MX2013005090A

MX2013005090A - Particulas pseudo-virales (ppvs) que comprenden glicoproteinas del virus de la rabia.

Info

Publication number: MX2013005090A
Application number: MX2013005090A
Authority: MX
Inventors: Gale Smith; Ye Liu
Original assignee: Novavax Inc
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2013-10-25
Also published as: LT2635257T; JP6158088B2; HRP20171213T1; EP3246019B1; CA2817005A1; RS56157B1; HUE034247T2; BR112013011194B1; RU2013125695A; WO2012061815A2; SI2635257T1; EP2635257B1; KR20130111581A; PL2635257T3; DK2635257T3; EP3246019A1; CN109157658A; US20190224307A1; JP2014500013A; CN103282023B

Abstract

La presente invención se refiere, en líneas generales, a partículas pseudo-virales (PPVs) que comprenden glicoproteínas (proteínas G) del virus de la rabia (VR) y a métodos para formarlas y usarlas, con inclusión de composiciones inmunogénicas tales como vacunas para el tratamiento y/o la prevención de infección por virus de la rabia.

Description

PARTÍCULAS PSEUDO-VIRALES (PPVs) QUE COMPRENDEN GLICOPROTEÍNAS DEL VIRUS DE LA RABIA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional U.S. No. 61/410.767, presentada el 5 de noviembre de 2011, cuya divulgación se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO EN FORMATO ELECTRÓNICO Los contenidos del archivo de texto presentado en formato electrónico con la presente se incorporan en la presente por referencia en su totalidad: Una copia en formato legible por computadora del listado de secuencias (nombre del archivo: NOVV_047_01WO_SeqList_ST25.txt; archivo guardado en fecha: 7 de noviembre de 2011; tamaño de archivo: 7 kilobytes) .

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en lineas generales, a partículas pseudo-virales o partículas parecidas a virus (PPVs) que comprenden glicoproteínas (proteínas G) del virus de la rabia (VR) y a métodos para formarlas y usarlas, con inclusión de composiciones inmunogénicas tales como vacunas para el tratamiento y/o la prevención de infección por virus de la rabia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la rabia (VR) es un virus de ARN de hebra negativa no segmentada de la familia Rhabdoviridae e induce una enfermedad neurológica fatal en humanos y animales. Se informan más de 70.000 casos fatales en humanos por año, y millones de otros casos requieren tratamiento postexposición. Si bien se han logrado avances significativos en la prevención y el control de la rabia, la enfermedad sigue siendo una amenaza primordial para la salud pública y continúa provocando numerosas muertes en humanos en todo el mundo. Los caninos siguen siendo el reservorio más importante en Asia, África y Latinoamérica, donde ocurren la mayoría de los casos de rabia. En los países desarrollados, la rabia en humanos se ha reducido de manera significativa durante los últimos 50 años, principalmente como resultado de la vacunación de rutina de las mascotas. No obstante, la transmisión de la rabia a través de la exposición a la fauna silvestre ha resurgido como una importante causa de muerte. En los Estados Unidos, más del 90% de los casos de rabia en animales ha sido informado en la fauna silvestre, lo que representa una continua amenaza a la salud pública. La mayoría de los casos en humanos en la última década han sido asociados con el VR encontrado en murciélagos; en particular, en el murciélago pelo plateado.

Los rhabdovirus tienen dos componentes estructurales principales: un núcleo de ribonucleoproteina helicoidal (RNP, por sus siglas en inglés Helical Ribonucleoprotein Core) y una envoltura circundante. El genoma de la rabia codifica cinco proteínas: nucleoproteína (N) , fosfoproteína (P, del inglés Phosphoprotein) , proteína de la matriz (M) , glicoproteína (G) y polimerasa (proteína grande) (L) . El orden de los genes en el genoma de la rabia del tipo silvestre es 3 ' -N-P-M-G-L-5 ' . Las proteínas N, L y P están asociadas con el complejo RNP central. El complejo RNP consiste en el genoma de ARN encapsidado por la N en combinación con la polimerasa L y la proteína P. Este complejo sirve como molde para la transcripción y la replicación del virus. El componente de envoltura viral del VR está compuesto por una glicoproteína (G) transmembrana y una proteína de la matriz (M) . La glicoproteína forma aproximadamente 400 espículas triméricas que están dispuestas en forma estrecha sobre la superficie del virus. La proteína M está asociada tanto con la envoltura como con el RNP, y puede ser la proteína central del conjunto de rhabdovirus.

Tal como se estableció con anterioridad, la rabia sigue siendo una importante amenaza a la salud pública en todo el mundo. Controlar la rabia y proteger a los humanos de la rabia requiere varias estrategias de control, tal como inmunización de rutina de las mascotas y animales silvestres portadores de virus, inmunización pre-exposición de las personas en riesgo, y tratamiento post-exposición de las personas mordidas por animales rabiosos. Si bien las vacunas de virus de la rabia (VR) inactivados preparadas a partir de cultivos celulares son seguras y bien toleradas, tienen múltiples desventajas. Son difíciles de elaborar, difíciles de almacenar, tienen baja inmunogenicidad, y requieren múltiples inyecciones. Además, son costosas y, por ende, están muy por fuera del alcance de la mayoría de las personas que necesitan de las vacunas en los países en vías de desarrollo. Asimismo, estas vacunas inactivadas típicamente incluyen coadyuvantes que pueden causar efectos colaterales indeseados . Por lo tanto, se necesitan vacunas contra el VR más seguras, más económicas y más eficaces.

La presente solicitud satisface esta necesidad a través del desarrollo de un método novedoso para la producción de partículas pseudo-virales (PPVs) que comprenden la glicoproteína del virus de la rabia (G) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las partículas pseudo-virales (PPVs) del virus de la rabia (VR) para uso en vacunas para el tratamiento y la prevención de infección por virus de la rabia. Las PPVs del VR de la invención tienen el potencial de inducir potentes respuestas inmunitarias en mamíferos contra el virus de la rabia.

En un primer aspecto, la presente invención provee PPVs del VR que comprenden una o más glicoproteínas del VR (proteínas G) . Las proteínas G del VR pueden derivar de cualquier cepa de VR adecuada, que incluye, más no se limita a cepas de VR de humano, canino, murciélago, mapache, zorrillo y zorro. En una forma de realización, las PPVs del VR que comprenden una o más proteínas G del VR pueden estar en forma de micelas. En algunas formas de realización, las PPVs del VR pueden comprender una o más proteínas adicionales del VR, seleccionadas entre nucleoproteína (N) , fosfoproteína (P), proteína de la matriz ( ) y polimerasa (proteína grande) (L) . En una forma de realización específica, las PPVs del VR de la presente invención pueden comprender la proteína de la matriz (M) del VR. En una forma de realización, la proteína deriva de una cepa humana de VR. En otra forma de realización, la proteína M deriva de una cepa canina de VR. En otra forma de realización más, la proteína M deriva de una cepa de murciélago de VR. En otras formas de realización, la proteína de la matriz puede ser una proteína MI de una cepa del virus de la gripe. En una forma de realización, la cepa del virus de la gripe es una cepa del virus de la gripe aviar. En otras formas de realización, la proteina M puede derivar de una cepa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés Newcastle Enfermedad Virus) .

En una forma de realización, la secuencia codificadora de la proteina G del VR se optimiza adicionalmente para potenciar su expresión en una célula huésped adecuada. En una forma de realización, la célula huésped es una célula de insecto. En una forma de realización de ejemplo, la célula de insecto es una célula Sf9.

Las PPVs del VR de la presente invención se pueden usar para la prevención y/o el tratamiento de infección por VR. Por ende, en otro aspecto, la invención provee un método para generar una respuesta inmunitaria contra el VR. El método implica administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene una PPV del VR a un sujeto, tal como un humano o un animal.

En otro aspecto, la presente invención provee composiciones de vacunas farmacéuticamente aceptables que comprenden una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR.

En una forma de realización, la invención comprende una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR. En otra forma de realización, la invención provee un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención.

En otra forma de realización, la invención provee un método para formular una composición antigénica o vacuna que induce inmunidad a una infección o al menos un síntoma de enfermedad de la misma a un mamífero, que comprende aqregar a la formulación una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR. En una forma de realización preferente, la infección es una infección por VR.

Las PPVs del VR de la invención son útiles para preparar composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria que confiere inmunidad o inmunidad sustancial a agentes infecciosos. Por ende, en una forma de realización, la invención provee un método para inducir inmunidad a infecciones o al menos un síntoma de enfermedad de las mismas en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR.

En otro aspecto más, la invención provee un método para inducir inmunidad sustancial a infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR.

Las composiciones de la invención pueden inducir inmunidad sustancial en un vertebrado (por ej . un humano o un canino) cuando se administra al vertebrado. Por ende, en una forma de realización, la invención provee un método para inducir inmunidad sustancial a infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR. En otra forma de realización, la invención provee un método para vacunar un mamífero contra el VR que comprende administrar al mamífero una cantidad que induce protección de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR. La formulación de vacuna profiláctica se administra sistémicamente, por e . , por inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y una jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. En una forma de realización de ejemplo, la formulación de vacuna se administra por vía intramuscular.

En otra forma de realización, la invención comprende un método para .inducir una respuesta de anticuerpos protectora contra una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR.

En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular protectora a infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR.

En otro aspecto más, la invención provee un ácido nucleico aislado que codifica una glicoproteína (proteína G) del virus de la rabia. En una forma de realización de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una glicoproteína (proteína G) del virus de la rabia es SEC ID NO: 1.

En otro aspecto más, la invención provee una célula aislada que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína (proteína G) del virus de la rabia. En una forma de realización de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una glicoproteína (proteína G) del virus de la rabia es SEC ID NO: 1.

En otro aspecto más, la invención provee un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una glicoproteína (proteína G) del virus de la rabia. En una forma de realización de ejemplo, el ácido nucleico aislado que codifica una glicoproteina (proteina G) del virus de la rabia es SEC ID NO: 1. En una forma de realización, el vector es un vector baculovirus.

