BRPI0621513A2 - partìculas quiméricas do tipo timovìrus - Google Patents
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Abstract
PARTìCULAS QUIMéRICAS DO TIPO TIMOVìRUS. A presente revelação está relacionada a partículas quiméricas do tipo timovírus (T-VLPs) compreendendo uma proteína de fusão que adicionalmente consiste de uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de timovirus e uma segunda proteína. Essas TVLPs quiméricas são úteis como antígenos. A presente revelação proporciona meios altamente eficientes para diferenciar animais infectados com vírus da doença do pé e da boca (FMDV) de animais vacinados. A presente revelação também proporciona um processo para a produção of TVLPs quiméricos e um kit diagnóstico para a determinação de anticorpos específicos do FMDV para diferençar animais infectados por FMDV dos animais vacinados. A presente revelação também proporciona o uso das TVLPs quiméricas para propósitos de diagnóstico.
Description
"PARTÍCULAS QUIMÉRICAS DO TIPO TIMOVÍRUS"
Campo da Invenção
Essa revelação está relacionada a partículas quiméricas do tipo timovírus (TVLPs) que compreendem proteína de fusão consistindo de proteína estrutural de Physalis mottle tymovirus (PhMV) e peptídeos/epítopos do vírus ou hormônio. Essas TVLPs quiméricas são usadas como antígenos. A presente revelação proporciona um meio altamente eficiente pa- ra diferençar animais infectados com FMDV dos animais vacinados. A presente revelação também está relacionada ao uso das referidas partículas quiméricas do tipo timovírus para propósitos de diagnóstico.
Antecedentes da Invenção
Doença do pé e da boca (FMD) é uma das mais contagiantes doenças virais agu- das de animais com pés fendidos tais como gado, ovinos, caprinos e suínos (Brown, 2003). A FMD é provocada pelo vírus da doença do pé e da boca (FMDV), pertencente ao gênero Aphthovirus na família Picornaviridae. A transmissão no ar é o método comum de dissemi- nação embora a doença também se espalhe através de contato. A FMD é controlada por aniquilação em países não endêmicos e por vacinação em países endêmicos (Grubman e Baxt, 2004).
A vacina convencional atual é uma preparação do vírus integral inativado (Doei, 2003). As dificuldades envolvidas em diferenciar os animais vacinados dos animais infecta- dos tem mantido muitos paises distantes da adoção da estratégia de vacinação da FMD como um método primário de controle. É necessário diferenciar animais vacinados de ani- mais infectados utilizando um teste diagnóstico preciso e confiável se os países não endê- micos possam considerar a vacinação um método de controle durante um surto.
Anticorpos principalmente contra as proteínas estruturais do FMDV são induzidas em animais vacinados, enquanto que animais infectados produzem anticorpos a ambas as proteínas estruturais e não estruturais (NSP) (Sun e colaboradores, 2004). Portanto, ensaios que demonstram anticorpos contra proteínas não estruturais possuem o potencial para dife- rençar animais infectados daqueles que tenham sido vacinados. Os anticorpos contra poli- proteína 3ABC têm se provado serem o marcador mais confiável da infecção por FMDV. ELISA utilizando proteínas recombinantes produzidas ou em E.coli ou Baculovírus são usa- das para diferençar os animais vacinados de animais infectados (De Diego e colaboradores, 1997; Mackay e colaboradores, 1998; Sorensen e colaboradores, 1998; Shen e colaborado- res, 1999; Kitching., 2002; Chung e colaboradores, 2002; Clavijo e colaboradores, 2004a, 2004b; Sorensen e colaboradores, 2005; Robiolo e colaboradores, 2005; Niedbalski, 2005). A especificidade de polipeptídios 2C e 3D foram também testados, mas foi descoberto se- rem menos sensíveis quando comparados polipeptídeo 3ABC (Sorensen e colaborado- res, 1998; Jae Ku Oem e colaboradores, 2005). Shen e colaboradores (1999) utilizaram polipeptídios sintéticos contendo epítopos de célula-B contendo proteínas não estruturais de FMDV e relataram que a imunoreativida- de a peptídeos 2C era primariamente para aquelas oriundas da região terminal-N da proteí- na. Também recentemente, peptídeos sintéticos de sobreposição foram usados para identi- ficar epítopos lineares de célula-B específicos para infecção por FMDV para diferençar gado infectado de gado vacinado (Hohlich e colaboradores, 2003; Sun e colaboradores, 2004). ELISA indireto baseado em peptídeo sintético longo (57 aminoácidos) foi usado por Shen e colaboradores, (1999), porém, a síntese de peptídeos longos é difícil. Portanto, peptídeos curtos de 20 aminoácidos foi sugerido por Hohlich e colaboradores (2003) os quais possuem problemas inerentes devido às suas fracas ligações à superfície sólida. Este é o fator princi- pal que influencia a eficiência e a sensibilidade de imuno-ensaio em fase sólida utilizando peptídeo sintético como um antígeno.
Exceto como de outro modo indicado, a revelação de todas as Patentes, pedidos de Patentes (e quaisquer patentes que estejam relacionadas com esse assunto, bem como qualquer pedido de patente estrangeira correspondente publicada), e publicações mencio- nadas no transcurso dessa descrição estão aqui incorporadas por referência. É expressa- mente não admitido, todavia, que qualquer dos documentos incorporados aqui por referên- cia ensinem ou revelem a presente invenção.
Sumário da Invenção
A presente revelação está relacionada a partículas quiméricas do tipo timovírus (T- VLPs) compreendidas de uma proteína de fusão que compreende uma primeira proteína que é uma proteína estrutural truncada de revestimento de timovírus e uma segunda proteí- na. A segunda proteína pode ser peptídeos/epítopos do vírus ou hormônio. Essas TVLPs quiméricas são úteis como antígenos. A presente revelação também proporciona um meio altamente eficiente para diferençar animais infectados com Vírus da doença do pé e da boca (FMDV) dos animais vacinados. A presente revelação também proporciona um processo para a produção da partículas quiméricas do tipo timovírus e um kit diagnóstico para a de- terminação de anticorpos específicos do FMDV para diferençar animais infectados por FMDV dos animais vacinados. A presente revelação também está relacionada ao uso das referidas partículas quiméricas do tipo timovírus para propósitos de diagnóstico.
Um aspecto da revelação é prover uma partícula quimérica do tipo timovírus com- preendendo uma proteína de fusão, onde a proteína de fusão compreende uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de timovírus e uma segunda proteí- na, onde a segunda proteína é selecionada a partir do grupo que compreende proteína do vírus da doença do pé e da boca (FMDV), proteína de revestimento parvoviral canino (CPV)1 polipeptídio do vírus da raiva canina P35 (CDV P35), proteína do hormônio de liberação da gonadotropina (GnRH) e uma combinação desses mencionados. Um outro aspecto da presente revelação é o de prover os TVLPs quiméricos com- preendendo uma proteína de fusão que compreende uma primeira proteína que é uma pro- teína truncada de revestimento de Physalis Mottle tymovirus (PhMV) e a segunda proteína é selecionada a partir de um grupo que compreende proteína do vírus da doença do pé e da boca (FMDV), proteína de revestimento parvoviral canino (CPV)1 polipeptídeo do vírus da raiva canina P35 (CDV P35), proteína do hormônio de liberação da gonadotropina (GnRH) e uma combinação desses mencionados.
Em ainda um outro aspecto, a presente revelação proporciona uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes que codifica a proteína de fusão em que o polinucleotídeo é selecionado a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, um fragmento ou uma variante desses menciona- dos.
Em ainda um outro aspecto, a presente revelação proporciona um processo para a produção da partícula quimérica do tipo timovírus que compreende:
a. produzir uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes que serve de código para uma proteína de fusão,
b. construir um vetor recombinante que compreende uma seqüência reguladora e a seqüência de polinucleotídeos recombinantes da etapa (a),
c. transformar uma célula hospedeira com o vetor recombinante da etapa (b) para produzir uma célula hospedeira recombinante,
d. desenvolver a célula hospedeira recombinante da etapa (c) para produzir partícu- las quiméricas do tipo timovírus,
e. purificar as partículas quiméricas do tipo timovírus da etapa (d). Ainda um outro um outro aspecto da presente revelação é para prover um kit de teste para a determinação de anticorpos específicos contra proteínas não estruturais do FMDV, o kit que compreende:
a. partículas quiméricas do tipo timovírus que compreende proteína de fusão sele- cionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7,
SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificadas pelas seqüências de polinucleotídeos recombi- nantes como mostradas nas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO:12, e
b. reagentes para a detecção de anticorpos.
Ainda um outro aspecto da presente revelação é o de prover um método para a de- tecção de anticorpos específicos contra FMDV numa amostra, o referido método compreen- dendo contatar a amostra com partículas quiméricas do tipo timovírus compreendendo pro- teína de fusão selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, codificadas pelas seqüências polinucleotí- deos recombinantes como mostradas nas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, e detectar a formação do complexo entre os referidos anti- corpos e as referidas partículas.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1: Esboço do plasmídeo recombinante pR-Ph SET-A.
Figura 2: Representação esquemática de construtos quiméricos de proteína não es- trutural (NSP) do FMDV de 3B1, 3B2, 3AB, 3D e 3ABD.
Figura 3: Análise SDS-PAGE de a. Frações não induzidas (UI) e induzidas (EM) de pRSET-A (controle negativo; NC), pR-Ph-CP (tipo selvagem; WT), pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB, pR-Ph-3D e pR- Ph-3 ABD expressas em E.coli,
b. Frações induzidas total (T) e solúvel (S) de pRSET-A (NC), pR-Ph-CP (WT), pR- Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB, pR-Ph-3D e pR-Ph-3ABD expressas em E.coli.
A raia M mostra os marcadores padrões de pesos moleculares (MBI Fermentas).
Figura 4: Análise western blot de partículas quiméricas do tipo timovírus Ph-3B1, Ph-3B2, Ph- 3AB, Ph-3D, Ph-3ABD. Ph-CP é capsídeo esvaziado de PhMV tipo selvagem usado como controle negativo. r3AB é 3AB recombinante expresso como controle positivo E.coli. O gel foi eletro-borrado e em seguida provado com anti-soro policlonal 3AB de coelho (1:2000) contra r3AB e anti-soro goat anti-rabbit marcado HRP (1:1000) foi usado como an- ticorpo secundário. A raia M representa. A raia M representa o marcador do peso molecular de proteína pré-manchado (NEB).
Figura 5: Micrografias eletrônicas de partículas quiméricas do tipo timovírus (resolu- ção 80X)
A) Ph-3B1 D) Ph-3D
B) Ph-3B2 E) Ph-3ABD
C) Ph-3AB Descrição Detalhada da Invenção
A presente revelação está relacionada a partículas quiméricas do tipo timovírus (T- VLPs) compreendidas de proteína de fusão consistindo de proteína estrutural de epítopos relacionados a infecção por Physalis Mottle Vírus (PhMV) e célula-B de proteínas não estru- turais 3B, 3AB, 3D e 3ABD do vírus da doença do pé e da boca (FMDV) ou de qualquer ou- tro vírus ou hormônio animal/humano. Essas TVLPs quiméricas são usadas como antígenos para a diferenciação de animais infectados com FMDV dos animais vacinados. A presente revelação também ensina o uso das referidas partículas quiméricas do tipo timovírus para propósitos de diagnóstico. A presente revelação também está relacionada a um processo de produção de par- tículas quiméricas do tipo timovírus e o desenvolvimento de um ensaio sensível e preciso para diferençar animais infectados com FMDV dos animais vacinados mediante detectar a presença de anticorpos contra proteínas não estruturais 3B, 3AB, 3D e 3 ABD nas amostras de soro testadas.
VLPs virais de plantas como sistemas de representação do epítopo são vantajosos quando comparado a outros sistemas: (1) os VLPs virais de plantas são mais econômicos para produzir que os tradicionais sistemas de expressão (2) a ausência de visco de conta- minação com patógenos animais (3) a possibilidade de produção em escala muito grande (4) o potencial para produzir kits diagnósticos específicos para diferentes propósitos (5) o risco de transmissão da doença é mínimo ou nulo (6) não existem preocupações com res- peito à bio-segurança seja em laboratório ou no campo (Johnson, 1997; Porta e Lomonos- soff, 1998). A maioria dos casos, os vírus infecciosos vegetal, animal, foram manipulados e também usados como sistemas de representação do epítopo com base em VLP para o uso como candidatos vacina. Os VLPs foram usados para a detecção do vírus da rubéola e vírus entérico suíno (Keros e Enders, 1997; Guo e colaboradores,., 2001). Não foi apresentado até o momento nenhum conhecimento sobre kit diagnóstico acerca de sistema de represen- tação de epítopo de base VLP. Este é o primeiro relato onde os VLPs Timovirais (TVLPs) são capazes de representar epítopos não estruturais 3B, 3AB, 3ABD e 3D de FMDV (proteí- nas/peptídeos) sobre a superfície das TVLPs e essas partículas quiméricas do tipo timovírus serem úteis na diferenciação bem sucedida por ELISA de animais infectados com FMDV de animais vacinados.
