JP2023029889A - Rsvに対するワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
関する。
と考えられている気道の伝染性が高い小児病原体である。2歳未満の小児では、RSVは
呼吸器感染症による入院の約50%を占め、入院のピークは月齢2~4ヶ月で生じる。ほ
とんど全ての小児が2歳までにRSV感染を経験し、生涯にわたる反復感染は自然免疫の
低さに起因すると報告されている。高齢者では、RSV疾患の負担は、一般的なインフル
エンザA感染によって引き起こされるものと類似している。現在、RSV感染に対するワ
クチンは入手できないが、疾患による高い負担のために要望されている。
ウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるRSV糖タンパク質(
G)およびRSV融合(F)タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパ
ク質をコードする。
ことで、広く中和抗体を誘発することができる魅力的なワクチン候補となっている。Fタ
ンパク質は膜貫通タンパク質であり、ウイルスの出芽中に細胞膜からビリオン膜に取り込
まれる。RSV Fタンパク質は、ウイルス膜と宿主細胞膜とを融合させることによって
感染を促進する。融合プロセスにおいて、Fタンパク質は、不安定な融合前コンフォメー
ションから安定な融合後コンフォメーションに不可逆的にリフォールディングする。タン
パク質前駆体F0は、細胞内成熟の間にフーリン様プロテアーゼによって切断される必要
がある。2つのフーリン部位があり、その切断によりp27ペプチドが除去され、2つの
ドメイン、N末端F2ドメインおよびC末端F1ドメインが形成される(図1)。F2お
よびF1ドメインは、2つのシスチン架橋によって結合される。融合タンパク質に対する
抗体は、細胞へのウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用を有す
る。中和抗体の標的であることに加えて、RSV Fは、細胞傷害性T細胞エピトープを
含む(Pemberton et al,1987,J.Gen.Virol.68:2
177-2182)。
い。ワクチン開発の大きな障害の1つは、1960年代の臨床試験において、ホルマリン
不活化(FI)RSVワクチンによる、疾患のワクチン増強があったことが受け継がれて
いることである。FI-RSVワクチン接種を受けた小児は、自然感染から防御されず、
感染した小児は、ワクチン接種を受けなかった小児よりも、2人の死亡を含む重篤な病気
を経験した。この現象は「疾患の増強」と呼ばれる。
ーチが追求されてきた。試みには、RSVの古典的生弱毒化低温継代株または温度感受性
変異株、(キメラ)タンパク質サブユニットワクチン、ペプチドワクチン、およびアデノ
ウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターから発現されるRSVタンパク質が含ま
れる。これらのワクチンのいくつかは、有望な前臨床データを示したが、安全性の懸念ま
たは有効性の欠如により、いずれのワクチンもヒトへの使用に対しては認可されなかった
。
をもたらさないワクチンの必要性が依然として存在する。本発明は、RSVに対するその
ようなワクチン、および安全にかつ効果的にワクチン接種するための方法を提供すること
を目的とする。
SV融合前Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む核酸分子を提供する
。
おける発現のためにコドン最適化されている。
または4の核酸配列を含む。
RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含むベクターをさらに提供
する。
ルスである。
中の欠失、E3領域中の欠失、またはE1およびE3の両方の領域中の欠失を有している
。
を含むゲノムを有する。
ウイルス(RSV)に対するワクチンを提供する。
物を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
ンパク質(好ましくは、医薬組成物として製剤化されたもの、したがってタンパク質ワク
チン)を対象に投与することをさらに含む。
低減する方法であって、本発明による核酸またはベクターを含む組成物をその対象に投与
することを含む方法を提供する。これは、対象のRSV感染から生じる悪影響を軽減し、
したがって、組成物の投与により、そのような悪影響から対象を防御することに寄与する
であろう。特定の実施形態では、RSV感染の悪影響を基本的に予防することができる、
すなわち、臨床的に重要でないほどの低レベルに低減することができる。
あって、RSV融合前Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む宿主細胞
を提供する。特定の実施形態では、RSV融合前Fタンパク質をコードする核酸分子は、
配列番号3または4の核酸配列を含む。
あって、RSV融合前Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトア
デノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖
させる工程と、組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、組換えアデノウイル
スを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、RSV融合前Fタンパク質は
配列番号1または2のアミノ酸配列を含む方法を提供する。特定の実施形態では、組換え
アデノウイルスはセロタイプ26または35のアデノウイルスである。
ンは、既に、国際公開第2013/139911号パンフレットおよび国際公開第201
3/139916号パンフレットで報告されている。その中で、RSV Fタンパク質を
コードする核酸を含むセロタイプ26または35の組換えアデノウイルスは、十分に確立
されたコットンラットモデルにおいてRSVに対して非常に有効なワクチンであり、RS
V Fタンパク質をコードするAd5について先に報告されたデータと比較して、改善さ
れた効力を有することが示された。RSV FをコードするAd26またはAd35の単
回投与でも、筋肉内投与でも、チャレンジRSVの複製を完全に防御するのに十分である
ことが実証された。
未成熟のままより安定な融合後コンフォメーションへとリフォールドする傾向を有する。
この現象は、溶液中およびビリオン表面上のいずれの場合にも現れるタンパク質に固有の
特徴である。しかしながら、ヒト血清では、大部分のRSV中和抗体は、融合前コンフォ
メーションのRSV Fに向かう。したがって、本発明を導いた研究では、RSV Fタ
ンパク質を完全長タンパク質状態で融合前コンフォメーションに安定化する改変がいかな
るものかを明らかにする努力がなされた。
については、既に国際公開第2014/174018号パンフレットおよび国際公開第2
014/202570号パンフレットで報告されている。本発明による核酸分子は、変異
の特有かつ特定のサブセットを含むRSV Fタンパク質をコードする。本発明によれば
、本発明の変異のこの特有の組み合わせが、RSV Fタンパク質発現レベルの増加およ
び融合前コンフォメーションのRSV Fタンパク質の安定性をもたらすことが示された
。さらに、本発明による核酸分子が、融合前コンフォメーションで安定化され、かつ、野
生型RSV Fタンパク質(国際公開第2013/139911号パンフレットおよび国
際公開第2013/139916号パンフレットで開示されているもの)と比較してより
高い力価の中和抗体を誘導する、RSV Fタンパク質をコードすることが示された。
RSV融合前Fタンパク質、またはRSV pre-Fタンパク質)をコードする新規の
核酸分子であって、RSV pre-Fタンパク質が配列番号1または2のアミノ酸配列
を含む核酸分子を提供する。
タンパク質をコードする。
ポリヌクレオチドという用語は、同義で使用され、いずれも、DNAおよびRNAを含む
ヌクレオチドから作られる線状生体高分子(鎖)を指す。
ドし得ることは、当業者に理解されている。また、当業者がルーチンの手法を用いて、記
述されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌク
レオチド置換を行って、ポリペプチドが発現する任意の特定の宿主生物のコドン使用を反
映し得ることも理解されている。したがって、特記されない限り、「アミノ酸配列をコー
ドする核酸配列」には、互いの縮重型であり、かつ同じアミノ酸配列をコードする全ての
ヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質をコード化するヌクレオチド配列およびRNA
は、イントロンを含み得る。本明細書の配列は、当該技術分野における慣習として、5’
から3’の方向に示される。
Fの断片をコードする
は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適
化の方法は知られており、既に報告されている(例えば、国際公開第96/09378号
パンフレット)。
の核酸配列を含む。特定の実施形態では、RSV Fタンパク質をコードする核酸は、配
列番号4の核酸配列を含む。
の核酸配列からなる。
および/または内部が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、完全長RSV Fタンパ
ク質配列、例えば、配列番号1または2のRSV Fタンパク質配列中の対応する位置と