En otro aspecto más, la invención provee un método para formar una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del virus de la rabia, que comprende (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico que codifica una glicoproteina (proteína G) del virus de la rabia; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conducen a la producción de dichas PPVs del VR. En una forma de realización, el ácido nucleico que codifica una glicoproteina (proteína G) del virus de la rabia es SEC ID NO: 1. En otra forma de realización, la célula huésped es una célula de insecto. En otra forma de realización, la célula huésped es una célula de insecto transfectada con un vector baculovirus que comprende una glicoproteina (proteína G) del virus de la rabia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra el mapa plasmídico para el vector pFastBacl que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas G del virus de la rabia (SEC ID NO: 1) · La Figura 2 ilustra los resultados del análisis Western blot para las proteínas G del VR usando sueros de conejo anti-VR bajo condiciones tanto reductoras (Figura 2A) como no reductoras (Figura 2B) .

La Figura 3 ilustra imágenes de partículas de proteínas G del VR recombinantes purificadas en forma de micelas, tomadas usando microscopía electrónica con tinción negativa a una magnificación de 150,000X.

La Figura 4 ilustra los resultados de los ensayos de inducción de anticuerpos en conejos con una administración de diluciones crecientes de partículas G del VR.

La Figura 5 muestra la secuencia proteica para el vector pFastBacl que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas G del virus de la rabia (SEC ID NO: 1) (arriba) y la secuencia de proteínas G del VR (SEC ID NO: 2) (abajo) .

La Figura 6 es un gráfico que ilustra los títulos de anticuerpos anti-virus de la rabia en diferentes días, trazados como la media geométrica para cada régimen de inmunización (n=5 para cada grupo de inmunización) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Tal como se usa en la presente, el término "coadyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se usa en combinación con un inmunogen específico (por ej . una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR) en una formulación, aumenta o de alguna otra manera altera o modifica la respuesta resultante. La modificación de la respuesta inmunitaria incluye la intensificación o la ampliación de la especificidad de la respuesta inmunitaria celular o de anticuerpo, o ambas. La modificación de la respuesta inmunitaria también puede implicar reducir o suprimir ciertas respuestas inmunitarias antigeno-especificas .

Tal como se emplea en la presente, el término "formulación antigénica" o "composición antigénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado, especialmente un ave o un mamífero, induce una respuesta inmunitaria.

Tal como se usa en la presente, el término "virus de la gripe aviar" se refiere al virus de la gripe encontrado principalmente en las aves pero que también puede infectar a humanos y otros animales. En algunos casos, el virus de la gripe aviar puede ser trasmitido o esparcido de un humano a otro. Un virus de la gripe aviar que infecta humanos tiene el potencial de causar una pandemia de gripe, es decir, morbidez y/o mortalidad en humanos. Una pandemia ocurre cuando emerge una nueva cepa del virus de la gripe (un virus para el cual los humanos no tienen inmunidad natural) , diseminándose más allá de los sitios individuales, posiblemente alrededor del mundo, e infectando un gran número de humanos al mismo tiempo .

Tal como se usa en la presente, una "dosis efectiva" generalmente se refiere a aquella cantidad de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR suficiente para inducir inmunidad, para prevenir y/o mejorar una infección, o para reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad, y/o para potenciar la eficacia de otra dosis de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR. Una dosis efectiva puede hacer referencia a la cantidad de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR suficiente para retardar o minimizar el inicio de una infección o enfermedad. Una dosis efectiva también puede hacer referencia a la cantidad de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR que brinda un beneficio terapéutico en el tratamiento o el manejo de una infección o enfermedad. Asimismo, una dosis efectiva es la cantidad respecto de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR en forma individual, o en combinación con otras terapias, que brinda un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de una infección o enfermedad. Una dosis efectiva también puede ser la cantidad suficiente para potenciar una respuesta inmunitaria del propio sujeto (por ej . , la de un humano) contra la posterior exposición a un agente infeccioso o enfermedad. Los niveles de inmunidad se pueden monitorizar, por ej . , al medir las cantidades de anticuerpos séricos y/o secretorios neutralizantes, por ej . , mediante ensayo de microneutralización, inmunoabsorbancia ligada a enzimas, fijación de complementos, neutralización plaquetaria, o al medir las respuestas celulares, tales como, mas sin limitarse a, células T ci'totóxicas, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células dendríticas y/u otras respuesta celulares. Las respuestas de las células T se pueden monitorizar, por ej . , al medir, por ejemplo, la cantidad de células CD4+ y CD8+ presentes usando marcadores específicos a través de citometría de flujo fluorescente o ensayos de células T, tales como, mas sin limitarse a, ensayo de proliferación de células T, ensayo de células T citotóxicas, ensayo de tetrámeros y/o ensayo de ELISPOT. En el caso de una vacuna, una "dosis efectiva" es aquella que previene la enfermedad y/o reduce la severidad de los síntomas..

Tal como se usa en la presente, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR necesaria o suficiente para obtener un efecto biológico deseado. Una cantidad efectiva de la composición sería la cantidad que alcanza un resultado seleccionado, y dicha cantidad podría ser determinada como parte de la experimentación de rutina por una persona versada en el arte. Por ejemplo, una cantidad efectiva para prevenir, tratar y/o mejorar una infección podría ser esa cantidad necesaria para causar activación del sistema inmunitario, generando el desarrollo de una respuesta inmunitaria antígeno-específica ante la exposición a una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas del VR (proteínas G) . El término también es sinónimo de "cantidad suficiente". En otra forma de realización, la cantidad efectiva es la cantidad en peso de una micela G del VR que induce seroprotección en un modelo animal relevante, paciente humano o animal en un número deseado de días; por ej . 7, 10, 14 o más días.

Tal como se usa en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual los ácidos polinucleicos son transcritos en ARNm y traducidos en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido polinucleico deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir -si se selecciona un organismo o célula huésped eucariótica apropiados- el empalme del ARNm. En el contexto de la presente invención, el término también engloba la obtención de ARNm génico G del VR y de las proteínas G del VR alcanzadas después de la expresión del mismo.

Tal como se usa en la presente, el término "proteína G" o "glicoproteína G" o "polipéptido de proteína G" se refiere a un polipéptido o una proteína que tiene una parte o la totalidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de proteína G del VR.

Tal como se usa en la presente, los términos "inmunogenes" o "antígenos" se refieren a sustancias tales como proteínas, péptidos, péptidos, ácidos nucleicos que son capaces de generar una respuesta inmunitaria. Ambos términos también engloban epítopos, y se usan en forma intercambiable.

Tal como se usa en la presente el término "inmunoestimulante" s.e refiere a un compuesto que potencia una respuesta inmunitaria a través de los mensajeros químicos del propio cuerpo (citoquinas ) . Estas moléculas comprenden varias citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades inmunoestimulantes, inmunopotenciadoras y pro-inflamatorias, tales como interferones (IFN-?) , interleuquinas (por ej . , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13) ; factores de crecimiento (por ej . , factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (del inglés Granulocyte-Macrophage (GM) -Colony Stimulating Factor (CSF) ) ; y otras moléculas inmunoestimulantes, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimulantes pueden ser administradas en la misma formulación que las PPVs de la invención, o pueden ser administradas por separado. La proteina, o un vector de expresión que codifica la proteina, pueden ser administrados para producir un efecto inmunoestimulante .

Tal como se utiliza en la presente, el término "formulación inmunogénica" se refiere a una preparación que, cuando se administra a un vertebrado, por ej . un mamífero, induce una respuesta inmunitaria.

Tal como se utiliza en la presente, el término "agente infeccioso" se refiere a microorganismos que causan una infección en un vertebrado. Usualmente, los organismos son virus, bacterias, parásitos, protozoos y/u hongos.

Tal como se usa en la presente, el término "multivalente" se refiere a composiciones que tienen una o más proteínas/péptidos antigénicos o inmunogenes contra múltiples tipos o cepas de agentes infecciosos o enfermedades, por ej . más de una cepa, secuencia, tipo de proteína G del VR, etc.

Tal como se usa en la presente, el término "vacuna farmacéuticamente aceptable" se refiere a una formulación que contiene una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR, que se encuentra bajo una forma que es capaz de ser administrada a un vertebrado y que induce una respuesta inmunitaria protectora suficiente para inducir inmunidad para prevenir y/o mejorar una infección o enfermedad, y/o para reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad, y/o para potenciar la eficacia de otra dosis de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR. Típicamente, la vacuna comprende un medio de solución acuosa tamponada o solución salina convencional en el cual la composición de la presente invención se suspende o disuelve. En esta forma, la composición de la presente invención se puede usar en forma conveniente para prevenir, mejorar o de alguna otra manera tratar una infección. Ante la introducción en un huésped, la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmunitaria que incluye, mas no se limita a, la producción de anticuerpos y/o citoquinas y/o la activación de células T citotóxicas, células presentadoras de antígenos, células T auxiliares, células dendriticas y/u otras respuestas celulares.

Tal como se usa en la presente, la frase "respuesta inmunitaria protectora" o "respuesta protectora" se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos contra un agente infeccioso o enfermedad, que es exhibida por un vertebrado (por ej . , un humano), que previene o mejora una infección o reduce al menos un síntoma de enfermedad de la misma. Una PPV del VR de la presente invención que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR puede estimular la producción de anticuerpos que, por ejemplo, neutralizan agentes infecciosos, bloquean el ingreso de los agentes infecciosos en la célula, bloquean la replicación de los agentes infecciosos y/o protegen las células huésped de la infección y destrucción. El término también puede hacer referencia a una respuesta inmunitaria que es mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos contra un agente infeccioso o enfermedad, exhibida por un vertebrado (por ej . , un humano) , que previene o mejora la infección o enfermedad, o reduce al menos un síntoma de la misma.

Tal como se utiliza en la presente, el término "vertebrado" o "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier miembro del subfilo de los cordados que incluye, sin limitación, humanos y otros primates, con inclusión de primates no humanos, tales como chimpancés y otras especies de simios y monos. Los animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; los mamíferos domésticos tales como perros y gatos; los animales de laboratorio que incluyen roedores tales como ratones, ratas (inclusive ratas del algodón) y cobayos; las aves, con inclusión de aves domésticas, silvestres y aves de juegos, tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares, también son ejemplos no limitativos. Los términos "mamíferos" y "animales" están incluidos en esta definición. Tanto los individuos adultos como los neonatos están destinados a ser incluidos. En particular, los humanos, mamíferos domésticos, y animales de granja, son receptores apropiados de una vacuna o agente terapéutico contra el VR.