Em uma modalidade, a presente revelação proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo uma proteína de fusão, em que proteína de fusão adicional- mente compreende uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de timovírus e uma segunda proteína, onde a segunda proteína é selecionada a partir do grupo que compreende proteína do vírus da doença do pé e da boca (FMDV), proteína de revesti- mento parvoviral canino (CPV), polipeptídio do vírus da raiva canina P35 (CDV P35), proteí- na do hormônio de liberação da gonadotropina (GnRH) e uma combinação desses mencio- nados.
Em uma outra modalidade a revelação proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus que compreende proteína de fusão que consiste da primeira proteína que é proteí- na truncada de revestimento de timovírus e segunda proteína, em que o timovírus é selecio- nado a partir de um grupo que compreende Physalis Mottle Virus, Belladonna Mottle Virus, Turnip Yellow Mosaic Virus, Cacao Yellow Mosaic Virus, Clitoria Yellow Vein Virus, Desmo- dium Yellow Mottle Virus, Egg Plant Mosaic Virus e Passion Fruit Yellow Mosaic Virus.
Em uma outra modalidade a revelação proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus que compreende primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de timovírus, em que a proteína de revestimento de timovírus é proteína truncada de reves- timento de Physalis Mottle Virus (PhMV).
Em uma outra modalidade a presente revelação proporciona uma partícula quiméri- ca do tipo timovírus compreendendo uma proteína de fusão que consiste da primeira proteí- na e segunda proteína.
Em uma outra modalidade a revelação proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revesti- mento de timovírus, onde a proteína truncada de revestimento de timovírus compreende pelo menos 149 aminoácidos adjacentes da seqüência aminoácida como mostrado na SEQ ID NO: 1.
Em uma outra modalidade a revelação proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revesti- mento de timovírus, onde a proteína truncada de revestimento de timovírus é codificada por uma seqüência polinucleotídeo como mostrada em SEQ ID NO: 2, um fragmento ou uma variante desses mencionados.
Em ainda uma outra modalidade a presente revelação proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de timovírus, em que a seqüência de polinucleotídeos compreende pelo menos 447 nucleotídeos adjacentes como mostrado na SEQ ID NO: 2.
Em ainda uma outra modalidade a presente revelação proporciona uma proteína truncada de revestimento de timovírus que compreende pelo menos 149 aminoácidos adja- centes da seqüência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID NO: 1 codificada por uma seqüência de polinucleotídeos que compreende pelo menos 447 nucleotídeos adjacentes como mostrado na SEQ ID NO: 2, um fragmento ou uma variante desses mencionados.
Ainda, em uma outra modalidade da presente revelação, proteína de fusão é possu- idora da seqüência de polipeptídeos selecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33.
Uma modalidade adicional da presente revelação proporciona a proteína de fusão selecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 codificada pela seqüência de polinucleotídeos recom- binantes como mostrado na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.
Em uma modalidade a presente invenção proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus que compreende uma proteína de fusão, onde a proteína de fusão é codifica- da por uma seqüência de polinucleotídeo recombinante.
Ainda uma outra modalidade proporciona uma partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo uma proteína de fusão, em que a proteína de fusão compreende uma pri- meira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de Physalis Mottle Vírus (PhMV) e uma segunda proteína, onde a segunda proteína é selecionada a partir de um grupo que compreende proteína do vírus da doença do pé e da boca (FMDV), proteína de revestimento parvoviral Canina (CPV)1 polipeptídio do vírus da raiva canina P35 (CDV P35), hormônio de liberação da gonadotropina (GnRH) e uma combinação desses mencionados.
Ainda uma outra modalidade da presente revelação revela uma seqüência de poli- nucleotídeos recombinantes que codifica a proteína de fusão, onde uma seqüência de poli- nucleotídeos recombinantes é selecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO: 34, um fragmento ou uma variante desses mencionados.
Ainda uma outra modalidade da presente revelação proporciona um vetor recombi- nante que compreende um cassete de expressão, o cassete de expressão adicionalmente compreende uma seqüência reguladora e uma seqüência de polinucleotídeos recombinan- tes selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34, um fragmento ou uma variante desses menciona- dos, onde a seqüência reguladora é selecionada a partir de um grupo que compreende T7, SP6 e T3.
Em uma outra modalidade a revelação proporciona um vetor recombinante que é selecionado a partir de um grupo que compreende pR-Ph-CP, pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR- Ph-3AB, pR-Ph-3D, pR-Ph-3ABD, pR-Ph-VP1-C1, pR-Ph-VP1-C2, pR-Ph-VP1-C3, pR-Ph- IC-C1, pR-Ph-IC-C2, pR-Ph- IC-C3, pR-Ph-CPV1, pR-Ph-CPV2, pR-Ph-CPV3, pR-Ph-CPV4 e pR-Ph- CP V5.
Em uma modalidade a presente revelação proporciona uma célula hospedeira que compreende o vetor recombinante. A célula hospedeira é selecionada a partir de um grupo que compreende E.coli, levedura e baculovírus.
Em ainda uma outra modalidade a presente revelação proporciona cepas E.coli se- lecionadas a partir de um grupo que compreende JM101, DH5ct, BL21, HB101, BL21 (DE3) ρLys S1 XL-I Blue e Rossetta.
Em uma modalidade a presente revelação está relacionada a um processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, o processo compreende: (a) produzir uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes,
(b) construir um vetor recombinante que compreende uma seqüência reguladora e uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes da etapa (a),
(c) transformar uma célula hospedeira com o vetor recombinante da etapa (b) para produzir uma célula hospedeira recombinante,
(d) desenvolver a célula hospedeira recombinante da etapa (c) para produzir partí- culas quiméricas do tipo timovírus,
(e) purificar as partículas quiméricas do tipo timovírus da etapa (d).
Em uma outra modalidade a presente revelação está relacionada a um processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo a etapa de cons- truir um vetor recombinante que compreende uma seqüência reguladora e a seqüência de polinucleotídeo recombinante revelada na invenção, onde a seqüência reguladora é selecio- nada a partir de um grupo que compreende 11, SP6 e T3.
Em uma outra modalidade a presente revelação está relacionada a um processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, onde a seqüência de polinucleotí- deos recombinantes é selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34.
Em uma outra modalidade a presente revelação está relacionada a um processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, onde o vetor recombinante é sele- cionado a partir do grupo que compreende pR-Ph-CP, pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB, pR-Ph-3D, pR-Ph-3ABD, pR-Ph-VP1-C1, pR-Ph-VP1-C2, pR-Ph-VP1-C3, pR-Ph- IC-C1, pR- Ph-IC-C2, pR-Ph- IC-C3, pR-Ph-CPV1, pR-Ph-CPV2, pR-Ph-CPV3, pR-Ph-CPV4 e pR-Ph- CP V5.
Em ainda uma outra modalidade a presente revelação proporciona um kit de teste para a determinação de anticorpos específicos contra FMDV1 o kit compreendendo:
(a) partículas quiméricas do tipo timovírus que compreendem proteína de fusão se- lecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11 codificadas pelas seqüências de polinucleotídeos recom- binantes como mostrado na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, e
(b) reagentes para a detecção de anticorpos.
Em ainda uma outra modalidade a presente revelação proporciona um método para a detecção de anticorpos específicos contra FMDV numa amostra, o referido método com- preendendo contatar a amostra com partículas quiméricas do tipo timovírus compreendendo proteína de fusão selecionada a partir do grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, codificadas pelas seqüências polinu- cleotídeos recombinantes como mostrado na SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, e detectar a formação do complexo entre os referidos anti- corpos e as referidas partículas.
PhMV, é um pequeno vírus vegetal esférico, um elemento do gênero timovírus de RNA de fita positiva foi primeiramente isolado por Moline & Fries (1974) em lowa, USA. O genoma do RNA de sentido positivo está encapsidado numa capa de proteína consistindo 180 cópias idênticas de CP (20,000 kDa) dispostas com simetria ecosaédrica T=3 na qual existem três padrões Iigantes distintos. Dependendo das interações Iigantes as subunidades quimicamente idênticas são chamadas A, B e C. Cinco subunidades tipo A formam pentâ- meros nos 12, eixos ecosaédricos de 5-dobras (um total de 60 subunidades) e as subunida- des tipo B e C formam hexâmeros nos 20, eixos ecosaédricos de 3-dobras (120 subunida- des). Uma comparação da seqüência de revestimento de proteína de PhMV com outros ti- movírus revelou que ela tinha 52% de identidade com belladonna mottle vírus (E) e 33% de identidade com turnip yellow mosaic vírus (TYMV), demonstrando que o PhMV (anterior- mente denominado como belladonna mottle vírus I) era um timovírus distinto (Mira e colabo- radores, 1997; 1999).
PhMV oferece as seguintes vantagens:
(1) O genoma é pequeno, (2) Ele é fácil de manipular, (3) A purificação é mais sim- pies e mais rápida que a regeneração de plantas transformadas de modo estável. A proteína de revestimento em PhMV se expressa de modo extremamente bem como capsídeos esva- ziados em E.coli resultando em (1) Rendimentos tão altos quanto 100-150 mg por litro de cultura, (2) Variações de batelada para batelada são nulas na medida em que cada uma de todas as confirmações dos capsídeos montados será mantida em um modo similar quanto à integridade dos capsídeos, (3) Ph-CP recombinante é estável ao longo de uma ampla faixa de pH de 4,2 a 9,0 e estável até 4M uréia, (4) A purificação de capsídeos esvaziados é fácil, (5) O mecanismo de montagem de capsídeos esvaziados está bem estudado, (6) A faixa hospedeira é muito estreita (Mira e colaboradores, 1997, 1999).
Partícula quimérica do tipo vírus Ph-3 AB foi testada utilizando ELISA para a dife- renciação de animais infectados dos animais não infectados ou animais vacinados. As a- mostras de soro de convalescentes coletadas de animais infectados (através do isolamento do vírus) foram testadas por ELISA e todos os soros reagiram bem com o TVLP Ph-3AB quimérico. Amostras não infectadas coletadas de animais jovens não reagiram com TVLP Ph-3AB quiméricos. O antígeno recombinante gerado é útil na diferenciação de animais in- fectados dos animais não infectados ou de animais vacinados ou animais não infectados. Outros TVLPs quiméricos foram também testados utilizando ELISA.
A disponibilidade fácil, barata e segura do antígeno e a adequação do método ELISA simples indireto é útil para:
1) Rápida detecção de animais portadores na presença ou ausência de vacinação,
2) monitorar o progresso dos programas de erradicação do FMDV e
3) pesquisas epidemiológicas em regiões nas quais se pratica a vacinação.
Essa abordagem é diferente da transformação genética de plantas onde se neces- sita a integração do gene de interesse dentro do genoma da planta e o uso de vetores ba- seados nos vírus da planta como plataformas para os propósitos de aplicação. Consideran- do as medições de bio-segurança, os VLPs são seguros na medida que não existe risco de transmissão de organismos infecciosos. Essa abordagem não necessita do desenvolvimento de clones do cDNA infeccioso para a manipulação dos genomas.
A seqüência DNA que serve de código para o "Physalis Mottle Vírus" (PhMV) foi i- dentificada a partir do GenBank possuindo número de acesso EMBL S97776 (Jocob e cola- boradores, 1992). A proteína truncada de revestimento de PhMV consiste de 159-175 resí- duos aminoácidos de proteína de revestimento de PhMV tipo selvagem. A proteína de re- vestimento foi produzida sinteticamente utilizando os métodos bem conhecidos na arte. Epi- topos relacionados com a infecção de célula-B de proteína não estrutural 3ABD do FMDV foram identificadas com base em informação existente (Hohlich e colaboradores, 2003, Sun e colaboradores, 2004). A seqüência nucleotídica (SEQ ID NO: 12) que codifica a proteína 3ABD (SEQ ID NO: 11) foi sintetizada em laboratório utilizando métodos bem conhecidos na arte. Uma seqüência DNA que codifica essa proteína é como mostrado na SEQ ID NO: 11. Procedimento detalhado está provido no Exemplo 1.
Gene que codifica diferentes epítopos de FMDV tais como 3B (SEQ ID NO: 4 e 6), 3AB (SEQ ID NO: 8), 3D (SEQ ID NO: 10) e 3ABD (SEQ ID NO: 12); epítopos antigênicos de VP1 FMDV (SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18), hormônio de liberação da Gonadotropina (GnRH) SEQ ID NO: 20, GnRH em combinação com P35 CDV (SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24) e peptídeos antigênicos de Parvovírus Canino (CPV) (SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34) foram clonados em vetores plasmídeos tais como séries pRSET-A, pPCR, pQE, pET e pGEX para clonagem e expressão. Todos os construtos foram produzidos sinteticamente com sítio Ndel na termi- nação 5' seguido por diferentes combinações desses epítopos como repetições em paralelo com ligando Glicina-Glicina-Serina (GGS) entre eles juntamente com uma parte da seqüên- cia de CP pHMV tipo selvagem en quadro até sítio Kpn I na terminação 3'. O procedimento detalhado está descrito no Exemplo 2.