同一であるペプチドを指す。免疫応答を誘導するためには、さらに一般的には、ワクチン
接種の目的のためには、タンパク質は、完全長である必要も、その野生型の機能を全て有
する必要がなく、タンパク質の断片も同等に有用であることは、理解されよう。当業者は
、例えばルーチンの分子生物学的手順を用いて、例えばアミノ酸置換、欠失、付加などに
よりタンパク質を変化させることができることも理解するであろう。一般に、ポリペプチ
ドの機能または免疫原性を喪失させることなく、保存的アミノ酸置換を適用することがで
きる。これは当業者によく知られたルーチンの手順に従って調べることができる。
をコードする核酸分子を含むベクターに関する。
の核酸分子の発現をもたらすことができるものであれば、いかなるベクターであってもよ
い。ベクターの選択は、通常、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依
存する。
換えアデノウイルスである。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野でよ
く知られている。本明細書で使用される、アデノウイルスに関する用語「組換え」は、ア
デノウイルスが人為的に改変されていること、例えば、その中に能動的にクローン化され
た改変末端を有し、かつ/または異種遺伝子を含む、すなわち、天然に存在する野生型ア
デノウイルスではないことを含意する。
アデノウイルスゲノムのE1領域、例えばE1a領域および/またはE1b領域の少なく
とも1つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウ
イルスベクターは、非必須E3領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態で
は、ベクターは、E1領域の少なくとも1つの必須遺伝子機能と、非必須E3領域の少な
くとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これは
アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの2つ以上の領域のそれぞれにおいて、
1つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のE1-欠損ま
たはE1-、E3-欠損アデノウイルスベクターは、E4領域の少なくとも1つの必須遺
伝子、および/またはE2領域の少なくとも1つの必須遺伝子(例えば、E2A領域およ
び/またはE2B領域)がさらに欠損していてよい。
られており、例えば、米国特許第5,559,099号明細書、同第5,837,511
号明細書、同第5,846,782号明細書、同第5,851,806号明細書、同第5
,994,106号明細書、同第5,994,128号明細書、同第5,965,541
号明細書、同第5,981,225号明細書、同第6,040,174号明細書、同第6
,020,191号明細書および同第6,113,913号明細書、それぞれVirol
ogy,B.N.Fields et al.,eds.,3d ed.,Raven
Press,Ltd.,New York(1996)の67および68章に収録のTh
omas Shenk,“Adenoviridae and their Repli
cation”およびM.S.Horwitz,“Adenoviruses”、ならび
に本明細書で言及している他の参考文献に記載されている。一般的には、アデノウイルス
ベクターの構築は、例えば、Sambrook et al.,Molecular C
loning,a Laboratory Manual,2d ed.,Cold S
pring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.
Y.(1989)、Watson et al.,Recombinant DNA,2
d ed.,Scientific American Books(1992),およ
びAusubel et al.,Current Protocols in Mol
ecular Biology,Wiley Interscience Publis
hers,NY(1995)、ならびに本明細書で言及している他の参考文献に記載され
ているものなどの、標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
スである。これらのセロタイプに基づく本発明のワクチンは、先行技術に記載されている
、Ad5に基づいたものより強力であると思われる。というのも、これらは単回筋肉内投
与後にRSVチャレンジの複製に対する完全な防御を提供できなかったからである(Ki
m et al,2010,Vaccine 28:3801-3808;Kohlma
nn et al,2009,J Virol 83:12601-12610;Kra
use et al,2011,Virology Journal 8:375)。本
発明のセロタイプは、一般に、ヒト集団において低い血清陽性率、および/または低い既
存の中和抗体力価をさらに有する。異なる導入遺伝子を有する、これらのセロタイプの組
換えアデノウイルスベクターは、臨床試験において評価されており、これまでのところ、
卓越した安全性プロファイルを有することが示されている。rAd26ベクターの調製は
、例えば、国際公開第2007/104792号パンフレットおよびAbbink et
al.,(2007)Virol 81(9):4654-63に記載されている。A
d26のゲノム配列の例は、GenBankアクセッション番号EF153474および
国際公開第2007/104792号パンフレットの配列番号1の中に見出される。rA
d35ベクターの調製については、例えば、米国特許第7,270,811号明細書、国
際公開第00/70071号パンフレット、およびVogels et al.,(20
03)J Virol 77(15):8263-71に記載されている。Ad35のゲ
ノム配列の例は、GenBankアクセッション番号AC_000019、および国際公
開第00/70071号パンフレットの図6の中に見出される。
特定の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例えば、これはこのアデノウイ
ルスがゲノムのE1領域に欠失を含むためである。当業者に知られているように、アデノ
ウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域でコード化された機能は、好
ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわちE1、
E2および/またはE4領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失した場合、これ
らはプロデューサー細胞内に、例えばそのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパ
ーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイ
ルスは、E3領域内の欠失も有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失
は補完される必要がない。
ング細胞」または「補完細胞」または「宿主細胞」とも称される)は、所望のアデノウイ
ルスが増殖できる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイル
スベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われ
る。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも1つの
アデノウイルスE1配列を有し、それによりE1領域内に欠失を有する組換えアデノウイ
ルスを補完することができる。E1を補完する任意のプロデューサー細胞、例えば、E1
により不死化されたヒト網膜細胞、例えば911細胞またはPER.C6細胞(米国特許
第5,994,128号明細書を参照)、E1で形質転換された羊膜細胞(欧州特許第1
230354号明細書を参照)、E1で形質転換されたA549細胞(例えば、国際公開
第98/39411号パンフレット、米国特許第5,891,690号明細書を参照)、
GH329:HeLa(Gao et al,2000,Human Gene The
rapy 11:213-219)、293などを使用することができる。特定の実施形
態では、プロデューサー細胞は、例えばHEK293細胞、またはPER.C6細胞、ま
たは911細胞、またはIT293SF細胞などである。
ルスについては、これらの亜群CでないアデノウイルスのE4-orf6コード配列を、
Ad5などの亜群CのアデノウイルスのE4-orf6と交換することが好ましい。これ
により、例えば、293細胞またはPER.C6細胞などの、Ad5のE1遺伝子を発現
する、よく知られた補完細胞株内で、そうしたアデノウイルスの増殖が可能になる(例え
ば、Havenga et al,2006,J.Gen.Virol.87:2135
-2143;国際公開第03/104467号パンフレット(これらは参照によりその全
体が本明細書に組み込まれる)を参照)。特定の実施形態では、使用することができるア
デノウイルスは、RSV Fタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている
、E1領域中に欠失を有し、かつAd5のE4 orf6領域を有する、セロタイプ35
のヒトアデノウイルスである。特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物中のアデノ
