JP2022513025A - 安定化された融合前ｒｓｖ ｆタンパク質 - Google Patents

安定化された融合前ｒｓｖ ｆタンパク質 Download PDF

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Abstract

本発明は、安定な融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、前記タンパク質を含む免疫原性組成物、並びにＲＳＶ感染の予防及び／又は処置のためのそれらの使用を提供する。

Description

本発明は、医薬の分野に関する。本発明は、特に、組換え融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、このＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子、及び例えばワクチンでのその使用に関する。
１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が発見されると、このウイルスは、直ちにヒトにおける上下気道感染症に関連した認定病原体になった。世界中で毎年６４００万件のＲＳＶ感染が発生し、その結果、１６０，０００人が死亡していると推定されている（ＷＨＯ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｕｐｄａｔｅ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に、未熟児、高齢者、及び免疫無防備状態の個体である。２歳未満の小児では、ＲＳＶが最も一般的な気道病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは２～４カ月齢で生じる。小児のほぼ全てが２歳までにＲＳＶに感染したことがあるとの報告がある。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果を有さないことに起因する。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、非汎発性のインフルエンザＡ感染により引き起こされるものと類似している。
ＲＳＶは、ニューモウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）亜科に属するパラミクソウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）及びＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として既知の膜タンパク質を含む様々なタンパク質をコードする。Ｆ１タンパク質の融合媒介部に対する抗体は、細胞へのウイルス取り込みを防止し得、そのため中和作用を有する。
ＲＳＶ Ｆは、不可逆性タンパク質が不安定な融合前コンフォメーションから安定した融合後コンフォメーションにリフォールディングすることにより、ウイルスと宿主細胞膜とを融合する。両方のコンフォメーションの構造が、ＲＳＶ Ｆ（ＭｃＬｅｌｌａｎ ＪＳ， ｅｔ ａｌ．（２０１０，２０１３，２０１３）；Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＡ， ｅｔ ａｌ．（２０１１））、及び関連するパラミクソウイルスからの融合タンパク質に関して決定されており、この融合タンパク質の複雑なメカニズムに関する洞察がもたらされている。他のＩ型融合タンパク質のように、不活性な前駆体、ＲＳＶ Ｆ０は、フーリン様プロテアーゼにより細胞内成熟中に切断される必要がある。ＲＳＶ Ｆは２つのフーリン切断部位を有し、それにより３つのタンパク質：Ｆ２、ｐ２７、及びＦ１に分けられ、Ｆ１はそのＮ末端に疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を含む。融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションにリフォールディングするために、ＦＰ及びヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）を含む残基１３７～２１６のリフォールディング領域１（ＲＲ１）は、へリックス、ループ、及びストランドのアセンブリから長い連続へリックスに変形する必要がある。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、融合前ＦスパイクにおいてＣ末端ステムを形成し、且つヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）が、ＲＳＶ Ｆヘッドの他方の側に位置を変え、ＨＲＡコイルドコイルトリマーをＨＲＢドメインと結合させて、６へリックスバンドルを形成する。６へリックスバンドルを完成するためのＲＲ１コイルドコイルの形成及びＲＲ２の移動は、リフォールディングの過程で起こる最も劇的な構造変化である。
現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは未だ入手不能であるが、疾患による高い負担のために非常に要望されている。ＲＳＶ融合糖タンパク質（ＲＳＶ Ｆ）は、ヒト血清中の中和抗体の主要な標的であることから、魅力的なワクチン抗原である。ヒトの血清中の大半の中和抗体は、融合前コンフォメーションに対するものであるが、不安定さに起因して、融合前コンフォメーションは、溶液中及びビリオン表面上の両方で融合後コンフォメーションに早期にリフォールディングする傾向がある。上記のように、結晶構造から、融合前状態と融合後状態との間にコンフォメーションの大きな変化があることが明らかになっている。再配列の規模から、ＲＳＶ－Ｆの融合後コンフォメーションに対する抗体の一部しか、ウイルス表面上で融合前スパイクの生得コンフォメーションと交差反応し得ないことが示唆された。従って、ＲＳＶに対するワクチンを作製する努力は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前形態を含むワクチンの開発に焦点が当てられている（例えば、国際公開第２０１０１１４９７４５号パンフレット、同第２０１０／１１４９７４３号パンフレット、同第２００９／１０７９７９６号パンフレット、同第２０１２／１５８６１３号パンフレットを参照されたい）が、今日まで、依然としてワクチンは入手不能である。
従って、ＲＳＶに対する効果的なワクチン（特に、融合前コンフォメーションのＲＳＶ Ｆタンパク質を含むワクチン）が依然として要望されている。本発明は、ＲＳＶに対するワクチン接種での使用のためのそのような安定な融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を得るための手段を提供することを目的とする。
本発明は、安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質（即ち、融合前コンフォメーションで安定化されている組換えＲＳＶ Ｆタンパク質）及びその断片を提供する。この融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片は、例えば、このタンパク質に対する、融合前コンフォメーションに特異的に抗体の特異的結合により決定された場合に、融合前コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む。ある特定の実施形態では、この融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、可溶性の多量体（例えば三量体）タンパク質である。本発明はまた、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片をコードする核酸分子、及びそのような核酸分子を含むベクター（例えばアデノベクター）も提供する。
本発明はまた、融合前コンフォメーションのＲＳＶ Ｆタンパク質を安定化させる方法、及び前記方法により得られる融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質にも関する。
本発明は、さらに、本明細書で説明されている、ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターを含む組成物、好ましくは免疫原性組成物、並びにＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導でのその使用、特にＲＳＶに対するワクチンとしてのその使用、に関する。本発明はまた、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導する方法であって、本明細書で説明されている、有効な量の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子、及び／又は前記核酸分子を含むベクターを対象に投与することを含む方法にも関する。好ましくは、誘導される免疫応答は、ＲＳＶに対する中和抗体及び／又はＲＳＶに対する防御免疫の誘導を特徴とする。特定の態様では、本発明は、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ抗体を誘導する方法であって、本明細書で説明されている、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子、及び／又は前記核酸分子を含むベクターを含む有効な量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
実施例で説明されているサブグループＡ ＲＳＶ Ｆタンパク質変異体の構築に使用されたＲＳＶ サブグループＡのＲＳＶ Ｆタンパク質の外部ドメインのコンセンサスアミノ酸配列を示す。この前駆体ポリペプチドは、リンカーと、フォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）三量化ドメイン（下線を引いている）とを有するＣ末端伸張を含む。このコンセンサスＲＳＶ Ｆ配列は、野生型（非継代）群Ａ ＲＳＶ Ｆ配列に非常に類似している（Ｋｕｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．２０１１）。 実施例で説明されているサブグループＢ ＲＳＶ Ｆタンパク質変異体の構築に使用されたサブグループＢのＲＳＶ Ｆタンパク質の外部ドメインのコンセンサスアミノ酸配列を示す。この前駆体ポリペプチドは、リンカーと、フォールドン三量化ドメイン（下線を引いている）とを有するＣ末端伸張を含む。このコンセンサスＲＳＶ Ｆ配列は、野生型（非継代）ＲＳＶ Ｆ配列に非常に類似している（Ｋｕｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．２０１１）。 図３：サブタイプＡのコンセンサスＦ及びそのバリアントの融合前Ｆの安定性。実施例１で説明されているトランスフェクトされた細胞の上清における融合前コンフォメーションのＦタンパク質の含有量を測定した。トランスフェクトされた細胞の上清を回収し、４℃で保存し、保存の１日目、４日目、１１日目、及び１８日目に、融合前Ｆタンパク質含有量に関して試験した。減衰曲線は、変異Ｉ７９Ｍ、Ｐ１０１Ｓ、Ｐ１０１Ｑ、Ｐ１０１Ｔ、Ｉ１５２Ｖ、又はＱ３５４Ｌが、単一のＤ４８６Ｎ変異を含む、既に説明されている安定化されたサブタイプＡ Ｆタンパク質（国際公開第２０１７／００５８４４号パンフレットで説明されている）と比較して融合前Ｆタンパク質を安定化させることを示す。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） サブタイプＢのコンセンサスＦ及びそのバリアントの融合前Ｆの安定性。実施例１で説明されているトランスフェクトされた細胞の上清における融合前コンフォメーションのＦタンパク質の含有量を測定した。トランスフェクトされた細胞の上清を回収し、４度で保存し、保存の１日目、４日目、１１日目、及び１８日目に、融合前Ｆタンパク質含有量に関して試験した。