ES2636965T3

ES2636965T3 - Partículas tipo virus de la glicoproteína de la rabia (VLPs)

Info

Publication number: ES2636965T3
Application number: ES11838942.8T
Authority: ES
Inventors: Gale Smith; Ye Liu
Original assignee: Novavax Inc
Current assignee: Novavax Inc
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2031-11-07
Also published as: CN103282023B; DK2635257T3; KR20130111581A; JP2014500013A; MX354750B; HRP20171213T1; BR112013011194B1; JP6158088B2; CY1119284T1; EP2635257A4; CN109157658A; MX2013005090A; RU2013125695A; US20190224307A1; SI2635257T1; WO2012061815A3; US10086065B2; JP2017035093A; RS56157B1; CA2817005C

Abstract

Un método para fabricar micelas que comprenden glicoproteínas (proteínas G) del virus de la rabia (RV), en el que las proteínas G forman un trímero que comprende: (a) transformar una célula huésped de insecto Sf9 con un vector de baculovirus que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína G del RV; (b) cultivar dicha célula huésped para expresar el ácido nucleico; y (c) purificar la proteína G del RV en forma de micelas.

Description

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Dado que la infección por el RV puede prevenirse proporcionando anticuerpos neutralizantes a un vertebrado, una vacuna que comprende una VLP del RV que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del RV puede inducir, cuando se administra a un vertebrado, anticuerpos neutralizantes in vivo. Las VLPs del RV que comprenden una o más glicoproteínas (proteínas G) del RV se usan favorablemente para la prevención y/o el tratamiento de la infección del RV. Por lo tanto, otro aspecto de esta descripción se refiere a un método para provocar una respuesta inmune contra el RV. El método implica la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición que contiene una VLP del RV que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del RV a un sujeto (tal como un sujeto humano o animal). La administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición provoca una respuesta inmune específica para los epítopos presentes en la proteína G del RV. Dicha respuesta inmune puede incluir respuestas de células B (por ejemplo, la producción de anticuerpos neutralizantes) y/o respuestas de células T (por ejemplo, la producción de citocinas). Preferiblemente, la respuesta inmune provocada por la proteína G del RV incluye elementos que son específicos para al menos un epítopo conformacional presente en la proteína G del RV. En una realización, la respuesta inmune es específica para un epítopo presente en una proteína G del RV encontrada en la conformación micelar. Las proteínas G y composiciones del RV pueden administrarse a un sujeto sin aumentar la enfermedad viral después del contacto con el RV. Preferiblemente, las proteínas G del RV descritas aquí y composiciones inmunogénicas formuladas adecuadamente provocan una respuesta inmune Th1 predispuesta que reduce o previene la infección con un RV y/o reduce o previene una respuesta patológica después de la infección con un RV.

Las proteínas G del RV producidas por la presente invención se encuentran en forma de micelas (por ejemplo rosetas). Ver ejemplo 2. Las micelas se purifican después de la expresión en una célula huésped. Cuando se administran a un sujeto, las micelas de la presente invención inducen preferiblemente anticuerpos neutralizantes. En algunas realizaciones, las micelas pueden administrarse con un adyuvante. En otras realizaciones, las micelas pueden administrarse sin un adyuvante.

La solicitud también describe partículas tipo virus (VLP) del RV que comprenden una proteína G del RV que puede formularse en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger vertebrados (por ejemplo humanos) contra la infección por el RV o por lo menos un síntoma de enfermedad de la misma. La presente solicitud también se refiere a VLPs del RV y vectores que comprenden genes de tipo salvaje y mutados del RV o una combinación de los mismos derivados de diferentes cepas del RV, que cuando se transfectan en células huésped, producirán partículas tipo virus (VLP) que comprenden proteínas del RV.

En algunas realizaciones, las partículas tipo virus del RV pueden comprender además al menos una proteína matriz viral (por ejemplo, una proteína M del RV). En una realización, la proteína M se deriva de una cepa humana del RV. En otra realización, la proteína M se deriva de una cepa alternativa del RV, tal como una cepa del RV canina, de murciélago, mapache o zorrillo. En otras realizaciones, la proteína matriz puede ser una proteína M1 de una cepa de virus de la gripe. En una realización, la cepa del virus de la gripe es una cepa de gripe aviar. En una realización ejemplar, la cepa de gripe aviar es la cepa H5N1 A/Indonesia/5/05. En otras realizaciones, la proteína matriz puede ser del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).