Vetores recombinantes ou seja pR-Ph-CP, pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB, pR-Ph-3D e pR-Ph-3 ABD foram transformados em células hospedeiras selecionadas a par- tir de um grupo que compreende E.coli, Levedura e Baculovírus. Para detalhes ver Exemplo 3. As células hospedeiras contendo os vetores recombinantes foram desenvolvidas em meio adequado para a superexpressão de proteína de fusão (ver Exemplo 4, 10 e 11) e a proteína de fusão foi purificada (ver Exemplo 5). Os métodos usados para a superexpres- são e purificação de proteína de fusão são bem conhecidos na arte.
A caracterização imunológica das partículas quiméricas do tipo timovírus (TVLPs) foi realizada através de diversos métodos bem conhecidos na arte. O procedimento detalha- do está provido no Exemplo 6. ELISA foi realizado para verificar a exibição das proteínas virais animais ou hormônio sobre a superfície de pHMV TVLP. Além disso, o Western blot- ting foi realizado para verificar a especificidade das partículas quiméricas do tipo timovírus (TVLPs). Estudos de caracterização das partículas quiméricas do tipo timovírus (TVLPs) foram realizados utilizando microscopia de transmissão eletrônica (ver Exemplo 7). ELISA indireto foi realizado para detectar animais infectados com FMDV dos animais vacinados utilizando TVLPs quiméricos. Diferentes antígenos quiméricos PhMV viz. Ph-3B1, Ph-3B2, Ph-3AB, Ph-3D e Ph-3ABD foram classificados num formato ELISA indireto contra diferentes soros. O antígeno PhMv tipo selvagem e a célula recombinante E.coli expressando o antí- geno recombinante Ph-3AB foi também incluída como controles antígeno positivo e negati- vo, respectivamente. O procedimento detalhado está provido no Exemplo 8.
FMDV é um elemento da família Picornavirus. O genoma viral consiste de ssRNA de sentido positivo de 8,5 kb, que está encapsidado num capsídeo icosaédrico composto de 60 cópias de cada uma das quatro proteínas estruturais designadas VP1, VP2, VP3 e VP4 que são produtos secundários de clivagem de poliproteína P1. entre eles, VP1 é a região imunodominante que contém 3 importantes sítios antigênicos. A exata posição dos epítopos de célula B e T da proteína capsídeo VP1 foi estabelecida nas partes flanco dos resíduos aminoácidos 21-40, 135-160 e 200-213. A análise da expressão dos epítopos da proteína estrutural de FMDV-VP1 foi realizada. Detalhes são dados no Exemplo 9.
A imuno-castração é uma alternativa ao método de castração cirúrgica. O hormônio de liberação da Gonadotropina (GnRH), é uma proteína muito pequena de 10 aminoácidos produzida pelos neurônios do hipotálamo. Ela é um antígeno fraco e necessita estar conju- gada a proteínas portadoras. Vacinas anti GnRH são usadas para reduzir o acúmulo de es- catol e androsteronas nos tecidos adiposos de porcos, o que leva ao odor sexual de macho em carnes de porco. O Vírus da Raiva Canina P35 (CDV P35) é um epítopo de célula-T da proteína de fusão e se mostra ser muito eficaz em eliciar anticorpos anti GnRH anticorpos em cães machos quando conjugado com GnRH. A indução de altos títulos de anticorpos específicos para GnRH está correlacionada com a regressão dos testes. Vacinas anti GnRH possuem aplicação potencial em terapias de câncer incluindo câncer de mama e de prósta- ta. A análise da expressão do hormônio de liberação da Gonadotropina foi realizada. O pro- cedimento detalhado é dado no Exemplo 10. Parvovírus Canino (CPV) pertence ao subgrupo do parvovírus felino do gênero Par- vorirus dentro da família da Parvoviridae. Ele provoca uma importante doença em cães e é endêmica ao redor do mundo. A infecção por CPV em cães é caracterizada por enterite de gravidade variável e está freqüentemente associada com uma relativa linfopenia. A miocar- dite aguda ocorre em cães jovens até 16 semanas de idade e provoca de 50-80% de morta- lidade. As vacinas atuais estão baseadas em vírus vivos atenuados. Uma limitação da vaci- na é que em cães jovens, os anticorpos derivados maternalmente atrapalham o desenvolvi- mento de uma imunidade protetora. Isso pode também ser interessante para capsídeos re- combinantes VP2 quando eles são usados como imunogênicos. Para tais casos, vacinas sintéticas ou subunidades podem representar uma alternativa preferível. Estudos de mape- amento do epítopo indicaram a presença de um número de sítios antigênicos os quais foram reconhecidos por neutralizar o soro. A expressão de epítopos CPV-VP2 em E. Coli foi anali- sada. Para o procedimento detalhado é feita referência ao Exemplo 11.
A presente revelação é importante pelo fato de que pode ser aplicada aos presen- tes e outros epítopos de patógenos animal/humano economicamente importantes para o diagnóstico ou a vacina ou propósitos terapêuticos. Embora a invenção mencionada até o momento tenha sido descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo quanto aos pro- pósitos de clareza e compreensão, será facilmente evidente para aqueles usualmente ver- sados na técnica à luz das informações dessa invenção que certas alterações e modifica- ções podem ser feitas sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações anexas.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são apresentados de modo a prover aqueles usualmente versados na técnica com uma revelação completa e a descrição de côo produzir e utilizar a presente invenção, e não está pretendido a limitar o escopo daquilo que os inventores per- cebem como a sua invenção nem estão pretendidos representar que os experimentos apre- sentados adiante sejam todos os únicos experimentos realizados.
Exemplo 1
Síntese do gene de proteína de revestimento de "Physalis Mottle Vírus"
A seqüência DNA que serve para codificar a proteína de revestimento (CP) do "Physalis Mottle Vírus" (PhMV) foi extraída do GenBank. (EMBL Número de Acesso: S97776). Este gene foi produzido sinteticamente com sítios Xho I e Hind Ill nas terminações 5' e 3', respectivamente e com um códon de parada na extremidade do quadro de leitura, sem o códon de partida no início do gene. O sítio I foi introduzido como uma mutação silente nos aminoácidos 44 e 45 da proteína de revestimento para os propósitos de permutação das seqüências heterólogas.
Síntese de genes de peptídeos não estruturais do FMDV
O DNA que serve para codificar epítopos como repetições em paralelo de 3B1, 3Β2, 3ΑΒ, 3D e 3ABD com Iigandos consistindo de 144, 198, 147, 153 e 165 nucleotídeos, respectivamente com Nde I na terminação 5' e uma parte da seqüência PhMV até o sítio Kpn I na terminação 3' dos genes foram produzidos sinteticamente.
O procedimento e a estratégia de clonagem foi a mesma para todos os construtos de proteína não estrutural (NSP) do FMDV quiméricos, construtos FMDV-VP1, construtos GnRH e construtos CPV. Todas as seqüências polinucleotídeo contendo repetições em pa- ralelo, Iigandos e uma parte da seqüência PhMV até o sítio Kpn I foram produzidas sinteti- camente com sítios Nde I e Kpn I nas terminações 5' e 3' e clonados dentro de vetor de S- cript pPCR.
Exemplo 2
Construção de vetores recombinantes
Clonagem de um gene de proteína de revestimento (CP) em vetor pRSET-A
PhMV CP tipo selvagem (SEQ ID NO: 2) foi produzida sinteticamente com sítios Xho I e Hind I nas terminações 5' e 3', respectivamente que foi clonado no Script pPCR do vetor plasmídeo. Essa inserção tipo selvagem CP de 564 bp foi liberada do vetor do Script pPCR mediante digestão com Xho I e Hind Ill e foi clonada nos sítios Xho I e Hind I do vetor de expressão pRSET-A. Para isto, Scripts pPCR de vetores plasmídeos contendo vetor PhMV CP tipo selvagem e vetor pRSET-A foram restringidos com enzimas Xho I e Hind I. Xho I e Hind I. Fragmentos Xho I e Hind I do vetor PhMV-CP tipo selvagem e vetor pRSET-A restringido foram eluídos pelo método de extração em gel e a ligação foi realizada. O DNA de inserção nesse vetor recombinante foi confirmado através de métodos de seqüenciamen- to de DNA conhecidos na arte. Nesse caso, o quadro de leitura começa no ATG no sítio Nde I do vetor, tal que a proteína de revestimento tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) possua 39 ami- noácidos extra da cadeia estrutural do vetor e com um códon de parada antes do sítio Hind III. O tamanho do vetor CP recombinante foi 3435 bp de comprimento. O vetor recombinante foi designado como pR-Ph-CP.
Clonagem do gene viral/hormônio modificado
Fragmento de DNA que serve para codificar a proteína do vírus/hormônio foi per- mutada em pR-Ph-CP nos sítios de restrição Nde I e Kpn I. Os fragmentos DNA que servem para codificar proteína de vírus podem ser de epítopos 3B1, 3B2, 3AB, 3D e 3ABD do FMDV e fragmentos DNA que servem para codificar proteína hormonal podem ser a partir do gene GnRH.
A seqüência DNA sintética que serve de código para 3ABD foi inserida nos sítios criados pelas enzimas de restrição Nde I e Kpn I para produzir um vetor recombinante. Para isto, Script pPCR de vetores plasmídeos contendo gene 3ABD gene e vetor pR-Ph-CP fo- ram restringidos com enzimas Nde I e Kpn I. Fragmentos Nde I e Kpn I do gene 3ABD e vetor pR-Ph-CP restringido foram eluídos através do método de extração em gel e a ligação foi realizada. O vetor recombinante é denominado como pR-Ph-3ABD. O DNA de inserção nesse vetor recombinante foi confirmado através de métodos de seqüenciamento de DNA conhecidos na arte. De modo similar fragmentos DNA que servem para codificar 3B1, 3B2, 3AB e 3D epítopos de FMDV, VP1 epítopos de FMDV1 fragmentos DNA que servem para codificar proteína hormonal a partir do gene GnRH em combinação com CDV P35 epítopo e CPV VP2 epítopos foram clonados em pR-Ph-CP em sítios Nde I e Kpn I. O vetores recom- binantes foram denominados como pR-Ph-CP, pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph- 3AB1 pR- Ph-3D, pR-Ph-3ABD, pR-Ph-VP1-C1, pR-Ph-VP1-C2, pR-Ph-VP1-C3, pR-Ph- IC-C1, pR-Ph- IC-C2, pR-Ph- IC-C3, pR-Ph-CPV1, pR-Ph-CPV2, pR-Ph-CPV3, pR-Ph-CPV4 e pR-Ph- CPV5. A mistura de ligação foi transformada em cepas E.coli DΗ5α. O plasmídeo foi isolado a partir de cepas E.coli DH5α contendo o vetor recombinante e a autenticidade dos recom- binantes foi confirmada por seqüenciamento. Clones positivos foram transformados em li- nhagens BL-21 (DE3) pLys S para a expressão da proteína de fusão.
Todas as inserções de gene vírus/hormônio estão na faixa de 200-300 nucleotídeos e foram feitas sinteticamente com sítios Nde I e Kpn I permutados no vetor de digestão Nde I e Kpn I de pR-Ph-CP, tal que aquela parte do CP tipo selvagem será substituída com a seqüência heteróloga e o restante da proteína tipo selvagem permanecerá em todos os construtos sem perturbação do quadro de leitura (Figura 1). A Figura 2 representa os cons- trutos quiméricos de proteína não estrutural (NSP) do FMDV vis. 3B1, 3B2, 3AB, 3D e 3ABD, onde os epítopos relacionados com infecção de cel-B de 3A, 3B, 3D e 3ABD em pa- ralelo com ligandos foram substituídos na parte terminal-N da proteína de revestimento tipo selvagem PhMV.
Exemplo 3
Transformação de E.coli
Células competentes de E.coli foram preparadas utilizando cloreto de cálcio como descrito por Sambrook e colaboradores (1989). Para a transformação de um ou outro de DH5-α ou BL 21 (DE3) pLys S as células competentes foram misturadas com o DNA em gelo, seguido por um breve choque térmico a 42 °C por 45 segundos. As células foram incu- badas com meio rico e deixadas crescer por 30-60 min a 37 °C antes do plaqueamento. Construtos contendo os genes recombinantes sob o controle a polimerase T7 se transforma- ram em DH5-ct para os propósitos de clonagem, mas precisam ser transformadas numa dife- rente linhagem bacteriana, BL21 (DE3) pLys S para a expressão de uma proteína recombi- nante. O vetor recombinante pR-Ph-3ABD foi transformado na cepa DH5α de E.coli para produzir células E.coli recombinantes. Essas células E.coli recombinantes são denominadas como r-Ph-3ABD. De modo similar outros vetores recombinantes pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB e pR-Ph-3D foram transformados em cepas E.coli DH5-α para produzir células E.coli recombinantes ou seja r-Ph-3B1, r-Ph-3B2, r-Ph-3AB e r-Ph-3D respectivamente. Exemplo 4
Superexpressão e purificação de partículas quiméricas do tipo timovírus em E.coli
O E.coli recombinante r-Ph-3ABD foi crescido em meio adequado de um dia para o outro a 37°C. As células foram colhidas por centrifugação. Plasmídeos foram isolados das células recombinantes contendo diferentes plasmídeos tais como pR-Ph-3ABD, pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB e pR-Ph-3D utilizando métodos bem conhecidos na arte. O isola- mento do DNA do plasmídeo foi realizado através do método de Iise alcalina como descrito (Sambrook e colaboradores, 1989). Para o estudo da expressão, vetor pRSET-A (controle negativo), os vetores tipo selvagem e recombinante foram transformados na linhagem BL21 (DE3) pLysS de E.coli. A transformação resultou em células E.coli recombinantes possuindo os plasmídeos recombinantes.