減衰曲線は、変異Ｔ１５２Ｍ及びＫ２２６Ｍが、サブタイプＢ Ｆ－Ｄ４８６Ｎ（国際公開第２０１７／００５８４４号パンフレットで説明されている）と比較して融合前Ｆタンパク質を安定化させることを示す。 図５：ＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆ（ＲＳＶ１８０３０５；配列番号２０）の精製。このバリアントは、Ｄ４８６Ｎ置換と、融合前コンフォメーションをさらに安定化させる、本発明に係る２つの追加の置換（Ｐ１０１Ｑ及びＩ１５２Ｖ）とを含み、ＲＳＶ ｐｒｅ－Ｆ（ＲＳＶ１７２５２７；配列番号２１）の精製物は、変異Ｓ４６Ｇ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｔ３５７Ｒ、Ｎ３７１Ｙ、Ｄ４８６Ｎ、及びＤ４８９Ｙにより融合前コンフォメーションで安定しており、且つ本発明に係る追加の変異Ｐ１０１Ｑ及びＩ１５２Ｖを含んでいた。（Ａ）及び（Ｂ）：ＲＳＶ１８０３０５は、Ｃ末端Ｃ－タグを含み、実施例２で説明されているようにＨｅｋ２９３細胞 ３００ｍｌから精製された。矢印は、プールされた画分を示す（図５Ｂを参照されたい）。精製されたＲＳＶ１８０３０５（Ｃ）及びＲＳＶ１７２５２７（Ｄ）を、４週にわたる４℃での保存後に、ＳＥＣ－ＭＡＬＳで分析した。 （上記の通り。） （上記の通り。） （上記の通り。） 非還元条件下（レーン２）及び還元条件下（レーン４）でのＳＥＣクロマトグラムからのプールされたピークを含むタンパク質サンプルであるＲＳＶ１７２５２７（配列番号２１）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。ゲルを、クマシーブリリアントブルーで染色する。 図７：精製されたｐｒｅ－Ｆタンパク質ＲＳＶ１８０３０５（配列番号２０）及びＲＳＶ１７２５２７（配列番号２１）のＥＬＩＳＡを、対照融合前Ｆタンパク質ＲＳＶ１５００４２（配列番号２２）（例えば、国際公開第２０１７／１７４５６８号パンフレットで説明されているＰＲＰＭ）と比較し、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションに特異的なモノクローナル抗体ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０２（それぞれ国際公開第ＷＯ２０１２／００６５９６号パンフレットで説明されている抗体５８Ｃ５及び３０Ｄ８の可変領域を含む）への結合と、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーション及び融合後コンフォメーションの両方に結合し、且つ配列番号２５を含む重鎖可変領域及び配列番号２６を含む軽鎖可変領域を含むＭａｂ ＣＲ９５０６への結合とに関して試験した。平均±ＳＥとしてプロットした。 （上記の通り。） 精製されたｐｒｅ－Ｆタンパク質（Ａ）ＲＳＶ１８０３０５及び（Ｂ）ＲＳＶ１７２５２７の温度安定性。融解温度（Ｔｍ℃）を、ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ蛍光染料による示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）アッセイにより決定した（実施例５で説明されている）。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、ウイルス膜と宿主細胞膜との融合に関与し、この融合は、感染に必要とされる。ＲＳＶ Ｆ ｍＲＮＡは、Ｆ０と称される５７４個のアミノ酸の前駆体タンパク質に翻訳され、この前駆体タンパク質は、Ｎ末端に、小胞体内のシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列（例えば、配列番号１３又は１４のアミノ酸残基１～２６）を含む。Ｆ０は、細胞プロテアーゼ（特に、フーリン又はフーリン様プロテアーゼ）により２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間及び１３６／１３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０～１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる）が除去され、Ｆ１及びＦ２と称される２つのドメイン（又はサブユニット）が生成される。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７～５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを含み、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０～５５０）領域及び細胞質領域（アミノ酸残基５５１～５７４）を含む。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２７～１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合している。Ｆ１－Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。
上記のように、現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは未だ入手不能である。ワクチンの作製に有望な１つのアプローチは、精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質に基づくサブユニットワクチンを作製することである。しかしながら、このアプローチの場合には、精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質が、例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する融合前コンフォメーションに特異的な抗体へのＲＳＶ Ｆタンパク質の特異的結合により決定された場合に、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似するコンフォメーションであり、且つ経時的に安定している（即ち、融合前コンフォメーションのままである）こと、及び十分な量で作製され得ることが望ましい。加えて、可溶性のサブユニットベースのタンパク質ワクチンの場合には、ＲＳＶ Ｆタンパク質を、膜貫通（ＴＭ）領域及び細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦタンパク質）を生成する必要がある。ＴＭ領域は、膜アンカリングに関与し、且つ安定性を増加させることから、アンカーなしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質と比べてかなり不安定であり、融合後最終状態に容易にリフォールディングするであろう。そのため、高い発現レベル及び高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るためには、融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。また、完全長（膜結合した）ＲＳＶ Ｆタンパク質は準安定でもあることから、融合前コンフォメーションの安定化は、完全長ＲＳＶ Ｆタンパク質（即ち、ＴＭ及び細胞質領域を含む）にも望ましく、例えば、任意の弱毒化生ワクチン又はベクターベースのワクチンのアプローチにも望ましい。
融合前コンフォメーションでの、Ｆ１サブユニット及びＦ２サブユニットに切断される可溶性ＲＳＶ Ｆの安定化のために、この可溶性ＲＳＶ－Ｆ Ｃ末端のＣ末端に、フィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）ベースの三量化ドメインが融合された（ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０，２０１３））。このフィブリチンドメイン又は「フォールドン」は、Ｔ４フィブリチンに由来しており、以前は人工的な天然三量化ドメインと説明された（Ｌｅｔａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）；Ｓ－Ｇｕｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４））。しかしながら、この三量化ドメインの融合のみでは、融合前ＲＳＶ－Ｆタンパク質は安定化しない（Ｋｒａｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１５））。実際に、これらの努力では、ヒトでの試験に適した候補を未だ得るに至っていない。
最近、本発明者らは、融合前コンフォメーションのＲＳＶ Ｆタンパク質を安定化するいくつかの変異の組み合わせを説明した（例えば、国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレット及び同第２０１４／２０２５７０号パンフレット）。そのため、例えば、２１５位のアミノ酸残基の変異（好ましくは、２１５位のアミノ酸ＳのＰへの変異）を含む安定な融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質が説明されている。加えて、短縮されたＦ１ドメインと、２１５位のアミノ酸残基の変異（好ましくは、２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異）とを含む可溶性融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質であって、前記短縮されたＦ１ドメインに結合した異種三量化ドメインを含むタンパク質が説明されている。追加の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質であって、任意選択的に２１５位での変異との組み合わせで、１つ又は複数の他の安定化変異（例えば、４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異、３５７位のアミノ酸残基ＴのＫ若しくはＲへの変異、及び／又は３７１位のアミノ酸残基ＮのＹへの変異）を含むタンパク質が説明されている。さらなる融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質であって、１つ又は複数の他の変異（例えば、４８９位のアミノ酸残基ＤのＹへの変異、３９８位のアミノ酸残基ＳのＬへの変異、及び／又は３９４位のアミノ酸ＫのＲへの変異）をさらに含むタンパク質が説明されている。
本発明は、１つ又は複数の安定化アミノ酸を含む新規の組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質であって、この１つ又は複数の安定化アミノ酸は、任意選択的に４８６位の安定化アミノ酸との組み合わせで、７９位、１０１位、１５２位、２２６位、及び／又は３５４位に存在している、新規の組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質を提供する。本発明によれば、任意選択的に４８６位のアミノ酸残基Ｎの存在との組み合わせでの、７９位、１０１位、１５２位、３５４位、及び／又は２２６位（配列番号１３又は１４に従うナンバリング）の１つ又は複数の特定の安定化アミノ酸の存在により、融合前コンフォメーションのタンパク質が安定化されことが発見されている。
