기초로 네스트-PCR 로 여러 지리구에서의 돼지로부터 앞서 검출되었다 (McKeown et al., 2004, supra). PTTV2 가 최근 확인되어, 상이한 두 세트의 네스트-PCR 프라이머가 PTTV1 의 영역 A 및 PTTV2 의 영역 D 를 각각 증폭시키는데 사용되었다 (도 1A) (Ellis et al., 2008, supra; Kekarainen, T., Sibila, M, and Segales, J. (2006). Prevalence of swine Torque teno virus in post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs in Spain. J Gen Virol 87(Pt 4), 833-7; Krakowka et al., 2008, supra). 유사한 검출 접근법이, 미국 내 돼지로부터의 PTTV 균주를 확인하기 위한 본 연구에도 이용되었다. 후속하여 전장 게놈 서열을 결정하는데 사용하기 위한 토착 PTTV1 (또는 PTTV2) 양성 샘플을 스크리닝하기 위해서, 버지니아의 농장의 20 마리의 수퇘지로부터 수집한 20 개의 혈청 (SR#1-20) 및 19 개의 정액 샘플 (SM#1-18 및 SM#20) 을 네스트-PCR 로 분석하였다. 놀랍게도, 20 개의 혈청 샘플 모두 PTTV1 에 대해 양성이었고, 19 개는 PTTV2 에 대해서도 양성이었다 (SR#18 은 제외). 이와 대조적으로, 오직 1 개의 정액 샘플 (SM#6) 만이 PTTV1-양성이었고, 3 개의 정액 샘플 (SM#8, 9 및 20) 이 PTTV2-양성이었다. 이러한 결과는, 스페인에서 수퇘지 정액 샘플이 PTTV DNA 에 대해 양성으로 나타났다는 점에서 최근 연구와 일치하였으며 (Kekarainen, T., Lopez-Soria, S., and Segales, J. (2007). Detection of swine Torque teno virus genogroups 1 and 2 in boar sera and semen. Theriogenology 68(7), 966-71), 따라서 PTTV 의 잠재적 수직 전파가 제안된다. 그러나, 정액 내 PTTV1 및 PTTV2 둘 다의 유병률은 혈청에서보다 훨씬 낮아, 동일한 돼지의 혈청 및 정액에서의 PTTV DNA 의 존재는 직접적인 관련이 없음이 제안된다.
실시예 3.
서열 및 계통발생 분석:
DNA 및 아미노산 서열의 제너릭 분석 및 배열은 Lasergene 패키지 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 를 사용하여 수행하였다. 3 개의 공지된 PTTV 균주의 게놈 서열, 및 배열 및 비교에 사용되는 그의 상응하는 GenBank 수탁 번호는 Sd-TTV31 (AB076001), TTV-1p (AY823990) 및 TTV-2p (AY823991) 이다. 쌍의 서열 비교 (PASC) 는, 온라인 프로그램 PASC (http://www. ncbi.nim.nih.gov/sutils/pasc/viridty.cgi?textpage=:overview) (Bao et al., 2008)으로 GenBank에서 입수가능한 인간 및 동물 TTV-관련 균주의 121 전장 게놈 서열을 사용하여 수행하였다.
계통분류도를 전장 게놈 서열 및 7 개의 PTTV 균주의 4 개의 ORF 의 추론된 아미노산 서열을 기초로 PAUP 4.0 프로그램 (David Swofford, Smithsonian Institute, Washington, DC, distributed by Sinauer Associate Inc.) 으로 이웃-연결 방법으로 제작하였다. 1000 번의 재-샘플링으로부터 데이터를 수득하였다.
실시예 4.
돼지 PTTV 감염을 진단하기 위한 PCR 프라이머의 디자인
DNA 서열의 분석 및 배열을 Lasergene 패키지 (DNASTAR Inc., Madison, WI) 를 사용하여 수행하였다. 10 개 돼지 TTV 균주의 전장 게놈 서열 및 배열에 사용되는 그의 상응하는 GenBank 수탁 번호는 다음과 같다. 종 PTTV1: Sd-TTV31 (AB076001), PTTV1a-VA (GU456383), TTV-1p (AY823990), PTTV1b-VA (GU456384), swSTHY-TT27 (GQ120664) 및 TTV1 #471819 (GU188045). 종 PTTV2: PTTV2b-VA (GU456385), PTTV2c-VA (GU456386), TTV-2p (AY823991) 및 TTV2 #472142 (GU188046). 6 개 PTTV1 및 4 개 PTTV2 게놈 중에서 보존된 서열을 각각 확인하였고, 후속하여 Beacon Designer 프로그램 (PREMIER Biosoft International, Palo Alto, CA) 을 사용한 실시간 PCR 프라이머 선택을 가이드하는데 사용하였다. PTTV1 의 양방향 네스트 PCR 에 사용된 프라이머는 Lasergene 패키지로 디자인하였다.
실시예 5.
PTTV1 및 PTTV2 실시간 PCR 의 표준 곡선
PTTV1b-VA 게놈의 PCR 절편 B 에 상응하는 2091 bp 영역을, 앞서 기재된 바와 같은 (Huang et al., 2010) 프라이머 TTV1-IF (5'-CATAGGGTGTAACCAATCAGATTTAAGGCGTT-3') 및 TTV1-2340R (5'-GGTCATCAGACGATCCATCTCCCTCAG-3') 을 사용하여 동일한 PCR 절편으로부터 재-증폭시켰다. 생성된 앰플리콘을 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) 로 겔-정제하고, 돼지 TTV 종 1 의 실시간 PCR 표준 주형에 사용되었던 NanoDrop 분광광도계로 정량화하였다. PTTV2c-VA 균주의 전장 DNA 클론인 pSC-PTTV2c 는, PTTV2c-VA로부터의 PCR 절편 E 및 F 를 벡터 pSC-B-amp/kan 내에 조립하여 제작하였다 (Huang et al., 미공개 데이터). 플라스미드 pSC-PTTV2c (7082 bp) 를 돼지 TTV 종 2 의 실시간 PCR 표준 주형으로 사용하였고, 플라스미드 DNA 농도를 NanoDrop 분광광도계로 측정하였다. 두 주형의 10-배 희석물 시리즈를 각각 사용하여 실시간 PCR 표준 곡선을 생성하였다.
실시예 6.
PCR 어세이를 위한 바이러스 DNA 의 추출
상기한 바와 같이 (Huang et al., 2010) QIAamp DNA 미니 키트 (Qiagen) 를 사용하여 버지니아 돼지 농장으로부터의 20 마리의 통상의 성체 수퇘지 (임상학적 증후군이 없는) 에서 수집한 20 개의 혈청 및 19 개의 정액 샘플로부터 총 DNA 를 단리하였다. 혈청 및 정액에 대하여 400 ㎕ 의 샘플 부피를 사용하여 DNA 를 추출하고, 50 ㎕ 의 멸균수로 최종 용리시켰다. 모든 추출된 DNA 샘플을 실시간 PCR 시험을 할 때까지 -20℃에 저장하였다. 통상의 네스트 PCR 로 이러한 샘플에서 돼지 TTV 를 검출하는 것은 앞서 기재되었다 (Huang et al., 2010). 동일한 절차로 염소 혈청 샘플로부터 추출한 총 DNA 를 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예 7.
SYBR 그린 실시간 정량적 PCR 어세이
PTTV1- 및 PTTV2-특이적 실시간 PCR 을 각각 SensiMix SYBR & Fluorescein kit (Quantace Ltd) 및 MyiQ iCYCLER 실시간 PCR 기구 (BIO-RAD Laboratories) 를 사용하여 수행하였다. 각각의 25-㎕ 반응은 12.5 ㎕ 의 SYBR 그린 Master Mix, 4 ㎕ 의 추출된 DNA, 0.5 ㎕ 의 각각의 프라이머 (10 nM) 및 7.5 ㎕ 의 멸균수를 함유하였다. PTTV1 에 대한 PCR 조건은 95℃ 에서 10 분 후, 40 사이클의 증폭 (95℃ 에서 15 초, 59.4℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 10 초) 이었다. 이에 바로 이어, 55℃ 에서 95℃ 로 온도를 점진적으로 증가시키고, 매 0.5℃ 마다 형광 신호를 측정하여 용융점 분석을 수득하였다. PTTV2 에 대한 PCR 조건은 어닐링 온도가 56℃ 임을 제외하고는 PTTV1 에서와 동일하였다. PTTV1 및 PTTV2 표준 주형은 매 시행마다 양성 대조군으로서 포함되었다. 증폭 및 데이터 분석은 MyiQ System 소프트웨어 (BIO-RAD Laboratories) 를 사용하여 수행하였다. 모든 샘플은 동일한 플레이트 상에서 이중으로 시행하였다.
실시예 8.