As células E.coli recombinantes foram desenvolvidas no meio de crescimento quan- to à expressão da proteína de fusão utilizando os métodos bem conhecidos na arte. Proteí- nas de fusão foram denominadas como Ph-3B1, Ph-3B2, Ph-3AB, Ph-3D e Ph-ABD. Proteí- nas de fusão foram isoladas utilizando métodos bem conhecidos na arte. SDS-PAGE foi realizado utilizando sistema tampão descontínuo descrito por Laemmli (Laemmli, 1970) utili- zando equipamento de eletroforese em gel em fatia grossa. Através desse estudo gel de poliacrilamida 15% com 1 mm de espessura (30:0,8, relação acrilamida para bisacrilamida) contendo 0,1 % SDS foi usado para a separação de proteínas por eletroforese. As amostras de proteína foram misturadas com um volume igual de 2X tampão de amostra (100 mM Tris- HCI pH 6,8 contendo 2 % SDS, 0,02 % azul bromofenol, 10 % β-ΜΕ e 20 % glicerol) e aque- cido a 95 0C por 5 min e foram carregados nas cavidades de gel exato de poliacrilamida. A eletroforese foi realizada numa voltagem constante a 100 V utilizando tampão 0,025 M Tris e 0,2 M glicina a pH 8,8 contendo 0,1 % SDS. Após a eletroforese, o gel ou foi manchado com azul commassie brilhante ou processado para borrão western. Colônias simples de cepas recombinantes de E.coli foram inoculadas em meio Luria-Bertani (LB) contendo 100 //g/mL ampicilina e 33 ug/mL clofamfenicol. 5 mL do meio LB foi inoculado com 1% de cultura de um dia para o outro, crescido durante três horas a 37 C e induzida com 0,5M isopropil-1-tio- β-D-galactopiranosida (IPTG). Duas horas mais tarde, as células foram colhidas e resuspen- sas em 500 μL de água destilada. Uma alíquota das células foi tomada para a análise de proteína. Um volume igual de tampão de carregamento 2x SDS-PAGE foi acrescentado a 20 μΥ. de células resuspensas e usadas para análise das proteínas totais das células mediante utilizar Análise SDS-PAGE (Figura 3). As células restantes foram submetidas a ação sônica por dez minutos utilizando um equipamento de ação sônica e centrifugada a 27000 g por dez minutos, a fração solúvel foi coletada e a fração insolúvel foi suspensa em 500 μί de água destilada. As frações total e solúvel foram analisadas por SDS/(p/v) 15% PAGE (La- emmli, 1970). Os métodos para a análise de proteínas foram realizados como conhecidos na arte.
Exemplo 5
Purificação de Partículas Quiméricas do tipo Timovírus
Para purificação em larga escala do tipo selvagem e TVLPs quiméricos, o procedi- mento conhecidos na arte foi realizada (Mira e colaboradores, 1997, 1998). As células foram suspensas em 50 mM tampão citrato de sódio (pH 5,5), submetidas a ação sônica e a fração solúvel foi submetida a precipitação com polietileno glicol (6000) 10% (p/v) seguida por uma ultra-centrifugação de alta velocidade (140.000 g, 3 h). O precipitado foi resuspenso em 50 mM tampão citrato de sódio e disposto em camadas por sobre um gradiente de 10-40% sa- carose. A zona de espalhamento da luz foi coletada, diluída e submetida a ultra- centrifugação (140.000 g por 3 h). Os aglomerados obtidos foram resuspensos em 50 mM tampão citrato de sódio (pH 5,5). A pureza das TVLPs quiméricas foi verificada por SDS/15% PAGE (Laemmli, 1970). Análise SDS-PAGE das frações não induzida, induzida de pRSET-A, tipo selvagem, 3B1, 3B2, 3AB, 3D, 3ABD e frações induzida total e solúvel de pRSET-A, tipo selvagem, 3B1, 3B2, 3AB, 3D, 3ABD expressas em E.coli, foi realizada (Figu- ra 3). A raia M mostra os marcadores padrões de pesos moleculares. A totalidade dos plas- mídeos recombinantes se expressaram bem juntamente com a proteína de revestimento de PhMV tipo selvagem. A expressão da proteína foi induzida e as frações de proteína induzida foram comparadas com as frações não induzidas (Fig. 3A) e não houve expressão observa- da onde o vetor (pRSET- A; controle negativo) sozinho estava expresso. Frações de proteí- na solúvel do vetor sozinho, CP tipo selvagem e plasmídeos quiméricos foram comparados com frações proteína total e descobriu-se que considerável fração de proteína está presente na fração solúvel (Fig. 3B).
Exemplo 6
Caracterização imunológica de partículas quiméricas do tipo timovírus (TVLPs) O tipo selvagem e TVLPs quiméricos foram separados em SDS 15% gel acrilamida e transferidos por sobre membranas de nitrocelulose. A análise western blot foi realizada utilizando anti-soro rabbit 3AB (1:2000) contra r-3AB (3AB recombinante expressas em E.coli) e anti-soro anti-rabbit goat marcadas HRP (1:1000) foi usado como anticorpo secun- dário.
O borrão foi desenvolvido utilizando Diamino benzidina (DAB) na presença de peró- xido de hidrogênio em tampão citrato de sódio 0,05 M (pH 4,8) contendo quantidades traço de cloreto de cobalto. Ph-3B1, Ph-3B2, Ph-3AB, Ph-ABD reagiram bem com anti-soro 3AB juntamente com o controle positivo r3AB. PhMV CP tipo selvagem e Ph-3D não reagiram com o anti-soro 3AB (Fig. 4)
Exemplo 7
Microscopia eletrônica O CP tipo selvagem e TVLPs quiméricos tais como Ph-3B1, Ph-3B2, Ph-3AB, Ph- 3ABD e Ph-3D e (0,5 mg/mL) foram aplicados por sobre grelhas revestidas de carbono e manchadas com acetato de uranila (2%; w/v). Essas grelhas foram visualizadas através de um microscópio eletrônico de alta resolução (Hitachi H 7500) numa ampliação de 80 X. Os TVLPs quiméricos são parecidos exatamente com capsídeos esvaziados de PhMV tipo sel- vagem (Mira e colaboradores, 1997) sob microscópio eletrônico (Fig. 5)
Exemplo 8
ELISA Indireto para diferençar animais infectados por FMDV dos animais vacinados utilizando TVLPs quiméricos
Placas ELISA foram sensibilizadas através de incubação de um dia para o outro a 4 °C com uma diluição ótima de antígeno quimérico purificado 3AB de TVLP (40 ng /50 μL/well) ou antígeno tipo selvagem purificado PhMV TVLP (40 ng/50 μL/cavidade) em tam- pão de revestimento carbonato-bicarbonato. Uma cavidade foi deixada como sem as no antígeno controle para cada amostra. Os reagentes usados para ELISA são bem conheci- dos na arte. Em tubos adequados todos os soros controle e teste foram bloqueados de um dia para o outro a 4°C através da preparação de pré-diluições numa diluição de 1:5 em dilu- ente ELISA bloqueado (10 μL soro em 40 μL tampão de bloqueio). De modo alternativo, os soros foram preparados e incubados a 37° C por 2 horas em um agitador para placas. No dia seguinte as placas foram lavadas com tampão de lavagem (Salino tamponado em fosfa- to com Tween 20 (0,05%) e secadas a petelecos. 50 μL de cada soro pré-diluído bloqueado foram transferidos para as cavidades marcadas das placas ELISA. As placas foram incuba- das a 37°C em um agitador para placas por 1 hora. As placas foram lavadas com tampão de lavagem, secadas a petelecos. 50 μL da diluição apropriada de anti-espécies IgG conjuga- das a HRP em diluente ELISA bloqueado foi acrescentado às placas e incubadas a 37°C em um agitador para placas por 1 hora. Em seguida as placas foram lavadas com a tampão de lavagem, secadas a petelecos. 50 μL mistura Cromógeno/Substrato resfriada em gelo, isto é, 0PD/H20 em diluição apropriada foi acrescentada e as placas foram incubadas por 5 minutos na temperatura ambiente no escuro. A reação foi interrompida com H2SO4 1M. As placas foram lidas a 492 nm utilizando um leitor de placa ELISA. Cavidades em branco de antígeno e cavidades contendo o antígeno VLP tipo selvagem do "Physalis Mottle Vírus" precisam apresentar uma OD de ≤ 0,100. Uma quantidade em torno de 100 soro negativos foram testados e o valor de corte foi derivado da média calculada e do desvio padrão (SD). Uma vez derivado o valor de corte 40 amostras positivas conhecidas (status de portador do FMDV confirmado através do isolamento do vírus em cultura de células orgânicas primárias) foram testados utilizando a TVLP 3AB quimérica. 80 amostras com histórico desconhecido de FMD foram testados. Também 80 amostras de histórico desconhecido foram também testadas. ELISA foi realizada utilizando outras proteínas quiméricas. O ensaio indicou cia- ramente que ELISA é altamente específica com base em amostras negativas e positivas.
Diferenciação de animais vacinados e infectados (DIVA) usando TVLPs quiméricos Reatividade do FMDV-NSP quiméricos de TVLPs quiméricos direcionada para as amostras experimentais de soro
Os diferentes TVLPs quiméricos viz. Ph-3B1, Ph-3B2, Ph-3AB, Ph-3ABD e Ph-3D foram classificados num formato ELISA indireto contra diferentes soros. PhMV VLP tipo sel- vagem e um 3AB recombinante expresso em E.coli (E.coli r-3AB) foi também incluído como controles de antígenos negativo e positivo. O soro convalescente bovino (BCS) foi também conhecido como soro bovino positivo para anticorpos FMDV-NSP; um soro obtido cada um de animal afetado e não afetado de origem bovina foi também incluído nos testes. Soro bo- vino normal foi usado como um controle negativo. A reatividade do antígeno foi também comparada com outros soros que incluíam um imuno-soro de rato e imuno-soro de coelho contra antígeno r-3AB E.coli enquanto soro não imunizado de rato e não imunizado de coe- lho atuaram como controles. Os outros controles usados foram um controle do meio de crescimento e salino tamponado em fosfato.
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Nota:
BCS - Soro Bovino Convalescente; BS - Soro bovino; IMS - imuno-soro de rato; MAb - Anticorpo monoclonal; MS - soro rato; IRS - Imuno-soro Coelho; RS - Soro coelho; PBS - Salino tamponado em fosfato
Os PhMV TVLPs quiméricos reagiram em diferentes sensibilidades com diferentes soros. Ph-3B2, Ph-3AB e Ph-3ABD reagiram bem com todos os soros. Ph-3B2 não reagiu com o tipo A BCS5 r-3AB IMS, r-3AB IRS e r-MVA 3AB IRS (MVA: Varíola Ankara modifica- da). Ph-3D não reagiu com qualquer dos soro positivos exceto tipo C BCS e r-3AB IMS. Re- ação consistente foi noticiada com Ph-3AB e antígenos Ph-3ABD com BCS indicaram que os epítopos FMDV NSP se apresentaram bem sobre a superfície das PhMV TVLPs. Ne- nhuma das TVLPs quiméricas reagiram com o anticorpo monoclonal Anti 3AB MAb 3C7. PhMV TVLP Tipo selvagem não apresenta qualquer reação ao soro diferente enquanto que o antígeno E.coli r-3AB reagiu bem como quase todos os soros exceto r-MVA 3AB IRS.
Padronização do Ensaio
O ensaio foi padronizado utilizando amostras positivas conhecidas e amostras ne- gativas conhecidas (amostras provias por IAH1 Pirbright Lab1 UK). Amostras de soro coleta- das a partir de animais que foram positivos através do teste de isolamento do vírus foram consideradas como amostras positivas conhecidas (n=40) enquanto que amostras de soro coletadas a partir de animais que foram negativas através do teste de isolamento do vírus foram consideradas como amostras negativas conhecidas. ELISA indireto foi realizado com 50 ng de antígeno pH-3AB. 36 entre 40 amostras positivas conhecidas foram positivas com Ph-3 AB enquanto que a totalidade das 100 amostras negativas conhecidas foram negativas com Ph-3 AB.
Avaliação do valor de corte:
O valor de corte foi avaliado como a Média + Três vezes o Desvio Padrão - 0,0150 para ELISAs de Ph-3 AB e Ph-3 ABD. ELISA de Ph-3D foi descontinuado porque ele não foi sensível. Soro de cinqüenta e quatro cabras e trinta e cinco ovelhas que foram negativas através do isolamento do vírus foram testados e o corte foi fixado a 0,230.