本発明によれば、示された位置での特定の安定化アミノ酸の存在により、融合前コンフォメーションのタンパク質の安定性が増加することが実証されている。本発明によれば、この特定のアミノ酸は、アミノ酸配列中に既に存在し得るか、又はこの位置のアミノ酸の本発明に係る特定のアミノ酸への置換（変異）により導入され得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列を含む組換えＦタンパク質であって、７９位のアミノ酸は、Ｍであり、１０１位のアミノ酸は、Ｓ、Ｑ、若しくはＴであり、１５２位のアミノ酸は、Ｖ若しくはＭであり、２２６位のアミノ酸は、Ｍであり、及び／又は３５４位のアミノ酸は、Ｌであり、任意選択的に、４８６位のアミノ酸は、Ｎである、組換えＦタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列を含む、ＲＳＶ サブグループＡの組換えＦタンパク質であって、７９位のアミノ酸は、Ｍであり、１０１位のアミノ酸は、Ｓ、Ｑ、若しくはＴであり、１５２位のアミノ酸は、Ｖ若しくはＭであり、及び／又は３５４位のアミノ酸は、Ｌであり、任意選択的に、４８６位のアミノ酸は、Ｎである、組換えＦタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列を含む、ＲＳＶ サブグループＢの組換えＦタンパク質であって、１５２位のアミノ酸は、Ｖ若しくはＭであり、及び／又は２２６位のアミノ酸は、Ｍであり、任意選択的に、４８６位のアミノ酸は、Ｎである、組換えＦタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、任意選択的に４８６位のアミノ酸の変異との組み合わせで、７９位のアミノ酸残基の変異、１０１位のアミノ酸残基の変異、１５２位のアミノ酸残基の変異、２２６位のアミノ酸残基の変異、及び３５４位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される１つ又は複数の安定化変異を含む組換え融合前Ｆタンパク質を提供する。
具体的な実施形態では、本発明は、７９位のアミノ酸残基の変異、１０１位のアミノ酸残基の変異、１５２位のアミノ酸残基の変異、３５４位のアミノ酸残基の変異、及び２２６位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される１つ又は複数の安定化変異との組み合わせで、４８６位のアミノ酸残基の変異（好ましくは、４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ））を含む組換え融合前Ｆタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、任意選択的に４８６位のアミノ酸残基の変異（好ましくは、４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ））との組み合わせで、７９位のアミノ酸残基の変異、１０１位のアミノ酸残基の変異、１５２位のアミノ酸残基の変異、及び３５４位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される１つ又は複数の安定化変異を含む、ＲＳＶ サブグループＡの組換え融合前Ｆタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、任意選択的に４８６位のアミノ酸残基の変異（好ましくは、４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ））との組み合わせで、１５２位のアミノ酸残基の変異、及び／又は２２６位のアミノ酸残基の変異を含む、ＲＳＶ サブグループＢの組換え融合前Ｆタンパク質を提供する。
ある特定の実施形態では、７９位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）のメチオニン（Ｍ）への変異（Ｉ７９Ｍ）である。
ある特定の実施形態では、１０１位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、又はトレオニン（Ｔ）への変異（Ｐ１０１Ｓ、Ｐ１０１Ｑ、又はＰ１０１Ｔ）である。
ある特定の実施形態では、１５２位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）又はメチオニン（Ｍ）への変異（Ｉ１５２Ｖ又はＩ１５２Ｍ）である。
ある特定の実施形態では、３５４位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸グルタミン（Ｑ）のロイシン（Ｌ）への変異（Ｑ３５４Ｌ）である。
ある特定の実施形態では、２２６位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸リシン（Ｋ）のメチオニン（Ｍ）への変異（Ｋ２２６Ｍ）である。
ある特定の実施形態では、融合前Ｆタンパク質は、下記からなる群から選択される１つ又は複数の追加の安定化変異を含む：
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異；
（ｃ）２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異
（ｄ）３５７位のアミノ酸ＴのＫへの変異；
（ｅ）３７１位のアミノ酸ＮのＹへの変異；
（ｆ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ，Ｎ、又はＩへの変異；
及び
（ｇ）４８９位のアミノ酸残基ＤのＹへの変異。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、２つ以上の安定化アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、２つ以上の安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、３つ以上の安定化アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、３つ以上の安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、４つ以上の安定化アミノ酸又は安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、５つ以上の安定化アミノ酸又は安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、６つ以上の安定化アミノ酸又は安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、７つ以上の安定化アミノ酸又は安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、８つ以上の安定化アミノ酸又は安定化変異を含む。
ある特定の実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、９つ以上の安定化アミノ酸又は安定化変異を含む。
好ましい実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、ＲＳＶ サブグループＡ由来であり、且つ任意選択的に４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異、２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異、３５７位のアミノ酸残基ＴのＲへの変異、３７１位のアミノ酸残基ＮのＹへの変異、４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異、及び４８９位のアミノ酸残基ＤのＹへの変異との組み合わせで、１０１位のアミノ酸ＰのＱへの変異、及び１５２位のアミノ酸ＩのＶへの変異を少なくとも含む。
好ましい実施形態では、組換え融合前Ｆタンパク質は、ＲＳＶ サブグループＢ由来であり、且つ任意選択的に４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異、２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異、３５７位のアミノ酸残基ＴのＲへの変異、３７１位のアミノ酸残基ＮのＹへの変異、４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異、及び４８９位のアミノ酸残基ＤのＹへの変異との組み合わせで、１５２位のアミノ酸ＩのＭへの変異、及び２２６位のアミノ酸ＫのＭへの変異を少なくとも含む。
そのため、本発明は、新規の安定な組換え融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質（即ち、融合前コンフォメーションで安定化されているＲＳＶ Ｆタンパク質）又はその断片を提供する。本発明の安定な融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片は、融合前コンフォメーションで存在し、即ち、このタンパク質又はその断片は、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（提示する）。融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは存在しないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオンで発現されるＲＳＶ Ｆタンパク質のものと同一のエピトープを含み得、従って、予防的中和抗体を誘発するという利点を備え得ると考えられる。
ある特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（以降、ＣＲ９５０１と称される）並びに／又は配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（ＣＲ９５０２と称される）により認識される少なくとも１つのエピトープを含む（表２）。ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０２は、それぞれ抗体５８Ｃ５及び３０Ｄ８の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのためこれらの抗体の結合特異性を有するが、これらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく融合前コンフォメーションのＲＳＶ Ｆタンパク質に特異的に結合することが既に分かっている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットを参照されたい）。
本発明はまた、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションを安定化させる方法であって、このＲＳＶ Ｆタンパク質に１つ又は複数の安定化変異を導入することであり、この１つ又は複数の安定化変異は、任意選択的に４８６位のアミノ酸の変異（好ましくは、４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ））との組み合わせで、７９位のアミノ酸の変異、１０１位のアミノ酸残基の変異、１５２位のアミノ酸残基の変異、３５４位のアミノ酸残基の変異、及び２２６位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される、導入することを含む方法も提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、サブグループＡのＲＳＶ Ｆタンパク質を安定化させる方法であって、任意選択的に４８６位のアミノ酸の変異（好ましくは、４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ））との組み合わせで、７９位のアミノ酸の変異、１０１位のアミノ酸残基の変異、及び３５４位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される１つ又は複数の安定化変異を導入することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、サブグループＢのＲＳＶ Ｆタンパク質を安定化させる方法であって、任意選択的に４８６位のアミノ酸の変異（好ましくは、４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ））との組み合わせで、１５２位のアミノ酸の変異、及び／又は２２６位のアミノ酸残基の変異を導入することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、７９位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）のメチオニン（Ｍ）への変異（Ｉ７９Ｍ）である。