두 개의 단방향 어세이의 특이성 및 민감성
PTTV1- 및 PTTV2-특이적 어세이의 증폭을 위한 최적 어닐링 온도는 각각 59.4℃ 및 56℃ 이었으며, 이는 어닐링 온도의 구배를 사용하여 증폭의 10-배 희석물로 결정하였다. 프라이머 TTV1F/TTV1R 을 사용한 118-bp 산물의 증폭은 PTTV1 주형으로만 수득된 반면, PTTV2 주형을 사용한 200-bp 산물은 프라이머 TTVF4/TTVR4 를 사용했을 때만 관찰되었다. 두 어세이 모두 서로로부터의 어떠한 교차-증폭도 산출시키지 않아, 프라이머 및 표적의 특이성이 확인되었다 (데이터 나타내지 않음).
PTTV1 표준 곡선은 25 ㎕ 당 표적 DNA 농도의 범위에 걸쳐 확립되었다. 선형 범위는 4.4 × 101 내지 4.4 × 108 복사본 범위인 것으로 나타났다. 최소 검출 한도 (44 복사본) 은 37.57 의 역치 사이클 (Ct) 에 상응하였다. Ct>37.57 인 시험한 샘플은 검출 한도 미만이며, 정량화가 가능하지 않은 것으로 고려하였다. 유사하게, PTTV2 표준 곡선을 생성하였고, 25 ㎕ 반응 당 8.6x100 내지 8.6x108 복사본 범위의 DNA 농도를 검출하는데 사용하였다. 최소 검출 한도 (8.6 복사본) 의 상응하는 Ct 는 36.53 이었다. PTTV1- 또는 PTTV2-양성으로 고려된 모든 샘플은 해당 최대 검출 한도보다 낮은 복사본 수를 가졌다. PTTV1 또는 PTTV2 표준 주형의 10-배 희석물 및 또한 20 개의 수퇘지 혈청 샘플을 이용한 용융 곡선 (도 6a & 6b; 청색 곡선) 은 각각 PTTV1 에 대해서 87.0℃, PTTV2 에 대해서는 80.0℃ 의 용융 온도 (Tm) 를 나타내었다 (도 6a & 6b; 적색 곡선). 주형으로서 멸균수 또는 염소 혈청 DNA 를 사용한 음성 대조군에서는 피크가 관찰되지 않았다 (도 6a & 7b; 검은색 선).
실시예 9.
수퇘지 혈청 및 정액 샘플 내 돼지 TTV1 및 TTV2 의 정량화
바이러스 적재량은 원 수퇘지 혈청 샘플 ml 당 PTTV1 또는 PTTV2 게놈의 복사본 수로 표현하였다. PTTV1 DNA 는 20 개의 혈청 샘플 모두에서 1.91 × 103 내지 3.25 × 105 복사본/ml 범위로 검출된 반면, PTTV2 DNA 는 19 혈청 샘플 (#10 제외) 에서 3.59 × 102 내지 1.39 × 106 복사본/ml 범위로 검출되었다. 결과는 통상의 네스트 PCR 을 사용한 본 출원인의 이전 연구와 일치하였다 (표 5). 정액 샘플 중 어느 것도 PTTV1-양성이 아니었던 반면, 3 개의 정액 샘플은 매우 낮은 바이러스 적재량 (각각 230, 244 및 357 복사본/ml) 으로 PTTV2-양성이었다.
표 5. 버지니아 농장의 성체 수퇘지로부터의 20 개의 혈청 및 19 개의 정액 샘플에서의 여러 어세이에 의한 돼지 TTV 검출의 비교
샘플 양성 개수/여러 어세이에 의해 시험된 총 개수
PTTV1 실시간 PCR PTTV1 네스트 PCR PTTV2 실시간 PCR PTTV2 네스트 PCR PTTV1/PTTV2 양방향 실시간 PCR
혈청
혈청
혈청
혈청
실시예 10.
PTTV1 / PTTV2 양방향 실시간 PCR 어세이
PTTV1/PTTV2 양방향 실시간 PCR 어세이를, 12.5 ㎕ 의 SYBR 그린 Master Mix, 0.5 ㎕ 의 각각의 PTTV1 프라이머, 0.5 ㎕ 의 각각의 PTTV2 프라이머, 4 ㎕ 의 DNA 및 6.5 ㎕ 의 멸균수를 함유하는 25-㎕ PCR 시스템 중에서 수행하였다. 양방향 PCR 조건 및 용융점 분석은 어닐링 온도가 58℃ 임을 제외하고는 PTTV1 과 동일하였다. 용융 피크를 분석하여 PTTV1- 및 PTTV2-특이적 앰플리콘을 구별하였다.
실시예 11.
양방향 네스트 PCR
1 회차 PCR 을, 50 ㎕ 의 총 부피로 4 ㎕ 의 추출된 DNA 를 사용하여 Platinum PCR HiFi Supermix (Invitrogen) 로 수행하였다. PCR 조건은, 2 분 동안 94℃ 에서 주형 DNA 를 초기 변성시킨 후, 30 초 동안 94℃, 30 초 동안 55℃, 30 초 동안 72℃ 의 30 사이클이었다. 1 회차 PCR 산물의 4-㎕ 분취량을, 동일한 PCR 시약 및 조건을 이용하여 2 회차 PCR 에 사용하였다. 한 쌍의 프라이머 Plab-mF/Plab-mR 을 1 회차 PCR 에 사용한 반면, 두 쌍의 프라이머의 혼합물, PTTV1a 의 검출을 위한 Pla-nF/Pla-nR 및 PTTV1b 의 검출을 위한 Plb-nF/Plb-nR 을 2 회차 PCR 에 사용했다 (표 1). 증폭 산물을 에티듐 브로마이드로 염색한 1% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동으로 시각화하였고, 각 유형에 있어서 특이적인 두 밴드는 UV 광으로 식별하였다.
실시예 12.
PTTV1 및 PTTV2 ORF 발현 플라스미드의 제작
0PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2c 의 ORF1 의 C-말단 부분을 해당 전장 DNA 클론 (pSC-PTTV1a, pSC-PTTV1b 및 pSC-PTTV2c; 다른 곳에 기재됨) 으로부터 증폭시켰다. 증폭된 절편은 PTTV1a 에 대해서 319 aa 를 갖는 단백질 산물 (ORF1 aa 위치 317-635 (SEQ ID NO:13); GenBank 수탁 번호 GU456383) 을, PTTV1b 에 대해서 318 aa 를 갖는 단백질 산물 (ORF1 aa 위치 322-639 (SEQ ID NO:14); GenBank 수탁 번호 GU456384) 을, 및 PTTV2c 에 대해서 316 aa 를 갖는 단백질 산물 (ORF1 aa 위치 310-625 (SEQ ID NO:16); GenBank 수탁 번호 GU456386) 을 각각 코딩하는 것으로 예상되었다. 248 aa 를 코딩하는 PTTV1b 의 C-말단 절단 절편 (ORF1 aa 위치 322-569 (SEQ ID NO:14)) 또한 증폭시켰고, SDS-PAGE 분석을 위해 비교 대조군으로 사용하였다. 모든 플라스미드는, E.coli/배큘로바이러스/포유류 세포 3중 발현 벡터 pTriEx1.1-Neo (Novagen) 내 NcoI 및 XhoI 제한 부위 사이로 PCR 산물을 클로닝하여 C-말단 8xHis-태그 융합 단백질을 생성시켜 제조되었다. 네 개의 재조합 플라스미드는 pTri-PTTV1a-ORF1, pTri-PTTV1b-ORF1, pTri-PTTV1b-ORF1ctruc 및 pTri-PTTV2c-ORF1 로 지정되었다. 모든 클로닝된 서열은 DNA 서열분석으로 확인하였다.
실시예 13.
재조합 PTTV1 및 PTTV2 단백질의 발현
4 개의 발현 플라스미드는 각각 Rosetta 2 (DE3) pLacl 수용 세포 (Novagen) 내로 형질전환시켰고, 박테리아를 100 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 각각의 제작물에 대한 단일 형질전환 콜로니를 사용하여 100 ㎍/ml 의 암피실린을 함유하는 LB 배지 (LB/amp) 3 ml 를 접종하였고, 37℃ 에서 6-8 시간 동안 성장시켰다. 그 후, 각각의 제작물에 대한 탁한 3 ml 배양물을 사용하여 25% 의 필터 멸균된 글리세롤을 첨가함으로써 박테리아 스탁을 제조하고, 배양물을 -80℃ 로 냉동시켰다. 정제하기 전에 각각의 제작물에 대한 10 ㎕ 의 냉동된 박테리아 스탁을 사용하여 LB/amp 의 3 ml 의 스타터 배양물을 접종하였고, 37℃ 에서 6-8 시간 동안 성장시켰다. 100-ml 의 Overnight Express TB Media (Novagen) 에 스타터 배양물을 접종하여 단백질 발현을 유도하고, 37℃ 에서 16-18 시간 동안 성장시켰다. 인큐베이션한 후, 자기유도 배양물을 3400 rpm 에서 15 분 동안 4℃ 에서 원심분리하였다. 각각의 제작물에 있어서 생성된 상청액을 버리고, 각각의 박테리아 펠렛을 사용할 때까지 -20℃ 에서 보존하였다.
실시예 14.