En realizaciones adicionales, las VLPs producidas por la invención pueden comprender uno o más inmunógenos heterólogos, tales como hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA) de la gripe.

En algunas realizaciones, la invención también se refiere a la producción de combinaciones de diferentes proteínas G, N, P, M y L del RV de las mismas y/o diferentes cepas en una o más VLPs. Además, las VLPs pueden incluir una

o más moléculas adicionales para la mejora de una respuesta inmune.

En otra realización, las VLPs del RV producidas por la invención pueden llevar agentes tales como ácidos nucleicos, ARNsi, ARNmicro, agentes quimioterapéuticos, agentes de formación de imágenes y/u otros agentes que necesitan ser dados a un paciente.

Las VLPs producidas por la invención son útiles para preparar vacunas y composiciones inmunogénicas. Una característica importante de las VLPs es la capacidad de expresar proteínas superficiales de interés de modo que el sistema inmune de un vertebrado induce una respuesta inmune contra la proteína de interés. Sin embargo, no todas las proteínas pueden expresarse en la superficie de las VLPs. Puede haber muchas razones por las cuales ciertas proteínas no se expresan, o se expresan pobremente, en la superficie de las VLPs. Una razón es que la proteína no está dirigida a la membrana de una célula huésped o que la proteína no tiene un dominio transmembrana. Como ejemplo, las secuencias próximas al extremo carboxilo de la hemaglutinina de la gripe pueden ser importantes para la incorporación de HA en la bicapa lipídica de las nucleocápsidas maduras envueltas de la gripe y para el montaje de la interacción del trímero HA con la proteína M1 matriz de la gripe (Ali et al., (2000) J. Virol. 74, 8709-19).

Por lo tanto, las VLPs pueden ser VLPs quiméricas que comprenden una proteína G del RV y al menos un inmunógeno que normalmente no se expresa eficientemente en la superficie celular o no es una proteína normal del RV. En una realización, la proteína G del RV puede estar fusionada con un inmunógeno de interés. En otra realización, la proteína G del RV se asocia con el inmunógeno a través del dominio transmembrana y la cola citoplasmática de una proteína heteróloga de membrana de superficie viral, por ejemplo, proteína envolvente MMTV.

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Entre las células huésped eucariotas se encuentran levaduras, insectos, aves, plantas, C. elegans (o nemátodos) y células huésped de mamífero. Ejemplos no limitativos de células de insecto son, células de Spodoptera frugiperda (Sf), por ejemplo, Sf9, Sf21, células de Trichoplusia ni, por ejemplo, células High Five y células de Drosophila S2. Ejemplos de células huésped de hongos (incluyendo levadura) son S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), especies de Candida incluyendo C. albicans y C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosacckaromyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris y Yarrowia lipolytica. Ejemplos de células de mamífero son células COS, células de riñón de hámster bebé, células L de ratón, células LNCaP, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK) y células de mono verde africano, células CV1, células HcLa, células MDCK, células Vero y Hcp-2. También se pueden utilizar ovocitos de Xenopus laevis u otras células de origen anfibio. Ejemplos de células huésped procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo E. coli, B. subtilis, Salmonella typhi y micobacterias.

Los vectores, por ejemplo, vectores que comprenden polinucleótidos de una proteína G del RV y al menos un inmunógeno incluyendo pero no limitado a N, L, P, del RV o porciones de los mismos, y/o cualquier molécula quimérica descrita anteriormente, pueden transfectarse en células huésped de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos en células eucariotas puede ser por co-precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. En los métodos de la presente invención, el vector es un baculovirus recombinante. El baculovirus recombinante se transfecta en una célula Sf9.