ある特定の実施形態では、１０１位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、又はトレオニン（Ｔ）への変異（Ｐ１０１Ｓ、Ｐ１０１Ｑ、又はＰ１０１Ｔ）である。
ある特定の実施形態では、１５２位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）又はメチオニン（Ｍ）への変異（Ｉ１５２Ｖ又はＩ１５２Ｍ）である。
ある特定の実施形態では、３５４位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸グルタミン（Ｑ）のロイシン（Ｌ）への変異（Ｑ３５４Ｌ）である。
ある特定の実施形態では、２２６位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸リシン（Ｋ）のメチオニン（Ｍ）への変異（Ｋ２２６Ｍ）である。
ある特定の実施形態では、この方法は、下記からなる群から選択される１つ又は複数の追加の安定化変異を導入することを含む：
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異；
（ｃ）２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異
（ｄ）３５７位のアミノ酸ＴのＫへの変異；
（ｅ）３７１位のアミノ酸ＮのＹへの変異；
（ｆ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ，Ｎ、又はＩへの変異；
及び
（ｇ）４８９位のアミノ酸残基ＤのＹへの変異。
ある特定の実施形態では、この方法は、２つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、３つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、４つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、５つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、６つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、７つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、８つ以上の安定化変異を導入することを含む。
ある特定の実施形態では、この方法は、９つ以上の安定化変異を導入することを含む。
好ましい実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブグループＡ由来であり、且つこの方法は、１０１位のアミノ酸ＰのＱへの変異、及び１５２位のアミノ酸ＩのＶへの変異を少なくとも導入することを含む。
別の好ましい実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、サブグループＢ由来であり、且つこの方法は、１５２位のアミノ酸ＴのＭへの変異、及び２２６位のアミノ酸ＫのＭへの変異を少なくとも導入することを含む。
本発明は、さらに、前記方法により得られる組換え融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び本明細書で説明されているその使用を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明の組換え融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、三量体タンパク質である。
上記のように、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質の断片もまた、本発明に含まれる。この断片を、アミノ末端欠失（例えば、シグナル配列を切断することによる）並びにカルボキシ末端欠失（例えば、膜貫通領域及び／若しくは細胞質側末端を欠失させることによる）のいずれかから得ることができるか、又はその両方から得ることができる。この断片は、Ｆタンパク質の免疫学的に活性な断片（即ち、対象に免疫応答を生じさせる部分）を含むように選択され得る。このことは、当業者には全て慣例である、インシリコ、インビトロ、及び／又はインビボの方法を使用して容易に決定され得る。
ある特定の実施形態では、本発明に係るコード化タンパク質又はその断片は、配列番号１３又は１４のアミノ酸１～２６に対応するシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチドとも称される）を含む。シグナル配列は、典型的には、分泌経路に向かう新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（例えば、５～３０個のアミノ酸の長さ）アミノ酸配列であり、典型的には、シグナルペプチダーゼにより切断されて、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質が生成される。
ある特定の実施形態では、本発明に係るタンパク質又はその断片は、シグナル配列を含まない。
ある特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質（その断片）は、可溶性タンパク質である（即ち、膜結合しない）。ある特定の実施形態では、本発明に係る安定な融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片は、短縮されたＦ１ドメインを含み、且つ前記短縮されたＦ１ドメインに結合した異種三量化ドメイン又は三量体のより高次の集合のためのアセンブリドメインを含む。本発明によれば、本明細書で説明されている安定化変異の内の１つ又は複数と組み合わされた、短縮されたＦ１ドメインのＣ末端アミノ酸残基への異種三量化ドメインの結合により、高発現を示し且つ融合前特異的抗体に結合する可溶性のＲＳＶ Ｆタンパク質が提供されることが示され、このことは、このタンパク質が融合前コンフォメーションであることを示す。
ある特定の実施形態では、異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１５）を含む。
上記のように、ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質又はその断片は、短縮されたＦ１ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「短縮された」Ｆ１ドメインは、完全長Ｆ１ドメインではないＦ１ドメイン（即ち、Ｎ末端又はＣ末端で１つ又は複数のアミノ酸残基が欠失しているＦ１ドメイン）を指す。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質側末端は、可溶性細胞外ドメインとしての発現を可能にするために欠失している。
ある特定の実施形態では、三量化ドメインは、ＲＳＶ Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に結合している。そのため、ある特定の実施形態では、三量化ドメインは、配列番号１５を含み、且つＲＳＶ Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に直接的に又はリンカーを介して結合している。
ある特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現レベルは、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質及び／又は４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ）を含むＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して上昇している。ある特定の実施形態では、融合前含有量（融合前特異的ＣＲ９５０１抗体に結合するＦタンパク質の割合として定義される）は、前記安定化置換が行なわれていない野生型Ｆタンパク質と比較して、タンパク質の回収後５～１０日で有意に高かった。
本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、安定化アミノ酸の内の１つ又は複数の存在（既に存在しているか、又は変異により導入されている）により、融合前コンフォメーションで安定化されており、即ち、タンパク質のプロセシング（例えば、精製、凍結融解サイクル、及び／又は保存等）時に、融合後コンフォメーションへと容易に変化しない。
ある特定の実施形態では、本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、変異がないＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、４℃での保存時の安定性が増大している。ある特定の実施形態では、このタンパク質は、４℃での保存時に、少なくとも１５日にわたり、好ましくは少なくとも１８日にわたり、好ましくは少なくとも３０日にわたり、好ましくは少なくとも６０日にわたり、好ましくは少なくとも６ヶ月にわたり、より一層好ましくは少なくとも１年にわたり、安定である。「保存時に安定な」とは、タンパク質が、少なくとも３０日にわたる４℃での溶液（例えば、培地）中におけるこのタンパク質の保存時に、融合前特異的抗体（例えば、ＣＲ９５０１及び／又はＣＲ９５０２）に特異的な少なくとも１つのエピトープを依然として提示することを意味する。ある特定の実施形態では、このタンパク質は、４℃での融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質の保存時に、少なくとも６ヶ月にわたり、好ましくは少なくとも１年にわたり、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
ある特定の実施形態では、本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、前記変異がないＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、実施例６で説明されているように溶融温度を測定して決定された熱安定性が増大している。
ある特定の実施形態では、このタンパク質は、適切な製剤緩衝液中での１～６回の凍結融解サイクルに供された後も、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
ある特定の実施形態では、このタンパク質は、ＨＩＳ－Ｔａｇ、ｓｔｒｅｐ－タグ、又はｃ－タグを含む。Ｈｉｓ－Ｔａｇ又はポリヒスチジン－タグは、少なくとも５つのヒスチジン（Ｈ）残基からなる、タンパク質中のアミノ酸モチーフであり；ｓｔｒｅｐ－タグは、８つの残基からなるアミノ酸配列であり（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２３））；ｃ－タグは、４つの残基からなるアミノ酸モチーフである（ＥＰＥＡ；配列番号２４）。タグは、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に存在することが多く、一般的には精製目的に使用される。