재조합 단백질의 정제 및 투석
재조합 단백질은 불용성이었고 박테리아 봉입체 내에서 발현되었다. 각각의 박테리아 펠렛은 BugBuster 및 rLysozyme 으로 제조자의 프로토콜 (Novagen) 에 따라 처리하였고, DNA 및 RNA 를 분해하기 위해 Benzonase Nuclease (Novagen) 를 첨가하였다. 각각의 봉입체 펠렛을 후속하여 840 ㎕ 의 용해 완충액 (6M 구아니딘 히드로클로라이드, 0.1M 인산나트륨, 0.01M 트리스-클로라이드, 0.01M 이미다졸, pH 8.0) 로 재현탁시키고, -80℃ 에서 30 분 이상 냉동시켰다. 그 후 이를 해동시킨 후, 부가적 2.5 ml 의 용해 완충액으로 희석시키고 30 분 동안 실온에서 천천히 회전시켰다. 용해물 상청액을 15,000 × g 에서 30 분 동안 실온에서 원심분리하여 수집하였다. 50%-Ni-NTA His-결합 슬러리 (Novagen) 를 각각의 디캔팅한 상청액에 첨가하였고, 혼합물을 60 분 동안 실온에서 진탕하여 his-태그 결합을 촉진시켰다. 용해물/수지 혼합물을 빈 크로마토그래피 컬럼에 적재하였다. 초기 유통시킨 후, 7-ml 의 용해 완충액을 컬럼에 첨가하고 유통시켰다. 그 후 각각의 컬럼을 7 ml 의 세척 완충액 (8M 우레아, 0.1M 인산나트륨, 0.15M 염화나트륨, 0.02M 이미다졸, pH 8.0) 으로 2회 세척하였다. 표적 단백질의 용리는 컬럼에 4 회의 1 ml 분취량의 용리 완충액 (8M 우레아, 0.05M 인산나트륨, 1M 염화나트륨, 0.5M 이미다졸, pH 8.0) 을 첨가하여 달성하였다. 4 개의 용리 분획을 SDS Page 및 Coomasie Blue 염색을 사용하여 분석하였다.
상당히 높은 농도의 표적 단백질을 함유하는 용리액을 0.5 ml - 3 ml 투석 카세트에 20,000 분자량 컷-오프 (Pierce) 로 주입하였다. 일련의 네 투석 완충액을 투석에 사용하였다; 투석 완충액 1 (6M 우레아, 0.05M 인산나트륨, 0.8M 염화나트륨, 0.3M 이미다졸, pH 8.0), 투석 완충액 2 (4M 우레아, 0.033M 인산나트륨, 0.533M 염화나트륨, 0.2M 이미다졸, pH 8.0), 투석 완충액 3 (2.67M 우레아, 0.022M 인산나트륨, 0.356M 염화나트륨, 0.133M 이미다졸, pH 8.0) 및 투석 완충액 4 (1.5M 우레아, 0.0148 인산나트륨, 0.237M 염화나트륨, 0.089M 이미다졸, pH 8.0). 투석 카세트를 6 시간을 초과하는 기간 동안 4℃ 에서 순차적으로 각각 투석 완충액 중에 담그고 회전시켰다. 투석이 완결되면, 재조합 His-태그 융합 단백질을 각각의 카세트로부터 제거하고, NanoDrop 을 사용하여 정량화하고 -80℃ 에서 냉동시켰다.
실시예 15.
SDS - PAGE 및 항- His -태그 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯을 전개하여 항-6x His-태그 단일클론 항체 (Rockland) 를 사용함으로써 정제된 재조합 단백질을 검출하였다. 동일한 부피의 각각의 정제된 절단 ORF1 단백질 및 LDS/10% β-ΜΕ 를 혼합하고 95℃ 에서 10 분 동안 비등시켰다. 10-㎕ 의 비등 샘플을 4-12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 겔 (Invitrogen) 의 각각의 적합한 웰에 첨가하고, 1xMES 전개 완충액 (Invitrogen) 중에서 43 분 동안 200 볼트에서 전개하였다. 단백질을 트랜스 블롯 반건조 트랜스퍼 장비 및 1x트랜스퍼 완충액 (Invitrogen) 을 사용하여 PVDF 막 (Bio-Rad) 으로 트랜스퍼시켰다. 트랜스퍼가 완결되면, PVDF 막을 Odyssey 블로킹 완충액 (Li-Cor) 중 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 항-6x His-태그 MAb를 Odyssey 블로킹 완충액/0.2% tween 20 중에 1:1000 으로 희석시키고, 앞서의 Odyssey 블로킹 완충액을 제거한 후 막으로 트랜스퍼시켰다. MAb 를 로커 (rocker) 상에 남겨두고 막과 함께 2 시간 동안 실온에서 또는 4℃ 에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 막을 트리스 완충된 염수/0.05% tween 20 (TBS-T, Sigma) 으로 3 회 세척하였다. 염소 항-토끼 IgG IRDye 800 (Li-Cor) 항체를 Odyssey 블로킹 완충액 / 0.2% tween 20 / 0.1% SDS 중에 1:5000 으로 희석시켰다. 이를 새로 세척한 PVDF 막으로 트랜스퍼시키고, 천천히 로킹하면서 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 막을 TBS-T 로 3 회, TBS 로 1 회 세척하고, Li-Cor Odyssey 를 사용하여 영상화하였다.
실시예 16.
혈청 웨스턴 블롯
혈청 웨스턴 블롯을 전개하였고, ELISA 전개를 위한 양성 및 음성 혈청 대조군으로 사용하였다. 상기한 바와 같이 SDS-PAGE 후, 단백질을 PVDF 막으로 트랜스퍼시키고, 이를 후속하여 Odyssey 블로킹 완충액 (Li-Cor) 중 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 선택된 혈청 샘플을 Odyssey 블로킹 완충액 / 0.2% tween 20 중에 1:100 으로 희석시키고, 앞서의 Odyssey 블로킹 완충액을 제거한 후 막으로 트랜스퍼시켰다. 혈청 샘플을 로커 상에 남겨두어 막과 함께 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후, 막을 트리스 완충된 염수 / 0.05% tween 20 (TBS-T, Sigma) 으로 3 회 세척하였다. 염소 항-돼지 IgG IRDye 800 항체 (Rockland) 를 Odyssey 블로킹 완충액 / 0.2% tween 20 / 0.1% SDS 중에 1:2500 으로 희석시켰다. 이를 새로 세척한 PVDF 막으로 트랜스퍼시키고, 천천히 로킹하면서 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 막을 TBS-T 로 3 회, TBS 로 1 회 세척하고, Li-Cor Odyssey 를 사용하여 영상화하였다.
실시예 17.
간접 PTTV1a -, PTTV1b - 및 PTTV2 -특이적 ELISA
플레이트를 코팅하는데 사용되는 항원의 최적 농도 및 항혈청 및 컨쥬게이트의 희석을 체크보드 적정으로 결정하였다. 각각의 정제된 재조합 His-태그 융합 단백질 (각각 PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2c, 각각) 을 1x 카보네이트 코팅 완충액 (CCB) 중 pH 9.6 에서 680 ng/ml 로 희석시키고, 배지 결합 ELISA 플레이트 (Greiner) 를 100 ㎕/웰로 코팅하여 ELISA 를 개시하였다. 플레이트를 커버하고, 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 코팅 한 후, 희석된 단백질을 제거하고 각각의 웰을 300 ㎕ 의 1x TBS-T 로 3 회 세척하였다. 그 후, 단백질 무함유 블로킹 완충액 (Pierce) 을 300 ㎕/웰의 부피로 첨가하고, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 동안 96-웰 희석 블록 안에서 혈청 샘플을 150 ㎕ 의 단백질 무함유 블로킹 완충 중에 1:100 으로 희석시켰다. 그 후, 블록을 제거하고, 100 ㎕ 의 각각의 희석된 혈청 샘플을 각각의 상응하는 ELISA 플레이트 상의 웰로 트랜스퍼시켰다. 플레이트를 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 각각의 웰을 300 ㎕ 의 TBS-T 로 3 회 세척시켰다. 다음, HRP-컨쥬게이트 항-돼지 IgG 항체 (Rockland) 를 12 ml 의 단백질 무함유 블록 중에 1:4000 으로 희석시켰고, 100 ㎕ 를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 이를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 웰을 300 ㎕ 의 TBS-T 로 3 회 세척하였다. ELISA 를 전개하기 위하여, 100 ㎕ 의 Sure Blue Reserve 1-Component (KPL) 를 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 20 분 후, 100 ㎕ 의 1N HCL 을 각각의 웰에 첨가하여 전개를 정지시켰다. 그 후, 플레이트를 450 nm 에서 판독하였다.
실시예 18.
데이터 분석
영리 회사 (뉴질랜드에서 생산되며 모든 OIE 질환이 부재하는 것으로 고려됨) 로부터 입수한 세포 배양 연구에 사용된 돼지 혈청을 3 개의 ELISA 프로토콜을 위한 양성 대조군으로 사용하였는데, 이는 혈청 웨스턴 블롯으로 검출시 혈청이 모두 PTTV1a-, PTTV1b- 및 PTTV2-양성이었으며, 높은 OD 값 (> 2.0) 을 나타내었기 때문이다. 먼저, 모집한 무균 돼지 혈청을, 웨스턴 블롯 검출에서 음성이었으므로, 음성 대조군으로 사용하였다. 후속하여, 음성 무균 돼지 혈청의 비교시, 위스콘신의 통상의 돼지 농장에서 수집한 일부 돼지 혈청을 스크리닝하였다. 이 또한 웨스턴 블롯 검출에서 음성이었으며, 그의 OD 값이 음성 무균 돼지 혈청의 OD 값에 상응하였다. 이러한 통상의 돼지 혈청을 풀링하고 음성 대조군으로 사용하였다. 각각의 ELISA 에 대한 컷오프 값은 음성 대조군 (n=4) 의 평균 OD 값 + (3 * 표준 편차) 로 계산하였다.