Tal como se usa en la presente, el término "partícula pseudo-viral" o "partícula parecida al virus" (PPV) se refiere a una estructura que, en al menos un atributo, se asemeja a un virus pero que no ha demostrado ser infecciosa. Las partículas pseudo-virales de acuerdo con la invención no portan información genética que codifica las proteínas de las partículas pseudo-virales. En general, las partículas pseudo-virales carecen de un genoma viral y, por lo tanto, no son infecciosas. Asimismo, las partículas pseudo-virales con frecuencia pueden ser producidas en grandes cantidades mediante expresión heteróloga y pueden ser purificadas con facilidad.

Tal como se usa en la presente, el término "PPV quimérica" se refiere a las PPVs que contienen proteínas, o porciones de las mismas, de al menos dos agentes infecciosos diferentes (proteínas heterólogas) . Usualmente, una de las proteínas deriva de un virus que puede llevar a la formación de las PPVs de las células huésped. A efectos ilustrativos, los ejemplos son la proteína M de la gripe aviar y/o la proteína G del VR. Los términos "PPVs del VR" y "PPVs quiméricas" pueden ser usados en forma intercambiable cuando sea apropiado.

Tal como se usa en la presente, el término "vacuna" se refiere a una preparación de patógenos muertos o debilitados, o de determinantes antigénicos derivados, que se usa para inducir la formación de anticuerpos o inmunidad contra el patógeno. Una vacuna se administra para proveer inmunidad a la enfermedad -por ejemplo, gripe- que es causada por el virus de la gripe. Asimismo, el término "vacuna" también se refiere a una suspensión o solución de un inmunogen (por ej . una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR) que se administra a un vertebrado para producir inmunidad protectora, es decir, inmunidad que previene o reduce la severidad de la enfermedad asociada con la infección. La presente invención provee composiciones de vacuna que son inmunogénicas y pueden brindar protección contra una enfermedad asociada con la infección.

Partículas pseudo-virales (PPVs) del virus de la rabia (VR) En un aspecto, la invención se relaciona con partículas pseudo-virales (PPVs) del VR que comprenden una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR que pueden ser formuladas en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger a los vertebrados (por ej . humanos y animales domésticos) contra la infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad de la misma. En algunas formas de realización, la PPV que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR además comprende proteínas adicionales del VR, tales como N, P, M y L. En otras formas de realización, la PPV que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR además comprende proteínas de las cepas heterologas del virus, tales como las proteínas HA, NA y MI del virus de la gripe. En una forma de realización, la proteína MI del virus de la gripe deriva de una cepa del virus de la gripe aviar (véase la solicitud estadounidense 13/280.043, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad) .

Vacunas contra el VR Como la infección por VR puede ser prevenida al proveer anticuerpos neutralizantes a un vertebrado, una vacuna que comprende una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR puede inducir, cuando se administra a un vertebrado, anticuerpos neutralizantes in vivo. Las PPVs del VR que comprenden una o más glicoproteínas (proteínas G) del ' VR se usan favorablemente para la prevención y/o el tratamiento de infección por VR. Por ende, otro aspecto de esta divulgación se refiere a un método para generar una respuesta inmunitaria contra el VR. El método implica administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que contiene una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR a un sujeto (tal como un humano o animal) . La administración de una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición genera una respuesta inmunitaria específica para los epítopos presentes en la proteína G del VR. Dicha respuesta inmunitaria puede incluir respuestas de células B (por ej . , la producción de anticuerpos neutralizantes) y/o respuestas de células T (por ej . , la producción de citoquinas) . Preferentemente, la respuesta inmunitaria generada por la proteína G del VR incluye elementos que son específicos para al menos un epítopo de conformación presente en la proteína G del VR. En una forma de realización, la respuesta inmunitaria es específica para un epítopo presente en una proteína G del VR encontrada en la conformación de la micela. Las proteínas G del VR y las composiciones se pueden administrar a un sujeto sin potenciar la enfermedad viral después del contacto con el VR. Preferentemente, las proteínas G del VR reveladas en la presente y las composiciones inmunogénicas formuladas de manera adecuada generan una respuesta inmunitaria en un perfil predominante Thl que reduce o previene la infección con un VR y/o reduce o previene una respuesta patológica después de la infección con VR.

En una forma de realización, las proteínas G del VR de la presente invención se encuentran en forma de micelas (por ej . rosetas). Véase el ejemplo 2. En una forma de realización, las micelas son purificadas después de la expresión en una célula huésped. Cuando se administran a un sujeto, las micelas de la presente invención preferentemente inducen anticuerpos neutralizantes. En algunas formas de realización, las micelas se pueden administrar con un coadyuvante. En otras formas de realización, las micelas se pueden administrar sin un coadyuvante .

En otra forma de realización, la invención abarca partículas pseudo-virales (PPVs) del VR que comprenden una proteína G del VR que se puede formular en vacunas o formulaciones antigénicas para proteger a los vertebrados (por ej . humanos) contra la infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad de la misma. La presente invención también se relaciona con las PPVs del VR y los vectores que comprenden genes del VR mutados y silvestres, o una combinación de los mismos, derivados de diferentes cepas del virus VR que, cuando se transfectan en las células huésped, producen partículas pseudo-virales (PPVs) que comprenden las proteínas del VR.

En algunas formas de realización, las partículas pseudo-virales del VR también pueden comprender al menos una proteína de la matriz viral (por ej . una proteína. M del VR) .

En una forma de realización, la proteína M deriva de una cepa humana del VR. En otra forma de realización, la proteína M deriva de una cepa alternativa del VR, tal como una cepa del VR de canino, murciélago, mapache, o zorrillo. En otras formas de realización, la proteína de la matriz puede ser una proteína MI de una cepa del virus de la gripe. En una forma de realización, la cepa del virus de la gripe es una cepa del virus de la gripe aviar. En una forma de realización de ejemplo, la cepa de la gripe aviar es la cepa H5N1 A/Indonesia/5/05. En otras formas de realización, la proteína de la matriz puede ser del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) .

En otras formas de realización, las PPVs de la invención pueden comprender uno o más inmunogenes heterólogos, tales como hemaglutinina (HA) y/o neuraminidasa (NA) del virus de la gripe.

En algunas formas de realización, la invención también comprende combinaciones de diferentes proteínas G, N, P, M, y L del VR de cepas iguales y/o diferentes en una o más PPVs. Asimismo, las PPVs pueden incluir una o más moléculas adicionales para potenciar una respuesta inmunitaria.

En otra forma de realización de la invención, las PPVs del VR pueden portar agentes tales como ácidos nucleicos, siRNA (ARN de interferencia pequeño) , microARN, agentes quimioterapéuticos , agentes de diagnóstico por imágenes, y/u otros agentes que necesitan ser suministrados a un paciente.

Las PPVs de la invención son útiles para preparar vacunas y composiciones inmunogénicas . Un rasgo importante de las PPVs es la .habilidad para expresar proteínas de superficie de interés de tal manera que el sistema inmunitario de un vertebrado induzca una respuesta inmunitaria contra la proteína de interés. No obstante, no todas las proteínas pueden ser expresadas sobre la superficie de las PPVs. Pueden existir muchas razones de por qué ciertas proteínas no son expresadas, o son expresadas de manera deficiente, sobre la superficie de las PPVs. Una razón es que la proteína no está dirigida a la membrana de una célula huésped o que la proteína no tiene un dominio transmembrana. Como ejemplo, las secuencias cercanas al término carboxilo de la hemaglutinina del virus de la gripe pueden ser importantes para la incorporación de HA en la bicapa lipídica de las nucleocápsides con el virus de la gripe maduro envuelto y para el ensamblado de la interacción del trímero HA con la proteína de la matriz MI de la gripe (Ali, et al., (2000) J. Virol. 74, 8709-19) .

Por ende, una forma de realización de la invención comprende PPVs quiméricas que comprenden una proteína G del VR y al menos un inmunogen que normalmente no es expresado en forma eficiente sobre la superficie celular o que no es una proteina normal del VR. En una forma de realización, la proteina G del VR se puede fusionar con un inmunogen de interés. En otra forma de realización, la proteina G del VR se asocia con el inmunogen mediante el dominio transmembrana y la cola citoplasmática de una proteina de membrana de superficie viral heteróloga, por ej . , proteina de envoltura MMTV.

Otras PPVs quiméricas de la invención comprenden PPVs que comprenden una proteina G del VR y al menos una proteina de un agente infeccioso heterólogo. Los ejemplos de agentes heterólogos incluyen, mas no se limitan a, virus, bacterias, protozoos, hongos y/o parásitos. En una forma de realización, el inmunogen de otro agente infeccioso es una proteina viral heteróloga. En otra forma de realización, la proteina de un agente infeccioso heterólogo es una proteina asociada con la envoltura. En otra forma de realización, la proteina de otro agente infeccioso heterólogo se expresa sobre la superficie de las PPVs. En otra forma de realización, la proteina de un agente infeccioso comprende un epitopo que genera una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado. En una forma de realización, la proteina de otro agente infeccioso es co-expresada con una proteina G del VR. En otra forma de realización, la proteina de otro agente infeccioso se fusiona a una proteina G del VR. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteina de otro agente infeccioso se fusiona a una proteina G del VR. En otra forma de realización, solamente una porción de una proteina de otro agente infeccioso se fusiona a una porción de una proteina G del VR. En otra forma de realización, la porción de la proteina de otro agente infeccioso fusionada a una proteina G del VR se expresa sobre la superficie de las PPVs.

La invención también engloba variantes de las proteínas expresadas sobre o en las PPVs de la invención. Las variantes pueden contener alteraciones en las secuencias aminoacídicas de las proteínas constituyentes. El término "variante" con respecto a una proteína se refiere a una secuencia aminoacídica que es alterada por uno o más aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares; por ej . , reemplazo de leucina con isoleucina. En forma alternativa, una variante puede tener cambios "no conservativos", por ej . , reemplazo de una glicina con un triptófano. Otras variaciones menores análogas también pueden incluir la deleción o inserción de aminoácidos, o ambas. Los lineamientos para determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados o delecionados sin eliminar la actividad biológica o inmunológica se pueden encontrar usando programas de computación ampliamente conocidos en el arte; por ejemplo, el programa informático DNASTAR.