Realização dos Testes de Soro
O ensaio foi realizado utilizando amostras positivas conhecidas e amostras negati- vas conhecidas (amostras foram derivadas de diversos experimentos de provocação em gado).
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74 entre 77 amostras positivas conhecidas foram positivas com antígeno Ph-3AB enquanto que apenas 67 foram positivas com antígeno Ph-SABD. Antígeno Ph-3D pode detectar apenas 52 entre 77 amostras positivas. Todas as 90 amostras negativas conheci- das foram declaradas negativas em todos os três testes. O teste foi comparado contra Cedi- test para as amostras positivas e os resultados mostraram que Ph-3AB foi mais específico que os outros dois antígenos quiméricos.
i. Comparação de quimeras-pHMV — Soro positivo conhecido
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Entre as 77 amostras tesadas pelos três antígenos quiméricos, 66 foram positivas através de ambos Ph-3 AB e Ph-3 ABD enquanto que 2 foram negativas através de ambos os testes. Entretanto, 8 amostras que foram declaradas positivas através de Ph-3 AB foram declaradas negativas através de Ph-3 ABD e apenas 1 que foi positiva através de Ph-3 ABD foi declarada negativa através de Ph-3 AB. De modo similar entre as 77 amostras testadas por meio dos três antígenos Quiméricos, 52 foram positivas através de ambos Ph-3AB e Ph- 3D enquanto que 2 foram negativas através de ambos os testes. Entretanto, 23 amostras que foram declaradas positivas através de Ph-3AB foram declaradas negativas Ph-3D e a- penas 1 que foi positiva através de Ph-3ABD foi declarada negativa através de Ph-3AB. Isto mostra que Ph-3AB foi mais sensível que os outros dois antígenos quiméricos.
Classificação randômica de amostras de soro coletadas do campo usando ELISA Ph-3AB e Ph-3ABD:
89 amostras de soro coletadas a partir de gado provenientes de diferentes lugares randomicamente foram testados com ELISA Ph-3AB e Ph-3ABD e os resultados foram co- mo a seguir.
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23 amostras foram declaradas positivas através de Ph-3 AB1 13 através de Ph-3 ABD e apenas uma através de Ph-3D quando comparado com 25 que foram declaradas positivas através de Ceditest.
i) Comparação de pHMV-Chimeras - Soro de campo
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Das 25 amostras declaradas positivas através de Ceditest houve concordância em 23 amostras em Ph-3 AB1 10 amostras em Ph-3 ABD e apenas 1 com Ph-3D. Das 64 amos- tras que foram declaradas negativas através de Ceditest concordância completa foi noticia- da em Ph-3AB e Ph-3D enquanto que apenas 61 amostras estavam de acordo com os re- sultados em Ph-3 ABD. Isto mostra que o teste Ph-3 ABD pode não ser tão específico quan- to os outros testes. Duas amostras que foram positivas com Ceditest foram declaradas ne- gativas em PhMV-3AB enquanto que 15 e 24 amostras foram declaradas negativas através de Ph-3 ABD e Ph-3D respectivamente indicando que a especificidade desses dois testes foi baixa quando comparado com Ceditest ou Ph-3 AB.
Desenvolvimento de controles internos para ELISA de Ph-3AB: 40 soro positivo conhecidos e 40 soro negativos conhecidos foram testados contra Ph-3AB para desenvolver padrões internos. Resultados: Os resultados foram similares com Ph-3AB e ELISA Ph-3ABD e através de Ceditest.
ELISA baseado em Ph-3AB para for gado, búfalo. ovinos e caprinos Amostras de Ovinos (n=61)
O ELISA Ph-3AB foi usado para classificar amostras de ovinos coletadas randomi- camente a partir de uma fazenda organizada em Tamil Nadu. Os resultados comparativos com Ceditest são dados adiante.
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Os resultados indicaram que 24 amostras foram declaradas positivas através de ambos os testes enquanto que 24 foram declaradas negativas através de ambos os testes. Entretanto, os dois testes não estavam de acordo com respeito às 10 amostras. Amostras Suínas (n=39):
O ELISA Ph-3AB foi usado para classificar 39 amostras de suínos coletadas de di- ferentes lugares. A comparação dos resultados contra Ceditest é dada abaixo.
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Os resultados indicaram que 13 amostras foram declaradas positivas através de ambos os testes enquanto que 24 foram declaradas negativas através de ambos os testes. Entretanto, os dois testes não estavam de acordo com respeito às 2 amostras.
ii. Número total de soros testados através de ELISA Ph-3AB e comparação com Ceditest
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ELISA de base Ph-3AB é muito específico (100%) com base nas amostras negati- vas testadas. ELISA de base Ph-3AB foi 95,80%, enquanto que a sensibilidade do Ceditest quando comparado com ELISA Ph-3AB foi 98,21. Poucas amostras que foram declaradas NSP anticorpos negativa através de Ceditest foram positivas através de ELISA de base Ph- 3AB e vice versa.
Exemplo 9
Análise da expressão de epítopos da proteína estrutural FMDV-VP1
Fragmentos DNA que servem para codificar epítopos neutralizantes de FMDV-VP1 foram clonados em pR-Ph-CP em sítios de restrição de I e Kpn I para produzir vetores re- combinantes pR-Ph-VP1-C1, pR-Ph- VP1-C2 e pR-Ph-VP1-C3. O DNA de inserção nesse vetor recombinante foi confirmado através de métodos de seqüenciamento de DNA conhe- cidos na arte. Esses vetores recombinantes foram transformados em cepas E.coli DH5 a. As células E.coli recombinantes contendo os referidos vetores recombinantes foram designados como r-Ph-VP1-C1, r-Ph-VP1-C2 e r-Ph-VP1-C3. O plasmídeo foi isolado a partir de cepas E.coli DH5 a contendo vetor recombinante e transformadas em cepas E.coli BL21 (DE3) pLys S para a expressão de proteínas de fusão. Os TVLPs quiméricos foram designados como Ph-VPI-C1, Ph-VP 1-C2 e Ph-VP 1-C3 possuindo seqüência aminoácida como mos- trado na SEQ ID NO: 13, 15 e 17. O procedimento detalhado está provido no Exemplo 3.
As células E.coli recombinantes foram desenvolvidas no meio de crescimento para a produção das partículas quiméricas do tipo timovírus como descrito no Exemplo 4. A puri- ficação de TVLPs quiméricos foi realizada utilizando o procedimento como descrito no E- xemplo 5.
Exemplo 10
Análise da expressa do hormônio de liberação da Gonadotropina
Fragmento DNA que serve para codificar GnRH proteína foi clonado em pR-Ph-CP em sítios de restrição de I e Kpn I para produzir vetores recombinantes pR-Ph-IC-C1 frag- mento DNA de GnRH em combinação com seqüência DNA P35 de CDV em repetições em paralelo foi também clonado em pR-Ph- CP em sítios de restrição de I e Kpn I para produzir vetores recombinantes pR-Ph-IC-C2 e pR-Ph- IC-C3.
O DNA de inserção nesse vetor recombinante foi confirmado através de métodos de seqüenciamento de DNA conhecidos na arte. Esses vetores recombinantes foram trans- formados em cepas E.coli DH5-o. As células E.coli recombinantes contendo os referidos vetores recombinantes foram designados como r-Ph-IC-C1, r-Ph-IC-C2 e r-Ph-IC-C3. O plasmídeo foi isolado a partir de cepas E.coli DH5-a contendo vetor recombinante e trans- formadas em cepas E.coli (DE3) pLys S para a expressão de proteínas de fusão. Os TVLPs quiméricos foram designados como Ph-IC-CI, Ph- IC-C2 e Ph-IC-C3 possuindo seqüência aminoácida como mostrado na SEQ ID NO: 19, 21 e 23. O procedimento detalhado está provido no Exemplo 3.
As células E.coli recombinantes foram desenvolvidas no meio de crescimento para a produção das partículas quiméricas do tipo timovírus como descrito no Exemplo 4. A puri- ficação de TVLPs quiméricos foi realizada utilizando o procedimento como descrito no E- xemplo 5.
Exemplo 11
Expressão de CPV-VP2 VLPs
Fragmento DNA que serve para codificar sítios de peptídeos antigênicos de Parvo- vírus Canino (CPV) foi clonado em pR-Ph-CP em sítios de restrição de I e Kpn I para produ- zir vetores recombinantes pR-Ph- CPV. fragmento DNA of sítios de peptídeos antigênicos of CPV em repetições em paralelo foi clonado em pR-Ph-CP em sítios de restrição de I e Kpn I para produzir vetores recombinantes pR-Ph- CPV1, pR-Ph-CPV2, pR-Ph-CPV3, pR-Ph- CPV4 e pR-Ph-CPV5.
O DNA de inserção nesse vetor recombinante foi confirmado através de métodos de seqüenciamento de DNA conhecidos na arte. Esses vetores recombinantes foram trans- formados em cepas E.coli DHõ-σ. As células E.coli recombinantes contendo os referidos vetores recombinantes foram designados como r-Ph-CPV1, r-Ph-CPV2, r-Ph-CPV3, r-Ph- CPV4 e r-Ph-CPV5. O plasmídeo foi isolado a partir de células de E.coli (DH5-a) recombi- nantes contendo vetor recombinante e transformadas em Cepa E.coli (DE3) pLys S para a expressão de proteínas de fusão. Os TVLPs quiméricos foram designados como Ph-CPVI, Ph-CP V2, Ph-CP V3, Ph-CP V4 e Ph-CP V5 possuindo seqüência aminoácida como mos- trado na SEQ ID NO: 25, 27, 29, 31 e 33. O procedimento detalhado da transformação de E.coli está provido no Exemplo 3.
As células E.coli recombinantes foram desenvolvidas no meio de crescimento para a produção das partículas quiméricas do tipo timovírus como descrito no Exemplo 4. A puri- ficação de TVLPs quiméricos foi realizada utilizando o procedimento como descrito no E- xemplo 5.