ＲＳＶは、２つの抗原性サブグループ：Ａ及びＢを有する単一血清型として存在することが知られている。２つのグループのプロセシングされた成熟Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、約９３％同一である。本出願全体を通して使用される場合、アミノ酸の位置は、サブグループＡ（配列番号１３）又はサブグループＢ（配列番号１４）の臨床分離株のＦタンパク質のコンセンサス配列を参照して付与される。そのため、本発明で使用される場合、「ＲＳＶ Ｆタンパク質の「ｘ」位のアミノ酸」という表現は、配列番号１３（サブグループＡの場合）又は配列番号１４（サブグループＢの場合）のＲＳＶ Ｆタンパク質の「ｘ」位でのアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願全体を通して使用されるナンバリングシステムでは、１は未成熟Ｆ０タンパク質（配列番号１３又は１４）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。別のＲＳＶ株のＦタンパク質が使用される場合には、このＦタンパク質のアミノ酸の位置は、必要に応じてギャップを挿入しつつ、この他のＲＳＶ株の配列と配列番号１３又は１４のＦタンパク質とをアラインさせることにより、配列番号１３（サブグループＡの場合）又は配列番号１４（サブグループＢの場合）のＦタンパク質のナンバリングを参照してナンバリングする。配列アラインメントを、当該技術分野で公知の方法を使用して行ない得、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｂｉｏｅｄｉｔ又はＣＬＣ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈにより行ない得る。
本出願全体を通して使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で記載されており、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で記載されている。
本発明に係るアミノ酸は、２０種の天然に存在するもの（又は「標準」アミノ酸）の内のいずれかであり得る。標準アミノ酸は、その特性に基づいて、いくつかのグループに分類され得る。重要な因子は、電荷、親水性又は疎水性、サイズ、及び官能基である。これらの特性は、タンパク質構造及びタンパク質間相互作用にとって重要である。いくつかのアミノ酸は、特別な特性を有する（例えば、他のシステイン残基とジスルフィド共有結合（又はジスルフィド架橋）を形成し得るシステイン、タンパク質骨格のターンを誘導するプロリン、及び他のアミノ酸と比べてフレキシブルなグリシン）。表１は、標準アミノ酸の略語及び特性を示す。
タンパク質に対する変異は慣例的な分子生物学手順により行なわれ得ることが当業者に認識されるだろう。本発明に係る変異は、好ましくは、この変異を含まないＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現レベルの上昇、及び／又は安定性の増大をもたらす。
本発明は、さらに、本発明に係るＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
好ましい実施形態では、本発明に係るタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）における発現用にコドン最適化されている。コドン最適化の方法は既知であり、既に説明されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。配列は、野生型配列と比較して少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えられている場合には、コドン最適化されていると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンのことであり、より好ましいコドンとは、生物において、好ましくないコドンと比べて使用される頻度が高いコドンのことである。特定の生物に関するコドン使用の頻度を、コドン頻度表（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）で見出し得る。好ましくは、複数の好ましくないコドン（好ましくは、ほとんど又は全ての好ましくないコドン）が、より好ましいコドンに置き換えられている。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンが、コドン最適化配列で使用されている。好ましいコドンに置き換えられると、概して発現が高くなる。
多くの異なるポリヌクレオチド及び核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として同じタンパク質をコードし得ることが、当業者に理解されるであろう。また、当業者が慣例の技術を使用して、タンパク質を発現させることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子がコードするタンパク質配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることも、理解される。従って、別途指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり且つ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよいし含まなくてもよい。
核酸配列は、慣例の分子生物学技術を使用してクローン化され得るか、又はＤＮＡ合成により新規に生成され得、それは、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、慣例の手順を使用して実施され得る。
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターも提供する。そのため、ある特定の実施形態では、本発明に係る核酸分子は、ベクターの一部である。そのようなベクターは、当業者に公知の方法により容易に操作され得、例えば、原核細胞及び／又は真核細胞で複製され得るように設計され得る。加えて、多くのベクターは、真核細胞の形質転換に使用され得、そのような細胞のゲノムに全体的に又は部分的に組み込まれ、その結果、ゲノムで所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適しており且つ目的の核酸の転写に使用され得る任意のベクターであり得る。本発明に係る好適なベクターは、例えば、アデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクター等である。当業者は、適切な発現ベクターを選択して、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入し得る。
融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞も、本発明の一部を形成する。融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、若しくは酵母、真菌、昆虫細胞、及び同類のもの、又はトランスジェニック動物若しくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術により作製され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、多細胞生物由来であり、ある特定の実施形態では、細胞は、脊椎動物起源又は無脊椎動物起源である。ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本発明の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質等の組換えタンパク質の産生は、発現可能形式でタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条件下での細胞の培養、及び前記細胞におけるタンパク質発現を可能にすることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であり得、通常は、核酸の発現をもたらし得る配列（例えば、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及び同類のもの）を必要とする。当業者は、様々なプロモーターが宿主細胞中での遺伝子の発現を得るために使用され得ることを認識している。プロモーターは、構成的又は調節的であり得、様々な供給源（例えば、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物の供給源）から入手され得るか、又は人為的に設計され得る。
細胞培養培地は、様々なベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が目的のタンパク質（本明細書では融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質）を発現するように慣例的に選択され得る。好適な培地は、血清を含んでもよいし含まなくてもよい。
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、宿主細胞中に天然には存在しない核酸分子である。異種核酸分子は、例えば、標準の分子生物学技術によりベクターに導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に作動可能に結合している。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで行われ得る。さらなる調節配列が加えられてもよい。導入遺伝子の発現のために多くのプロモーターが使用され得、それらは当業者に既知であり、例えば、それらは、ウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、合成プロモーター、及び同類のものを含み得る。真核細胞内での発現を得るのに好適なプロモーターの非限定的な例は、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）であり、例えばＣＭＶ最初期プロモーターであり、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．－７３５～＋９５を含むものである。ポリアデニル化シグナル（例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書））が、導入遺伝子の後に存在してもよい。或いは、いくつかの広く使用されている発現ベクターが、当該技術分野で及び商用供給源から入手可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ及びｐＥＦベクターシリーズ、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅｓのｐＭＳＣＶ及びｐＴＫ－Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔ等があり、これらを使用して、目的のタンパク質を組換えにより発現させ得えるか、又は好適なプロモーター及び／若しくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列、並びに同類のものを得ることができる。
細胞培養は、任意のタイプの細胞培養（例えば、付着細胞培養、例えば培養容器の表面又はマイクロキャリアに付着した細胞、及び懸濁培養）であり得る。ほどんどの大規模懸濁培養は、操作及びスケールアップが最も簡単であることからバッチ法又は流加法として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続法がより一般的になりつつあり、且つ好適でもある。好適な培養培地も当業者に公知であり、一般に、商用供給源から大量に得ることができるか、又は標準プロトコルに従って注文生産し得る。培養を、例えば、バッチ、流加、連続システム、及び同類のものを使用して、シャーレ、ローラーボトル、又はバイオリアクター内で行い得る。細胞を培養するのに好適な条件は、既知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３），及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ ０－４７１－３４８８９－９）を参照されたい）。