Las variantes naturales pueden aparecer debido a las mutaciones en las proteínas. Estas mutaciones pueden provocar variabilidad antigénica dentro de grupos individuales de agentes infecciosos, por ejemplo gripe. Por ende, una persona infectada con, por ejemplo, una cepa de la gripe, desarrolla anticuerpos contra ese virus; a medida que aparecen nuevas cepas del virus, los anticuerpos contra las cepas antiguas ya no reconocen los virus nuevos, y la re-infección puede tener lugar. La invención abarca toda variabilidad antigénica y genética de las proteínas de los agentes infecciosos para formar PPVs.

Los textos generales que describen técnicas biológicas moleculares, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y similares, incluyen los de Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed. ) , Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F. M.

Ausubel et al., eds . , Current Protocols, una obra conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). Estos textos describen la mutagenesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, por ej . , la clonación y la mutación de moléculas G del VR, etc. Por ende, la invención también engloba el uso de métodos conocidos de ingeniería de proteínas y tecnología de ADN recombinante para mejorar o alterar las características de las proteínas expresadas sobre o en las PPVs de la invención. Varios tipos de mutagenesis pueden ser usados para producir y/o aislar ácidos nucleicos variantes que codifican las moléculas proteicas y/o para adicionalmente modificar/mutar las proteínas en o sobre las PPVs de la invención. Ellos incluyen, mas no se limitan a, mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis puntual aleatoria, recombinación homologa (barajado de ADN), mutagenesis usando moldes que contienen uracilo, mutagenesis dirigida a oligonucleótidos, mutagenesis de ADN con modificación de fosforotioato, mutagenesis usando ADN dúplex incompleto, o similares. Los métodos adecuados adicionales incluyen reparación de discordancia puntual, mutagenesis usando cepas de huésped con deficiencia en el sistema de reparación, restricción-selección y restricción-purificación, mutagenesis por deleción, mutagenesis por síntesis total de genes, reparación de rotura bicatenaria, y similares. La mutagenesis -por ejemplo, la que implica construcciones quiméricas-también está incluida en la presente invención. En una forma de realización, la mutagenesis puede estar guiada por información conocida de la molécula de origen natural o la molécula de origen natural alterada o mutada, por ej . , secuencia, comparaciones de secuencias, propiedades físicas, estructura cristalina, o similares.

La invención además comprende variantes de proteínas que muestran actividad biológica sustancial, por ej . , capaces de generar una respuesta de anticuerpos efectiva cuando se expresan sobre o en las PPVs de la invención. Dichas variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas de acuerdo con reglas generales conocidas en el arte por tener poco efecto sobre la actividad.

Los métodos de clonación de proteínas son conocidos en el arte. Por ejemplo, el gen que codifica una proteína específica del VR puede ser aislado por RT-PCR a partir del ARNm poliadenilado extraído de células que han sido infectadas con el virus de la rabia. El gen del producto resultante se puede clonar como un inserto de ADN en un vector. El término "vector" se refiere al medio por el cual un ácido nucleico puede ser propagado y/o transferido entre organismos, células, o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, pro-virus, fagémidos, transposones, cromosomas artificiales, y similares, que se replican de manera autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula huésped. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto tanto por ADN como por ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN conjugado con poli-lisina, un ADN o ARN conjugado con péptido, un ADN conjugado con liposoma, o similares, que no se replican en forma autónoma. En muchas formas de realización., mas no todas, los vectores de la presente invención son plásmidos o bácmidos.

Por ende, la invención comprende nucleótidos que codifican proteínas -inclusive moléculas quiméricas- clonadas en un vector de expresión que puede expresarse en una célula que induce la formación de las PPVs de la invención. Un "vector de expresión" es un vector, tal como un plásmido que es capaz de promover la expresión, así como también la replicación de un ácido nucleico allí incorporado. Típicamente, el ácido nucleico a ser expresado está "ligado operativamente" a un promotor y/o potenciador, y se somete al control regulatorio de la transcripción por el promotor y/o potenciador. En una forma de realización, los nucleótidos codifican una proteina G del VR (como se analizó con anterioridad) . En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican la proteina M del VR. En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican las proteínas M y/o N del VR. En otra forma de realización, el vector además comprende nucleótidos que codifican las proteínas M, L y/o N del VR. En una forma de realización de ejemplo, el vector de expresión es un vector baculovirus.

En algunas formas de realización de la invención, las proteínas pueden comprender mutaciones que contienen alteraciones que producen sustituciones, adicionales o deleciones silenciosas, pero no alteran las propiedades o actividades de la proteína codificada o la forma en que las proteínas están hechas. Las variantes de nucleótidos pueden producirse por una variedad de razones; por ej . , para optimizar la expresión de codones para un huésped particular (cambiar codones en el ARNm humano por aquellos preferidos por las células de insecto tales como células Sf9) . Véase la publicación de patente U.S. 2005/0118191, incorporada en presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Asimismo, los nucleótidos pueden secuenciarse para asegurar que se clonen las regiones codificadoras correctas y no contengan ninguna mutación indeseada. Los nucleótidos pueden ¦ subclonarse en un vector de expresión (por ej . baculovirus) para la expresión en cualquier célula. Lo anterior es solamente un ejemplo de cómo clonar las proteínas virales del VR. Una persona medianamente versada en el arte entiende que existen otros métodos posibles y disponibles.

La invención también provee construcciones y/o vectores que comprenden nucleótidos del VR que codifican genes estructurales del VR, con inclusión de G, M, N, L, P, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad. El vector puede ser, por ejemplo, un vector fágico, plasmídico, viral o retroviral. Las construcciones y/o vectores que comprenden genes estructurales del VR, con inclusión de G, M, N, L, P, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad, deberían estar ligados operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor de polihedrina AcMNPV (u otro baculovirus), promotor PL lambda fágico, los promotores lac, phoA y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos SV40, y los promotores de LTRs retrovirales, como ejemplos no limitativos. Otros promotores adecuados serán conocidos para la persona versada en el arte según la célula huésped y/o la velocidad de expresión deseada. Las construcciones de expresión también contienen sitios para el inicio y la finalización de transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificadora de los transcriptos expresados por las construcciones preferentemente incluye un codón de inicio de traducción al comienzo y un codón de finalización apropiadamente ubicado al final del polipéptido a ser traducido.

Los vectores de expresión preferentemente incluyen al menos un marcador seleccionable . Dichos marcadores incluyen gen de resistencia de dihidrofolato reductasa, G418 o neomicina para cultivo de células eucarióticas y genes de resistencia de tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias. Entre los vectores preferidos se encuentran los vectores virales, tales como baculovirus, virus de la viruela o poxvirus (por ej . , virus vaccinia, virus de la viruela en aves, canarios, aves de corral, mapaches, cerdos, etc.), adenovirus (por ej . , adenovirus en caninos), herpesvirus y retrovirus. Otros vectores que se pueden usar con la invención comprenden vectores para uso en bacterias, que comprenden pQE70, pQE60 y pQE-9, vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre los vectores eucarióticos preferidos se encuentran pFastBacl pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG, pSVK3, pBPV, p SG y pSVL. Otros vectores adecuados serán fácilmente advertidos por la persona versada en el arte. En una forma de realización, el vector que comprende nucleótidos que codifican genes del VR -con inclusión de genes G del VR, asi como también genes para , N, L, P, o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad- es el pFastBac.

Las construcciones recombinantes mencionadas con anterioridad se podrían usar para transfectar, infectar o transformar, y pueden expresar proteínas del VR, con inclusión de una proteína G del VR y al menos un inmunogen. En una forma de realización, la construcción recombinante comprende un gen G, M, N, L, P del VR, o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad, en células eucarióticas y/o células procarióticas . Por ende, la invención provee células huésped que comprenden un vector (o vectores) que contienen ácidos nucleicos que codifican genes estructurales del VR, inclusive un gen G del VR; y al menos un inmunogen tal como, mas sin limitarse a gen N, L y P del VR, o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad, y permiten la expresión de genes, con inclusión de genes G, N, L y P del VR, o sus porciones, y/o cualquier molécula descrita con anterioridad en la célula huésped bajo condiciones que permiten la formación de las PPVs.

Entre las células huésped eucarióticas están las células huésped de mamíferos, levaduras, insectos, aves, plantas y C. elegans (o nematodo) . Los ejemplos no limitativos de células de insecto son las células de Spodoptera frugiperda (Sf), por ej . Sf9, Sf21, células Trichoplusia ni, por ej . células High Five y células Drosophila S2. Los ejemplos de células huésped de hongos (inclusive levaduras) son S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), especies de Candida que incluyen C. albicans y C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris, y Yarrowia lipolytica. Los ejemplos de células de mamíferos son células COS, células de riñon de hámster bebé, células L de ratones, células LNCaP, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés Chínese Hámster Ovary) , células de riñon de embrión humano (HEK, por sus siglas en inglés Human Embryonic Kidney) , y células de mono verde africano, células CV1, células HeLa, células MDCK, células Vero y Hep-2. También es posible usar ovocitos de rana Xenopus laevis, u otras células de origen anfibio. Los ejemplos de células huésped procarióticas incluyen células bacterianas; por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Salmonella typhi y micobacterias .· Los vectores, por ej . , vectores que comprenden polinucleótidos de una proteína G del VR; y al menos un inmunogen que incluye mas no se limita a N, L, P del VR, o sus porciones, y/o cualquier molécula quimérica descrita con anterioridad, se pueden transfectar en células huésped de acuerdo con los métodos ampliamente conocidos en el arte. Por ejemplo, la introducción de ácidos nucleicos en células eucarióticas puede ser mediante co-precipitación de fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. En una forma de realización, el vector es un baculovirus recombinante . En otra forma de realización, el baculovirus recombinante es transfectado en una célula eucariótica. En una forma de realización preferida, la célula es una célula de insecto. En otra forma de realización, la célula de insecto es una célula Sf9.