Esta aplicación también describe construcciones y métodos que aumentarán la eficiencia de la producción de VLP. Por ejemplo, la adición de secuencias líderes a la G, M, N, L, P, del RV o porciones de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente, puede mejorar la eficiencia de transporte de la proteína dentro de la célula. Por ejemplo, se puede fusionar una secuencia de señal heteróloga con la G, M, N, L, P, del RV o partes de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente. En una realización, la secuencia de señal se puede derivar del gen de una célula de insecto y fusionarse a la G, M, N, L, P, del RV o porciones de las mismas, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente. En otra realización, el péptido señal es la secuencia de señal de quitinasa, que funciona eficazmente en sistemas de expresión de baculovirus.

Otro método para aumentar la eficiencia de la producción de VLP es optimizar por codón los nucleótidos que codifican el RV incluyendo una proteína G del RV, M, N, L, P, o porciones de los mismos, y/o cualquier molécula quimérica o heteróloga descrita anteriormente para un tipo celular específico. En una realización de la presente invención, los ácidos nucleicos están optimizados por codón para la expresión en células de insecto Sf9.

La invención proporciona métodos para producir una VLP en forma de una micela, de acuerdo con las reivindicaciones, que comprende transfectar vectores que codifican por lo menos la proteína G del RV en una célula huésped Sf9 y expresar la proteína G del RV bajo condiciones que permiten la formación de VLP. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas está dentro de la habilidad de una persona con experiencia normal en la técnica.

Los métodos para cultivar células diseñadas para producir VLPs de la invención incluyen, pero no se limitan a, técnicas de cultivo de células por lote, de carga intermitente, continuas y de perfusión. Cultivo celular significa el crecimiento y propagación de células en un biorreactor (una cámara de fermentación) donde las células se propagan y expresan proteína (por ejemplo, proteínas recombinantes) para purificación y aislamiento. Típicamente, el cultivo celular se lleva a cabo en condiciones estériles, temperatura controlada y condiciones atmosféricas en un biorreactor. Un biorreactor es una cámara utilizada para cultivar células en las que pueden controlarse condiciones ambientales tales como temperatura, atmósfera, agitación y/o pH. En una realización, el biorreactor es una cámara de acero inoxidable. En otra realización, el biorreactor es una bolsa de plástico preesterilizada (por ejemplo Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, Nueva Jersey). En otra realización, las bolsas de plástico preesterilizadas son bolsas de aproximadamente 50 L a 1000 L.

Las VLP se aislan a continuación usando métodos que preservan la integridad de las mismas, tal como por centrifugación en gradiente, por ejemplo, cloruro de cesio, sacarosa e iodixanol, así como técnicas de purificación estándar incluyendo, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel.

El siguiente es un ejemplo de cómo las VLPs de la invención pueden prepararse, aislarse y purificarse. Una persona experimentada en la técnica comprenderá que existen métodos adicionales que pueden utilizarse para preparar y purificar VLPs de la invención, por lo que la invención no se limita al método descrito a continuación.

La producción de VLPs de la invención puede comenzar sembrando células Sf9 (no infectadas) en matraces agitadores, permitiendo que las células se expandan y aumenten a medida que las células crecen y se multiplican (por ejemplo de un matraz de 125 ml a una bolsa Wave de 50 L). El medio utilizado para el crecimiento de las células se formula para la línea celular apropiada (preferiblemente medio libre de suero, por ejemplo medio de insecto ExCell-420, JRH). A continuación, las células se infectan con baculovirus recombinante a la multiplicidad más eficaz de infección (por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades formadoras de placa por célula). Una vez que ha ocurrido la infección, la proteína G del RV, y/o cualquier molécula quimérica o

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En otra realización, la solicitud describe un método para inducir una respuesta de anticuerpo protector a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis eficaz de una VLP del RV que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del RV .

Como se usa aquí, un "anticuerpo" es una proteína que comprende uno o más polipéptidos codificados, sustancial o parcialmente, por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como una miríada de genes de inmunoglobulina de región variable. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural típica de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que son los principales responsables del reconocimiento del antígeno. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas.

En una realización, la solicitud describe un método para inducir una respuesta celular protectora a la infección por el RV o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis eficaz de VLP del RV que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del RV.