本発明は、さらに、上記の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターを含む組成物を提供する。そのため、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが融合後コンフォメーションには存在しないエピトープを提示する融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組成物を提供する。本発明はまた、そのような融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子及び／又はベクターを含む組成物も提供する。本発明は、さらに、上記の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、さらに、上記の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターと、１種又は複数種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
本発明はまた、対象にＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、本発明に係る安定化された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターの使用も提供する。さらに提供されるのは、対象にＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターをこの対象に投与することを含む方法である。同様に提供されるのは、対象へのＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導での使用のための、本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターである。さらに提供されるのは、対象へのＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導での使用のための薬剤の製造のための、本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターの使用である。
本発明の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、又はベクターを、ＲＳＶ感染の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））及び／又は処置に使用し得る。ある特定の実施形態では、予防及び／又は処置は、ＲＳＶ感染に罹りやすい患者群を標的にし得る。そのような患者群として下記が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、及び好ましくは６５歳以上）、若齢者（例えば、５歳以下、１歳以下）、妊婦（母胎免疫化の場合）、入院患者、並びに抗ウイルス性化合物で処置されたが十分な抗ウイルス応答を示していない患者。
本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターを、例えば、ＲＳＶを原因とする疾患若しくは病態の独立した処置及び／若しくは予防で使用し得るか、又は（既存の若しくは将来の）ワクチン、抗ウイルス剤、及び／若しくはモノクローナル抗体等の他の予防的処置及び／若しくは治療的処置と組み合わせて使用し得る。
本発明は、さらに、本発明に係る融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターを利用して、対象のＲＳＶ感染を予防する及び／又は処置する方法を提供する。特定の実施形態では、対象のＲＳＶ感染を予防する及び／又は処置する方法は、上記の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターの有効な量を、必要とする対象に投与することを含む。治療上有効な量は、ＲＳＶによる感染から生じる疾患又は病態を予防するのに、寛解させるのに、及び／又は処置するのに有効なタンパク質、核酸分子、又はベクターの量を指す。予防は、ＲＳＶの伝播の阻害若しくは低減を包含するか、又はＲＳＶによる感染に関連した症状の内の１つ若しくは複数の発症、進展、若しくは進行の阻害若しくは低減を包含する。寛解は、本明細書で使用される場合、目に見えるか若しくは知覚できる疾患の症状、ウイルス血症、又はインフルエンザ感染の任意の他の計測可能な徴候の低減を指し得る。
ヒト等の対象に投与するために、本発明は、本明細書で説明されている融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を使用し得る。本文脈では、「薬学的に許容される」という用語は、担体若しくは賦形剤が、使用される投与量及び濃度で、それらを投与する対象に如何なる望ましくないか又は有害な効果も引き起こさないことを意味する。そのような薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当該技術分野では公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照されたい）。ＲＳＶ Ｆタンパク質又は核酸分子は、凍結乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、滅菌溶液として製剤化されて投与されることが好ましい。滅菌溶液は、滅菌ろ過により調製されるか、又は当該技術分野でそれ自体既知である他の方法により調製される。次いで、この溶液は、凍結乾燥されるか、又は医薬投与容器に充填される。この溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０～９．５の範囲であり、例えばｐＨ５．０～７．５の範囲である。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、典型的には、好適な薬学的に許容される緩衝剤を含む溶液中に存在し、この組成物は塩も含み得る。任意選択的に、アルブミン等の安定剤が存在し得る。ある特定の実施形態では、洗浄剤が添加されている。ある特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、注射用製剤に製剤化され得る。
ある特定の実施形態では、本発明に係る組成物は、１種又は複数種のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントは、当該技術分野で既知である。「アジュバント」及び「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種又は複数種の物質と定義される。この文脈では、アジュバントは、本発明のＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例として、下記が挙げられる：アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム；油－エマルション組成物（又は水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９等のスクアレン－水エマルション（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照されたい）；サポニン製剤、例えば、ＱＳ２１及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、同第９６／１１７１１号パンフレット、同第２００４／００４７６２号パンフレット、同第２００５／００２６２０号パンフレットを参照されたい）；細菌又は微生物の派生物（これらの例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ－モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ－リボシル化細菌毒素又はその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、及び同類のものである）；真核生物のタンパク質（例えば、抗体又はその断片（例えば、抗原自体又はＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に対するもの）、並びに受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ等）（これらは、受容細胞と相互作用すると、免疫応答を刺激する））。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントとして、アルミニウムを、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、又はこれらの組み合わせの形態で、１回の用量当たり０．０５～５ｍｇ（例えば０．０７５～１．０ｍｇ）のアルミニウム含有量の濃度にて含む。
融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質をまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子等のナノ粒子と組み合わせても投与し得るか、又はこのナノ粒子にコンジュゲートさせ得る。融合前Ｆタンパク質を、アジュバントの有無にかかわらず、ナノ粒子と組み合わせ得るか、ナノ粒子中に封入し得るか、又はナノ粒子にコンジュゲートさせ得る。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号明細書で説明されている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号明細書又は同第４，４７４，７５７号明細書で開示されている。融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質をまた、自己集合タンパク質にもコンジュゲートさせ得る。
他の実施形態では、本組成物は、アジュバントを含まない。
ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、本発明に係るＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸、又はベクターを準備すること、及びこのＲＳＶ Ｆタンパク質、核酸、又はベクターを薬学的に許容される組成物に製剤化することを含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、ある特定の病原体又は疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに有効な活性成分を含む薬剤又は組成物を指し、これにより、この病原体又は疾患による感染に関連する症状の重症度、期間、又は他の徴候が少なくとも低減される（最大で完全消失する）。本発明では、ワクチンは、有効な量の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び／又は融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子、及び／又は前記核酸分子を含むベクターを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、入院に至る重篤な下気道疾患を予防する方法、並びに対象でのＲＳＶの感染及び複製に起因する肺炎及び細気管支炎等の合併症の頻度の低減を提供する。本発明に係る「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、そのため、典型的には、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含むことを暗示する。それは、さらなる活性成分を含んでもよいし含まなくてもよい。ある特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質及び／又は他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組み合わせワクチンであってもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与により行われてもよいし、本発明のワクチンとさらなる活性成分との組み合わせ製剤を投与することにより行われてもよい。
