JP2019510497A - Rsvに対するワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
塩基性RSV F配列をコードするプラスミドを合成し、部位特異的変異誘発によりアミノ酸置換をタンパク質に導入した。タンパク質変異体を、HEK293細胞内で一時的に発現させた。細胞表面上の相対的なタンパク質発現を、フローサイトメトリーによって評価した。融合前コンフォメーションでのFタンパク質の安定性を、熱安定性アッセイで評価した。
供給業者の推奨に従って293fectine(カタログ番号12347−019)トランスフェクション試薬(Life Technologies)を使用し、接着性HEK293T細胞にプラスミドを一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、EDTA含有FACS緩衝液(トリプシン含まず、次の節を参照)で剥離することによって細胞を回収し、温度安定性実験のために、水浴またはPCRブロックで10分間、細胞懸濁液を熱処理した。熱処理後、細胞をフローサイトメトリー分析のために調製した。
それぞれの染色には、以下の対照を含めた:1)陰性対照試料。すなわち、いかなる処理にも供されず、フルオロフォアで標識されたいかなる抗体でも染色されなかった細胞;2)陽性対照試料、すなわち、1つのフルオロフォア(実験のために使用されるものの1つ)でのみ染色された細胞。
完全長Fタンパク質変異体の表面細胞発現:
融合前コンフォメーションのRSV Fタンパク質外部ドメインの発現または安定性を増加させることが以前に同定された変異のサブセットを、野生型完全長RSV A2 F配列(アクセッション番号Genbank ACO83301)に導入した。変異を単独で、または複数の組み合わせで導入し、タンパク質の発現および安定性に対する効果を評価した。
短時間スケールの周囲条件では、安定化変異の異なる組み合わせを有する完全長F変異体間で、融合前コンフォメーションの安定性に有意差は観察されなかった。温度を上げることは、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへとRSV Fタンパク質をリフォールディングするための効率的なインビトロトリガーとして働くことが知られている。したがって、熱ショックアッセイを確立し、膜結合完全長タンパク質の安定性を評価するために使用した。簡単に言えば、HEK293T細胞をFタンパク質コンストラクトでトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後にアッセイで使用した。細胞を細胞培養皿から剥離し、細胞懸濁液を、温度を上げながら10分間熱処理した。熱処理後、細胞を抗RSV F抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーデータを2つの異なる方法で分析した。抗F抗体による染色に対して陽性である細胞のパーセンテージを分析し、陽性細胞の平均蛍光強度(MFI)も計算した(図5)。
Ad35およびAd26のE1領域へのRSV F遺伝子のクローニング:
本発明の融合前Fタンパク質をコードする核酸配列は、Geneartにより、ヒトでの発現のために遺伝子が最適化され、合成された。コザック配列(5’GCCACC3’)をATG開始コドンの直前に含め、2つの停止コドン(5’TGA TAA3’)をRSV.pre−Fコード配列の終端に付加した。RSV.pre−F遺伝子を、HindIIIおよびXbaI部位を介して、pAdApt35BSUプラスミドおよびpAdApt26プラスミドに挿入した。
PER.C6細胞を、10mM MgCl2を添加した、10%ウシ胎児血清(FBS)含有ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で維持した。
全てのアデノウイルスを、PER.C6(登録商標)細胞中で、単一の相同組換えにより生成し、以前に報告されているように生成した(rAd35では:Havenga et al.,2006,J.Gen.Virol.87:2135−2143;rAd26では:Abbink et al.,2007,J.Virol.81:4654−4663)。簡単に記すと、PER.C6細胞に、製造業者(Life Technologies)が提供する説明書に従い、リポフェクタミンを使用して、Adベクタープラスミドをトランスフェクトした。例えば、RSV.pre−F導入遺伝子発現カセットを有するAd35ベクターのレスキューでは、pAdApt35BSU.RSV.pre−FプラスミドおよびpWE/Ad35.pIX−rITR.dE3.5orf6コスミドを使用し、RSV.pre−F導入遺伝子発現カセットを有するAd26ベクターでは、pAdApt26.RSV.pre−FプラスミドおよびpWE.Ad26.dE3.5orf6.コスミドを使用した。細胞を、完全なCPEの1日後に回収し、凍結融解し、3,000rpmで5分間遠心分離し、−20℃で保存した。次に、ウイルスをプラーク精製し、マルチウェル24組織培養プレートの単一ウェル上で培養したPER.C6中で増幅させた。T25組織培養フラスコおよびT175組織培養フラスコを使用して培養したPER.C6中でさらに増幅させた。T175粗溶解物のうちの3〜5mlを使用して、70%コンフルエント層のPER.C6細胞を含有する20×T175三層組織培養フラスコに接種した。ウイルスを、2段階CsCl精製法を使用して精製した。最終的に、ウイルスを一定分量に分割して−85℃で保存した。
Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2.2の免疫原性をマウスで評価し、細胞性および体液性免疫応答を、同一用量のAd26.RSV.FA2(すなわち、野生型RSV Fタンパク質を発現)によって誘導される応答と比較した。Balb/cマウス(1群当たりn=4)を、108〜1010個のウイルス粒子(vp)、Ad26.RSV.FA2またはAd26.RSV.preF2.1またはAd26.RSV.preF2.2の示された用量で、または製剤緩衝液で免疫を付与した。初回免疫から8週後に、ELISpotを用い、106脾細胞当たりRSV F A2特異的IFNγスポット形成単位(SFU)数を決定した。Ad26.RSV.FA2と比較すると、Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2.2では、広い中和能を有し、かつ細胞応答を維持しながらマウスの体液性免疫応答の誘導が増加することが示された。Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2.2による単回筋肉内免疫付与は、IFNγ、IL2および/またはTNFαに対して陽性のCD8+T細胞の誘導によって特徴付けられる(データは示さず)細胞応答を誘発した(図7)。
配列番号1:RSV preF2.1アミノ酸配列:
配列番号2:RSV preF2.2アミノ酸配列:
配列番号3:RSV F pre−F2.1融合前タンパク質PreF2.1をコードするコドン最適化核酸
配列番号4:RSV F pre−F2.2融合前タンパク質PreF2.2をコードするコドン最適化核酸
Claims (17)
- 融合前コンフォメーションで安定化されるRSV Fタンパク質(融合前RSV Fタンパク質)をコードする核酸分子であって、前記RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む核酸分子。
- 前記融合前RSV Fタンパク質をコードする前記核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている請求項1に記載の核酸分子。
- 前記融合前RSV Fタンパク質をコードする前記核酸は、配列番号3または4の核酸配列を含む請求項1または2に記載の核酸分子。
- 請求項1、2または3に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターはヒト組換えアデノウイルスである請求項4に記載のベクター。
- 前記組換えヒトアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのE1領域中の欠失、E3領域中の欠失、またはE1およびE3の両領域中の欠失を有している請求項5に記載のベクター。
- 前記アデノウイルスがセロタイプ26または35のアデノウイルスである請求項5または6に記載のベクター。
- 前記組換えアデノウイルスは、その5’末端に配列CTATCTATを含むゲノムを有する請求項5、6または7に記載のベクター。
- 請求項1、2または3に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
- 請求項5〜8のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物。
- 対象にRSVに対するワクチンを接種する方法であって、前記対象に請求項9または10に記載の組成物を投与することを含む方法。
- 前記対象にRSV Fタンパク質を投与することをさらに含む請求項11に記載の方法。
- 対象におけるRSVの感染および/または複製を減少させる方法であって、前記対象に、請求項1、2または3に記載の融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組成物を投与することを含む方法。
- 対象におけるRSVの感染および/または複製を減少させる方法であって、前記対象に、請求項5〜8のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物を投与することを含む方法。
- 請求項1、2または3に記載の融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む単離宿主細胞。
- 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対するワクチンを作製する方法であって、融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトアデノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させる工程と、前記組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、前記組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、前記融合前RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む方法。
- 融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、組換えヒトアデノウイルスのゲノムを形成する単離組換え核酸であって、前記融合前RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む単離核酸。
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