실시예 19.
돼지 TTV1a , 1b 및 2c 의 전장 게놈 DNA 클론의 제작
US 단리물 PTTV1a-VA 로부터의 PCR 절편 B 및 C (GenBank 수탁 번호 GU456383) 를 상기한 제작물로부터 재-증폭시켰고, 후속하여 벡터 pSC-B-amp/kan (Stratagene) 상에서 Herculase II 융합 DNA 폴리머라아제 (Stratagene) 를 사용하여 PCR 을 중첩시킴으로써 게놈의 양 말단에 BamH I 부위를 갖는 전장 게놈 DNA 로 조립하였다. 생성된 제작물을 pSC-PTTV1a 로 지정하였다 (도 17A). 동일한 전략을 이용하여 US 단리물 PTTV1b-VA (GenBank 수탁 번호 GU456384) 로부터 유래된 클론 pSC-PTTV1b (도 17B) 및 US 단리물 PTTV2c-VA (GenBank 수탁 번호 GU456386) 로부터 유래된 클론 pSC-PTTV2c (도 17C) 을, 동일한 골격 벡터 상에 동일한 제한 부위 (BamH I) 를 갖도록 제작하였다. 독일 병원성 돼지 TTV2 단리물인 TTV2-#471942 로부터 유래된 전장 게놈 DNA 를 함유하는 플라스미드 TTV2-#471942-전장 (도 17E) 은 Dr. Andreas Gallei (BIVI, 독일) 로부터의 기증물이었다. TTV2-#471942 는, 계통발생 분석을 기초로 US 단리물 PTTV1b-VA 와 함께 돼지 TTV 서브유형 2b 로 분류되었다 (데이터 나타내지 않음).
실시예 20.
돼지 TTV2b 및 2c 의 탠덤-이량체화 DNA 클론의 제작
전장 PTTV2c 게놈을 클론 pSC-PTTV2c 로부터 BamH I 로 제한하여 절단해내고, 정제하고 라이게이션시켜 연쇄동일체를 형성하였다. 라이게이션된 연쇄동일체를 BamH I-전-제한된 pSC-B-amp/kan 벡터 내로 클로닝하여 탠덤-이량체화 DNA 클론 pSC-2PTTV2c-RR 을 제조했다 (도 1D). 유사하게, 탠덤-이량체화 DNA 클론, pSC-2PTTV2b-RR 을 EcoR V 제한 부위를 이용하여 클론 TTV2-#471942-전장으로부터 생성하였다 (도 1F).
실시예 21.
PTTV1a -, PTTV1b - 및 PTTV2 -특이적 항- ORF1 다중클론 항체의 생성
ORF1-코딩 산물은 TTV 의 추정 캡시드 단백질이다. PTTV ORFI 단백질의 발현을 검출하고 PTTV DNA 클론의 감염력을 측정하기 위한 PTTV1a-, PTTV1b- 및 PTTV2-특이적 항-ORF1 다중클론 항체를 생성하기 위해, PTTV1a, PTTV1b 및 PTTV2c 로부터의 세 ORF1 단백질을 E.coli 에서 발현시키고, 정제하고, 후속하여 각각 Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA) 에서의 주문 항체 생산 서비스로 뉴질랜드 화이트 토끼를 면역화하는데 사용하였다. 각각의 항-ORF1 다중클론 항체를 면역화시킨 토끼의 혈청으로부터 제조하였다.
실시예 22.
PTTV 감염성 클론의 시험관 내 트랜스펙션
PK-15 세포를 6-웰 플레이트 상에 웰 당 2x105 개의 세포로 시딩하고, 트랜스펙션 전 60%-70% 컨플루언트한 상태까지 성장시켰다. DNA 클론 pSC-2PTTV2b-RR 및 pSC-2PTTV2c-RR 을 각각 P-15 세포 내로, Lipofectamine LTX (Invitrogen) 를 제조자의 프로토콜에 따라 직접 트랜스펙션시켰다. 상기한 바와 같이 제조된 클론 pSC-PTTV1a, pSC-PTTV2c 및 TTV2-#471942-full 에 대하여, 그의 라이게이션된 연쇄동일체를 각각 트랜스펙션에 사용하였다. 세포를 3 내지 5 일 동안 배양하였고, 면역형광 어세이 (IFA) 에 적용하여 돼지 TTV 의 ORF1 의 발현을 검출하였다. 대안적으로는, 트랜스펙션된 세포를 새로운 6-웰 플레이트로 계대시켜 IFA 검출하기 전까지 3 일 동안 배양을 계속하였다.
실시예 23.
면역형광 어세이 ( IFA )
트랜스펙션된 또는 계대시킨 세포를 PBS 로 2 회 세척하고, 아세톤으로 고정시켰다. PTTV1a 또는 PTTV2 에 특이적인, PBS 중 1:500 희석된 500 ㎕ 의 항체를 세포 위에 첨가하고, 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS 로 3 회 세척하고, 그 후 1:200 희석된 500 ㎕ Texas red- 또는 Alexa Fluor 488-표지된 염소 항-토끼 IgG (Invitrogen) 를 첨가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후, PBS 로 세척하고, 세포를 1:1000 으로 희석하여 500 ㎕ DAPI (KPL, Inc.) 로 염색하고, 형광 현미경 아래에서 시각화하였다.
실시예 24.
탠덤-이량체화 돼지 TTV2 클론을 사용한 통상의 돼지의 생체 내 접종.
돼지 접종 연구를 수행하여 두 탠덤-이량체화 돼지 TTV2 클론: pSC-2TTV2b-RR 및 pSC-2TTV2c-RR 의 감염력을 측정하였다. 간단하게, 돼지 TTV2 에 대해 혈청음성 및 바이러스 DNA 음성인 4-주령 통상의 돼지 8 마리를 각각 4 마리 씩 두 군으로 무작위 배정하였다. 돼지의 각각의 군을 나누어 우리에 넣고, Institutional Committee on Animal Care and Use 의 모든 요건을 만족하는 조건하에서 유지하였다.
각각의 군의 모든 돼지에 림프절내 경로 및 근육내 경로의 조합으로 주사하였다. 4 마리의 돼지 (번호 181, 189, 192 및 13) 에 각각 200 ㎍ 의 pSC-2TTV2b-RR 플라스미드 DNA 를 주사한 반면, 또 다른 4 마리의 돼지 (번호 92, 180, 188 및 191) 에는 각각 200 ㎍ 의 pSC-2TTV2c-RR 클론을 접종하였다. 매일 총 28 일 동안 돼지의 임상학적 증상을 모니터링하였다. 모든 돼지는 접종 후 28일에 부검하였다.