Esta invención también provee construcciones y métodos que incrementan la eficiencia de la producción de PPVs. Por ejemplo, la adición de secuencias líder a G, M, N, L, P del VR, o sus porciones, y/o cualesquiera moléculas heterólogas o quiméricas descritas con anterioridad, puede mejorar la eficiencia del transporte de la proteína dentro de la célula. Por ejemplo, una secuencia señal heteróloga puede fusionarse al G, , N, L, P del VR o sus porciones, y/o cualquier molécula heteróloga o quimérica descrita con anterioridad. En una forma de realización, la secuencia señal puede derivar del gen de una célula de insecto y fusionarse al G, M, N, L, P del VR, o sus porciones, y/o cualquier molécula heteróloga o quimérica descrita con anterioridad. En otra forma de realización, el péptido señal es la secuencia señal de chitinasar que funciona de manera eficiente en sistemas de expresión de baculovirus.

Otro método para incrementar la eficiencia de la producción de PPVs es optimizar con codones los nucleótidos que codifican el VR, con inclusión de una proteina G, M, N, L, P del VR, o porciones de la misma, y/o cualesquiera moléculas heterólogas o quiméricas descritas con anterioridad para un tipo celular especifico. En una forma de realización, los ácidos nucleicos se optimizan con codones para la expresión en células de insecto. En una forma de realización de ejemplo, las células de insecto son células de insecto Sf9.

La invención también provee métodos para producir PPVs, donde dichos métodos comprenden expresar genes del VR que incluyen una proteina G del VR bajo condiciones que permiten la formación de PPVs. Según el sistema de expresión y la célula huésped seleccionada, las PPVs son producidas al desarrollar células huésped transformadas por un vector de expresión bajo condiciones mediante las cuales las proteínas recombinantes son expresadas y las PPVs son formadas. En una forma de realización, la invención comprende un método para producir una PPV, que comprende transfectar vectores que codifican al menos la proteina G del VR en una célula huésped adecuada y expresar la proteína G del VR bajo condiciones que permiten la formación de PPVs. En otra forma de realización, la célula eucariótica se selecciona entre el grupo que consiste en células de levadura, insecto, anfibio, ave o mamífero. La selección de las condiciones de desarrollo apropiadas se encuentra dentro del conocimiento de la persona versada en el arte.

Los métodos para desarrollar células diseñadas para producir las PPVs de la invención incluyen, mas no se limitan a, técnicas de cultivo celular por lote, lote alimentado, continuo y por perfusión. "Cultivo celular" hace referencia al crecimiento y la propagación de células en un bioreactor (una cámara de fermentación) donde las células se propagan y expresan proteínas (por ej . proteínas recombinantes) para la purificación y el aislamiento. Típicamente, el cultivo celular se realiza bajo condiciones atmosféricas y de temperatura controladas, estériles, en un bioreactor. Un bioreactor es una cámara usada para cultivar células en el cual las condiciones ambientales -tales como temperatura, atmósfera, agitación y/o pH- pueden ser monitorizadas . En una forma de realización, el bioreactor es una cámara de acero inoxidable. En otra forma de realización, el bioreactor es una bolsa de plástico pre-esterilizada (por ej . Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ) . En otra forma de realización, las bolsas de plástico pre-esterilizadas son bolsas de aproximadamente 50 L a 1000 L.

Las PPVs son luego aisladas usando métodos que preservan la integridad de las mismas, tales como mediante centrifugación en gradiente, por ej . , cloruro de cesio, sacarosa e iodixanol, asi como también técnicas de purificación estándares que incluyen, por e . , cromatografía de intercambio iónico y filtración de gel.

El siguiente es un ejemplo de cómo las PPVs de la invención pueden formarse, aislarse y purificarse. Usualmente, las PPVs son producidas a partir de líneas celulares recombinantes diseñadas para crear PPVs cuando las células son desarrolladas en cultivo celular (véase arriba) . La persona versada en el arte entendería que existen métodos adicionales que pueden ser utilizados para formar y purificar las PPVs de la invención; por ende, la invención no se limita al método descrito.

La producción de las PPVs de la invención puede comenzar al sembrar células Sf9 (no infectadas) en matraces de agitación, permitiendo que las células se expandan y aumenten a medida que las células se desarrollan y multiplican (por ejemplo, de un matraz de 125 mi a una bolsa de 50 L de Wave) . El medio usado para desarrollar la célula se formula para la linea celular apropiada (preferentemente, medio libre de suero, por ej . medio de insecto ExCell-420, JRH) . A continuación, las células son infectadas con baculovirus recombinante en la multiplicidad de infección más eficiente (por ej . desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 unidades formadoras de placas por célula) . Una vez que ha ocurrido la infección, la proteina G del VR, y/o cualquier molécula heteróloga o quimérica descrita con anterioridad, se expresan del genoma del virus, se autoensamblan en PPVs y se segregan de las células aproximadamente 24 a 72 horas después de la infección. Usualmente, la infección es más eficiente cuando las células están en la fase logarítmica media de crecimiento (4-8 ? 106 células/ml) y son al menos aproximadamente 90% viables.

Las PPVs pueden ser cosechadas aproximadamente 48 a 96 horas después de la infección, cuando los niveles de las PPVs en el medio de cultivo celular están cerca del máximo pero antes de la lisis celular extensiva. La viabilidad y la densidad de las células Sf9 al tiempo de cosecha puede ser de aproximadamente 0.5* 106 células/ml a aproximadamente 1.5 ? 106 células/ml con al menos 20% de viabilidad, tal como se determina mediante el ensayo de exclusión con tinción. Posteriormente, el medio es extraído y clarificado. Es posible agregar NaCl al medio a una concentración de aproximadamente 0.4 a aproximadamente 1.0 M, preferentemente a aproximadamente 0.5 M, para evitar la acumulación de PPVs . La extracción de células y residuos celulares del medio de cultivo celular que contiene PPVs de la invención se puede lograr mediante filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés Tangential Flow Filtration) con un cartucho de filtro de 0.5 o 1.00 µp? de fibra hueca, pre-esterilizado, de uso único, o un dispositivo similar.

A continuación, las PPVs en el medio de cultivo clarificado se puede concentrar mediante ultra-filtración usando un cartucho de fibra hueca con un peso molecular limite de 500,000, pre-esterilizado, descartable. Las PPVs concentradas pueden ser diafiltradas contra 10 volúmenes de solución tamponada en fosfato (PBS del inglés Phosphate-Buffered Saline) , pH 7.0 a 8.0, que contiene NaCl 0.5 M para extraer los componentes del medio residuales.

Las PPVs diafiltradas concentradas se pueden purificar adicionalmente en un gradiente de sacarosa discontinuo de 20% a 60% en tampón PBS, pH 7.2, con NaCl 0.5 M mediante centrifugación a 6,500 ? g durante 18 horas a una temperatura de aproximadamente 4o C a aproximadamente 10° C. Usualmente, las PPVs forman una banda visible distintiva entre aproximadamente 30% y aproximadamente 40% de sacarosa o en la interfaz (en un gradiente con paso de 20% y 60%) que se puede recolectar del gradiente y almacenar. Este producto puede ser diluido para comprender 200 mM de NaCl en preparación para el siguiente paso en el proceso de purificación. Este producto contiene PPVs y puede contener partículas intactas de baculovirus.

La purificación adicional de las PPVs se puede alcanzar mediante cromatografía de intercambio aniónico, o centrifugación isopícnica en colchón de sacarosa al 44%. En la cromatografía de intercambio aniónico, la muestra del gradiente de sacarosa (ver arriba) se carga en una columna que contiene un medio con un anión (por ej . Matrix Fractogel EMD TMAE) y se eluye mediante un gradiente de sal (desde aproximadamente 0.2 M hasta aproximadamente 1.0 M de NaCl) que puede separar la PPV de otros contaminantes (por ej . baculovirus y ADN/ARN) . En el método del colchón de sacarosa, la muestra que comprende las PPVs se agrega a un colchón de sacarosa al 44% y se centrifuga durante aproximadamente 18 horas a 30,000 g. Las PPVs forman una banda en el tope de la sacarosa al 44%, mientras que el baculovirus se precipita al fondo y otras proteínas contaminantes permanecen en la capa de sacarosa al 0% en el tope. Se recolecta la banda o el pico de PPV.

El baculovirus intacto puede ser inactivado, si se desea. La inactivación se puede lograr mediante métodos químicos, por ejemplo, formol o ß-propiolactona (BPL) . La extracción y/o inactivación del baculovirus intacto también se puede lograr en gran medida al usar precipitación selectiva y métodos cromatográficos conocidos en el arte, tal como se ejemplificó con anterioridad. Los métodos de inactivación comprenden incubar la muestra que contiene las PPVs en 0.2% de BPL durante 3 horas a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 27 °C. El baculovirus también puede ser inactivado al incubar la muestra que contiene las PPVs a 0.05% de BPL a una temperatura de 4 °C durante 3 días, luego a una temperatura de 37 °C durante una hora .

Después del paso de inactivación/extracción, el producto que comprende PPVs puede someterse a otro paso de diafiltración para extraer cualquier reactivo del paso de inactivación y/o cualquier sacarosa residual, y para colocar las PPVs en el tampón deseado (por ej . PBS) . La solución que comprende PPVs se puede esterilizar mediante métodos conocidos en el arte (por ej . filtración estéril) y almacenar en el refrigerador o congelador.

Las técnicas anteriores se pueden practicar en una variedad de escalas. Por ejemplo, botellas de cultivo, matraces de agitación, botellas giratorias, hasta bioreactores de tamaño industrial. Los bioreactores pueden comprender un tanque de acero inoxidable o una bolsa de plástico pre-esterilizada (por ejemplo, el sistema vendido por Wave Biotech, Bridgewater, NJ) . Una persona con conocimiento en el arte sabe lo que es más deseable para sus propósitos .

La expansión y la producción del vector baculovirus de expresión y la infección de células con baculovirus recombinante para producir PPVs recombinantes del VR se puede lograr en células de insecto; por ejemplo, células de insecto Sf9 según lo descrito previamente. En una forma de realización, las células son células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante diseñadas para producir las PPVs del VR.