組成物を、対象（例えばヒト対象）に投与し得る。単回投与のための組成物中におけるＲＳＶ Ｆタンパク質の総用量は、例えば約０．０１μｇ～約１０ｍｇであり得、例えば１μｇ～１ｍｇであり得、例えば１０μｇ～１００μｇであり得る。単回投与のための組成物中における、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＤＮＡを含む（アデノ）ベクターの総用量は、例えば約０．１×１０１０ｖｐ／ｍｌ～２×１０１１ｖｐ／ｍｌであり得、好ましくは約１×１０１０ｖｐ／ｍｌ～２×１０１１ｖｐ／ｍｌであり得、好ましくは５×１０１０ｖｐ／ｍｌ～１×１０１１ｖｐ／ｍｌであり得る。
本発明に係る組成物の投与を、標準の投与経路を使用して実施し得る。非限定的な実施形態として、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、皮下、経皮）、又は粘膜投与（例えば、鼻腔内、口腔内）、及び同類のものが挙げられる。一実施形態では、組成物を、筋肉内注射により投与する。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物（例えばワクチン）を投与する様々な可能性を認識している。
対象は、本明細書で使用される場合、好ましくは、哺乳動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス、コットンラット）、又は非ヒト霊長類、又はヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。
タンパク質、核酸分子、ベクター、及び／又は組成物を、初回免疫として、又は追加免疫として、同種又は異種の初回免疫－追加免疫レジメンでも投与し得る。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、典型的には、そのような追加免疫ワクチン接種を、最初に対象に組成物を投与した（このような場合には「初回免疫ワクチン接種」と呼ばれる）後の１週間～１年（好ましくは２週間～４ヶ月）のある時点で、同じ対象に投与する。ある特定の実施形態では、この投与は、初回免疫投与、及び少なくとも１回の追加免疫投与を含む。
加えて、本発明のタンパク質を、例えば、本発明のタンパク質に結合可能な抗体が個体の血清中に存在するか否かを確定することにより、そのような個体の免疫状態を検査するための診断ツールとして使用し得る。そのため、本発明はまた、患者におけるＲＳＶ感染の存在を検出するためのインビトロ診断方法であって、ａ）前記患者から得られた生体サンプルと、本発明に係るタンパク質とを接触させる工程と、ｂ）抗体－タンパク質複合体の存在を検出する工程と
を含む方法に関する。
実施例１：培養物上清中でのＲＳＶ Ｆバリアントの融合前コンフォメーションの安定性
この安定性試験の対照として使用するＲＳＶ Ｆ配列は、サブグループＡのコンセンサス配列（配列番号１３）又はサブグループＢのコンセンサス配列（配列番号１４）のいずれかに基づいており、なぜならば、このコンセンサス配列は、臨床分離株に対応する野生型（非継代）配列に非常に類似しているからである（Ｋｕｍａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（２０１１））。検出目的のために、Ｆタンパク質のＣ末端にｓｔｒｅｐ－タグを融合させた。ＲＳＶ Ｆでの様々な点変異の安定性を評価するために、融合前コンフォメーションのＦタンパク質の含有量を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡで測定した。
このアッセイを、アッセイ緩衝液中の融合前特異的Ｍａｂ ＣＲ９５０１（０．８ｎＭ）、抗ヒトＩｇＧ受容体ビーズ、及びＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ Ｄｏｎｏｒビーズ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の混合物 ２５μｌに、ＲＳＶ Ｆサンプル ５μｌを添加することにより実施した。この混合物の室温での２．５時間のインキュベーション後に、６１５ｎｍでの化学発光を測定した。融合前コンフォメーションのＲＳＶ Ｆのみが両方の抗体に同時に結合し、そのため、このアッセイでシグナルが得られる。回収後０日目、４日目、１１日目、及び１８日目に測定を行ない、融合前Ｆシグナルの減少を、ｗｔ Ｆシグナル、及び安定化Ｄ４８６Ｎ変異を有するＦタンパク質のシグナルと比較した。不安定な融合前Ｆタンパク質を、ＣＲ９５０１結合（Ｆ ｗｔ及びＦ－Ｄ４８６Ｎ）の時間依存的喪失により同定し得るが、より安定な融合前構築物は、本発明の安定化点変異を有しない対照Ｆタンパク質（例えば、ｗｔＦ及びＦ－Ｄ４８６Ｎ）と比較した場合に、回収日でのより高い融合前Ｆ含有量、及び／又は４℃でのある期間にわたる保存後の融合前Ｆ含有量のより遅い減少若しくは減少なしを示した。図３は、変異Ｖ７６Ｇ、Ｉ７９Ｍ、Ｐ１０１Ｓ、Ｐ１０１Ｑ、Ｐ１０１Ｔ、Ｉ１５２Ｖ、又はＱ３５４Ｌの内の１つ又は複数の追加により、サブタイプＡのＦ－Ｄ４８６Ｎバリアントと比較して融合前Ｆタンパク質が安定化されることを示す。図４は、変異Ｔ１５２Ｍ及び／又はＫ２２６Ｍの追加により、サブタイプＢのＦ－Ｄ４８６Ｎバリアントと比較して融合前Ｆタンパク質が安定化されることを示す。
実施例２：安定な融合前ＲＳＶ Ｆポリペプチドの調製－安定化変異
コンセンサスＲＳＶ Ｆ（配列番号１３又は１４）に基づく可溶性融合前タンパク質を、明らかな不安定性（図３、４に示される）に起因して精製し得なかった。図３に示す安定化変異の一部を評価するために、既に説明されているＤ４８６Ｎ安定化変異に加えて、融合前コンフォメーションを安定化させる２つの変異（具体的には変異Ｐ１０１Ｑ及びＩ１５２Ｖ）を有するＲＳＶ－Ｆタンパク質（ＲＳＶ１８０３０５；配列番号２０）を作製した（Ｋｒａｒｕｐ ｅｔ．ａｌ．，２０１５）。加えて、別の安定化された融合前Ｆタンパク質を作製し（ＲＳＶ１７２５２７；配列番号２１）、この融合前Ｆタンパク質では、既に説明されているいくつかの安定化置換（具体的には、変異Ｓ４６Ｇ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｔ３５７Ｒ、Ｎ３７１Ｙ、Ｄ４８６Ｎ、及びＤ４８９Ｙ）を既に含む融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質に、Ｐ１０１Ｑ置換及びＩ１５２Ｖ置換を導入した。この構築物を、Ｇｅｎｅ Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で合成してコドン最適化した。この構築物を、部位特異的変異誘発及びＰＣＲに関する分野で広く知られている標準的方法により、ｐＣＤＮＡ２００４にクローニングしたか又は生成し、配列決定した。使用する発現プラットフォームは、ＨＥＫ２９３細胞であった。細胞を、製造業者の指示に従って２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して一過性にトランスフェクトし、３７℃及び１０％ＣＯ２で５日又は６日にわたり培養した。培養物上清を採取し、３００ｇで５分にわたり遠心して、細胞及び細胞片を除去した。その後、０．２２ｕｍの真空フィルタを使用して、遠心上清を滅菌ろ過し、使用するまで４℃で保存した。
融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を、ｐＨ５．０での陽イオン交換による、Ｃ－タグ付きタンパク質ＲＳＶ１８０３０５又はタグなしタンパク質ＲＳＶ１７２５２７の場合にはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｃ－タグ親和性カラム（ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓカラム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）、及びその後のＲｅｓｏｕｒｃｅ－Ｑカラムを使用する陰イオン交換を含む２段階精製プロトコルを使用して精製した。ＲＳＶ１８０３０５（配列番号２０）及びＲＳＶ１７２５２７（配列番号２１）の両方を、それぞれ図５ａ及び図５ｂに示すように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。４週間にわたる４℃での保存後、プールされたサンプルのＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析は、精製されたタンパク質が三量体であることを示しており、精製されたＲＳＶ１８０３０５には集合体がわずかに含まれていることも観察した。
実施例３：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。
精製されたＲＳＶ１７２５２７を、還元条件下又は非還元条件下で、４～１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、１×ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。全ての手順を、製造業者の指示に従って実施した。純度分析のために、このゲルを、Ｋｒｙｐｔｏｎ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。非還元ＲＳＶ１７２５２７及び還元ＲＳＶ１７２５２７は純粋であり、Ｆ０及びＦ１外部ドメインそれぞれの予想される高さで、バンドが見える。
実施例４：ＥＬＩＳＡ
４週にわたる４℃での保存後、精製された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質ＲＳＶ１８０３０５、ＲＳＶ１７２７２５、及び国際公開第２０１７／１７４５６８号パンフレットで既に説明されている対照融合前Ｆタンパク質（ＲＳＶ１５００４２）（配列番号２２）の、融合前特異的中和抗体への結合を、ＥＬＩＳＡで試験した。１／２ ＡｒｅａＰｌａｔｅ－９６ ＨＢプレート（白色、高タンパク質結合親和性（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を、抗ＲＳＶモノクローナル抗体の試験パネルでコーティングした。Ｍａｂ ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０２は、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーションに特異的であり、Ｍａｂ ＣＲ９５０６は、ＲＳＶ Ｆの融合前コンフォメーション及び融合後コンフォメーションの両方に結合する。ＣＲ９５０６は、モタビズマブと競合し（データは示さない）、同一の直鎖状エピトープに結合する。これらの抗体を、１μｇ／ｍｌにてＰＢＳで希釈し、ＰＢＳ中で４℃にて一晩プレートにコーティングした。翌日、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳでブロックした。全てのインキュベーションを、１時間にわたり室温で実施した。各工程後、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質の滴定液を、１％ウシ血清アルブミンを含む洗浄緩衝液で調製した。ＣＲ９５０６を、標準的手順に従ってビオチン化し、検出用のＢＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に０．０５μｇ／ｍｌで使用した。図７に示すように、全ての精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合前特異的Ｍａｂ（ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０２）と、両方のコンフォメーションに特異的なＭａｂ（ＣＲ９５０６）とに同様に結合し、そのため、本発明に係るＦタンパク質は融合前コンフォメーションであることが示された。