본 발명을 여러 실시양태에 대한 기재로 예시하였고, 예시적 실시양태를 상세히 기재하였지만, 본 출원인은 첨부된 청구범위의 범주를 이러한 상세사항으로 어떠한 방식으로도 제한 또는 한정하고자 하는 의도는 없다. 당업자는 부가적 개질을 용이하게 생각해낼 것이다. 따라서 본 발명은 그의 보다 넓은 측면에서, 보여지고 기재된 특정 상세사항, 대표 장비 및 방법 및 예시 실시예에 한정되지 않는다. 따라서, 본 출원인의 발명의 전반적 개념의 주제 또는 범주에서 벗어나지 않는 한 이러한 상세사항을 변경할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Virginia Tech Intellectual Properties Huang, Yaowei Dr. Meng, Xiang-Jin Dr. <120> DIAGNOSIS OF PORCINE TORQUE TENO VIRUS INFECTION AND PORCINE TORQUE TENO VIRUS VACCINES <130> 124617-00306 <150> US 61/235,833 <151> 2009-08-21 <150> US 61/316,519 <151> 2010-03-23 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 1 catagggtgt aaccaatcag atttaaggcg tt 32 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 2 ggtcatcaga cgatccatct ccctcag 27 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 3 cttctgaggg agatggatcg tctgatga 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 4 ttgagctccc gaccaatcag aattgact 28 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 5 ttgtgccgga gctcctgaga gc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 6 aggtgcttga ggagtcgtcg cttg 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 7 tacccaggcg gttagacact cagctct 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> 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<212> DNA <213> Torque teno virus <400> 11 taatgacagg gttcaccgga aaggctgcaa aattacagct aaaaccacaa tcataacaca 60 ataaaccaca aactattaca ggaaactgca ataaattaag aaataaatta cacataacca 120 cctaaccaca ggaaactttg caaaaaaggg gaaataaatc tcattggctg ggccagaagt 180 cctcattaga ataagaaaag aaccaatcag aaacacttcc tcttttagag tatataagta 240 agtgcgcaga cgaatggctg agtttatgcc gctggtggta gacacgaaca gagctgagtg 300 tctaaccgcc tgggcgggtg ccggagctcc tgagagcgga gtcaaggggc ctatcgggca 360 ggcggtaatc cagcggaact gggcccccct ccatggaaga aagatggctg acggtagcgt 420 actgcgcgca cggattattc tgcgactgta aaaacccgaa aaaacatctt gaaaaatgcc 480 ttacagacgc tatcgccgac gccgaaggag accgacacgg agatggaggc accggaggtg 540 gagacgctac tttcgatatc ggtatcgacg cgctcctcgc cgccgccgcc caaaggtaag 600 gagacggagg aggaaagctc cggtcattca atggttccct cctagccgga gaacctgcct 660 catagagggc ttctggccgt tgagctacgg acactggttc cgtacctgtc tccctatgag 720 aaggctaaac ggactgattt tcacgggtgg aggatgtgac tggactcaat ggagtttaca 780 aaatttattc catgaaaaat taaactggag aaatatatgg 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acaaatttat ttcaaatggg 1680 atggccagga gatcaaaact ggccacccac aaaccaagac caaaccaatt ttaactgggg 1740 actcagagga ctttgtgtat taagagataa catgaaacta ggagcacaag agctagacga 1800 tgaatgcaca atgctctcct tatttggacc atttgttgaa aaagcaaaca cagcttttgc 1860 tacaaacgac ccaaaatatt ttaggcctga actaaaggac tacaacgtag taatgaaata 1920 tgcttttaaa tttcagtggg gaggacatgg caccgaaaga tttaaaacaa ccatcggaga 1980 tcccagcacc ataccatgtc cctttgaacc cggggaacgg taccaccacg gggtacaaga 2040 ccccgccaag gtacaaaaca cagtcctcaa cccttgggac tatgactgtg acgggattgt 2100 tagaacagat actctcaaaa gacttctcga actccccaca gagacggagg agacggagaa 2160 ggcgtaccca ctccttggac aaaaaacaga gaaagagcca ttatcagact ccgacgaaga 2220 gagcgttatc tcaagcacga gcagtggatc ctctcaagaa gaagagacgc agagacgaaa 2280 gcaccacaag ccaagcaagc gacgactcct caagcacctc cagcgggtgg taaagaggat 2340 gaaaacactg tgatagataa atacagaaac ctagcagacc cctcactcaa tgtcacagga 2400 cacatggaaa aattcatgca actacacata caaaacatac aagaaataag agctaaaaat 2460 gctaaaaaat ccctcaataa actttacttt tctgattaat 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220 Ser Glu Pro Trp Leu Glu Gly Trp Gly Asn Ala Phe Tyr Ser Val Leu 225 230 235 240 Gly Tyr Glu Ala Ser Lys His Ser Gly Arg Trp Ser Asn Trp Thr Gln 245 250 255 Met Lys Tyr Phe Trp Ile Tyr Asp Thr Gly Val Gly Asn Ala Val Tyr 260 265 270 Val Ile Leu Leu Lys Lys Asp Val Ser Asp Asn Pro Gly Asp Met Ala 275 280 285 Thr Gln Phe Val Thr Gly Ser Gly Gln His Pro Asp Ala Ile Asp His 290 295 300 Ile Glu Met Val Asn Glu Gly Trp Pro Tyr Trp Leu Phe Phe Tyr Gly 305 310 315 320 Gln Ser Glu Gln Asp Ile Lys Lys Leu Ala His Asp Gln Asp Ile Val 325 330 335 Arg Glu Tyr Ala Arg Asp Pro Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ile Gly Val 340 345 350 Ile Gly Trp Ala Ser Ser Asn Tyr Thr Thr Ala Gly Ser Asn Gln Asn 355 360 365 Ser Val Leu Gln Thr Pro Glu Ala Ile Gln Gly Gly Tyr Val Ala Tyr 370 375 380 Ala Gly Ser Arg Ile Pro Gly Ala Gly Ser Ile Thr Asn Leu Phe Gln 385 390 395 400 Met Gly Trp Pro Gly Asp Gln Asn Trp Pro Pro Thr Asn Gln Asp Gln 405 410 415 Thr Asn Phe Asn Trp Gly Leu Arg Gly Leu Cys Val Leu Arg Asp Asn 420 425 430 Met Lys Leu Gly Ala Gln Glu Leu Asp Asp Glu Cys Thr Met Leu Ser 435 440 445 Leu Phe Gly Pro Phe Val Glu Lys Ala Asn Thr Ala Phe Ala Thr Asn 450 455 460 Asp Pro Lys Tyr Phe Arg Pro Glu Leu Lys Asp Tyr Asn Val Val Met 465 470 475 480 Lys Tyr Ala Phe Lys Phe Gln Trp Gly Gly His Gly Thr Glu Arg Phe 485 490 495 Lys Thr Thr Ile Gly Asp Pro Ser Thr Ile Pro Cys Pro Phe Glu Pro 500 505 510 Gly Glu Arg Tyr His His Gly Val Gln Asp Pro Ala Lys Val Gln Asn 515 520 525 Thr Val Leu Asn Pro Trp Asp Tyr Asp Cys Asp Gly Ile Val Arg Thr 530 535 540 Asp Thr Leu Lys Arg Leu Leu Glu Leu Pro Thr Glu Thr Glu Glu Thr 545 550 555 560 Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Gln Lys Thr Glu Lys Glu Pro Leu 565 570 575 Ser Asp Ser Asp Glu Glu Ser Val Ile Ser Ser Thr Ser Ser Gly Ser 580 585 590 Ser Gln Glu Glu Glu Thr Gln Arg Arg Lys His His Lys Pro Ser Lys 595 600 605 Arg Arg Leu Leu Lys His Leu Gln Arg Val Val Lys Arg Met Lys Thr 610 615 620 Leu 625 <210> 16 <211> 625 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 16 Met Pro Tyr Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Thr Arg Arg 1 5 10 15 Trp Arg His Arg Arg Trp Arg Arg Phe Phe Arg Tyr Arg Tyr Arg Arg 20 25 30 Ala Pro Arg Arg Arg Arg Thr Lys Val Arg Arg Arg Arg Arg Lys Ala 35 40 45 Pro Val Ile Gln Trp Phe Pro Pro Ser Arg Arg Thr Cys Leu Ile Glu 50 55 60 Gly Phe Trp Pro Leu Ser Tyr Gly His Trp Phe Arg Thr Cys Leu Pro 65 70 75 80 Met Arg Arg Leu Asn Gly Leu Ile Phe Thr Gly Gly Gly Cys Asp Trp 85 90 95 Thr Gln Trp Ser Leu Gln Asn Leu Tyr His Glu Lys Leu Asn Trp Arg 100 105 110 Asn Ile Trp Thr Ala Ser Asn Val Gly Met Glu Phe Ala Arg Phe Leu 115 120 125 Arg Gly Lys Phe Tyr Phe Phe Arg His Pro Trp Arg Ser Tyr Ile Ile 130 135 140 Thr Trp Asp Gln Asp Ile Pro Cys Lys Pro Leu Pro Tyr Gln Asn Leu 145 150 155 160 His Pro Leu Leu Met Leu Leu Lys Lys Gln His Lys Leu Val Leu Ser 165 170 175 Gln Lys Asp Cys Asn Pro Asn Arg Arg Gln Lys Pro Val Thr Leu Lys 180 185 190 Ile Arg Pro Pro Pro Lys Leu Thr Ser Gln Trp Arg Leu Ser Arg Glu 195 200 205 Leu Ala Lys Met Pro Leu Val Arg Leu Gly Val Ser Leu Ile Asp Leu 210 215 220 Ser Glu Pro Trp Leu Glu Gly Trp Gly Asn Ala Phe Tyr Ser Val Leu 225 230 235 240 Gly Tyr Glu Ala Ser Lys His Ser Gly Arg Trp Ser Asn Trp Thr Gln 245 250 255 Ile Lys Tyr Phe Trp Ile Tyr Asp Thr Gly Val Gly Asn Ala Val Tyr 260 265 270 Val Ile Leu Leu Lys Gln Glu Val Asp Asp Asn Pro Gly Ala Met Ala 275 280 285 Thr Lys Phe Val Thr Gly Pro Gly Gln His Pro Asp Ala Ile Asp Arg 290 295 300 Ile Glu Gln Ile Asn Glu Gly Trp Pro Tyr Trp Leu Phe Phe Tyr Gly 305 310 315 320 Gln Ser Glu Gln Asp Ile Lys Lys Leu Ala His Asp Gln Glu Ile Ala 325 330 335 Arg Glu Tyr Ala Asn