ウイルスは、RSV Fタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、E
1領域中に欠失を有し、かつAd5のE4 orf6領域を有する、セロタイプ26のヒ
トアデノウイルスである。
d5の)を配置する必要はないが、代わりに、E1欠失の亜群CでないベクターをE1お
よび両立可能なE4orf6の両者を発現する細胞株、例えば、Ad5からE1およびE
4orf6の両方を発現する293-ORF6細胞株中で増殖させる(例えば、293-
ORF6細胞の生成について記載があるBrough et al,1996,J Vi
rol 70:6497-501;そのような細胞株を用いて、E1欠失の亜群Cでない
アデノウイルスベクターの生成についてそれぞれ記載があるAbrahamsen et
al,1997,J Virol 71:8946-51およびNan et al,
2003,Gene Therapy 10:326-36を参照)。
できる(例えば、国際公開第00/70071号パンフレット、国際公開第02/406
65号パンフレットを参照)。
始コドンのすぐ上流の243bp断片(Ad35ゲノム中のBsu36I制限部位によっ
て5’末端で標識される)などの、pIXオープンリーディングフレームのすぐ上流の1
66bpまたはこれを含む断片など、アデノウイルスのE1B 55Kオープンリーディ
ングフレームの3’末端を保持することが好ましいが、これはpIX遺伝子のプロモータ
ーがこの領域に部分的に存在することから、アデノウイルスの安定性を高めるためである
(例えば、Havenga et al,2006,J.Gen.Virol.87:2
135-2143;国際公開第2004/001032号パンフレット(これらは参照に
より本明細書に組み込まれる)を参照)。
れる)は、アデノウイルスに天然には存在しない核酸である。これは、例えば、標準的な
分子生物学的手法によって、アデノウイルスに導入される。本発明では、異種核酸は、配
列番号1または2のアミノ酸配列を含むRSV pre-Fタンパク質(またはその断片
)をコードする。これは、例えば、アデノウイルスベクターの欠失E1またはE3領域に
クローン化され得る。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。こ
れは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施さ
れ得る。さらなる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために、多数のプ
ロモーターを使用することができ、それらは当業者に知られている。真核細胞内での発現
を得るのに適したプロモーターの非限定的な例として、CMVプロモーター(米国特許第
5,385,839号明細書)、例えばCMV最初期プロモーター、例えばCMV最初期
遺伝子エンハンサー/プロモーターからのnt.-735~+95を含むものが挙げられ
る。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリAシグナル(米国特許第5
,122,458号明細書)を導入遺伝子の後に存在させることができる。
ヌクレオチド配列CTATCTATを含む。これらの実施形態は、元の5’末端配列(一
般にCATCATCA)を有するベクター(また2012年3月12日にCrucell
Holland B.V.の名前で出願された「Batches of recomb
inant adenovirus with altered terminal e
nds」という名称の、特許出願番号PCT/EP2013/054846号明細書およ
び米国特許出願第13/794,318号明細書(参照によりその全体が本明細書に組み
込まれる)を参照)と比較して、そのようなベクターが生産プロセスにおいて改良された
複製を示し、改良された均質性を有するアデノウイルスのバッチを生じるので有利である
。したがって、本発明はまた、RSV Fタンパク質またはその一部をコードする組換え
アデノウイルスのバッチであって、RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ
酸配列を含み、かつ基本的にバッチ中のアデノウイルスの全て(例えば、少なくとも90
%)は、末端ヌクレオチド配列CTATCTATを有するゲノムを含むバッチを提供する
。
ができる。この断片は、アミノ末端の欠失およびカルボキシ末端の欠失のいずれかまたは
その両方から生じるものであってよい。欠失の程度は、例えば組換えアデノウイルスがよ
り高収率で得られるように、当業者が決定することができる。この断片は、Fタンパク質
の免疫学的に活性な断片、すなわち、対象に免疫応答を生じさせる部分を含むように選択
されるであろう。これは、当業者には全てルーチン的である、インシリコ、インビトロ、
および/またはインビボの方法を使用して容易に決定することができる。
ドする核酸分子を含む組成物を提供する。
の感染および/または複製の低減に使用するものである。特定の好ましい実施形態では、
組成物は、RSVに対するワクチンとしての使用するものである。「ワクチン」という用
語は、特定の病原体または疾病に対して治療程度の免疫を対象に誘導する効力がある活性
成分を含む薬剤または組成物を指す。本発明では、ワクチンは、配列番号1もしくは2を
含むRSV融合前Fタンパク質、またはその抗原フラグメントをコードする有効量の核酸
分子を含み、RSVのFタンパク質に対する免疫応答を誘導する。これは、入院が必要と
なる重篤な下気道疾患を予防し、対象のRSV感染および複製による肺炎および細気管支
炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。したがって、本発明はまた、重篤な下
気道疾患を予防または軽減し、入院を予防または軽減(例えば、短縮)し、かつ/または
RSVによって引き起こされる対象の肺炎または細気管支炎の頻度および/もしくは重症
度を低減するための方法であって、RSV pre-Fタンパク質またはその断片をコー
ドする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含み、RSV Fタンパク質は配列
番号1または2のアミノ酸配列を含む方法を提供する。本発明による「ワクチン」という
用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体
、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでもよく含まな
くてもよい。特定の実施形態では、それは、例えばRSVの他のタンパク質および/また
は他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組み合せワクチンであ
ってもよい。
トをさらに含むか、または一緒に投与される。アジュバントは、適用される抗原決定基に
対する免疫応答をさらに増大させることが当該技術分野で知られており、アデノウイルス
および好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば、国際公開第2007/1104
09号パンフレット(参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている。「アジュ
バント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の
刺激を引き起こす1種または複数種の物質と定義される。これに関連して、アジュバント
は、本発明のRSV融合前Fタンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。
好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび/またはリン酸アルミニウ
ム塩などのアルミニウム塩;MF59などのスクアレン-水エマルションをはじめとする
油エマルション組成物(または水中油型組成物)(例えば、国際公開第90/14837
号パンフレットを参照);例えば、QS21および免疫賦活性錯体(ISCOMS)など
のサポニン製剤(例えば、米国特許第5,057,540号明細書;国際公開第90/0
3184号パンフレット、国際公開第96/11711号パンフレット、国際公開第20
04/004762号パンフレット、国際公開第2005/002620号パンフレット
を参照);その例が、大腸菌(E.coli)易熱性エンテロトキシンLT、コレラ毒素
CTなどである、モノホスホリルリピドA(MPL)、3-O-脱アシル化MPL(3d
MPL)、CpGモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ADPリボース化細菌毒素またはそ
れらの変異体などの細菌または微生物派生物が挙げられる。また、例えば、C4-結合タ
ンパク質(C4bp)のオリゴマー化ドメインと目的の抗原との融合物をコードする異種
核酸を使用することにより、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能
である(例えば、Solabomi et al,2008,Infect Immun
76:3817-23)。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化ア
ルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合
わせの形態のアルミニウムを、1用量当たり0.05~5mg、例えば0.075~1.