Como se mencionó anteriormente, las composiciones inmunogénicas producidas por la invención previenen o reducen al menos un síntoma de infección por el RV en un sujeto. Los síntomas del RV son bien conocidos en la técnica. Incluyen fiebre, dolor de cabeza y debilidad o molestia general. A medida que avanza la enfermedad, aparecen síntomas más específicos que pueden incluir insomnio, ansiedad, confusión, parálisis leve o parcial, excitación, alucinaciones, agitación, hipersalivación (aumento de la saliva), dificultad para tragar e hidrofobia (miedo al agua). Por lo tanto, el método descrito aquí comprende la prevención o reducción de al menos un síntoma asociado con infección por el RV. Por ejemplo, la reducción en un síntoma puede ser determinada subjetiva u objetivamente, por ejemplo, la autoevaluación por un sujeto, la evaluación de un médico clínico o la realización de un ensayo o medida apropiados (por ejemplo, la temperatura del cuerpo), incluyendo, por ejemplo, una evaluación de la calidad de vida, la progresión retrasada de una infección por el RV o síntomas adicionales, una severidad reducida de los síntomas del RV o ensayos adecuados (por ejemplo, titulación de anticuerpos y/o ensayo de activación de células T). La evaluación objetiva comprende evaluaciones tanto animales como humanas.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben ser interpretados como limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Purificación de las partículas G de la rabia para el estudio animal

El propósito de este ejemplo es demostrar cómo se purificaron partículas G tipo virus del RV después de la expresión a partir de vectores de baculovirus en células de insecto Sf9.

Para estructurar las VLPs del RV, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína G del RV (SEQ ID NO: 2) se expresó a partir del vector baculovirus (pFastBac1 Rabia G) mostrado en la Figura 1.

Las células de insecto Sf9 se infectaron a 2,5 x 106 células/ml con una MOI de 0,2. Las células se cosecharon a las 69 horas post infección por centrifugación a 4000 g durante 15 minutos. Las células se lavaron con PBS 1X, se centrifugaron de nuevo y se congelaron a -70 ºC.

Se usó una pella cellular de 23 gramos obtenida de un cultivo de células de aproximadamente 2L. La pella celular se resuspendió con 200 ml de 2,5 mM de TrisCL pH 8,0, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,5%, 4 μg/mL de leupeptina. Se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se centrifugó a 7000 g durante 60 minutos a 4 ºC y se reservó 200 ml de sobrenadante para cromatografía.

Una vez completada la extracción de G839 de la Rabia a partir de la pella celular, las proteínas solubles se cargaron en una columna de cromatografía Fractogel EMD TMAE Hicap (M). Las especificaciones de la columna fueron las siguientes: Fabricante de la columna: GE Healthcare; Tipo de columna: XK50f20; Fabricante de la resina: EMD Chemicals; Tipo de resina: Fractogel EMD TMAE Hicap (M); Dimensiones de la columna empacada: aproximadamente 10 cm de altura x 5,0 cm de diámetro; volumen de la columna empacada: 200 ml; magnitud de flujo de empacado: 30 ml/min; regulador de empacado: 25 mM de Tris pH 8,0/ 300 mM de NaCl.

Las especificaciones del proceso de intercambio aniónico fueron las siguientes: rata de flujo en funcionamiento: 20 ml/min; regulador equilibrador de la columna: 25 mM de Tris pH 8,0, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Eluyente A: 25 mM de Tris pH 8.0, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Eluyente B1: 25 mM de Tris pH 8.0, 180 mM de NaCl, NP9 al

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0,02%; Eluyente B2: 25 mM de Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Eluyente B3: 25 mM de Tris pH 8.0, 1500 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Carga en columna: 200 ml de sobrenadante de extracción de G VLP de la rabia; Lavado en columna después de carga: 2 CV de eluyente A; Elución en columna: 2 CV de eluyente BI, 2 CV de eluyente B2, 2 CV de eluyente B3.

La recolección de las principales fracciones y los volúmenes fueron los siguientes: Fracción de flujo pasante: 250 mL; elución B1 de 180 mM de NaCl: 175 ml (producto); elución B2 de 500 mM de NaCl: 100 ml; elución B3 de 1500 mM de NaCl: 100 ml.