Asn Pro Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ile Gly Val 340 345 350 Ile Gly Trp Ala Ser Ser Asn Phe Thr Thr Ala Gly Ser Ser Gln Asn 355 360 365 Gln Thr Pro Gln Thr Pro Glu Ala Ile Gln Gly Gly Tyr Val Ala Tyr 370 375 380 Ala Gly Ser Lys Ile Gln Gly Ala Gly Ala Ile Thr Asn Leu Tyr Thr 385 390 395 400 Asp Ala Trp Pro Gly Asp Gln Asn Trp Pro Pro Leu Asn Arg Glu Gln 405 410 415 Thr Asn Phe Asn Trp Gly Leu Arg Gly Leu Cys Ile Met Arg Asp Asn 420 425 430 Met Lys Leu Gly Ala Gln Glu Leu Asp Asp Glu Cys Thr Met Leu Thr 435 440 445 Leu Phe Gly Pro Phe Val Glu Lys Ala Asn Thr Ala Phe Ala Thr Asn 450 455 460 Asp Pro Lys Tyr Phe Arg Pro Glu Leu Lys Asp Tyr Asn Ile Val Met 465 470 475 480 Lys Tyr Ala Phe Lys Phe Gln Trp Gly Gly His Gly Thr Glu Arg Phe 485 490 495 Lys Thr Thr Ile Gly Asp Pro Ser Thr Ile Pro Cys Pro Phe Glu Pro 500 505 510 Gly Glu Arg Tyr His His Gly Val Gln Asp Pro Ala Lys Val Gln Asn 515 520 525 Thr Val Leu Asn Pro Trp Asp Tyr Asp Cys Asp Gly Ile Val Arg Thr 530 535 540 Asp Thr Leu Lys Arg Leu Leu Glu Leu Pro Thr Glu Thr Glu Glu Thr 545 550 555 560 Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Gln Lys Thr Glu Lys Glu Pro Leu 565 570 575 Ser Asp Ser Asp Glu Glu Ser Val Ile Ser Ser Thr Ser Ser Gly Ser 580 585 590 Ser Gln Glu Glu Glu Thr Gln Arg Arg Arg Gln His Lys Pro Ser Lys 595 600 605 Arg Arg Leu Leu Lys His Leu Gln Arg Val Val Lys Arg Met Lys Thr 610 615 620 Leu 625 <210> 17 <211> 73 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 17 Met Lys Glu Lys Asp Tyr Trp Glu Glu Ala Trp Leu Thr Ser Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ile His Asp His His Cys Asn Cys Gly Ser Trp Arg Asp His Leu 20 25 30 Trp Thr Leu Cys Ala Leu Asp Asp Ala Asp Leu Ala Ala Ala Ala Asp 35 40 45 Ile Ile Glu Arg Glu Glu Ala Asp Gly Gly Glu Asp Phe Gly Phe Val 50 55 60 Asp Gly Asp Pro Gly Asp Ala Gly Gly 65 70 <210> 18 <211> 72 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 18 Met Pro Glu His Trp Glu Glu Ala Trp Leu Glu Ala Thr Lys Gly Trp 1 5 10 15 His Asp Leu Asp Cys Arg Cys Gly Asn Trp Gln Asp His Leu Trp Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Asp Gly Asp Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Asp Ala Ile 35 40 45 Glu Arg Asp Ala Met Gly Gly Glu Asp Val Thr Thr Ala Thr Asp Arg 50 55 60 Val Thr Ile Gly Asp Asp Gly Trp 65 70 <210> 19 <211> 68 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 19 Met Glu Glu Arg Trp Leu Thr Val Ala Tyr Cys Ala His Gly Leu Phe 1 5 10 15 Cys Asp Cys Lys Asn Pro Lys Lys His Leu Glu Lys Cys Leu Thr Asp 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Ala Glu Gly Asp Arg His Gly Asp Gly Gly Thr Gly 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Thr Phe Asp Ile Gly Ile Asp Ala Leu Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Gln Arg 65 <210> 20 <211> 68 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 20 Met Glu Glu Arg Trp Leu Thr Val Ala Tyr Cys Ala His Gly Leu Phe 1 5 10 15 Cys Gly Cys Lys Asp Pro Lys Lys His Leu Glu Lys Cys Leu Thr Asp 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Ala Glu Gly Asp Arg His Gly Asp Gly Gly Thr Gly 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Ser Phe Asp Ile Gly Ile Asp Ala Leu Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Gln Arg 65 <210> 21 <211> 174 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 21 Met Arg Phe Arg Arg Arg Arg Phe Gly Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr Arg 1 5 10 15 Lys Arg Arg Gly Gly Trp Arg Arg Arg Phe Arg Ile Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Trp Arg Arg Trp Arg Phe Gly Gly Met Tyr Gln Pro Pro Thr Gly 35 40 45 Ile Gln Asp Pro Cys Thr Ser Asn Pro Thr Tyr Pro Val Arg Met Val 50 55 60 Gly Ala Val Thr His Pro Lys Tyr Ala Gly Gln Gly Gly Ile Thr Thr 65 70 75 80 Gln Ile Gly Asp Gln Gly Ile Thr Ala Ala Ser Ile Arg Ala Ile Ser 85 90 95 Ala Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Thr Gln Ser Ala Phe Leu Lys Ala Pro 100 105 110 Glu Thr Glu Lys Glu Glu Glu Arg Glu Ser Glu Thr Ser Phe Thr Ser 115 120 125 Ala Glu Ser Ser Ser Glu Gly Asp Gly Ser Ser Asp Asp Gln Ala Glu 130 135 140 Arg Arg Ala Ala Arg Lys Arg Val Ile Lys Leu Leu Leu Lys Arg Leu 145 150 155 160 Ala Asp Arg Pro Val Asp Asn Lys Arg Arg Arg Phe Ser Glu 165 170 <210> 22 <211> 182 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 22 Met Ala Pro Thr Arg Arg Trp Arg Arg Arg Phe Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Arg Tyr Arg Lys Arg Arg Tyr Gly Trp Arg Arg Arg Tyr Tyr Arg Tyr 20 25 30 Arg Pro Arg Tyr Tyr Arg Arg Arg Trp Leu Phe Gly Gly Glu Tyr Gln 35 40 45 Pro Pro Thr Gly Ile Arg Asp Pro Cys Ile Asp Thr Pro Ala Tyr Pro 50 55 60 Val Pro Gln Ser Gly Ser Val Thr His Pro Lys Phe Ala Gly Lys Gly 65 70 75 80 Gly Met Leu Thr Glu Thr Asp Arg Trp Gly Ile Thr Ala Ala Ser Ser 85 90 95 Arg Thr Leu Ser Ala Asp Thr Pro Thr Glu Ala Ala Gln Ser Ala Leu 100 105 110 Leu Arg Gly Asp Ala Glu Lys Lys Gly Glu Glu Thr Glu Glu Thr Ala 115 120 125 Ser Ser Ser Ser Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ser Thr Glu Gly Asp Gly 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Glu Glu Thr Ile Arg Arg Arg Arg Arg Thr Trp Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Arg Met Val Arg Gln Gln Leu Asp Arg Arg Met Asp His 165 170 175 Lys Arg Gln Arg Leu His 180 <210> 23 <211> 178 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 23 Met Pro Tyr Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Thr Arg Arg 1 5 10 15 Trp Arg His Arg Arg Trp Arg Arg Tyr Phe Arg Tyr Arg Tyr Arg Arg 20 25 30 Ala Pro Arg Arg Arg Arg Pro Lys Trp Gly Gly His Gly Thr Glu Arg 35 40 45 Phe Lys Thr Thr Ile Gly Asp Pro Ser Thr Ile Pro Cys Pro Phe Glu 50 55 60 Pro Gly Glu Arg Tyr His His Gly Val Gln Asp Pro Ala Lys Val Gln 65 70 75 80 Asn Thr Val Leu Asn Pro Trp Asp Tyr Asp Cys Asp Gly Ile Val Arg 85 90 95 Thr Asp Thr Leu Lys Arg Leu Leu Glu Leu Pro Thr Glu Thr Glu Glu 100 105 110 Thr Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Gln Lys Thr Glu Lys Glu Pro 115 120 125 Leu Ser Asp Ser Asp Glu Glu Ser Val Ile Ser Ser Thr Ser Ser Gly 130 135 140 Ser Ser Gln Glu Glu Glu Thr Gln Arg Arg Lys His His Lys Pro Ser 145 150 155 160 Lys Arg Arg Leu Leu Lys His Leu Gln Arg Val Val Lys Arg Met Lys 165 170 175 Thr Leu <210> 24 <211> 178 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 24 Met Pro Tyr Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Arg Pro Thr Arg Arg 1 5 10 15 Trp Arg His Arg Arg Trp Arg Arg Phe Phe Arg Tyr Arg Tyr Arg Arg 20 25 30 Ala Pro Arg Arg Arg Arg Thr Lys Trp Gly Gly His Gly Thr Glu Arg 35 40 45 Phe Lys Thr Thr Ile Gly Asp Pro Ser Thr Ile Pro Cys Pro Phe Glu 50 55 60 Pro Gly Glu Arg Tyr His His Gly Val Gln Asp Pro Ala Lys Val Gln 65 70 75 80 Asn Thr Val Leu Asn Pro Trp Asp Tyr Asp Cys Asp Gly Ile Val Arg 85 90 95 Thr Asp Thr Leu Lys Arg Leu Leu Glu Leu Pro Thr Glu Thr Glu Glu 100 105 110 Thr Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Leu Gly Gln Lys Thr Glu Lys Glu Pro 115 120 125 Leu Ser Asp Ser Asp Glu Glu Ser Val Ile Ser Ser Thr Ser Ser Gly 130 135 140 Ser Ser Gln Glu Glu Glu Thr Gln Arg Arg Arg Gln His Lys Pro Ser 145 150 155 160 Lys Arg Arg Leu Leu Lys His Leu