0mgのアルミニウム含有量となる濃度で、アジュバントとして含む。
わせて投与することも可能である。そのようなさらなる活性成分は、例えば、他のRSV
抗原またはそれらをコードする核酸を含むベクターを含むことができる。そのようなベク
ターは、非アデノウイルス性またはアデノウイルス性であってよく、後者は任意のセロタ
イプであってよい。他のRSV抗原の例としては、RSV FもしくはGタンパク質また
はその免疫学的に活性な部分が挙げられる。例えば、G糖タンパク質の可溶性コアドメイ
ン(アミノ酸130~230)を発現する、鼻腔内適用の組換え複製-欠損Ad5ベース
のアデノベクターrAd/3xGは、マウスモデルでは保護的であり(Yu et al
,2008,J Virol 82:2350-2357)、それを筋肉内適用した場合
には保護的ではないが、これらのデータから、RSV Gが保護応答を誘導するのに好適
な抗原であることは明らかである。さらなる活性成分はまた、例えばウイルス、細菌、寄
生生物などの他の病原体に由来する非RSV抗原を含むことができる。さらなる活性成分
の投与は、例えば、個別投与によって行われても、本発明のワクチンおよびさらなる活性
成分のワクチンの併用製品を投与することによって行われてもよい。特定の実施形態では
、さらなる非アデノウイルス抗原を(RSV.Fに加えて)、本発明のベクターにコード
することができる。したがって、特定の実施形態では、単一のアデノウイルスから1種を
超えるタンパク質の発現が望ましい可能性があり、そのような場合、例えばより多くのコ
ード化配列が結合されて、単一の発現カセットから単一の転写産物が形成され得るか、ま
たは、アデノウイルスゲノムの異なる部分内にクローン化された2つの別個の発現カセッ
ト内に存在し得る。
とができる。1回の投与の間に対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、当業者に知
られているように変化させることができ、一般に1×107ウイルス粒子(vp)~1×
1012vp、好ましくは1×108vp~1×1011vp、例えば3×108~5×
1010vp、例えば109~3×1010vpである。
、注射などによる非経口投与、例えば皮内、筋内など、または皮下、経皮、または粘膜投
与、例えば鼻腔内、経口などを含む。鼻腔内投与は、一般に、RSVに対するワクチンの
好ましい経路と見なされている。生鼻腔内法の最も重要な利点は、局所呼吸器免疫の直接
刺激および付随する疾患増強の欠如である。現在、小児への使用で臨床評価されている唯
一のワクチンは、生鼻腔内ワクチンである(Collins and Murphy.「
Vaccines against human respiratory syncy
tial virus」in:Perspectives in Medical Vi
rology 14:Respiratory Syncytial Virus(Ed
.Cane,P.),Elsevier,Amsterdam,the Netherl
ands,pp233-277)。鼻腔内投与は、本発明によれば同様に適切な好ましい
経路である。筋内投与の利点は、簡単でかつ十分に確立されていることであり、6カ月未
満の乳児に対する鼻腔内適用の安全性の懸念がないことである。一実施形態では、組成物
は、例えば、腕の三角筋、または大腿の外側広筋への筋肉内注射によって投与される。当
業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチン
を投与する様々な可能性を認識している。
コットンラットなど、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒ
ト対象である。対象は、任意の年齢、例えば約1月齢~100年齢、例えば約2月齢~約
80年齢、例えば約1月齢~約3年齢、約3年齢~約50年齢、約50年齢~約75年齢
などであり得る。
も可能である。追加免疫ワクチン接種を行う場合、一般に、そのような追加免疫ワクチン
接種は、組成物を対象に最初に投与(これは、こうした場合、「初回ワクチン接種」と称
される)した後、1週間~1年、好ましくは2週間~4カ月の時点で、同じ対象に投与さ
れるであろう。代替の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なるセロタイプ
の1つ以上のアデノウイルス、またはMVAなどの他のベクター、またはDNA、または
タンパク質を、初回ワクチン接種の後で対象に投与することも可能である。例えば、初回
免疫として融合前RSV Fタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えアデノウイル
スベクターを対象に投与し、RSV Fタンパク質を含む組成物で追加免疫することが可
能である。特定の実施形態では、RSV Fタンパク質はまた、融合前コンフォメーショ
ンで安定化される。
む。特定の実施形態では、組成物は、初回免疫-追加免疫ワクチン接種レジメンにおいて
、初回免疫組成物として、および/または追加免疫組成物として投与される。その特定の
実施形態では、初回免疫投与は、RSV pre-Fタンパク質またはその断片をコード
する核酸を含むrAd35(「rAd35-RSV.pre-F」)を用い(RSV F
pre-Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む)、追加免疫投与は
、RSV Fタンパク質をコードする核酸を含むrAd26(「rAd26-RSV.p
re-F」)を用いる(RSV pre-Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸
配列を含む)。その、他の実施形態では、初回免疫投与はrAd26-RSV.pre-
Fを用い、追加免疫投与はrAd35-RSV.pre-Fを用いる。他の実施形態では
、初回免疫投与および追加免疫投与の両者とも、rAd26.RSV.pre-Fを用い
る。特定の実施形態では、初回免疫投与はrAd26-RSV.pre-FまたはrAd
35-RSV.pre-Fを用い、追加免疫投与はRSV Fタンパク質を用いる。これ
らの全ての実施形態で、同じまたは他のベクターまたはタンパク質を用いてさらなる追加
免疫投与を提供することが可能である。RSV Fタンパク質を用いる追加免疫が特に有
益となり得る実施形態には、例えば、50歳以上のリスク群(例えば、COPDまたは喘
息に罹患)の高齢対象、または例えば60歳以上もしくは65歳以上の健常対象における
ものが含まれる。
物の単回投与を含む。そのような実施形態は、初回免疫-追加免疫レジメンと比較して、
単回投与レジメンでは複雑性および費用が低減される点で有利である。本明細書の実施例
におけるコットンラットモデルでは、本発明の組換えアデノウイルスベクターの単回投与
後、追加免疫投与を行わなくとも、完全な防御が既に観察されている。
ンを作製する方法であって、RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含
む組換えヒトアデノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の
培養物中で増殖させる工程と、組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、組換
えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、RSV Fタ
ンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む方法を提供する。
く知られた方法に従って宿主細胞内で調製および増殖され得る。細胞培養は、付着細胞培
養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞、および懸濁培養を含
む、いかなるタイプの細胞培養であってもよい。
または流加法として操作される。最近、灌流原理に基づいた連続法がより一般的となり始
め、好適でもある(例えば、国際公開第2010/060719号パンフレットおよび国
際公開第2011/098592号パンフレットを参照。これらには大量の組換えアデノ
ウイルスの獲得および精製に好適な方法が記載されており、いずれも参照により本明細書
に組み込まれる)。
ス力価を増大させる。細胞の培養は、本発明による目的ウイルスの代謝、および/または
成長、および/または分裂、および/または生成を可能にするように行われる。これは、
当業者によく知られた方法により達成することができ、限定はされないが、例えば適切な
培養培地中で細胞に栄養素を供給することを含む。好適な培養培地は当業者によく知られ
ており、一般に、商業的供給源から大量に得られ、または標準的なプロトコルに従ってカ
スタムメイドすることができる。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを使用して
、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養
するための好適な条件は知られている(例えば、Tissue Culture,Aca
demic Press,Kruse and Paterson,editors(1
973)、およびR.I.Freshney,Culture of animal c
ells:A manual of basic technique,fourth
edition(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-
34889-9を参照)。