Formulaciones farmacéuticas o de vacuna y administración Las composiciones farmacéuticas útiles en la presente contienen un portador farmacéuticamente aceptable, con inclusión de cualquier diluyente o excipiente adecuado, que incluye cualquier agente farmacéutico que no induce por si mismo la producción de una respuesta inmunitaria perjudicial al vertebrado que recibe la composición, y que se puede administrar sin toxicidad indebida y una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR. Tal como se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" significa ser aprobado por un organismo regulatorio del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea Estadounidense, la Farmacopea Europea u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en mamíferos, y más particularmente en humanos. Estas composiciones pueden ser útiles como composiciones de vacuna y/o antigénicas para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado .

La invención abarca una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR. En una forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende PPVs que comprenden al menos una proteína G del VR y al menos un inmunogen adicional. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende PPVs que comprenden al menos una proteína G del VR y al menos una proteína M del VR. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende PPVs que comprenden al menos una proteína G del VR y al menos una proteína M del virus de la gripe. En otra forma de realización, la composición de vacuna farmacéuticamente aceptable comprende PPVs que comprenden al menos una proteína G del VR y al menos una proteína Mi de la gripe aviar.

La invención también abarca un kit para inmunizar un vertebrado, tal como un humano, que comprende PPVs que comprenden al menos una proteína G del VR.

En una forma de realización, la invención comprende una formulación inmunogénica que comprende al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR.

La formulación inmunogénica de la invención comprende una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, mas no se limitan a, solución salina, salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, tampón acuoso isotónico estéril, y combinaciones de los mismos. Un análisis exhaustivo de los portadores, diluyentes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables se presenta en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J., edición actual). La formulación debería adecuarse al modo de administración. En una forma de realización preferida, la formulación es adecuada para administración a humanos, preferentemente es estéril, no particulada y/o no pirogénica.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. La composición puede estar en forma sólida, tal como un polvo liofilizado adecuado para reconstitución, una solución liquida, suspensión, emulsión, comprimido, pildora, cápsula, formulación de liberación prolongada, o polvo. La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

La invención también provee un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la invención. En una forma de realización, el kit comprende dos recipientes, uno que contiene una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR, y el otro que contiene un coadyuvante. Asociado con dicho (s) recipiente ( s ) puede estar un aviso en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos o biológicos, donde dicho aviso refleja la aprobación por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para la administración a humanos .

La invención también provee que la formulación sea envasada en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla o sachet que indica la cantidad de la composición. En una forma de realización, la composición es suministrada como un líquido; en otra forma de realización, 5 como un polvo liofilizado y esterilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado y puede ser reconstituido, por ej . , con agua o solución salina a la concentración apropiada para administración a un sujeto.

En una forma de realización alternativa, la composición se suministra en forma liquida en un recipiente herméticamente sellado que indica la cantidad y concentración de la composición. Preferentemente, la forma liquida de la composición se suministra en un recipiente herméticamente sellado al menos aproximadamente 50 pg/ml, más preferentemente al menos aproximadamente 100 g/ml, al menos aproximadamente 200 µ?/p??, al menos 500 \iq/ml, o al menos 1 mg/ml .

Como ejemplo, las PPVs del VR que comprenden una o más proteínas G del VR se administran en una cantidad efectiva o una cantidad (según se definió con anterioridad) suficiente para estimular una respuesta inmunitaria ; cada respuesta contra una o más cepas del VR. La administración de la PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR genera inmunidad contra el VR. Típicamente, la dosis se puede ajustar dentro de este rango sobre la base de, por ej . , la edad, la condición física, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra sistémicamente, por ej . , por inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. En una forma de realización de ejemplo, la formulación de vacuna se administra por vía intramuscular.

Por ende, la invención también comprende un método para formular una composición antigénica o de vacuna que induce inmunidad a una infección o al menos un síntoma de enfermedad de la misma a un mamífero, que comprende agregar a la formulación una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR. En una forma de realización, la infección es una infección por VR.

Si bien la estimulación de la inmunidad con una dosis única es posible, también pueden administrarse dosis adicionales, por la misma vía, o por una vía diferente, para alcanzar el efecto deseado. En los neonatos e infantes, por ejemplo, las administraciones múltiples pueden ser necesarias para generar suficientes niveles de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos en toda la niñez, según sea necesario para mantener suficientes niveles de protección contra infecciones, por ej . infección por VR. En forma similar, los adultos que son particularmente susceptibles a infecciones serias o repetidas, tales como, 5 por ejemplo, trabajadores al cuidado de la salud, empleados de guarderías, familiares de niños pequeños, ancianos e individuos con función cardiopulmonar comprometida pueden necesitar múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden ser monitorizados , por ejemplo, al medir las cantidades de anticuerpos séricos y secretorios neutralizantes, y al ajustar las dosis o repetir las vacunaciones según sea necesario para generar y mantener los niveles deseados de protección.

Los métodos para administrar una composición que comprende una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR (por e . formulación de vacuna y/o antigénica) incluyen, mas no se limitan a, administración parenteral (por ej . , intradérmica, intramuscular, intravenosa y subcutánea) , epidural y a través de la mucosa (por ej . , por vía intranasal y oral o pulmonar, o mediante supositorios) . En una forma de realización específica, las composiciones de la presente invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, subcutánea, transdérmica o intradérmica. Las composiciones pueden ser administradas por cualquier vía conveniente; por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por e . , mucosa oral, colon, conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, vejiga urinaria y mucosa intestinal, etc.) y pueden ser administradas junto con otros agentes biológicamente activos.

Las formulaciones inmunogénicas y/o de 1 vacuna de la invención también se pueden administrar de acuerdo con un régimen de dosificación; por ejemplo, una administración inicial de la composición de vacuna con posteriores administraciones de refuerzo. En las formas de realización particulares, una segunda dosis de la composición se administra en un momento cualquiera entre dos semanas a un año, preferentemente de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 a aproximadamente 6 meses, después de la administración inicial. Asimismo, una tercera dosis se puede administrar después de la segunda dosis y de aproximadamente tres meses a aproximadamente dos años, o incluso un periodo mayor, preferentemente aproximadamente 4, aproximadamente 5, o aproximadamente 6 meses, o aproximadamente 7 meses a aproximadamente un año después de la administración inicial. La tercera dosis puede administrarse opcionalmente cuando se detectan niveles bajos o nulos de inmunoglobulinas especificas en el suero y/u orina o secreciones de la mucosa del sujeto después de la segunda dosis. En una forma de realización preferida, se administra una segunda dosis aproximadamente un mes después de la primera administración y una tercera dosis se administra aproximadamente seis meses después de la primera administración. En otra forma de realización, la segunda dosis se administra aproximadamente seis meses después de la primera administración. En otra forma de realización, las composiciones de la invención se pueden administrar como parte de una terapia de combinación. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden formular con otras composiciones inmunogénicas, antivirales y/o antibióticas .

La dosis de la composición farmacéutica puede ser determinada con facilidad por la persona versada en el arte; por ejemplo, al identificar primero las dosis efectivas para generar una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica; por ej . , al medir el titulo sérico de las inmunoglobulinas especificas para el virus o al medir la relación inhibitoria de los anticuerpos en las muestras de suero, o muestras de orina, o secreciones de la mucosa. Las dosis pueden determinarse a partir de estudios en animales. Una lista no limitativa de animales usados para estudiar la eficacia de las vacunas incluye: cobayos, hámsteres, hurones, chinchillas, ratones y ratas del algodón. La mayoría de los animales no son huéspedes naturales para los agentes infecciosos pero aún asi sirven en los estudios de los varios aspectos de la enfermedad. Por ejemplo, cualquiera de los animales anteriores pueden recibir una dosis de una vacuna candidato, por ej . una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR, para caracterizar parcialmente la respuesta inmunitaria inducida y/o para determinar si se han producido anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, se han realizado muchos estudios en el modelo de ratón porque los ratones tienen un tamaño pequeño y porque su costo bajo permite que los investigadores lleven a cabo estudios a mayor escala.

Asimismo, las personas versadas en el arte pueden llevar a cabo estudios clínicos en humanos para determinar la dosis efectiva preferida para los humanos. Dichos estudios clínicos son estudios de rutina ampliamente conocidos en el arte. La dosis precisa a ser empleada también dependerá de la vía de administración. Las dosis efectivas se pueden extrapolar de las curvas dosis-respuesta derivadas de los sistemas de evaluación in vitro o en animales.

Tal como se conoce ampliamente en el arte, la inmunogenicidad de una composición particular se puede potenciar mediante el uso de estimulantes no específicos de la respuesta inmunitaria, conocidos como coadyuvantes. Los coadyuvantes han sido usados en forma experimental para promover un incremento generalizado en la inmunidad contra antigenos desconocidos (por ej . , patente U.S. No. 4.877.611). Los protocolos de inmunización han usado coadyuvantes para estimular las respuestas durante muchos años y, como tales, los coadyuvantes son ampliamente conocidos para la persona versada en el arte. Algunos coadyuvantes afectan la manera en la cual se presentan los antigenos. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria se incrementa cuando los antigenos proteicos son precipitados con alumbre. La emulsificación de los antigenos también prolonga la duración de la presentación de los antigenos. La inclusión de cualquier coadyuvante descrito en Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2da Edición)," incorporado en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos, está contemplada dentro del alcance de esta invención.

Los coadyuvantes de ejemplo incluyen el coadyuvante completo de Freund (un estimulante no especifico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis muerta) , coadyuvantes incompletos de Freund y coadyuvante de hidróxido de aluminio. Otros coadyuvantes comprenden GMCSP, BCG, hidróxido de aluminio, compuestos MDP, tales como thur-MDP y nor-MDP, CGP (MTP-PE) , lipido A, y monofosforil lipido A (MPL) . RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, MPL, trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS del inglés Cell Wall Skeleton) en una emulsión 2% escualeno/Tween 80 también está contemplado. F-59, Novasomes®, antigenos MHC también se pueden usar.