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<110> INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED MASARAPU, HEMA
NAGENDRAIÜJMAR, SINGANALLUR BALASUBRAMANIAN THIAGARA3AN, DORAIRA3AN SRINIVASAN, VILLUPPANOOR ALWAR
<120> "PARTÍCULAS QUIMÉRICAS DO TIPO TIMOVÍRUS"
<130> PCT0046
<150> 486/CHE/2006 <151> 2006-03-17
<160> 34
<170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 187 <212> PRT
<213> Physalis MottTe Virus <400> ' 1
Asp Ser Ser Glu Val Val Lys Val Lys Gln Ala Ser Ile Pro Ala Pro 15 10 15
Gly Ser Ile Leu Ser Gln Pro Asn Thr Glu Gln Ser Pro Ala Ile Val 20 25 30
Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala 35 40 45
Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala 50 55 60
Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro 65 70 75 80
Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val
85 90 95
Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly 100 105 110 Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile ser Ala Ala Lys Thr Ile 115 120 125
Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser 130 135 140
Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro 145 150 155 160
Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg
165 170 175
Ile Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 180 185
<210> 2 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 2
gactcttcgg aagttgtcaa agtcaagcag gcctccatcc ccgcccctgg ctccattctc 60
tcccagccca acacagaaca atcacctgcc atagttctcc cttttcagtt tgaagccact, 120
actttcggta ccgctgaaac cgcagcccaa gtctctctcc agactgccga ccccattacc 180
aaactgaccg ccccctaccg acatgctcag atcgtcgagt gcaaagctat cctcactcca 240
actgatcttg ctgtctccaa tcccctcaca gtctacctag catgggtccc cgccaactcc 300
cctgccactc cgactcaaat actgcgagtc tacggcggtc agtcttttgt tcttggcggc 360
gccatctcag ccgccaaaac cattgaggtc cccctcaatc ttgactctgt caaccgcatg 420 ttgaaagaca gcgtgaccta cactgacacc cccaagctcc ttgcctactc aagagccccc 480
accaacccct cgaaaatccc aaccgctagt attcagatca gcggtcgcat tcggctctcc 540
aagccaatgc tgatagccaa ctaa 564
<210> 3 <211> 210 <212> PRT
<213> Chimeric protein <400> 3
Met Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val 15 10 15
Arg Ala Lys Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu 20 25 30
Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu 35 40 45
Glu Gln ser Pro Ala Xle Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr 50 55 60
Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala Asp 65 70 75 80
Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile Val Glu
85 90 95
Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu 100 105 110
Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr 115 120 125
Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala 130 135 140 Ile Ser ATa Ala Lys Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp ser Val 145 150 155 160
Asn Arg Met Leu Lys Asp ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu
165 170 175
Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr Ala 180 185 190
Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile 195 200 205
Ala Asn 210
<210> 4
<211> 633
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 4
atgggtccgt atgccggtcc gctggaacgt cagaaaccgc tgaaagttcg tgccaaactg 60
ccgcagcagg aaggcccgta cgctggcccg atggagcgcc aaaagccatt aaaggtgaaa 120
gcgaaagcgc cggttgttaa agaagaacag agcccggcga ttgttctgcc gtttcagttt 180
gaagcgacca cctttggtac cgctgaaacc gcagcccaag tctctctcca gactgccgac 240
cccattacca aactgaccgc cccctaccga catgctcaga tcgtcgagtg caaagctatc 300
ctcactccaa ctgatcttgc tgtctccaat cccctcacag tctacctagc atgggtcccc 360
gccaactccc ctgccactcc gactcaaata ctgcgagtct acggcggtca gtcttttgtt 420
cttggcggcg ccatctcagc cgccaaaacc attgaggtcc ccctcaatct tgactctgtc 480
aaccgcatgt tgaaagacag cgtgacctac actgacaccc ccaagctcct tgcctactca 540
agagccccca ccaacccctc gaaaatccca accgctagta ttcagatcag cggtcgcatt 600
cggctctcca agccaatgct gatagccaac taa 633
<210> 5 <211> 228 <212> PRT <213> Chimeric protein
<400> 5
Met Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Gly 1 5 10 15
Gly Ser Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala 20 25 30
Gly Gly Ser Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu 35 40 45
Lys Gly Gly Ser Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala 50 55 60
Lys Ala Glu Gln Ser Pro Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala 65 70 75 80
Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr 85 90 95
Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile 100 105 110
Val Glu cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn 115 120 125
Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr 130 135 140
Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Glrt Ser Phe Val Leu Gly 145 150 155 160
Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu vai Pro Leu Asn Leu Asp
165 170 175
Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro 180 185 190
Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro ser Lys Ile Pro 195 200 205
Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu ser Lys Pro Met 210 215 220
Leu Ile Ala Asn 225
<210> 6
<211> 687
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 6
atgggtccgt atgccggtcc gctggaacgt cagaaaccgc tgaaaggtgg tagcccgatg 60
gagcgccaaa aaccgctgaa ggttaaagcg aaagcgggcg gtagcggccc gtacgctggc 120
ccgttagaac gtcaaaaacc gttaaaaggc ggctctccga tggaacgcca gaagccgtta 180
aaagtgaaag cgaaagccga acagagcccg gcgattgttc tgccgtttca gtttgaagcg 240
accacctttg gtaccgctga aaccgcagcc caagtctctc tccagactgc cgaccccatt 300
accaaactga ccgcccccta ccgacatgct caaatcgtcg agtgcaaagc tatcctcact 360
ccaactgatc ttgctgtctc caatcccctc acagtctacc tagcatgggt ccccgccaac
tcccctgcca ctccgactca aatactgcga gtctacggcg gtcagtcttt tgttcttggc
ggcgccatct cagccgccaa aaccattgag gtccccctca atcttgactc tgtcaaccgc 540
atgttgaaag acagcgtgac ctacactgac acccccaagc tccttgccta ctcaagagcc 600
cccaccaacc cctcgaaaat cccaaccgct agtattcaga tcagcggtcg cattcggctc 660
tccaagccaa tgctgatagc caactaa 687
<210> 7 <211> 221 <212> PRT
<213> chimeric protein <400> 7
Met Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Asri Ile Thr Thr Asp Asp Lys Gly 1 5 10 15
Gly Ser Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys 20 25 30
Gly Gly Ser Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys 35 40 45
Ala Pro Gly Ser Ile Leu Ser Gln pro Asn Thr Glu Gln Ser Pro Ala 50 55 60
Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu 65 70 75 80
Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu
85 90 95 Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln-Ile Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu 100 105 110
Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala 115 120 125
Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val 130 135 140
Tyr Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys 145 150 155 160
Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp ser Val Asn Arg Met Leu Lys
165 170 175
Asp Ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg 180 185 190
Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser 195 200 205
Gly Arg Ile Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215 220
<210> 8 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 8
atgaacgaat acatcgaaaa agcgaacatc accaccgatg ataaaggtgg taqcggtccg 60
tatgccggtc cgctggaacg tcagaaaccg ctgaaaggtg gttctccgat ggagcgccaa 120
aagccattaa aggtgaaagc gaaagcgccg ggtagcattc tgagccagcc gaataccgaa 180
cagagcccgg cgattgttct gccgtttcag tttgaagcga ccacctttgg taccgctgaa 240 accgcagccc aagtctctct ccagactgcc gaccccatta ccaaactgac cgccccctac
cgacatgctc agatcgtcga gtgcaaagct atcctcactc caactgatct tgctgtctcc 360
aatcccctca cagtctacct agcatgggtc cccgccaact cccctgccac tccgactcaa 420
atactgcgag tctacggcgg tcagtctttt gttcttggcg gcgccatctc agccgccaaa 480
accattgagg tccccctcaa tcttgactct gtcaaccgca tgttgaaaga cagcgtgacc 540
tacactgaca cccccaagct ccttgcctac tcaagaqccc ccaccaaccc ctcgaaaatc 600
ccaaccgcta gtattcagat cagcggtcgc attcggctct ccaagccaat gctgatagcc 660
aactaa 666
<210> 9 <211> 219 <212> prt
<213> Chimeric protein <400> 9
Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr VaT Ala His Gly Val Phe Gly 1 5 10 15
Gly Ser Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val 20 25 30
Phe Gly Gly Ser Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His 35 40 45
Gly Val Phe Leu ser Gln Pro Asn Thr Glu Gln Ser Pro Ala Ile Val 50 55 60
Leu Pro Phe Gln Phe gTu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala 65 70 75 80 Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala
85 90 95
Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile Val Glu Cys Lys Ala lie Leu Thr Pro 100 105 110
Thr Asp Leu Ala Val ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val 115 120 125
Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly 130 135 140
Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile ser Ala Ala Lys Thr Ile 145 150 15 5 160
Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser
165 170 175
Vai Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr ser Arg Ala Pro 180 185 190
Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile ser Gly Arg 195 200 205
Ile Arg Leu ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215
<210> 10
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 10
atgcgtaaaa ccaaactggc gccgaccgtg gcccatggcg tgtttggcgg cagcatgcgc 60
aaaacgaaac tggccccgac ggttgctcac ggtgtgttcg gcggctcgat gcgcaaaacc 120 aaactggcac cgacggtggc acacggcgtt tttctgagcc agccgaacac cgaacagagc 180
ccggcgattg tgctgccgtt tcagtttgaa gcgaccacct ttggtaccgc tgaaaccgca 240
gcccaagtct ctctccagac tgccgacccc attaccaaac tgaccgcccc ctaccgacat 300
gctcagatcg tcgagtgcaa agctatcctc actccaactg atcttgctgt ctccaatccc
ctcacagtct acctagcatg ggtccccgcc aactcccctg ccactccgac tcaaatactg 420
cgagtctacg gcggtcagtc ttttgttctt ggcggcgcca tctcagccgc caaaaccatt 480
gaggtccccc tcaatcttga ctctgtcaac cgcatgttga aagacagcgt gacctacact 540
gacaccccca agctccttgc ctactcaaga gcccccacca acccctcgaa aatcccaacc 600
gctagtattc agatcagcgg tcgcattcgg ctctccaagc caatgctgat agccaactaa 660
<210> 11 <211> 217 <212> PRT
<213> Chimeric protein <400> 11
Met Asn Glu Tyr Ile Glu Lys Ala Asn Ile Thr Thr Asp Asp Lys Gly 15 10 15
Gly Ser Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys 20 25 30
Val Lys Ala Lys Ala Gly Gly Ser Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro 35 40 45
Thr Val Ala His Gly Val Phe Glu Gln ser Pro Ala Ile vai Leu Pro 50 55 60
Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln 65 70 75 80
Val Ser Leu GTn Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr
85 90 95
Arg His Ala Gln Ile Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp 100 105 110
Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala 115 120 125
Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln 130 135 140
Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu Val 145 150 155 160
Pro Leu Asn Leu Asp Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser Val Thr
165 170 175
Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Thr Asn 180 185 190
Pro ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg 195 200 205
Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215
<210> 12
<211> 654
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 12
atgaacgaat acatcgaaaa agcgaacatt accaccgatg ataaaggcgg cagcggcccg 60
tatgccggtc cgctggaacg tcagaaaccg ctgaaagtga aagcgaaagc gggcggtagc 120
atgcgtaaaa ccaaactggc gccgaccgtg gcccatggcg tgtttgaaca gagcccggcg 180
attgtgctgc cgtttcagtt tgaagcgacc acctttggta ccgctgaaac cgcagcccaa 240
gtctctctcc agactgccga ccccattacc aaactgaccg ccccctaccg acatgctcag
atcgtcgagt gcaaagctat cctcactcca actgatcttg ctgtctccaa tcccctcaca 360
gtctacctag catgggtccc cgccaactcc cctgccactc cgactcaaat actgcgagtc 420
tacggcggtc agtcttttgt tcttggcggc gccatctcag ccgccaaaac cattgaggtc 480
cccctcaatc ttgactctgt caaccgcatg ttgaaagaca gcgtgaccta cactgacacc 540
cccaagctcc ttgcctactc aagagccccc accaacccct cgaaaatccc aaccgctagt 600
attcagatca gcggtcgcat tcggctctcc aagccaatgc tgatagccaa ctaa 654
<210> 13 <211> 219 <212> PRT
<213> Chimeric protein <400> 13
Met Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val Ser Phe Ile 1 5 10 15
Met Asp Arg Phe Val Gly Gly Ser Lys Val Thr Pro Gln Asn Gln Ile 20 25 30
Asn Ile Leu Asp Leu Met Gln Val Pro Ser His Thr Gly Gly Ser Pro 35 40 45
Gly Ser Ile Leu Ser Gln Pro Asn Thr Glu Gln Ser Pro Ala Ile Val 50 55 60 Leu Pro Phe GTn Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala 65 70 75 80
Ala Gln Val ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala
85 90 '95
Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro 100 105 110
Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr vai Tyr Leu Ala Trp Val 115 120 125
Pro Ala Asn ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg vai Tyr Gly 130 135 140
Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile 145 150 155 160
Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser
165 170 175
Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr ser Arg Ala Pro 180 185 190
Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg 195 200 205
Ile Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215
<210> 14
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic <400> 14
atggaaaccc agattcagcg tcgtcagcat accgatgtga gctttatcat ggatcgtttt 60 gtgggcggca gcaaagtgac cccgcagaac cagattaaca ttctggatct gatgcaggtt
ccgagccata ccggtggtag cccgggcagc attctgagcc agccgaacac cgaacagagc 180
ccggcgattg tgctgccgtt tcagtttgaa gcgaccacct ttggtaccgc tgaaaccgca 240
gcccaagtct ctctccagac tgccgacccc attaccaaac tgaccgcccc ctaccgacat
gctcagatcg tcgagtgcaa agctatcctc actccaactg atcttgctgt ctccaatccc 360
ctcacagtct acctagcatg ggtccccgcc aactcccctg ccactccgac tcaaatactg 420
cgagtctacg gcggtcagtc ttttgttctt ggcggcgcca tctcagccgc caaaaccatt 480
gaggtccccc tcaatcttga ctctgtcaac cgcatgttga aagacagcgt gacctacact 540