が取り込まれる。通常、最適な撹拌は約50~300rpm、典型的には約100~20
0、例えば約150であり、典型的なDOは20~60%、例えば40%であり、最適p
Hは6.7~7.7であり、最適温度は30~39℃、例えば34~37℃であり、最適
MOIは5~1000、例えば約50~300である。典型的には、アデノウイルスはプ
ロデューサー細胞に自然に感染し、細胞を感染させるのには、プロデューサー細胞をrA
d粒子と接触させれば十分である。一般に、アデノウイルスのシードストックを培養液に
加えて感染を開始させ、その後、アデノウイルスはプロデューサー細胞内で増殖する。こ
れらは全て当業者にはルーチン的である。
セスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称される。アデノウイルス感染は最終的に
は、感染した細胞の溶解をもたらす。したがってアデノウイルスの溶解特性はウイルス産
生の2つの異なるモードを可能にする。第1のモードは、細胞を溶解するのに外部因子を
使用し、細胞溶解に先立ってウイルスを回収することである。第2のモードは、生成され
たウイルスによって(殆ど)完全に細胞が溶解した後に、ウイルス上清を回収することで
ある(例えば、外部因子によって宿主細胞を溶解しないアデノウイルスの回収を記載して
いる米国特許第6,485,958号明細書を参照)。外部因子を使用して、細胞を積極
的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
際公開第98/22588号パンフレット、p.28-35に論じられている。これに関
する有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張および/または低張溶解、液体
せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせなどである。本発明の一
実施形態では、細胞は、少なくとも1種の洗浄剤を使用して溶解する。溶解のための洗浄
剤の使用は、方法が容易であること、および容易に拡大可能であることの利点を有する。
例が、例えば、国際公開第98/22588号パンフレット、p29-33で論じられて
いる。洗浄剤としては、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性および非イオン性洗浄剤
を挙げることができる。洗浄剤の濃度は、例えば約0.1%~5%(w/w)の範囲内で
変動してもよい。一実施形態では、使用する洗浄剤は、Triton X-100である
。
核酸を除去することができる。本発明での使用に好適なヌクレアーゼの例としては、Be
nzonase(登録商標)、Pulmozyme(登録商標)、または当該技術分野内
で一般に使用されている任意のその他のDNaseおよび/またはRNaseが挙げられ
る。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはBenzonase(登録商標)であり、こ
れは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合の加水分解によって核酸を迅速に
加水分解し、それにより細胞溶解産物の粘度を低下させる。Benzonase(登録商
標)は、Merck KGaAから商業的に入手し得る(コードW214950)。ヌク
レアーゼが使用される濃度は、好ましくは1~100単位/mlの範囲内である。ヌクレ
アーゼ処理の代替として、またはヌクレアーゼ処理に加えて、アデノウイルスの精製中に
、ドミフェン臭化物などの選択的沈澱剤を使用して、アデノウイルス調製物から宿主細胞
DNAを選択的に沈殿除去することも可能である(例えば、米国特許第7,326,55
5号明細書;Goerke et al.,2005,Biotechnology a
nd bioengineering,Vol.91:12-21;国際公開第2011
/045378号パンフレット;国際公開第2011/045381号パンフレットを参
照)。
5/080556号パンフレットに広範に記載されている。
スの精製は、数工程で行うことができ、例えば国際公開第05/080556号パンフレ
ット(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている清澄化、限外ろ過、ダイア
フィルトレーションまたはクロマトグラフィーを用いた分離を含む。清澄化は、ろ過工程
により行うことができ、細胞溶解物から細胞デブリおよび他の不純物を除去する。限外ろ
過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用するダイアフィルトレーシ
ョン、または緩衝液交換は、塩、糖などの除去および交換のための一方法である。当業者
は、各精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。国際公開第98/22588号
パンフレット(この全体が参照により本明細書に組み込まれる)も、アデノウイルスベク
ターの生成および精製方法を記載している。これらの方法は、宿主細胞を成長させ、この
宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、この宿主細胞を回収および溶解し、粗溶解物を濃
縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、この溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフ
ィーを用いてウイルスをさらに精製することを含む。
-70に論じられているように、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程が使用される
。アデノウイルスのさらなる精製に関して多数のプロセスが記載されており、当該プロセ
スにはクロマトグラフィー工程が含まれている。当業者は、これらのプロセスを知ってお
り、プロセスを最適化するために、クロマトグラフ工程の厳密な使用法を変更することが
できる。例えば、アニオンイオン交換クロマトグラフィー工程によりアデノウイルスを精
製することが可能であり、例えば、国際公開第2005/080556号パンフレット、
およびKonz et al,2005,Hum Gene Ther 16:1346
-1353を参照されたい。多数の他のアデノウイルス精製方法が報告されており、これ
らは当業者の手の届く範囲にある。アデノウイルスを生成および精製するさらなる方法は
、例えば(国際公開第00/32754号パンフレット;国際公開第04/020971
号パンフレット;米国特許第5,837,520号明細書;米国特許第6,261,82
3号明細書;国際公開第2006/108707号パンフレット;Konz et al
,2008,Methods Mol Biol 434:13-23;Altaras
et al,2005,Adv Biochem Eng Biotechnol 9
9:193-260)に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれ
る。
医薬組成物を用い得る。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦
形剤が、使用する投与量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない影響も悪影
響も何ら引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形
剤は、当該技術分野でよく知られている(Remington’s Pharmaceu
tical Sciences,18th edition,A.R.Gennaro,
Ed.,Mack Publishing Company[1990];Pharma
ceutical Formulation Development of Pept
ides and Proteins,S.Frokjaer and L.Hovga
ard,Eds.,Taylor&Francis[2000];およびHandboo
k of Pharmaceutical Excipients,3rd editi
on,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutical Press[2000
]を参照)。精製されたrAdは、好ましくは滅菌溶液として処方されて投与されるが、
凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当該技術分野で
それ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、
または医薬投与容器に充填される。溶液のpHは、一般にpH3.0~9.5、例えばp
H5.0~7.5の範囲内である。rAdは、通常、好適な薬学的に許容される緩衝剤を
含む溶液中にあり、rAdの溶液は塩を含有することもある。任意選択により、アルブミ
ンなどの安定剤が含まれる。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態
では、rAdは注射用調製物として製剤してもよい。これらの製剤は有効量のrAdを含
み、滅菌液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンのいずれかであり、任意選択に
より安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエ
アロゾル化されてもよい(例えば、国際公開第2009/117134号パンフレットを