La fracción de elución de 180 mM de NaCl de la columna TMAE se cargó sobre una columna de lectina de lenteja. Las especificaciones de la columna fueron las siguientes: Fabricante de la columna: GE Healthcare; Tipo de columna: XKI6/20; Fabricante de la resina: GE Healthcare; Tipo de resina: Sefarosa de lectina de lenteja 4B; Número de catálogo de la resina: 17-0444-01; Dimensiones de la columna empacada: 2,5 cm de altura x 1,6 cm de diámetro; Volumen de la columna empacada: aproximadamente 5 ml; rata de flujo de empaque: 2,5 ml/min; regulador de empacado: 25 mM de NaHPO4 pH 6,8, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; rata de flujo en funcionamiento: 2 ml/min; regulador equilibrador de la columna: 25 mM de NaHPO4 pH 6,8, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Eluyente A: 25 mM de NaHPO4 pH 6.8, 50 mM de NaCl, NP9 0,02%, Eluyente B: 25 mM de NaHPO4 pH 6.8, 50 mM de NaCl NP9 al 0,02%, 500 mM de metil-alfa-dmannopironosidos (Fisher Scientific); Carga en columna: 175 ml de G839 TMAE de la Rabia Elución de 180 mM de NaCl; Lavado en columna después de carga: 5 CV con el eluyente A; Elución en columna: 10 CV con el eluyente B;

La recolección de las principales fracciones y los volúmenes fueron los siguientes: Fracción de flujo pasante: 180 ml; Fracción de elución: 30 ml (producto).

La elución de lectina de lenteja se cargó en una columna de cromatografía Fractogel EMD SO3-Hicap (M). Las especificaciones de la columna fueron las siguientes: Fabricante de la columna: GE Healthcare; Tipo de columna: XK16/20; Fabricante de la resina: EMD Chemicals; Tipo de resina: Fractogel EMD SO3-Hicap (M); Dimensiones de la columna empacada: 5 cm de altura x 1,6 cm de diámetro; Volumen de la columna empacada: 10 ml; rata de flujo de empaque: 7,5 ml/min; regulador de empaque: 25 mM de NaHPO4 pH 6.8, 50 mM de NaCl, NP9 al 0.02%.

Las especificaciones del proceso de intercambio catiónico fueron las siguientes: rata de flujo en funcionamiento: 5 ml/min; regulador equilibrador de la columna: 25 mM de NaHPO4 pH 6.8, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Eluyente A: 25 mM de NaHPO4 pH 6.8, 50 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Eluyente B: 25 mM de NaHPO4 pH 6.8, 300 mM de NaCl, NP9 al 0,02%; Carga en columna: 30 ml de elución de lectina de lenteja G839 de la rabia; Lavado en columna después de carga: 3 CV con el eluyente A; Elución en columna: eluyente 4 CV de etapa de elución B; recolección de las principales fracciones y los volúmenes: Fracción de elución: 9 ml (producto final); Filtro 9 ml de columna de SO3 producto de elución de 300 mM de NaCl con filtro de 0,2 m: Fabricación del filtro (0,2 m): Corning; Tipo de filtro: filtro de jeringa de 28 mm con una membrana SFCA de 0,2 micras.

Se realizó el método de Western blot usando sueros de conejo G anti RV (Figura 2). La pureza de partículas G del RV usando las condiciones anteriores fue del 86%. La cantidad de proteína total fue de 0,39 mg/ml, y la concentración de partículas G del RV fue de 0,33 mg/ml, con un total de 2,97 mg de partículas G del RV de un cultivo de células de 2 L, con un rendimiento de aproximadamente 1,5 mg/L de cultivo celular. De manera importante, las partículas G del RV eran estables a 4 ºC durante al menos un mes (datos no mostrados).

Ejemplo 2

Microscopía electrónica para el análisis de la conformación de la proteína G del RV

La proteína purificada G del RV se analizó mediante microscopía electrónica de tinción negativa (véase la figura 3). El peso molecular medio de las partículas G del RV con NP9 al 0,02% fue 1,04 x 10-6. Los trímeros de proteínas presentaban un peso molecular de 175,5 kDa y el número medio de trímeros en una partícula era 5,9. Las proteínas G del RV se agregaron en forma de micelas (rosetas). El hecho de que los picos G exhiben la morfología de las micelas bajo microscopía electrónica sugiere que las partículas de la proteína G tienen la estructura tridimensional correcta de una proteína nativa.