gacaccccca agctccttgc ctactcaaga gcccccacca acccctcgaa aatcccaacc 600
gctagtattc agatcagcgg tcgcattcgg ctctccaagc caatgctgat agccaactaa 660
<210> 15 <211> 229 <212> PRT
<213> Chimeric protein <400> 15
Met Arg Tyr Ser Arg Asn ATa Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln 15 10 15
Val Leu Ala Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Arg Tyr 20 25 30
Ser Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala 35 40 45
Gln Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro Gly Gly Ser Pro Asn Leu Arg Gly 50 55 60
Asp Leu Gln Val Leu Ser Pro Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu 65 70 75 80
Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln 100 105 110
Ile Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala vai Ser 115 120 125
Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala IBO 135 140
Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu 145 150 155 160
Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu
165 170 175
Asp ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr 180 185 190
Pro Lys Leu Leu Ala Tyr ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro ser Lys Ile 195 200 205
Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu ser Lys Pro 210 215 220
Met Leu Ile Ala Asn 225
<210> 16
<211> 690
<212> DNA
<213> Artificial <220>
<223> Synthetic <400> 16
atgcgttata gccgtaacgc cgtgccgaac ctgcgtggtg atctgcaggt gctggcccag 60
aaagtggcàc gtaccctgcc gggtggcagc cgctattctc gtaatgccgt tccgaatctg
cgcggcgacc tgcaagttct ggcacaaaaa gttgcccgta cgctgccggg cggtagcccg 180
aatctgcgtg gcgatctgca ggttctgtct ccggcgattg tgctgccgtt tcagtttgaa 240
gcgaccacct ttggtaccgc tgaaaccgca gcccaagtct ctctccagac tgccgacGcc 300
attaccaaac tgaccgcccc ctaccgacat gctcagatcg tcgagtgcaa agctatcctc 360
actccaactg atcttgctgt ctccaatccc ctcacagtct acctagcatg ggtccccgcc 420
aactcccctg ccactccgac tcaaatactg cgagtctacg gcggtcagtc ttttgttctt 480
ggcggcgcca tctcagccgc caaaaccatt gaggtccccc tcaatcttga ctctgtcaac 540
cgcatgttga aagacagcgt gacctacact gacaccccca agctccttgc ctactcaaga 600
gcccccacca acccctcgaa aatcccaacc gctagtattc agatcagcgg tcgcattcgg 660
ctctccaagc caatgctgat agccaactaa 690
<210> 17 <211> 220 <212> PRT
<213> Chimeric protein <400> 17
Met Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ser Arg His Lys GTn Lys Ile-Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu 20 25 30
Gly Gly Ser Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr 35 40 45
Leu Gly Gly Ser Leu Ser Gln Pro Asn Thr Glu Gln ser Pro Ala Ile 50 55' 60
Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr 65 70 75 80
Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr
85 90 95
Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln lie Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr 100 105 110
pro Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp 115 120 125
Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln lie Leu Arg Val Tyr 130 135 140
Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile ser Ala Ala Lys Thr 145 150 155 160
Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp
165 170 175
Ser vai Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala 180 185 190
Pro Thr Asn Pro ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly 195 200 205
Arg lie Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215 220 <210> 18
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 18
atgcgccata aacagaaaat tgtggcgccg gtgaaacaga ccctgggcgg cagccgtcac 60
aaacagaaaa tcgttgcccc ggttaaacaa acgctgggcg gttctcgtca taaacaaaaa 120
atcgtcgctc cggtcaaaca gaccctgggt ggtagcctga gccagccgaa caccgaacag 180
agcccggcga ttgtgctgcc gtttcagttt gaagcgacca cctttggtac cgctgaaacc 240
gcagcccaag tctctctcca gactgccgac cccattacca aactgaccgc cccctaccga 300
catgctcaga tcgtcgagtg caaagctatc ctcactccaa ctgatcttgc tgtctccaat 360
cccctcacag tctacctagc atgggtcccc gccaactccc ctgccactcc gactcaaata 420
ctgcgagtct acggcggtca gtcttttgtt cttggcggcg ccatctcagc cgccaaaacc 480
attgaggtcc ccctcaatct tgactctgtc aaccgcatgt tgaaagacag cgtgacctac 540
actgacaccc ccaagctcct tgcctactca agagccccca ccaacccctc gaaaatccca 600
accgctagta ttcagatcag cggtcgcatt cggctctcca agccaatgct gatagccaac 660
taa 663
<210> 19
<211> 227
<212> PRT
<213> Chimeric protein
<400> 19 Met Glu His Trp ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Ser Glu His 15 10 15
Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Ser Glu His Trp Ser Tyr 20 25 30
Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg .35 40 45
Pro Gly Gly Gly Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 50 55 60
Gly Ser Gln ser Pro Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr 65 70 75 80
Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala
85 90 95
Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln lie Val 100 105 110
Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala vai ser Asn Pro 115 120 125
Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro 130 135 140
Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln ser Phe vai Leu Gly Gly 145 150 15 5 160
Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu vai Pro Leu Asn Leu Asp ser
165 170 175
Val Asn Arg Met Leu Lys Asp ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys 180 185 190
Leu Leu Ala Tyr ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro ser Lys Ile Pro Thr 195 200 205 Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu ser Lys Pro Met Leu 210 215 220
Ile Ala Asn 225
<210> 20
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 20
atggaacatt ggagctatgg cctgcgtccg ggcggtggca gcgaacattg gtcttacggt 60
ctgcgtccgg gtggcggctc tgaacactgg tcctatggcc tgcgtccggg tggcggttcc 120
gaacattgga gctacggtct gcgtccgggt ggtggtagcg aacactggag ttatggcctg 180
cgtccgggtg gtggtagtca gagcccggcg attgtgctgc cgtttcagtt tgaagcgacc 240
acctttggta ccgctgaaac cgcagcccaa gtctctctcc agactgccga ccccattacc 300
aaactgaccg ccccctaccg acatgctcag atcgtcgagt gcaaagctat cctcactcca 360
actgatcttg ctgtctccaa tcccctcaca gtctacctag catgggtccc cgccaactcc 420
cctgccactc cgactcaaat actgcgagtc tacggeggtc agtcttttgt tcttggcggc 480
gccatctcag ccgccaaaac cattgaggtc cccctcaatc ttgactctgt caaccgcatg 540
ttgaaagaca gcgtgaccta cactgacacc cccaagctcc ttgcctactc aagagccccc 600
accaacccct cgaaaatccc aaccgctagt attcagatca gcggtcgcat tcggctctcc 660
aagccaatgc tgatagccaa ctaa 684
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> Chimeric protein
<400> 21
Met Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 1 5 10 15
Leu Asn Gly Gly Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 20 25 30
Gly ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser 35 40 45
Asn Leu Asn Gly Gly Ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 50 55 60
Gly Gly Ser Ser Pro Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr 65 70 75 80
Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala
85 90 95
Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln lie Val 100 105 110
Glu cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala vai Ser Asn Pro 115 120 125
Leu Thr vai Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro 130 135 140
Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln ser Phe Val Leu Gly Gly 145 150 155 160
Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu vai Pro Leu Asn Leu Asp Ser
165 170 175 Val Asn Arg Met Leu Lys Asp ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys 180 185 190
Leu Leu Ala Tyr ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr 195 200 205
Ala ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu 210 215 220
Ile Ala Asn 225
<210> 22
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 22
atgaccgccg ctcagattac cgccggcatt gcgctgcatc agagcaacct gaacggcggc 60
agcgaacatt ggagctatgg cctgcgtccg ggtggtggta gcacggcggc acagatcacc 120
gctggtatcg ccctgcatca gtctaacctg aatggcggtt ctgaacattg gtcttacggt 180
ctgcgtccgg gcggtggcag ctctccggcg attgtgctgc cgtttcagtt tgaagcgacc 240
acctttggta ccgctgaaac cgcagcccaa gtctctctcc agactgccga ccccattacc 300
aaactgaccg ccccctaccg acatgctcag atcgtcgagt gcaaagctat cctcactcca 360
actgatcttg ctgtctccaa tcccctcaca gtctacctag catgggtccc cgccaactcc 420
cctgccactc cgactcaaat actgcgagtc tacggcggtc agtcttttgt tcttggcggc 480
gccatctcag ccgccaaaac cattgaggtc cccctcaatc ttgactctgt caaccgcatg 540
ttqaaagaca gcgtgaccta cactgacacc cccaagctcc ttgcctactc aagagccccc 600
accaacccct cgaaaatccc aaccgctagt attcagatca gcggtcgcat tcggctctcc 660
aagccaatgc tgatagccaa ctaa 684
<210> 23 <211> 222 <212> PRT
<213> chimeric protein <400> 23
Met Thr Ala Ala Gln Xle Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln ser Asn 15 10 15
Leu Asn Gly Gly ser Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly 20 25 30
Gly ser Glu His Trp ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly Ser Glu 35 40 45
His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Gly ser Glu Gln ser Pro 50 55 60
Ala lie vai Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala 65 -70 75 80
Glu Thr Ala Ala Gln Val ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys
85 90 95
Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile vai Glu Cys Lys Ala Ile 100 105 110
Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu 115 120 125
Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln lie Leu Arg 130 135 140
Val Tyr Gly Gly Gln ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile ser Ala Ala 145 150 155 160
Lys Thr He Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp ser Val Asn Arg Met Leu
165 170 175
Lys Asp Ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser 180 185 190
Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile pro Thr Ala ser Ile Gln Ile 195 200 205
Ser Gly Arg Ile Arg Leu ser Lys Pro Met Leu lie Ala Asn 210 215 220
<210> 24
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 24
atgaccgccg ctcagattac cgccggcatt gcgctgcatc agagcaacct gaacggcggc 60
agcgaacatt ggagctatgg cctgcgtccg ggcggtggca gcgaacactg gtcttacggt 120
ctgcgtccgg gtggcggctc tgaacattgg tcgtatggcc tgcgtccggg tggcggtagt 180
gaacagagcc cggcgattgt gctgccgttt cagtttgaag cgaccacctt tggtaccgct 240
gaaaccgcag cccaagtctc tctccagact gccgacccca ttaccaaact gaccgccccc 300
taccgacatg ctcagatcgt cgagtgcaaa gctatcctca ctccaactga tcttgctgtc 360
tccaatcccc tcacagtcta cctagcatgg gtccccgcca actcccctgc cactccgact 420 caaatactgc gagtctacgg cggtcagtct tttgttcttg gcggcgccat ctcagccgcc 480
aaaaccattg aggtccccct caatcttgac tctgtcaacc gcatgttgaa agacagcgtg 540
acctacactg acacccccaa gctccttgcc tactcaagag cccccaccaa cccctcgaaa 600
atcccaaccg ctagtattca gatcagcggt cgcattcggc tctccaagcc aatgctgata 660
gccaactaa 669
<210> 25 <211> 227 <212> PRT <213> chimeric protein
<400> 25
Met Ser Asp Gly Ala VaT Gln Pro Asp GTy Gly Gln Pro Ala Val Arg 1 5 10 15
Asn Glu Arg Gly Gly Ser Lys Thr Ala Vai Asn Gly Asn .Met Ala Leu 20 25 30
Asp Asp Thr His Ala Gly Gly Ser Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu 35 40 45
Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly 50 55 60
Val Gln Gly Gly Ser Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr 65 70 75 80
Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln Thr Ala 85 90 95
Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile val 100 105 110 Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro-Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro 115 120 · 125
Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn ser Pro Ala Thr Pro 130 135 140
Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly 145 150 155 160
Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu vai Pro Leu Asn Leu Asp Ser
165 170 175
Val Asn Arg Met Leu Lys Asp ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys 180 185 190
Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr 195 200 205
Ala ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu ser Lys Pro Met Leu 210 215 220
Ile Ala Asn 225
<210> 26
<211> 684
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 26
atgagcgatg gcgcggtgca gccggatggt ggtcagccgg cggtgcgtaa cgaacgtggc 60
ggcagcaaaa ccgcggtgaa cggcaacatg gcgctggatg atacccatgc gggcggtagc 120
gcgctgggtc tgccgccgtt tctgaacagc ctgccgcaga gcgaaggcgg caccaacttt 180
ggctatattg gcgtgcaggg cggcagcgcg attgtgctgc cgtttcagtt tgaagcgacc 240 acctttggta ccgctgaaac cgcagcccaa gtctctctcc agactgccga ccccattacc 300
aaactgaccg ccccctaccg acatgctcag atcgtcgagt gcaaagctat cctcactcca 360
actgatcttg ctgtctccaa tcccctcaca gtctacctag catgggtccc cgccaactcc 420
cctgccactc cgactcaaat actgcgagtc tacggcggtc agtcttttgt tcttggcggc 480
gccatctcag ccgccaaaac cattgaggtc cccctcaatc ttgactctgt caaccgcatg 540
ttgaaagaca gcgtgaccta cactgacacc cccaagctcc ttgcctactc aagagccccc 600
accaacccct cgaaaatccc aaccgctagt attcagatca gcggtcgcat tcggctctcc 660
aagccaatgc tgatagccaa ctaa 684
<210> 27
<211> 223
<212> PRT
<213> chimeric protein
<400> 27
Met Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 1 5 10 15
Leu Asn Gly Gly Ser Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly 20 25 30
Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ala Ala 35 40 45
Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn Leu Asn Gly Gly 50 55 60
Ser Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe Gly Thr 65 70 75 80 Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr
85 90 95
Lys-Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile Val Glu Cys Lys Ala 100 105 110
Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr 115 120 125
Leu Ala Trp vai Pro Ala Asn ser Pro Ala Thr Pro Thr Gln Ile Leu 130 135 140
Arg Val Tyr Gly Gly Gln ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile Ser Ala 145 150 155 160
Ala Lys Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp Ser Val Asn Arg Met
165 170 175
Leu Lys Asp ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr 180 185 190
ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro ser Lys lie Pro Thr Ala ser Ile Gln 195 200 205