実施例５：ＲＳＶ Ｆタンパク質の温度安定性
精製されたタンパク質の温度安定性を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。精製された融合前Ｆタンパク質を、９６ウェル光学ｑＰＣＲプレート内でＳＹＰＲＯ橙色蛍光染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５０）と混合した。最適な染料及びタンパク質の濃度を、実験により決定した（データは示さない）。タンパク質の希釈をＰＢＳで実施し、減算参照として、染料のみを含む陰性対照サンプルを使用した。測定を、下記のパラメータを使用するｑＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７）で実施した：１秒当たり０．０１５℃の速度での２５～９５℃の温度勾配。データを、連続的に取得した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ＰＲＩＳＭソフトウエア（バージョン５．０４）を使用して、溶融曲線をプロットした。非線形ＥＣ５０シフト方程式を使用して、最大蛍光の５０％で溶融温度を算出した。ＲＳＶ１８０３０５の融解温度は６５．９度であり（図８ａ）、ＲＳＶ１７２５２７の融解温度は７２．９であった（図８ｂ）。参照融合前ＲＳＶ Ｆ（ＲＳＶ１５００４２）は、融解温度が６５．０である（データは示さない）。
Figure 2022513025000002
Figure 2022513025000003
配列
ＲＳＶ Ｆ Ａコンセンサス完全長（配列番号１３）
Figure 2022513025000004
ＲＳＶ Ｆ Ｂコンセンサス外部ドメイン（配列番号１４）
Figure 2022513025000005
配列番号１５（フィブリチン）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
ＣＲ９５０１重鎖（配列番号１６）：
Figure 2022513025000006
ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号１７）：
Figure 2022513025000007
ＣＲ９５０２重鎖（配列番号１８）：
Figure 2022513025000008
ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号１９）：
Figure 2022513025000009
ＲＳＶ１８０３０５（配列番号２０）
Figure 2022513025000010
ＲＳＶ１７２５２７（配列番号２１）
Figure 2022513025000011
ＲＳＶ１５００４２（配列番号２２）
Figure 2022513025000012
ＣＲ９５０６重鎖（配列番号２５）
Figure 2022513025000013
ＣＲ９５０６軽鎖（配列番号２６）
Figure 2022513025000014
参考文献
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Ｓｗａｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）

Claims (27)

  1. １つ又は複数の安定化アミノ酸を含む組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質であって、前記１つ又は複数の安定化アミノ酸は、任意選択的に４８６位の安定化アミノ酸との組み合わせで、７９位、１０１位、１５２位、２２６位、及び／又は３５４位に存在している、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質。
  2. 前記７９位のアミノ酸は、Ｍであり、前記１０１位のアミノ酸は、Ｓ、Ｑ、若しくはＴであり、前記１５２位のアミノ酸は、Ｖ若しくはＭであり、前記２２６位のアミノ酸は、Ｍであり、及び／又は前記３５４位のアミノ酸は、Ｌであり、任意選択的に、前記４８６位のアミノ酸は、Ｎである、請求項１に記載の組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質。
  3. 任意選択的に４８６位のアミノ酸の変異との組み合わせで、７９位のアミノ酸残基の変異、１０１位のアミノ酸残基の変異、１５２位のアミノ酸残基の変異、３５４位のアミノ酸残基の変異、及び２２６位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される１つ又は複数の安定化変異を含む請求項１又は２に記載の組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質。
  4. 前記７９位のアミノ酸残基の変異、前記１０１位のアミノ酸残基の変異、前記１５２位のアミノ酸残基の変異、前記３５４位のアミノ酸残基の変異、及び前記２２６位のアミノ酸残基の変異からなる群から選択される１つ又は複数の安定化変異との組み合わせで、前記４８６位のアミノ酸残基の変異を含み、好ましくは、前記４８６位のアミノ酸ＤのＮへの変異（Ｄ４８６Ｎ）を含む請求項３に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  5. 前記７９位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）のメチオニン（Ｍ）への変異である、請求項３又は４に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  6. 前記１０１位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸プロリン（Ｐ）のセリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、又はトレオニン（Ｔ）への変異である、請求項３又は４に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  7. 前記１５２位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸イソロイシン（Ｉ）のバリン（Ｖ）又はメチオニン（Ｍ）への変異である、請求項３又は４に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  8. 前記３５４位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸グルタミン（Ｑ）のロイシン（Ｌ）への変異である、請求項３又は４に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  9. 前記２２６位のアミノ酸残基の変異は、アミノ酸リシン（Ｋ）のメチオニン（Ｍ）への変異である、請求項３又は４に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  10. 前記組換え融合前Ｆタンパク質は、前記安定化変異の内の２つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  11. 前記組換え融合前Ｆタンパク質は、前記安定化変異の内の３つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  12. 前記組換え融合前Ｆタンパク質は、前記安定化変異の内の３つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  13. 前記組換え融合前Ｆタンパク質は、前記安定化変異の内の４つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  14. 前記組換え融合前Ｆタンパク質は、前記安定化変異の内の５つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  15. 前記組換え融合前Ｆタンパク質は、前記安定化変異の内の６つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え融合前Ｆタンパク質。
  16. 前記タンパク質は、前記融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体並びに／又は配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、並びに配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、及び配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体により認識される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質。
  17. 前記タンパク質は、三量体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質。
  18. 短縮されたＦ１ドメイン、及び前記短縮されたＦ１ドメインに結合した異種三量化ドメインを含む請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質。
  19. 前記異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１５）を含む、請求項１８に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質。
  20. 前記三量化ドメインは、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸残基５１３に結合している、請求項１８又は１９に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子。
  22. 前記核酸分子は、哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項２１に記載の核酸分子。
  23. 請求項２１又は２２に記載の核酸分子を含むベクター。
  24. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、請求項２１若しくは２２に記載の核酸分子、及び／又は請求項２３に記載のベクターを含む組成物。
  25. ＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導での使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、請求項２１若しくは２２に記載の核酸分子、及び／又は請求項２３に記載のベクター。
  26. ワクチンとしての使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、請求項２１若しくは２２に記載の核酸分子、及び／又は請求項２３に記載のベクター。
  27. ＲＳＶ感染の予防及び／又は処置での使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質、請求項２１若しくは２２に記載の核酸分子、及び／又は請求項２３に記載のベクター。
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