En una forma de realización de la invención, el coadyuvante es una vesícula lipídica paucilamelar que tiene aproximadamente dos a diez bicapas dispuestas en forma de cubiertas sustancialmente esféricas separadas por capas acuosas que rodean una cavidad central amorfa grande libre de bicapas lipídicas. Las vesículas lipídicas paucilamelares pueden actuar para estimular la respuesta inmunitaria de varias maneras, como estimulantes no específicos, como portadores para el antígeno, como portadores de coadyuvantes adicionales, y combinaciones de los mismos. Las vesículas lipídicas paucilamelares actúan como inmunoestimulantes no específicos cuando, por ejemplo, una vacuna se prepara al entremezclar el antígeno con las vesículas preformadas de tal manera que el antígeno permanece extracelular a las vesículas. Al encapsular un antígeno dentro de la cavidad central de la vesícula, la vesícula actúa tanto como un inmunoestimulante cuanto como un portador para el antígeno. En otra forma de realización, las vesículas están principalmente hechas de vesículas no fosfolipídicas . En otra forma de realización, las vesículas son Novasomes®. Las Novasomes® son vesículas no fosfolipídicas paucilamelares en un rango de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 500 nm. Comprenden .Brij 72, colesterol, ácido oleico y escualeno. Se ha demostrado que las Novasomes son un coadyuvante efectivo para los antigenos de la gripe (véase las patentes U.S. 5.629.021, 6.387.373 y 4.911.928, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos) .

Las composiciones de la invención también se pueden formular con "inmunoestimulantes". Estos son los mensajeros químicos del propio cuerpo (citoquinas) para incrementar la respuesta del sistema inmunitario. Los inmunoestimulantes incluyen, mas no se limitan a, varias citoquinas, linfoquinas y quimioquinas con actividades immunoestimulantes , inmunopotenciadoras y pro-inflamatorias, tales como interleuquinas (por ej . , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores del crecimiento (por ej . , factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (CSF del inglés Granulocyte-Macrophage (GM) -Colony Stimulating Factor)); y otras moléculas inmunoestimulantes, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimulantes pueden ser administradas en la misma formulación que las composiciones de la invención, o se pueden administrar por separado. La proteína, o bien un vector de expresión que codifica la proteína, se puede administrar para producir un efecto inmunoestimulante. Por ende, en una forma de realización, la invención comprende formulaciones antigénicas y de vacuna que comprenden un coadyuvante y/o un inmunoestimulante.

Métodos para estimular una respuesta inmunitaria Las PPVs del VR que comprenden una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR son útiles para preparar composiciones que estimulan una respuesta inmunitaria que confiere inmunidad o inmunidad sustancial a agentes infecciosos. La invención abarca un método para inducir inmunidad a infecciones o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR.

En un aspecto, la invención comprende un método para inducir inmunidad a una infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del VR. En una forma de realización, el sujeto es un vertebrado. En otra forma de realización, el vertebrado es un mamífero. En incluso otra forma 'de realización, el mamífero es un humano. En otra forma de realización más, el ' mamífero es un animal doméstico. En otra forma de realización, el método comprende inducir inmunidad a Una infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad al administrar la formulación en una dosis. En otra forma de realización, el método comprende inducir inmunidad a una infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad al administrar la formulación en dosis múltiples .

Las composiciones de la invención pueden inducir inmunidad sustancial en un vertebrado (por ej . un humano) cuando se administra al vertebrado. La inmunidad sustancial se genera a partir de una respuesta inmunitaria contra las composiciones de la invención que protege o mejora la infección o al menos reduce un síntoma de infección en el vertebrado. En algunos casos, si el vertebrado es infectado, la infección será asintomática . La respuesta puede no ser una respuesta totalmente protectora. En este caso, si el vertebrado es infectado con un agente infeccioso, el vertebrado experimentará síntomas reducidos o una duración más corta de los síntomas en comparación con un vertebrado no inmunizado.

En otra forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta de anticuerpos protectora a una infección o al menos un síntoma de la misma en un sujeto, que comprende administrar al menos una. dosis efectiva de una PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR.

Tal como se usa en la presente, un "anticuerpo" es una proteina que comprende uno o más polipéptidos sustancialmente o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asi como también los genes de región variable de la mirlada de inmunoglobulinas . Las cadenas livianas se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina típica (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, donde cada par tiene una cadena "liviana" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD) . El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas.

En una forma de realización, la invención comprende un método para inducir una respuesta celular protectora a infección por VR o al menos un síntoma de enfermedad en un sujeto, que comprende administrar al menos una dosis efectiva de PPV del VR que comprende una o más glicoproteínas (proteínas G) del VR.

Tal como se mencionó con anterioridad, las composiciones inmunogénicas de la invención previenen o reducen al menos un síntoma de infección por VR en un sujeto. Los síntomas del VR son ampliamente conocidos en el arte. Estos incluyen fiebre, dolor de cabeza, y debilidad o malestar general. A medida que la enfermedad progresa, aparecen síntomas más específicos, que pueden incluir insomnio, ansiedad, confusión, parálisis leve o parcial, excitación, alucinaciones, agitación, hipersalivación (incremento de saliva), dificultad al tragar, e hidrofobia (miedo al agua) . Por ende, el método de la invención comprende la prevención o reducción de al menos un síntoma asociado con infección por VR. Una reducción en un síntoma puede ser determinada subjetiva u objetivamente, por ej . , autoevaluación por parte del sujeto, por medio de la evaluación del médico, o al realizar un ensayo o una medición apropiados (por ej . temperatura corporal), con inclusión de, por ejemplo, evaluación de la calidad de vida, un avance ralentizado de una infección por VR o síntomas adicionales, una severidad reducida de los síntomas del VR, o un ensayo adecuado (por ej . ensayo del titulo de anticuerpos y/o ensayo de activación de células T) . La evaluación objetiva comprende evaluaciones tanto en animales como en humanos.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deberían tomarse como limitativos. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en toda esta solicitud, así como también las Figuras y el Listado de Secuencias, se incorporan en la presente por referencia para todos los propósitos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Purificación de partículas G del virus de la rabia para estudio en animales El propósito de este Ejemplo es demostrar cómo se purificaron las partículas pseudo-virales G del VR siguiendo la expresión de vectores baculovirus en células de insecto Sf9.

Para construir las PPVs del VR, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína G del VR (SEC ID NO: 2) fue expresada a partir del vector baculovirus (pFastBacl Rabies G) ilustrado en la Figura 1.

Las células de insecto Sf9 fueron infectadas a 2.5 x 106 célula/ml con una MOI de 0.2. Las células fueron cosechadas a 69 horas post-infección por centrifuga a 4000 g durante 15 minutos. Las células se lavaron con IX PBS, se centrifugaron nuevamente, y se congelaron a -70 °C.

Se usó un sedimento celular de 23 gramos obtenido de un cultivo celular de aproximadamente 2 L. El sedimento celular se resuspendió con 200 mi de TrisCL 25 mM pH 8.0, NaCl 50 mM, NP9 0.5%, 4 ug/mL de leupeptina. Se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, se centrifugó a 7000 g durante 60 minutos a 4 °C, y se guardaron 200 mi de sobrenadante para cromatografía.

Una vez completa la extracción de la muestra Rabies G839 del sedimento celular, las proteínas solubles se cargaron en una columna de cromatografía Fractogel EMD TMAE Hicap (M) . Las especificaciones de la columna fueron las siguientes: fabricante de la columna: GE Healthcare; tipo de columna: XK50f20; fabricante de la resina: EMD Chemicals; tipo de resina: Fractogel EMD TMAE Hicap (M) ; dimensiones de la columna empacada: aproximadamente 10 cm de altura x 5.0 cm de diámetro; volumen de la columna empacada: 200 mi; caudal del empaque: 30 ml/min; Buffer de empaque: Tris 25 mM pH 8.0 / NaCl 300 mM.

Las especificaciones del proceso de intercambio aniónico fueron las siguientes: caudal por corrida: 20 ml/min; buffer de equilibrio de columna: Tris 25 mM pH 8.0, NaC150 mM, NP9 0.02%; Eluyente A: Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 50 mM, NP9 0.02%; Eluyente Bl: Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 180 mM, NP9 0.02%; Eluyente B2 : Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, NP9 0.02%; Eluyente B3: Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 1500 mM, NP9 0.02%; carga de columna: 200 mi de sobrenadante de extracción de PPV G del virus de la rabia; lavado de columna posterior a la carga: 2 CV con eluyente A; elución de la columna: 2 CV con eluyente Bl, 2 CV con eluyente B2, 2 CV con eluyente B3.

La recolección de la fracción principal y los volúmenes fueron los siguientes: Fracción traspasada: 250 mL; Bl NaCl 180 mM, elución: 175 mi (producto); B2 NaCl 500 mM, elución: 100 mi; B3 NaCl 1500 mM, elución: 100 mi.

La fracción de elución de NaCl 180 mM de la columna de TMAE se cargó en una columna de lentil lectina. Las especificaciones de la columna fueron las siguientes: fabricante de la columna: GE Healthcare; tipo de columna: XKI6/20; fabricante de la resina: GE Healthcare; tipo de resina: Lentil Lectina Sefarosa 4B; catálogo de resinas #: 17-0444-01; dimensiones de la columna empacada: 2.5 cm de altura x 1.6 cm de diámetro; volumen de la columna empacada: aproximadamente 5 mi; caudal del empaque: 2.5 ml/min; buffer 'de empaque: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%; caudal por corrida: 2 mL/min; buffer de equilibrio de columna: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%; Eluyente A: NaHP04 25 mM pH6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%, Eluyente B: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%, metil-alfa-D-manopiranósido 500 mM (Fisher Scientific) ; carga de la columna: 175 mi de muestra Rabies G839, elución NaCl 180 mM en TMAE; lavado de columna posterior a la carga: 5 CV con eluyente A; elución de columna: 10 CV con eluyente B.

La recolección de la fracción principal y los volúmenes fueron los siguientes: fracción traspasada: 180 mi; fracción de elución: 30 mi (producto) .

La elución de lentil lectina se cargó en una columna de cromatografía Fractogel EMD S03 - Hicap (M) . Las especificaciones de la columna fueron las siguientes: fabricante de la columna: GE Healthcare; tipo de columna: XK16/20; fabricante de la resina: EMD Chemicals; tipo de resina: Fractogel EMD S03 - Hicap (M) ; dimensiones de la columna empacada: 5 cm de altura x 1.6 cm de diámetro; volumen de columna empacada: 10 mi; caudal del empaque: 7.5 ml/min; buffer de empaque: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%.