Gln Arg Val Val Lys Arg Met Lys 165 170 175 Thr Leu <210> 25 <211> 224 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 25 Met Lys Glu Lys Asp Tyr Trp Glu Glu Ala Trp Leu Thr Ser Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ile His Asp His His Cys Asn Cys Gly Ser Trp Arg Asp His Leu 20 25 30 Trp Thr Leu Cys Ala Leu Asp Asp Ala Asp Leu Ala Ala Ala Ala Asp 35 40 45 Ile Ile Glu Arg Glu Glu Ala Asp Gly Gly Glu Asp Phe Gly Phe Val 50 55 60 Asp Gly Asp Pro Gly Asp Ala Gly Gly Ser Ala Ala Cys Thr Ser Leu 65 70 75 80 Pro Pro Glu Ser Lys Ile Pro Ala Leu Leu Thr Arg Pro Ile Leu Ser 85 90 95 Glu Trp Ser Glu Gln Leu His Thr Pro Asn Thr Pro Gly Lys Ala Glu 100 105 110 Ser Arg Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Ser Pro Leu Pro Leu Ser Val 115 120 125 Pro Ser Val Gln Leu His Gln Ile Pro Thr Arg Ser Arg Arg Ser Ser 130 135 140 Lys Pro Arg Lys Pro Arg Lys Lys Arg Lys Glu Arg Val Arg Pro Val 145 150 155 160 Ser Arg Val Pro Lys Ala Leu Leu Arg Glu Met Asp Arg Leu Met Thr 165 170 175 Lys Gln Arg Asp Ala Leu Pro Glu Ser Glu Ser Ser Ser Tyr Phe Ser 180 185 190 Ser Asp Ser Leu Thr Asp Pro Trp Thr Thr Ser Asp Asp Asp Phe Gln 195 200 205 Ser Asp Pro Asp Pro Leu Thr Asn Lys Arg Lys Lys Arg Leu Gln Phe 210 215 220 <210> 26 <211> 228 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 26 Met Pro Glu His Trp Glu Glu Ala Trp Leu Glu Ala Thr Lys Gly Trp 1 5 10 15 His Asp Leu Asp Cys Arg Cys Gly Asn Trp Gln Asp His Leu Trp Leu 20 25 30 Leu Leu Ala Asp Gly Asp Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Asp Ala Ile 35 40 45 Glu Arg Asp Ala Met Gly Gly Glu Asp Val Thr Thr Ala Thr Asp Arg 50 55 60 Val Thr Ile Gly Asp Asp Gly Cys Leu Ala Val Asn Thr Ser His Gln 65 70 75 80 Gln Val Ser Ala Ile Pro Ala Leu Ile His Gln Pro Ile Leu Cys Arg 85 90 95 Ser Gln Glu Val Leu His Thr Pro Asn Ser Pro Glu Arg Ala Glu Cys 100 105 110 Ser Arg Lys Gln Thr Val Gly Val Ser Leu Leu Pro Leu Pro Glu Pro 115 120 125 Ser Val Gln Ile His Pro Pro Lys Gln Arg Lys Val His Phe Ser Glu 130 135 140 Gly Thr Arg Lys Arg Lys Glu Arg Lys Pro Arg Lys Pro Arg His Arg 145 150 155 160 Pro Val Ser Arg Val Pro Lys Ala Leu Leu Arg Glu Met Asp Arg Leu 165 170 175 Met Met Lys Arg Gln Ser Asp Ala Glu Gly Gly Pro Gly Ser Asp Ser 180 185 190 Asp Gly Trp Ser Asp Ser Ser Leu Thr Asp Glu Trp Thr Thr Ser Asp 195 200 205 Ser Asp Phe Ile Asp Thr Pro Ile Arg Glu Arg Cys Leu Asn Lys Lys 210 215 220 Gln Lys Lys Arg 225 <210> 27 <211> 199 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 27 Met Glu Glu Arg Trp Leu Thr Val Ala Tyr Cys Ala His Gly Leu Phe 1 5 10 15 Cys Asp Cys Lys Asn Pro Lys Lys His Leu Glu Lys Cys Leu Thr Asp 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Ala Glu Gly Asp Arg His Gly Asp Gly Gly Thr Gly 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Thr Phe Asp Ile Gly Ile Asp Ala Leu Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Gln Ser Gly Glu Asp Met Ala Pro Lys Asp Leu Lys Gln Pro 65 70 75 80 Ser Glu Ile Pro Ala Pro Tyr His Val Pro Leu Asn Pro Gly Asn Gly 85 90 95 Thr Thr Thr Gly Tyr Lys Thr Pro Pro Arg Tyr Lys Thr Gln Ser Ser 100 105 110 Thr Leu Gly Thr Met Thr Val Thr Gly Leu Leu Glu Gln Ile Leu Ser 115 120 125 Lys Asp Phe Ser Asn Ser Pro Gln Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 130 135 140 Thr His Ser Leu Asp Lys Lys Gln Arg Lys Ser His Tyr Gln Thr Pro 145 150 155 160 Thr Lys Arg Ala Leu Ser Gln Ala Arg Ala Val Asp Pro Leu Lys Lys 165 170 175 Lys Arg Arg Arg Asp Glu Ser Thr Thr Ser Gln Ala Ser Asp Asp Ser 180 185 190 Ser Ser Thr Ser Ser Gly Trp 195 <210> 28 <211> 199 <212> PRT <213> Torque teno virus <400> 28 Met Glu Glu Arg Trp Leu Thr Val Ala Tyr Cys Ala His Gly Leu Phe 1 5 10 15 Cys Gly Cys Lys Asp Pro Lys Lys His Leu Glu Lys Cys Leu Thr Asp 20 25 30 Ala Ile Ala Asp Ala Glu Gly Asp Arg His Gly Asp Gly Gly Thr Gly 35 40 45 Gly Gly Asp Ala Ser Phe Asp Ile Gly Ile Asp Ala Leu Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Gln Ser Gly Glu Ala Thr Glu Pro Lys Asp Ser Lys Gln Pro 65 70 75 80 Ser Glu Ile Pro Ala Pro Tyr His Val Pro Leu Asn Pro Gly Asn Gly 85 90 95 Thr Thr Thr Gly Tyr Lys Thr Pro Pro Arg Tyr Lys Thr Gln Ser Ser 100 105 110 Thr Leu Gly Thr Met Thr Val Thr Gly Leu Leu Glu Gln Ile Leu Ser 115 120 125 Lys Asp Phe Ser Asn Ser Pro Gln Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 130 135 140 Thr His Ser Leu Asp Lys Lys Gln Arg Lys Ser His Tyr Gln Thr Pro 145 150 155 160 Thr Lys Arg Ala Leu Ser Gln Ala Arg Ala Val Asp Pro Leu Lys Lys 165 170 175 Lys Arg Arg Arg Glu Glu Asp Ser Thr Ser Gln Ala Ser Asp Asp Ser 180 185 190 Ser Ser Thr Ser Ser Gly Trp 195 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 29 tccgaatggc tgagtttatg c 21 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 30 tccgctcagc tgctcct 17 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 31 ggtggtaaag aggatgaa 18 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 32 aatagattgg acacaggag 19 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 33 tatcgggcag gagcagct 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 34 taggggcgcg ctctacgt 18 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 35 cctacatgaa ggagaaagac t 21 <210> 36 <211> 17 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 36 ccagcgtctc cagggtc 17 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 37 aagctaccaa gggctgg 17 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 38 gcggtctggt agcggtagt 19 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 39 cgaatggctg agtttatgcc gc 22 <210> 40 <211> 11 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 40 agtcctcatt t 11 <210> 41 <211> 11 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 41 aaccaatcag a 11 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 42 ctgggcgggt gccggag 17 <210> 43 <211> 14 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 43 cggagtcaag gggc 14 <210> 44 <211> 11 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 44 tatcgggcag g 11 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 45 tacacttccg ggttcaggag gct 23 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 46 actcagccat tcggaacctc ac 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 47 caatttggct cgcttcgctc gc 22 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 48 tacttatatt cgctttcgtg ggaac 25 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 49 agttacacat aaccaccaaa cc 22 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 50 attaccgcct gcccgatagg c 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 51 ccaaaccaca ggaaactgtg c 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Torque teno virus <400> 52 cttgactccg ctctcaggag 20

Claims (66)

  1. PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 85% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는, 감염성 돼지 토크 테노 바이러스 (porcine Torque teno virus: PTTV) 를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 돼지 토크 테노 바이러스 (porcine Torque teno virus: PTTV) 의 감염성 핵산 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본인 감염성 핵산 분자.
  3. 제 1 항에 있어서, 게놈 서열이 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 및 SEQ ID NO:12 에 언급된 서열로부터 선택되는 감염성 핵산 분자.