参照)。
Hoganson et al,Development of a stable a
denoviral vector formulation,Bioprocessi
ng March 2002,p.43-48)にも使用される緩衝液:20mM トリ
ス pH8、25mM NaCl、2.5%グリセロール中に保存することができる。ヒ
トへの投与に好適な他の有用な製剤緩衝液は、20mMのトリス、2mMのMgCl2、
25mMのNaCl、10%w/vのスクロース、0.02%w/vのポリソルベート8
0である。他の多くの緩衝液を使用できることは明らかであり、保存、および精製(アデ
ノ)ウイルス調製物の医薬品としての投与に好適な製剤の例は、例えば欧州特許第085
3660号明細書、米国特許第6,225,289号明細書、および国際特許出願の国際
公開第99/41416号パンフレット、国際公開第99/12568号パンフレット、
国際公開第00/29024号パンフレット、国際公開第01/66137号パンフレッ
ト、国際公開第03/049763号パンフレット、国際公開第03/078592号パ
ンフレット、国際公開第03/061708号パンフレットに見出すことができる。
ない。それらは、発明を明確にする役割を果たすのみである。
塩基性RSV F配列をコードするプラスミドを合成し、部位特異的変異誘発によりア
ミノ酸置換をタンパク質に導入した。タンパク質変異体を、HEK293細胞内で一時的
に発現させた。細胞表面上の相対的なタンパク質発現を、フローサイトメトリーによって
評価した。融合前コンフォメーションでのFタンパク質の安定性を、熱安定性アッセイで
評価した。
セッション番号ACO83301.1から読み出した。アミノ酸置換を部位特異的変異誘
発によって配列に導入した(QuikChange II XL Site-Direc
ted Mutagenesis Kit、Agilent technologies
)。変異誘発プライマーを、オンラインツールPrimerXを用いて設計した。HEK
293T細胞(CRL-11268)をAmerican Tissue Cultur
e Collectionから購入し、標準的な細胞培養条件下(37℃、10%CO2
)で培養した。
重鎖(VH)および軽鎖(VL)可変領域を単一のIgG1発現ベクターにクローニング
することによって構築した。PER.C6(登録商標)細胞(Crucell)をIgG
1発現コンストラクトでトランスフェクトし、POROS Mabcapture Aク
ロマトグラフィー(Applied Biosystems)を用いて、培養物上清から
の発現抗体を精製し、その後、緩衝液を50mM NaAc、50mM NaCl、pH
5.5に交換した。抗体濃度を280nmでの光吸収によって測定した。抗体の質も、サ
イズ排除クロマトグラフィー(SEC)、SDS-PAGEおよび等電点電気泳動によっ
て確認した。抗体CR9501は、融合前コンフォメーションのRSV Fタンパク質に
特異的に結合し、融合後コンフォメーションには結合しない58C5(WO2011/0
20079に記載されているような)のVHおよびVL領域を含む。CR9503は、R
SV Fの融合前および融合後コンフォメーションの両方を認識するモタビズマブのVH
およびVL領域を含む。
供給業者の推奨に従って293fectine(カタログ番号12347-019)ト
ランスフェクション試薬(Life Technologies)を使用し、接着性HE
K293T細胞にプラスミドを一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションか
ら48時間後、EDTA含有FACS緩衝液(トリプシン含まず、次の節を参照)で剥離
することによって細胞を回収し、温度安定性実験のために、水浴またはPCRブロックで
10分間、細胞懸濁液を熱処理した。熱処理後、細胞をフローサイトメトリー分析のため
に調製した。
0MOIで、またAd35ウイルスを5000、2500または1250MOIで、A5
49細胞に感染させた。48時間後、細胞を剥離し、37℃、50℃および56℃で15
分間熱処理した。熱処理終了後、CR9501-Alexa647またはCR9503-
Alexa647およびヨウ化プロピジウム(PI)を用いて細胞を染色した。染色後、
細胞を固定し、BD FACS CANTO II細胞分析器を用いて分析した。
それぞれの染色には、以下の対照を含めた:1)陰性対照試料。すなわち、いかなる処
理にも供されず、フルオロフォアで標識されたいかなる抗体でも染色されなかった細胞;
2)陽性対照試料、すなわち、1つのフルオロフォア(実験のために使用されるものの1
つ)でのみ染色された細胞。
に再懸濁し、蓋付き96ウェルプレート(U底またはV底プレート)に1ウェルあたり5
0μlの体積の細胞懸濁液を分配した。2段階または1段階の手順で染色した。
加し、RTで30分間インキュベートした。ビオチン化CR9501およびCR9503
を2μg/mlで使用した(ウェル中の最終濃度は1μg/ml)。インキュベーション
後、FC緩衝液で細胞を2回洗浄した。その後、50μlのストレプトアビジン-APC
(Molecular Probesカタログ番号SA1005、0.1mg/mlを1
:100で使用)または陰性対照では緩衝液をウェルに添加し、RTで30分間インキュ
ベートした。インキュベーション後、再度、FC緩衝液で細胞を2回洗浄した。最後の洗
浄後、細胞を100μlのFC緩衝液+/-ライブ-デッド染色液(Invitroge
nからのPI、カタログ番号P1304MP、2μg/mlで使用)に再懸濁し、RTで
15分間インキュベートした。細胞を200G(1000rpm)で5分間遠心分離し、
PIを含む緩衝液を除去し、150μlのFC緩衝液に細胞を再懸濁させた。
抗体を蛍光プローブAlexa647(Molecular Probes、カタログ番
号A-20186)で標識した。ストレプトアビジン-APC工程を除いて、細胞を上記
手順に従って染色した。
を決定した。CR9503結合が陽性の細胞は、それらの表面にRSV Fタンパク質を
発現する。CR9501結合が陽性の細胞は、それらの表面に融合前RSV Fを発現す
る。
例する。Fタンパク質を発現する生細胞集団からMFIを計算した。
完全長Fタンパク質変異体の表面細胞発現:
融合前コンフォメーションのRSV Fタンパク質外部ドメインの発現または安定性を
増加させることが以前に同定された変異のサブセットを、野生型完全長RSV A2 F
配列(アクセッション番号Genbank ACO83301)に導入した。変異を単独
で、または複数の組み合わせで導入し、タンパク質の発現および安定性に対する効果を評
価した。
03抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度(MFI)として測定
した。可溶性RSV pre-Fタンパク質の安定化について以前に記載された2つのア
ミノ酸置換(すなわち、N67IおよびS215P)の組み合わせは、また、野生型完全
長RSV Fと比較して、完全長RSV Fタンパク質の発現レベルを2.3倍増加させ
た(図2)。
興味深いことに、1つの変異体に4つ以上の変異を組み合わせても、タンパク質発現をさ
らに増加させることはなかった。これは、Fタンパク質の多数のコピーを収容する細胞膜
の容量が限られていることに起因しているのかもしれない。
した(図3)。全てのF変異体の細胞へのトランスフェクションは、細胞表面上に多かれ
少なかれ類似した量の融合前Fタンパク質をもたらした。膜貫通ドメインの存在は完全長
タンパク質をある程度安定化し、したがって、融合前安定性の差異は、周囲条件下では完
全長Fタンパク質間で明らかでない。したがって、以下に記載するように、完全長変異体
の安定性をより良く識別するために、熱安定性アッセイを開発した。
14/174018号パンフレットおよび国際公開第2014/202570号パンフレ
ット)は、2つの特有かつ稀な変異(すなわち、リジン66およびイソロイシン76の)
を蓄積した細胞株適合実験室株である。本発明では、これら2つの残基を、天然の臨床分
離株(K66E、I76V)に適合するように変異させた。選択されたタンパク質の設計
にK66EおよびI76Vの変異を含めた。Lys66およびIle76を有する変異体
と比較して、66位にグルタミン酸を有する変異体(K66E)は、わずかに高く発現す
る傾向を有する。残基76でのバリンの付加(K66EおよびI76Vの二重置換)は、
K66E置換のみを有する変異体と比較した場合、発現レベルに影響を与えない(図4)
。
短時間スケールの周囲条件では、安定化変異の異なる組み合わせを有する完全長F変異
体間で、融合前コンフォメーションの安定性に有意差は観察されなかった。温度を上げる
ことは、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへとRSV Fタンパ
ク質をリフォールディングするための効率的なインビトロトリガーとして働くことが知ら
れている。したがって、熱ショックアッセイを確立し、膜結合完全長タンパク質の安定性
を評価するために使用した。簡単に言えば、HEK293T細胞をFタンパク質コンスト
ラクトでトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後にアッセイで使用した
。細胞を細胞培養皿から剥離し、細胞懸濁液を、温度を上げながら10分間熱処理した。
熱処理後、細胞を抗RSV F抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。フ
ローサイトメトリーデータを2つの異なる方法で分析した。抗F抗体による染色に対して