Ile ser Gly Arg Ile Arg Leu Ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215 220
<210> 28
<211> 672
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 28
atgaccgcgg cgcagattac cgcgggcatc gcgctgcatc agtctaacct gaacggcggc 60
agcatgagcg atggtgcggt gcagccggat ggtggtcagc cggcggtgcg taacgaacgt 120 gcgaccggcg gtagcaccgc cgcccagatc accgccggta tcgccctgca ccagagcaat 180
ctgaatggtg gtagcgcgat tgtgctgccg tttcagtttg aagcgaccac ctttggtacc 240
gctgaaaccg cagcccaagt ctctctccag actgccgacc ccattaccaa actgaccgcc
ccctaccgac atgctcagat cgtcgagtgc aaagctatcc tcactccaac tgatcttgct
gtctccaatc ccctcacagt ctacctagca tgggtccccg ccaactcccc tgccactccg 420
actcaaatac tgcgagtcta cggcggtcag tcttttgttc ttggcggcgc catctcagcc 480
gccaaaacca ttgaggtccc cctcaatctt gactctgtca accgcatgtt gaaagacagc 540
gtgacctaca ctgacacccc caagctcctt gcctactcaa gagcccccac caacccctcg 600
aaaatcccaa ccgctagtat tcagatcagc ggtcgcattc ggctctccaa gccaatgctg 660
atagccaact aa 672
<210> 29 <211> 223 <212> PRT
<213> Chimeric protein <400> 29
Met Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 15 10 15
Leu Asn Gly Gly Ser Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly 20 25 30
Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Gly Gly Ser Met Ser Asp Gly Ala 35 40 45
Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Gly Gly 50 55 60 Ser Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu Ala Thr Thr Phe GTy Thr 65 70 75 80
Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val ser Leu Gln Thr Ala Asp Pro Ile Thr
85 90 95
Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln Ile Val Glu Cys Lys Ala 100 105 110
Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val Ser Asn Pro Leu Thr Val Tyr 115 120 125
Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn ser Pro Alã Thr Pro Thr Gln Ile Leu 130 135 140
Arg Val Tyr Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu Gly Gly Ala Ile ser Ala 145 150 155 160
Ala Lys Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu Asp ser Val Asn Arg Met
165 170 175
Leu Lys Asp ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr Pro Lys Leu Leu Ala Tyr 180 185 190
ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile Pro Thr Ala Ser Ile Gln 195 200 205
Ile ser Gly Arg Ile Arg Leu ser Lys Pro Met Leu Ile Ala Asn 210 215 220
<210> 30
<211> 6*72
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 30
atgaccgcgg cgcagattac cgcgggcatt gcgctgcatc agagcaacct gaacggtggc agtatgtctg acggtgcggt gcagccggat ggtggtcaac cggcggtgcg taacgagcgt 120
ggcggtagca tgagcgatgg cgccgttcag ccggatggcg gccagccggc cgttcgcaat
gaacgtggtg gcagcgcgat tgtgctgccg tttcagtttg aagcgaccac ctttggtacc 240
gctgaaaccg cagcccaagt ctctctccag actgccgacc ccattaccaa actgaccgcc 300
ccctaccgac atgctcagat cgtcgagtgc aaagctatcc tcactccaac tgatcttgct 360
gtctccaatc ccctcacagt ctacctagca tgggtccccg ccaactcccc tgccactccg 420
actcaaatac tgcgagtcta cggcggtcag tcttttgttc ttggcggcgc catctcagcc 480
gccaaaacca ttgaggtccc cctcaatctt gactctgtca accgcatgtt gaaagacagc 540
gtgacctaca ctgacacccc caagctcctt gcctactcaa gagcccccac. caacccctcg 600
aaaatcccaa ccgctagtat tcagatcagc ggtcgcattc ggctctccaa gccaatgctg 660
atagccaact aa 672
<210> 31
<211> 229
<212> PRT
<213> Chimeric protein
<400> 31
Met Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln Ser Asn 1 5 10 15
Leu Asn Gly Gly Ser Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met Ala Leu Asp 20 25 30
Asp Thr His Ala Gln Gly Gly Ser Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe 35 40 45
Leu Asn Ser Leu Pro Gln ser Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile 50 55 60
Gly Val Gln Gln Gly Gly ser Ala Ile Val Leu Pro Phe Gln Phe Glu 65 70 75 80
Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arq His Ala Gln 100 105 110
Ile Val Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala Val Ser 115 120 125
Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala 130 13 5 140
Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln Ser Phe Val Leu 145 150 155 160
Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu
165 170 175
Asp Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr 180 185 190
Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile 195 200 205
Pro Thr Ala ser Ile Gln Ile ser Gly Arg Ile Arg Leu Ser Lys Pro 210 215 220
Met Leu Ile Ala Asn 225
<210> 32 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial
<220>
<223> Synthetic <400> 32
atgacagcag ctcagataac tgcgggtatc 60
tcgaaaactg cagttaacgg aaacatggct 120
agagcattgg gcttaccacc atttctaaat 180
tttggttata taggagttca acaaggaggt 240
gccactactt tcggtaccgc tgaaaccgca 300
attaccaaac tgaccgcccc ctaccgacat 360
actccaactg atcttgctgt ctccaatccc 420
aactcccctg ccactccgac tcaaatactg 480
ggcggcgcca tctcagccgc caaaaccatt 540
cgcatgttga aagacagcgt gacctacact 600
gcccccacca acccctcgaa aatcccaacc 660
ctctccaagc caatgctgat agccaactaa 690
<210> 33
<211> 229
<212> PRT
<213> Chimeric protein
<400> 33
gcattgcatc agtcaaactt gaatggaggt ttagatgata ctcatgcaca aggaggttcg tctttgcctc aatctgaagg aggtactaac tcggccatag ttctcccttt tcagtttgaa gcccaagtct ctctccagac tgccgacccc gctcagatcg tcgagtgcaa agctatcctc ctcacagtct acctagcatg ggtccccgcc cgagtctacg gcggtcagtc ttttgttctt gaggtccccc tcaatcttga ctctgtcaac gacaccccca agctccttgc ctactcaaga gctagtattc agatcagcgg tcgcattcgg Met Lys Thr Ala vai Asn Giy Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His Ala 1 5 10 15
Gln Gly Gly Ser Arg.Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu 20 25 30
Pro Gln ser Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln 35 40 45
Gly Gly Ser Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Gln 50 55 60
ser Asn Leu Asn Gly Gly Ser Ala Ile vai Leu Pro Phe Gln Phe Glu 65 70 75 . 80
Ala Thr Thr Phe Gly Thr Ala Glu Thr Ala Ala Gln Val ser Leu Gln
85 90 95
Thr Ala Asp Pro Ile Thr Lys Leu Thr Ala Pro Tyr Arg His Ala Gln 100 105 110
lie vai Glu Cys Lys Ala Ile Leu Thr Pro Thr Asp Leu Ala vai ser 115 120 125
Asn Pro Leu Thr Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala Asn Ser Pro Ala 130 135 140
Thr Pro Thr Gln Ile Leu Arg Val Tyr Gly Gly Gln ser Phe Val Leu 145 150 155 160
Gly Gly Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Ile Glu Val Pro Leu Asn Leu 165 170 175
Asp Ser Val Asn Arg Met Leu Lys Asp Ser Val Thr Tyr Thr Asp Thr 180 185 190
Pro Lys Leu Leu Ala Tyr Ser Arg Ala Pro Thr Asn Pro Ser Lys Ile 195 200 205 Pro Thr Ala Ser Ile Gln Ile Ser Gly Arg Ile Arg Leu Ser Lys Pro 210 215 220
Met Leu Ile Ala Asn 225
<210> 34
<211> 690
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 34
atgaaaaccg cggtgaacgg caacatggcg ctggatgata cccatgcgca gggcggtagc 60
cgtgcgctgg gtctgccgcc gtttctgaac agcctgccgc agagcgaagg cggcaccaac
tttggctata ttggcgtgca gcagggtggt agcaccgcgg cgcagattac cgcgggcatt 180
gcgctgcatc agagcaacct gaacggcggc agcgcgattg tgctgccgtt tcagtttgaa 240
gcgaccacct ttggtaccgc tgaaaccgca gcccaagtct ctctccagac tgccgacccc 300
attaccaaac tgaccgcccc ctaccgacat gctcagatcg tcgagtgcaa agctatcctc 360
actccaactg atcttgctgt ctccaatccc ctcacagtct acctagcatg ggtccccgcc 420
aactcccctg ccactccgac tcaaatactg cgagtctacg gcggtcagtc ttttgttctt 480
ggcggcgcca tctcagccgc caaaaccatt gaggtccccc tcaatcttga ctctgtcaac 540
cgcatgttga aagacagcgt gacctacact gacaccccca agctccttgc ctactcaaga 600
gcccccacca acccctcgaa aatcccaacc gctagtattc agatcagcgg tcgcattcgg 660
ctctccaagc caatgctgat agccaactaa 690
Claims (24)
1. Partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo uma proteína de fusão, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de timovírus e uma segunda proteína, onde a segunda proteína é selecionada a partir de um grupo que compreende proteína do vírus da doença do pé e da boca (FMDV), proteína de revestimento parvoviral canino, polipeptídeo do vírus da raiva canina P35 (CDV P35), hormônio de liberação da gonadotropina (GnRH) e uma combinação desses mencionados.
2. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o timovírus é selecionado a partir de um grupo que compreende Physalis Mottle Virus (PhMV), Belladonna Mottle Virus, Turnip Yellow Mosaic Virus, Cacao Yellow Mosaic Virus, Clitoria Yellow Vein Virus, Desmodium Yellow Mottle Vi- rus, Egg Plant Mosaie Virus, Passion Fruit Yellow Mosaic Virus.
3. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína truncada de revestimento de timovírus é a proteína truncada de revestimento de Physalis Mottle Virus (PhMV).
4. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína truncada de revestimento de timovírus com- preende pelo menos 149 aminoácidos adjacentes da seqüência de aminoácidos como mos- trada na SEQ ID NO: 1.
5. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína truncada de revestimento de timovírus é co- dificada por uma seqüência de polinucleotídeos como mostrada na SEQ ID NO: 2, um frag- mento ou uma variante desses mencionados.
6. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos compreende pelo me- nos 447 nucleotídeos adjacentes.
7. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão é selecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: -11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: -33.
8. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão é selecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: -11 codificadas pelas seqüências de polinucleotídeos recombinantes como mostradas nas SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12.
9. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão é codificada por uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes.
10. Partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos recombinantes é sele- cionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34, um fragmento ou uma variante desses mencionados.
11. Partícula quimérica do tipo timovírus compreendendo uma proteína de fusão, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende uma primeira proteína que é uma proteína truncada de revestimento de Physalis Mottle Virus (PhMV) e uma se- gunda proteína, onde a segunda proteína é selecionada a partir de um grupo que compre- ende proteína do vírus da doença do pé e da boca (FMDV), proteína de revestimento parvo- viral canino (CPV)1 polipeptídeo do vírus da raiva canina P35 (CDV P35), hormônio de libe- ração da gonadotropina (GnRH) e uma combinação desses mencionados.
12. Seqüência de polinucleotídeos recombinantes que codifica a proteína de fusão, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos recombinantes é sele- cionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, um fragmento ou variante destes.
13. Vetor recombinante que compreende um cassete de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que o cassete de expressão compreende uma seqüência reguladora e uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes conforme definida na rei- vindicação 12.
14. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência reguladora é selecionada a partir de um grupo que compreende T7, SP6 e T3.
15. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor recombinante é selecionado a partir de um grupo que compreende pR- Ph-CP, pR-Ph-3B1, pR-Ph-3B2, pR-Ph-3AB, pR-Ph-3D, pR-Ph-3ABD, pR-Ph- VP1-C1, pR- Ph-VPI-C2, pR-Ph-VP1-C3, pR-Ph-IC-C1, pR-Ph- IC-C2, pR-Ph- IC-C3, pR-Ph-CPV1, pR- Ph-CPV2, pR-Ph-CPV3, pR-Ph-CPV4 e pR-Ph-CPV5.
16. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor re- combinante conforme definido na reivindicação 13.
17. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir de um grupo que compreende E.coli, levedura, baculovírus.
18. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a E.coli é selecionada a partir de um grupo que compreende JM101, ϋΗ5σ, BL21, HB101, BL21(DE3) pLys S, XL-I Blue e Rossetta.
19. Processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido processo compreende: a. produzir uma seqüência de polinucleotídeos recombinantes conforme definida na reivindicação 12; b. construir um vetor recombinante que compreende uma seqüência reguladora e a seqüência de polinucleotídeos recombinantes da etapa (a); c. transformar uma célula hospedeira com o vetor recombinante da etapa (b) para produzir uma célula hospedeira recombinante; d. desenvolver a célula hospedeira recombinante da etapa (c) para produzir partícu- las quiméricas do tipo timovírus; e e. purificar as partículas quiméricas do tipo timovírus da etapa (d).
20. Processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência reguladora é sele- cionada a partir de um grupo que compreende T7, SP6 e T3.
21. Processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de polinucleotí- deos recombinantes é selecionada a partir de um grupo que compreende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34.
22. Processo para a produção de partícula quimérica do tipo timovírus, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor recombinante é sele- cionado a partir de um grupo que compreende pR-Ph-CP, pR-Ph-3B, pR-Ph-3B2, pR-Ph- 3AB, pR-Ph-3D, pR-Ph-3ABD, pR-Ph-VP1-C1, pR-Ph-VP1-C2, pR-Ph-VP1-C3, pR-Ph- IC- C1, pR-Ph-IC-C2, pR- Ph- IC-C3, pR-Ph-CPV1, pR-Ph-CPV2, pR-Ph-CPV3, pR-Ph-CPV4 e pR-Ph- CPV5.
23. Kit de teste para a determinação de anticorpos específicos contra FMDV, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido kit compreende: a. partículas quiméricas do tipo timovírus, conforme definidas na reivindicação 8, e b. reagentes para a detecção de anticorpos.
24. Método para a detecção de anticorpos específicos contra FMDV em uma amos- tra, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método compreende contatar a amostra com partículas quiméricas do tipo timovírus, conforme definidas na reivindicação 8, e detec- tar a formação do complexo entre os referidos anticorpos e as referidas partículas.
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