  4. 제 3 항에 따른 감염성 핵산 분자를 함유하는 생물학적으로 기능성인 플라스미드 또는 바이러스 벡터.
  5. 제 4 항에 있어서, 감염성 핵산 분자의 하나 초과의 복사본을 함유하는 생물학적으로 기능성인 플라스미드 또는 바이러스 벡터.
  6. 제 4 항에 따른 감염성 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 트랜스펙션된 적합한 숙주 세포.
  7. 제 6 항에 따른 감염성 핵산 분자를 함유하는 세포에 의해 생성된 무독력, 감염성 PTTV.
  8. 무독성, 생리학적으로 허용가능한 담체 및 면역원성 양의, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 멤버를 포함하는 백신:
    (a) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA, 또는 이의 상보성 가닥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는 핵산 분자;
    (b) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA, 또는 이의 상보성 가닥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열의 하나 이상의 복사본을 함유하는 핵산 분자를 함유하는 생물학적으로 기능성인 플라스미드 또는 바이러스 벡터;
    (c) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 로 이루어진 군으로부터 선택되는 게놈 서열과 85% 이상의 상동성을 갖는 게놈 서열을 함유하고 이로부터 유래되는, 무독력, 감염성 비병원성 돼지 토크 테노 바이러스; 및
    (d) PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 번역된 폴리펩티드 서열 또는 완전한 단백질의 면역원성 절편.
  9. 제 8 항에 있어서, 생 PTTV 바이러스를 함유하는 백신.
  10. 제 8 항에 있어서, 치사 PTTV 바이러스를 함유하는 백신.
  11. 제 8 항에 있어서, 정제된 박테리아 발현된 또는 배큘로바이러스-발현된 재조합 단백질을 포함하는 폴리펩티드 서열 또는 완전한 단백질의 면역원성 절편이 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1 및 ORF2/2 로부터 발현된 백신.
  12. 제 11 항에 있어서, 정제된 박테리아 발현된 또는 배큘로바이러스-발현된 재조합 단백질을 포함하는 폴리펩티드 서열 또는 완전한 단백질의 면역원성 절편이 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1 로부터 발현된 백신.
  13. 제 8 항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 함유하는 백신.
  14. 돼지에게 면역학적으로 유효한 양의 제 8 항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, PTTV 바이러스 감염에 대항하여 돼지를 면역화하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 백신을 비경구로, 비강내로, 피부내로, 또는 경피로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 백신을 림프구내로 또는 근육내로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  17. SEQ ID NO:9 에 언급된 PTTV1a-VA 의 뉴클레오티드 서열과 85% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
  18. 제 17 항에 있어서, SEQ ID NO:9 에 언급된 PTTV1a-VA 의 뉴클레오티드 서열과 95% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제 17 항에 있어서, SEQ ID NO:9 에 언급된 PTTV1a-VA 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  20. SEQ ID NO:10 에 언급된 PTTV1b-VA 의 뉴클레오티드 서열과 85% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:10 에 언급된 PTTV1b-VA 의 뉴클레오티드 서열과 95% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:10 에 언급된 PTTV1b-VA 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. SEQ ID NO:11 에 언급된 PTTV2b-VA 의 뉴클레오티드 서열과 85% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:11 에 언급된 PTTV2b-VA 의 뉴클레오티드 서열과 95% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:11 에 언급된 PTTV2b-VA 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. SEQ ID NO:12 에 언급된 PTTV2c-VA 의 뉴클레오티드 서열과 85% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
  27. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:12 에 언급된 PTTV2c-VA 의 뉴클레오티드 서열과 95% 상동성을 갖는 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  28. 제 23 항에 있어서, SEQ ID NO:12 에 언급된 PTTV2c-VA 의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리 핵산 서열인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  29. PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 번역된 폴리펩티드 서열 또는 완전한 단백질의 면역원성 절편을 포함하는 백신.
  30. 제 29 항에 있어서, 면역원성 절편 또는 완전한 단백질이 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 캡시드 단백질인 백신.
  31. 제 29 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신.
  32. 제 31 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 유전자형 PTTV1a-VA 의 ORF1 인 백신.
  33. 제 31 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 유전자형 PTTV1b-VA 의 ORF1 인 백신.
  34. 제 31 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 서브유형 PTTV2c-VA 의 ORF1 인 백신.
  35. 제 29 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, 및 SEQ ID No:28 에 언급된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신.
  36. 제 35 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:13 에 언급되는 백신.
  37. 제 36 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:13 의 C-말단 영역 (aa 317-635) 인 백신.
  38. 제 35 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:14 에 언급되는 백신.
  39. 제 38 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:14 의 C-말단 영역 (aa 322-639) 인 백신.
  40. 제 35 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:16 에 언급되는 백신.
  41. 제 40 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:16 의 C-말단 영역 (aa 310-625) 인 백신.
  42. 제 35 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:20 에 언급되는 백신.
  43. 제 29 항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 함유하는 백신.
  44. 돼지에게 면역학적으로 유효한 양의 제 29 항에 따른 백신을 투여하는 것을 포함하는, PTTV 바이러스 감염에 대항하여 돼지를 면역화하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 면역원성 절편 또는 완전한 단백질을 돼지에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제 44 항에 있어서, 백신을 비경구로, 비강내로, 피부내로, 또는 경피로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제 44 항에 있어서, 백신을 림프구내로 또는 근육내로 돼지에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  48. 하기 단계를 포함하는, PTTV1 감염의 진단 및 PTTV1 로딩량의 정량을 위한 방법:
    PTTV1 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계;
    SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:30 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; 및
    PTTV1 특이적 증폭을 검출하는 단계.
  49. 제 48 항에 있어서, 폴리머라아제 연쇄 반응이 SYBR 그린 실시간 PCR 인 방법.
  50. 하기 단계를 포함하는, PTTV2 감염의 진단 및 PTTV2 로딩량의 정량을 위한 방법:
    PTTV2 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계;
    SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; 및
    PTTV2 특이적 증폭을 검출하는 단계.
  51. 제 50 항에 있어서, 폴리머라아제 연쇄 반응이 SYBR 그린 실시간 PCR 인 방법.
  52. 하기 단계를 포함하는, PTTV1 및 PTTV2 감염을 동시에 검출 및 진단하기 위한 방법:
    PTTV 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계;
    SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계; 및
    PTTV1 및 PTTV2 특이적 증폭을 검출하는 단계.
  53. 제 52 항에 있어서, 폴리머라아제 연쇄 반응이 SYBR 그린 실시간 PCR 인 방법.
  54. 하기 단계를 포함하는, PTTV1a 및 PTTV1b 감염을 동시에 검출 및 진단하기 위한 방법:
    PTTV1 감염이 의심되는 샘플로부터 DNA 를 추출하는 단계;
    SEQ ID NO:33 및 SEQ ID NO:34 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 1 차 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 수행하는 단계;
    SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, 및 SEQ ID NO:38 에 언급된 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 2 차 PCR 을 수행하는 단계; 및
    PTTV1a 및 PTTV1b 특이적 증폭을 검출하는 단계.
  55. 하기 단계를 포함하는, PTTV 감염을 진단하기 위한 방법:
    PTTV 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1, ORF2, ORF1/1, 및 ORF2/2 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열에 따라 번역된 폴리펩티드 서열의 면역원성 절편 또는 완전한 단백질을 부동화시키는 단계;
    PTTV 감염이 의심되는 돼지로부터의 혈청 샘플을 부동화된 면역원성 절편 또는 완전한 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    면역원성 절편에 특이적인 포획된 항체를 검출하는 단계.
  56. 제 55 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 유전자형 또는 서브유형 PTTV1a-VA, PTTV1b-VA, PTTV2b-VA, 및 PTTV2c-VA 의 ORF1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 유전자형 PTTV1a-VA 의 ORF1 인 백신.
  58. 제 56 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 유전자형 PTTV1b-VA 의 ORF1 인 방법.
  59. 제 56 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 서열이 PTTV 서브유형 PTTV2c-VA 의 ORF1 인 방법.
  60. 제 55 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:13, SEQ ID No:14, SEQ ID No:15, SEQ ID No:16, SEQ ID No:17, SEQ ID No:18, SEQ ID No:19, SEQ ID No:20, SEQ ID No:21, SEQ ID No:22, SEQ ID No:23, SEQ ID No:24, SEQ ID No:25, SEQ ID No:26, SEQ ID No:27, 및 SEQ ID No:28 에 언급된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:13 에 언급되는 방법.
  62. 제 60 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:16 에 언급되는 백신.
  63. 제 62 항에 있어서, 면역원성 절편이 SEQ ID No:13 의 C-말단 영역 (aa 317-635), SEQ ID No:14 의 C-말단 영역 (aa 322-639), 또는 SEQ ID No:16 의 C-말단 영역 (aa 310-625) 인 백신.
  64. 제 60 항에 있어서, 폴리펩티드 서열이 SEQ ID No:20 에 언급되는 백신.
  65. 제 55 항에 있어서, 포획된 항체의 검출을 웨스턴 블롯을 통해 수행하는 방법.
  66. 제 55 항에 있어서, 포획된 항체의 검출을 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 를 통해 수행하는 방법.
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