Ejemplo 3

Las partículas G del RV inducen altos niveles de anticuerpos en conejos

Para probar la capacidad de las partículas G del RV para inducir una respuesta inmune, se le administró a conejos partículas G del RV a concentraciones variables. Los resultados de estos experimentos se ilustran en la Figura 4. Las partículas G del RV fueron capaces de inducir altos niveles de anticuerpos en conejos.

Ejemplo 4

Ensayo de neutralización del RV y estudios de exposición de RV en ratones

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Para probar la eficacia de una vacuna que comprende VLPs del RV que comprenden una o más proteínas G en la protección contra la infección por el RV, se realizan ensayos de neutralización en ratones. Brevemente, se inyectan grupos de ratones por vía intramuscular con VLPs del RV o VLPs del RV + un adyuvante, tal como aluminio. Además, se inyecta a los ratones Rabipur®, una vacuna del virus de la rabia inactivada disponible comercialmente, que se utiliza como un agente de vacuna comparativo. Se espera generalmente que las VLPs del RV que comprenden una o más proteínas G (es decir, micelas G del RV) induzcan títulos más altos de anticuerpos neutralizantes en comparación con Rabipur®.

Ejemplo 5

Comparación del título de antirrábicos en ratones Balb/c inyectados con partículas G del RV o Rabipur®, la vacuna comercial contra la rabia

La inmunogenicidad de las VLPs de la presente invención se comparó con la vacuna comercial contra la rabia Rabipur® en un modelo de ratón Balb/c. Las partículas G VLP del RV se prepararon y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Las VLPs se agregaron en forma de micelas (Figura 3).

El estudio incluyó cuatro grupos (n=5 para cada grupo):

Grupo I: control positivo (vacuna comercial contra la rabia Rabipur®)

Grupo II: G VLP del RV (5 g)

Grupo III: G VLP del RV (2 g)

Grupo IV: G VLP del RV (1 g)

A los ratones se les administró el inmunógeno respectivo de 0,1 mL en los días 0, 3 y 7. Se tomaron muestras de suero de los ratones en los días 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35. Se analizó por ELISA el suero para detectar anticuerpos antirrábicos neutralizantes.

En la tabla 1 a continuación se presenta un resumen del diseño del estudio.

Tabla 1. diseño del estudio

Parámetro: Título de antirrábicos en suero por ELISA (neutralizante)

Analitos: Suero

Identificación: Grupo I Grupo II Grupo III Grupo IV

control positivo: Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3

Número de ratones: 5 5 5 5

Inmunógeno: Vacuna comercial de la rabia Rabipur® G VLP del RV (5 g) G VLP del RV (2 g) G VLP del RV (1 g)

Calendario de inmunización: 0.1 mL, I/D, Día 0, 3, 7

sangrados (días): 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35

Analito: suero para título neutralizante de antirrábicos

Como se discutió anteriormente, los anticuerpos neutralizantes antirrábicos se midieron en sueros de ratón en los puntos de tiempo proporcionados anteriormente. Los títulos se representaron como la media geométrica para cada medición (Figura 6). Como muestra la Figura 6, las micelas de VLP de la presente invención, a cada dosificación, proporcionan títulos de anticuerpos más rápidos y más altos que la vacuna Rabipur® comercialmente disponible. Específicamente, la G VLP del RV proporcionó un título de seroprotección (0,5 EU/mL) días antes que la vacuna Rabipur® (Figura 6, Tabla 2).

La Tabla 2 también muestra el porcentaje de seroprotección (es decir, un título de anticuerpo neutralizante de 0,5 EU/mL) para cada grupo de inmunización. La tabla indica que la seroprotección ocurre más rápidamente en animales tratados con la G VLP del RV de la presente invención (en todas las tres dosis), en comparación con los animales a los que se administró la vacuna Rabipur®.

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Claims

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