Las especificaciones del proceso de intercambio catiónico fueron las siguientes: caudal por corrida: 5 mL/min; buffer de equilibrio de columna: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%; Eluyente A: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 50 mM, NP9 0.02%; Eluyente B: NaHP04 25 mM pH 6.8, NaCl 300 mM, NP9 0.02%; carga de columna: 30 mL de elución de lectina lectina de muestra Rabies (Rabia) G839; lavado de columna posterior a la carga: 3 CV con eluyente A; elución de columna: 4 CV, elución escalonada, con eluyente B; recolección de la fracción principal y volúmenes: fracción de elución: 9 mi (producto final) ; Filtro 9 mi S03 -producto de elución en columna NaCl 300 mM con filtro de 0.2 µp\; fabricante del filtro (0.2 µ??) : Corning; tipo de filtro: filtro de jeringa de 28 mm con una membrana SFCA de 0.2 micrones.

Se realizó análisis Western blot usando suero de conejo anti-G del VR (Figura 2) . La pureza de las partículas G del VR usando las condiciones anteriores fue del 86%. La cantidad de proteína total fue de 0.39 mg/ml, y la concentración de las partículas G del VR fue de 0.33 mg/ml, con un total de 2.97 mg de partículas G del VR a partir de un cultivo celular de 2 L, con un rendimiento de aproximadamente 1.5 mg/L de cultivo celular. Es importante destacar que las partículas G del VR fueron estables a 4 °C durante al menos un mes (datos no ilustrados) .

Ejemplo 2 Microscopía electrónica para análisis de la conformación de proteína G del VR Se analizó la proteína G purificada del VR mediante microscopía electrónica con tinción negativa (véase la Figura 3) . El peso molecular promedio de las partículas G del VR con NP9 0.02% fue de 1.04 x 10-6. Los trímeros de proteína exhibieron un peso molecular de 175.5 kDa y el número promedio de trímeros en una partícula fue de 5.9. Las proteínas G del VR se acumularon en forma de micelas (rosetas) . El hecho de que las espículas G exhiben morfología de micela bajo microscopía electrónica sugiere que las partículas de proteína G tienen la estructura tri-dimensional correcta, de una proteína nativa.

Ejemplo 3 Las partículas G del VR inducen altos niveles de anticuerpos en conejos Para evaluar la habilidad de las partículas G del VR para inducir una respuesta inmunitaria, se administró a los conejos partículas G del VR en diversas concentraciones. Los resultados de estos experimentos se ilustran en la Figura 4. Las partículas G del VR fueron capaces de inducir altos niveles de anticuerpos en conejos.

Ejemplo 4 Ensayo de neutralización del VR y estudios de provocación de VR en ratones Para evaluar la eficiencia de una vacuna que comprende PPVs del VR que comprenden una o más proteínas G en la protección contra la infección por VR, se llevaron a cabo ensayos de neutralización en ratones. Brevemente, los grupos de ratones recibieron inyecciones intramusculares de PPVs del VR o PPVs del VR + un coadyuvante, tal como aluminio. Además, los ratones fueron inyectados con Rabipur®, una vacuna de virus de la rabia inactivado comercialmente disponible, que se usa como agente de vacuna comparativo. Por lo general, se espera que las PPVs del VR que comprenden una o más proteínas G (es decir, micelas G del VR) induzcan títulos más altos de anticuerpos neutralizantes cuando se comparan con Rabipur®.

Ejemplo 5 Comparación de título anti-rabia en ratones Balb/c inyectados con partículas G del VR o con vacuna comercial contra la rabia Rabipur® ' La inmunogenicidad de las PPVs de la presente invención se comparó con la vacuna comercial contra la rabia Rabipur® en un modelo de ratón Balb/c. Las partículas PPV G del VR fueron construidas y purificadas tal como se describió en el Ejemplo 1. Las PPVs se acumularon en forma de micelas (Figura 3) .

El estudio incluyó cuatro grupos (n=5 para cada grupo) : Grupo I: control positivo (vacuna comercial contra la rabia Rabipur®) Grupo II: PPV G del VR (5 ig) Grupo III: PPV G del VR (2 pg) Grupo IV: PPV G del VR (1 g) Los ratones recibieron el inmunogen respectivo a 0.1 mL los días 0, 3 y 7. Las muestras séricas fueron tomadas de los ratones los dias 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35. Se evaluó el suero en cuanto a los anticuerpos anti-rabia neutralizantes mediante ELISA.

A continuación se brinda un resumen del diseño de estudio en la tabla 1.

Tal como se analizó con anterioridad, los anticuerpos neutralizantes anti-rabia se midieron en suero de ratón en los momentos indicados con anterioridad. Los títulos se trazaron como la media geométrica (GMT) para cada medición (Figura 6) . Tal como lo ilustra la Figura 6, las PPV en forma de micelas de la presente invención, en cada dosis, brindan títulos de anticuerpos más rápidos y más altos que la vacuna comercialmente disponible, Rabipur®. Específicamente, la PPV G del VR brindó un título de sero-protección (0.5 EU/mL) días antes que la vacuna Rabipur® (Figura 6, Tabla 2) .

La Tabla 2 también muestra la sero-protección porcentual (es decir, un título de anticuerpo neutralizante de = 0.5 EU/mL) para cada grupo de inmunización. La tabla indica que la sero-protección ocurre más rápidamente en los animales tratados con la PPV G del VR de la presente invención (en todas las tres dosis), en comparación con los animales que recibieron la vacuna Rabipur®.

La descripción detallada anterior ha sido dada solamente para que pueda entenderse con claridad, y no deberían suponerse limitaciones innecesarias a partir de la misma ya que las modificaciones serán obvias para la persona versada en el arte. No se admite que la información provista en la presente sea arte previo ni relevante para las invenciones reivindicadas en la presente, ni que cualquier publicación especifica o implícitamente aludida sea arte previo.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por la persona versada en el arte al cual pertenece esta invención.

Si bien la solicitud ha sido separada en secciones para llamar la atención del lector a formas de realización específicas, dichas secciones no deberían considerarse como una división entre las formas de realización. Las enseñanzas de cada sección y las formas de realización descritas en ella son aplicables a otras secciones.

Si bien la invención ha sido descrita en relación con las formas de realización específicas de la misma, ha de entenderse que se pueden realizar otras modificaciones y que esta solicitud está destinada a cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluye dichas desviaciones de la presente divulgación tal como puedan aparecer dentro de la práctica conocida o habitual dentro del arte al cual pertenece la invención y como puedan aplicarse a las características esenciales establecidas con anterioridad y tal como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas .

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una micela purificada caracterizada porque comprende una o más glicoproteinas (proteínas G) del virus de la rabia (VR) .

2. La micela purificada de la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína G del VR deriva de una cepa del VR seleccionada entre cepa del VR en humano, canino, murciélago, mapache, zorrillo y zorro.

3. Una partícula pseudo-viral (PPV) caracterizada porque comprende una proteína G del VR.

4. La PPV de la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína G del VR deriva de una cepa del VR seleccionada entre cepa del VR en humano, canino, murciélago, mapache, zorrillo y zorro.

5. La PPV de cualquiera de las reivindicaciones 3-4, caracterizada porque la PPV comprende una proteína de la matriz ( ) .

6. La PPV de la reivindicación 5, caracterizada porque dicha proteína M deriva del VR.

7. La PPV de la reivindicación 5, caracterizada porque dicha proteina M es Mi de una cepa del virus de la gripe.

8. La PPV de la reivindicación 5, caracterizada porque dicha cepa del virus de la gripe es una cepa del virus de la gripe aviar.

9. La PPV de la reivindicación 8, caracterizada porque dicha cepa del virus de la gripe aviar es una cepa H5N1.

10. La PPV de la reivindicación 9, caracterizada porque dicha cepa H5N1 es A/Indonesia/5/05.

11. La PPV de la reivindicación 5, caracterizada porque dicha proteina M deriva de una cepa del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) .

12. La PPV de cualquiera de las reivindicaciones 3-11, caracterizada porque la PPV se expresa en una célula eucariótica bajo condiciones que permiten la formación de PPVs.

13. La PPV de la reivindicación 12, caracterizada porque la célula eucariótica se selecciona entre el grupo que consiste en células de levadura, insecto, anfibio, ave, mamífero o planta.

14. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una micela purificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

15. Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende una PPV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13.

16. Una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una micela purificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizada porque la micela es capaz de generar una respuesta inmunitaria en un huésped.

17. Una composición de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende una PPV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13, caracterizada porque la PPV en forma de micela es capaz de generar una respuesta inmunitaria en un huésped.

18. Un kit para inmunizar un humano contra una infección viral caracterizado porque comprende una micela purificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2.

19. Un kit para inmunizar un humano contra una infección viral caracterizado porque comprende una PPV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13.

20. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-19, caracterizado porque la infección viral es una infección por VR.

21. Un método para vacunar un mamífero contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar una micela purificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un humano.

22. Un método para vacunar un mamífero contra una infección viral que comprende administrar una PPV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un humano.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21-22, caracterizado porque la formulación farmacéuticamente aceptable comprende un coadyuvante.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizado porque el coadyuvante es una liposoma no fosfolipídica .

25. Un método para generar una respuesta inmunitaria contra una infección viral caracterizado porque comprende administrar una micela purificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un humano.

26. Un método para generar una respuesta inmunitaria contra una infección viral que comprende administrar una PPV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-13 en una formulación farmacéuticamente aceptable a un humano.

27. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica una proteína G del VR de SEC ID NO: 2.

28. Una célula aislada caracterizada porque comprende un ácido nucleico de la reivindicación 27.

29. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 27.

30. Un método para formar una proteina G del VR, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico de la reivindicación 27; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conducen a la producción de dicha proteina G del VR.

31. Un método para formar una micela de proteina G del VR, caracterizado porque comprende: (a) transformar una célula huésped para expresar un ácido nucleico de la reivindicación 27; y (b) cultivar dicha célula huésped bajo condiciones que conducen a la producción de dicha micela de proteina G del VR.

32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-31, caracterizado porque dicha célula huésped es una célula de insecto.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque dicha célula de insecto es una célula de insecto transfectada con un vector que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 27.