陽性である細胞のパーセンテージを分析し、陽性細胞の平均蛍光強度(MFI)も計算し
た(図5)。
る抗体)およびCR9503(融合前Fタンパク質および融合後Fタンパク質の両方を認
識する抗体)による染色の両方を使用した。CR9503抗体を陽性対照とした。Fタン
パク質が融合前のコンフォメーションを失って、なお細胞表面上に存在する場合、そのタ
ンパク質は依然CR9503抗体で検出される。両方の抗体による染色の喪失は、タンパ
ク質が、例えば凝集により、細胞表面上で抗体結合に利用できないことを示す。
Fと比較した。これらの変異体の発現が最も高く、したがってこれらの変異体は好まし
い候補であった。全てのタンパク質はN67IおよびS215P置換を含み、1つまたは
2つの追加の安定化変異を加えた。
CR9503染色のMFIは高い温度ほど上昇したが、値の広がりも非常に大きかった。
これは、熱ショック後にタンパク質の凝集が起こらなかったことを示した。融合前コンフ
ォメーションの半分は約55℃での細胞のインキュベーション後に失われ、60℃でのイ
ンキュベーション後には、高温熱ショック後の野生型F試料へのCR9501結合の減少
が示すように、全ての融合前コンフォメーションは失われた。
度での処理後も保持されており、野生型RSV Fよりも安定であった(図5および6)
。K498Rアミノ酸置換を有するタンパク質は、他のものよりも安定性が低かった。さ
らに、K66E変異の付加は、K498Rアミノ酸置換を有する変異体も他のものと同程
度に安定になるのと同じく、タンパク質を安定化させ、60℃での融合前コンフォメーシ
ョンの損失は観察されなかった。組み合わされたK66EおよびI76Vを含む、安定化
変異の選択された組み合わせのみを試験した。陽性細胞のパーセントの分析では、試験し
た4つのタンパク質は全て安定であったが、MFIの分析では、K498Rを有する変異
体は60℃での処理後にCR9501結合に明らかな減少を示し、この変異体は温度スト
レスアッセイで評価した場合、安定が低いことが示された。
高い発現レベルおよび安定性に十分であると考えられた。S46GまたはD486N変異
が、タンパク質構造におけるそれらの位置を理由に、第3の安定化変異として選択された
。K66EおよびI76Vは、タンパク質の発現および安定性に対して負の効果を有さず
、天然に存在するものにより近い配列を作製するので、含められた。
る融合前RSV Fタンパク質(F2.2)(配列番号2)、ならびに変異K66E、N
67I、I76V、S215PおよびS46Gを有する融合前RSV Fタンパク質(F
2.1)(配列番号1)が、アデノウイルスベクターの構築のために選択された。これら
のタンパク質は60℃までの温度安定性アッセイにおいて融合前コンフォメーションで安
定であり、かつ高レベルで発現されることが示された。
Ad35およびAd26のE1領域へのRSV F遺伝子のクローニング:
本発明の融合前Fタンパク質をコードする核酸配列は、Geneartにより、ヒトで
の発現のために遺伝子が最適化され、合成された。コザック配列(5’GCCACC3’
)をATG開始コドンの直前に含め、2つの停止コドン(5’TGA TAA3’)をR
SV.pre-Fコード配列の終端に付加した。RSV.pre-F遺伝子を、Hind
IIIおよびXbaI部位を介して、pAdApt35BSUプラスミドおよびpAdA
pt26プラスミドに挿入した。
PER.C6細胞を、10mM MgCl2を添加した、10%ウシ胎児血清(FBS
)含有ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で維持した。
全てのアデノウイルスを、PER.C6(登録商標)細胞中で、単一の相同組換えによ
り生成し、以前に報告されているように生成した(rAd35では:Havenga e
t al.,2006,J.Gen.Virol.87:2135-2143;rAd2
6では:Abbink et al.,2007,J.Virol.81:4654-4
663)。簡単に記すと、PER.C6細胞に、製造業者(Life Technolo
gies)が提供する説明書に従い、リポフェクタミンを使用して、Adベクタープラス
ミドをトランスフェクトした。例えば、RSV.pre-F導入遺伝子発現カセットを有
するAd35ベクターのレスキューでは、pAdApt35BSU.RSV.pre-F
プラスミドおよびpWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6コスミドを
使用し、RSV.pre-F導入遺伝子発現カセットを有するAd26ベクターでは、p
AdApt26.RSV.pre-FプラスミドおよびpWE.Ad26.dE3.5o
rf6.コスミドを使用した。細胞を、完全なCPEの1日後に回収し、凍結融解し、3
,000rpmで5分間遠心分離し、-20℃で保存した。次に、ウイルスをプラーク精
製し、マルチウェル24組織培養プレートの単一ウェル上で培養したPER.C6中で増
幅させた。T25組織培養フラスコおよびT175組織培養フラスコを使用して培養した
PER.C6中でさらに増幅させた。T175粗溶解物のうちの3~5mlを使用して、
70%コンフルエント層のPER.C6細胞を含有する20×T175三層組織培養フラ
スコに接種した。ウイルスを、2段階CsCl精製法を使用して精製した。最終的に、ウ
イルスを一定分量に分割して-85℃で保存した。
6および35を用いたRSV Fに対する免疫の誘導。
Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2.2の免疫
原性をマウスで評価し、細胞性および体液性免疫応答を、同一用量のAd26.RSV.
FA2(すなわち、野生型RSV Fタンパク質を発現)によって誘導される応答と比較
した。Balb/cマウス(1群当たりn=4)を、108~1010個のウイルス粒子
(vp)、Ad26.RSV.FA2またはAd26.RSV.preF2.1またはA
d26.RSV.preF2.2の示された用量で、または製剤緩衝液で免疫を付与した
。初回免疫から8週後に、ELISpotを用い、106脾細胞当たりRSV F A2
特異的IFNγスポット形成単位(SFU)数を決定した。Ad26.RSV.FA2と
比較すると、Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2
.2では、広い中和能を有し、かつ細胞応答を維持しながらマウスの体液性免疫応答の誘
導が増加することが示された。Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RS
V.preF.2.2による単回筋肉内免疫付与は、IFNγ、IL2および/またはT
NFαに対して陽性のCD8+T細胞の誘導によって特徴付けられる(データは示さず)
細胞応答を誘発した(図7)。
reF.2.2およびAd26.RSV.FA2の間で同等であった。対照的に、Ad2
6.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2.2は、Ad26.
RSV.FA2よりも有意に高いRSV中和抗体力価を誘導した。抗体応答のより厳密な
分析により、Ad26.RSV.preF2.1およびAd26.RSV.preF.2
.2は、融合前Fに対するより高いレベルの抗体を誘導したが、一方で、融合後Fの力価
はAd26.RSV.FA2と同等の値に留まり、その結果、preF/postFの抗
体比は有意に増加することが示された。さらに、抗体応答のIgG2a/IgG1比は変
化しないままであり、Ad26.RSV.FA2について以前に示されたのと同様の体液
性応答のTh1優位を示した(図8)。
.FA2で観察されたのと同様に、種々のRSV AおよびB株、実験室株、ならびに臨
床分離株を中和し得ることが示された(図9)。
ベクターコンストラクトの有効性および免疫原性を、コットンラットモデルで評価した。
これらの動物はヒトRSVの複製を許容し、肺におけるRSV力価は4日目および5日目
にピークに達する。低用量のRSV A2で鼻腔内感染させ、それによって自然曝露を模
倣した群、ならびにFI-RSVで免疫付与した群を実験の対照群として含め、臨床研究
において、コットンラットで重症呼吸器疾患強(ERD)を誘導することが示された希釈
で、ERDを誘導したオリジナルロット100を使用した。
用量が106~109vp/動物の範囲のAd35.RSV.preF2.2を用いて、
動物の単回筋肉内免疫付与を行うと、105vpのAd26.RSV.preF2.2で
免疫付与した3匹の動物を除いて、ワクチン相同RSV A2株による感染から肺を完全
に防御した(図10Aおよび10B)。両ベクターで、RSV複製に対する鼻の用量依存
的防御が観察された。これは、Ad26.RSV.preF2.2では108vp/動物
での完全防御から、105vpでの部分防御までの範囲にわたったが、Ad35.RSV
.preF2.2では109vpで免疫付与した動物の鼻部はRSV A2から完全に防
御され、106vpでは部分防御が得られた(図10Cおよび10D)。用量に関して分
析すると、Ad26.RSV.preF2.2およびAd35.RSV.preF2.2
で免疫付与した動物の鼻部は、両者それぞれの野生型Fの対応物であるAd26.RSV
.FA2およびAd35.RSV.FA2で免疫付与した場合よりもRSV A2からの
防御が良好であった(p=0.0003およびp=0.0001)。RSV感染からの防
御は、RSV A Longに対するウイルス中和力価の用量依存的誘導を伴うが、これ
は最低用量のAd26.RSV.preF2.2またはAd35.RSV.preF2.
2の適用により既に誘発されている(図10Eおよび10F)。VNA A Longの
力価について用量に関して統計的な比較を行うと、Ad26.RSV.preF2.2は
Ad26.RSV.FA2より免疫原性が高い(p=0.0414)が、VNA力価の誘
発はAd35.RSV.preF2.2とAd35.RSV.FA2との間で有意差はな
かった。
いずれの濃度でも、RSV A2チャレンジ後に重症呼吸器疾患(ERD)の組織病理学
的徴候を誘導しないことが示された。コットンラットは、ERDをモニターするのに最も
多く使用され、最もよく研究されているモデルである。この動物モデルで、FI-RSV
によるワクチン接種は、RSVチャレンジ後にERDを一貫して誘導し、これは、主に好
中球浸潤物からなる肺胞炎、および主にリンパ球浸潤物からなる細気管支周囲炎のような
パラメータについて、感染した肺の切片の組織病理学的分析を行うことによって可視化さ
れる。コットンラットでは、これらのパラメータに対するFI-RSV誘導スコアは、R
SV感染後1日目から観察することができ、RSVチャレンジ後4~5日目にピークに達
する。
質性肺炎、肺胞炎)の4つのパラメータをスコア化することによって、ERDを分析した
。FI-RSVによる免疫付与は、ほとんどの組織病理学的マーカーについてスコアの増
加をもたらし、これは肺胞炎について特に明らかであり(図11)、このマーカーは、以
前にERDに対して最も識別性のあるマーカーであることが示されたものである。初回免
疫のみのレジメンで、RSVチャレンジ後にAd26.RSV.preF2.2またはA
d35.RSV.preF2.2により免疫を付与した動物では、低親和性および/また
は低レベルの抗体を誘導し得る低ワクチン用量でさえ、肺胞炎または任意の他のERD組
織病理学的マーカーの増加は観察されなかった(図11)。これは、Ad26.RSV.
FA2およびAd35.RSV.FA2ベクターを用いた我々の先の結果を確認するもの
である。
preFは、融合前コンフォメーションで安定化されるRSV F A2を発現する、強
力なアデノウイルスベクターであることが示された。これらのベクターは、強力な体液性
および細胞性免疫応答を誘導する。誘発された免疫応答は、RSV A2のチャレンジに
対して保護的であり、RSVの臨床分離株および実験室分離株に対してインビトロで広範
囲のウイルス中和を提供する。ワクチン接種した動物のRSV曝露後に、コットンラット
でERD誘導は観察されず、したがって、野生型RSV F A2抗原をコードするAd
26およびAd35で得られたデータが裏付けられた。マウスでもコットンラットでも、
Ad26.RSV.preFまたはAd35.RSV.preFの注射後に反応原性の明
白な徴候を示さなかった。
(変異には下線が引かれている)
配列番号1:RSV preF2.1アミノ酸配列:
配列番号2:RSV preF2.2アミノ酸配列:
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.融合前コンフォメーションで安定化されるRSV Fタンパク質(融合前RSV Fタンパク質)をコードする核酸分子であって、前記RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む核酸分子。
2.前記融合前RSV Fタンパク質をコードする前記核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている上記1に記載の核酸分子。
3.前記融合前RSV Fタンパク質をコードする前記核酸は、配列番号3または4の核酸配列を含む上記1または2に記載の核酸分子。
4.上記1、2または3に記載の核酸分子を含むベクター。
5.前記ベクターはヒト組換えアデノウイルスである上記4に記載のベクター。
6.前記組換えヒトアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのE1領域中の欠失、E3領域中の欠失、またはE1およびE3の両領域中の欠失を有している上記5に記載のベクター。
7.前記アデノウイルスがセロタイプ26または35のアデノウイルスである上記5または6に記載のベクター。
8.前記組換えアデノウイルスは、その5’末端に配列CTATCTATを含むゲノムを有する上記5、6または7に記載のベクター。
9.上記1、2または3に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
10.上記5~8のいずれかに記載のベクターを含む医薬組成物。
11.対象にRSVに対するワクチンを接種する方法であって、前記対象に上記9または10に記載の組成物を投与することを含む方法。
12.前記対象にRSV Fタンパク質を投与することをさらに含む上記11に記載の方法。
13.対象におけるRSVの感染および/または複製を減少させる方法であって、前記対象に、上記1、2または3に記載の融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組成物を投与することを含む方法。
14.対象におけるRSVの感染および/または複製を減少させる方法であって、前記対象に、上記5~8のいずれかに記載のベクターを含む組成物を投与することを含む方法。15.上記1、2または3に記載の融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む単離宿主細胞。
16.呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対するワクチンを作製する方法であって、融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトアデノウイルスを用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させる工程と、前記組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、前記組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、前記融合前RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む方法。
17.融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、組換えヒトアデノウイルスのゲノムを形成する単離組換え核酸であって、前記融合前RSV Fタンパク質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む単離核酸。
Claims (17)
- 融合前コンフォメーションで安定化されるRSV Fタンパク質(融合前RSV Fタ
ンパク質)をコードする核酸分子であって、前記RSV Fタンパク質は配列番号1また
は2のアミノ酸配列を含む核酸分子。 - 前記融合前RSV Fタンパク質をコードする前記核酸は、ヒト細胞での発現のために
コドン最適化されている請求項1に記載の核酸分子。 - 前記融合前RSV Fタンパク質をコードする前記核酸は、配列番号3または4の核酸
配列を含む請求項1または2に記載の核酸分子。 - 請求項1、2または3に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記ベクターはヒト組換えアデノウイルスである請求項4に記載のベクター。
- 前記組換えヒトアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのE1領域中の欠失、E3領
域中の欠失、またはE1およびE3の両領域中の欠失を有している請求項5に記載のベク
ター。 - 前記アデノウイルスがセロタイプ26または35のアデノウイルスである請求項5また
は6に記載のベクター。 - 前記組換えアデノウイルスは、その5’末端に配列CTATCTATを含むゲノムを有
する請求項5、6または7に記載のベクター。 - 請求項1、2または3に記載の核酸分子を含む医薬組成物。
- 請求項5~8のいずれか一項に記載のベクターを含む医薬組成物。
- 対象にRSVに対するワクチンを接種する方法であって、前記対象に請求項9または1
0に記載の組成物を投与することを含む方法。 - 前記対象にRSV Fタンパク質を投与することをさらに含む請求項11に記載の方法
。 - 対象におけるRSVの感染および/または複製を減少させる方法であって、前記対象に
、請求項1、2または3に記載の融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードす
る核酸を含む組成物を投与することを含む方法。 - 対象におけるRSVの感染および/または複製を減少させる方法であって、前記対象に
、請求項5~8のいずれか一項に記載のベクターを含む組成物を投与することを含む方法
。 - 請求項1、2または3に記載の融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードす
る核酸を含む単離宿主細胞。 - 呼吸器合胞体ウイルス(RSV)に対するワクチンを作製する方法であって、融合前R
SV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む組換えヒトアデノウイルスを
用意する工程と、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させる工程と、
前記組換えアデノウイルスを単離および精製する工程と、前記組換えアデノウイルスを薬
学的に許容される組成物で製剤化する工程とを含み、前記融合前RSV Fタンパク質は
配列番号1または2のアミノ酸配列を含む方法。 - 融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、組換えヒトアデ
ノウイルスのゲノムを形成する単離組換え核酸であって、前記融合前RSV Fタンパク
質は配列番号1または2のアミノ酸配列を含む単離核酸。
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