CN102869380A - 用于禽舍疾病的活疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备用于对禽类病毒性疾病实施局部施药治疗的疫苗组合物的方法，至少包括步骤：a）即时混合包括至少一种选自属于所述禽类疾病的一种或多种毒株的病毒的活病毒的疫苗和佐剂稀释剂（DA），其特征在于所述佐剂稀释剂是水包油连续水性相乳剂或水包油微乳剂。

Description

用于禽舍疾病的活疫苗

本发明涉及制备疫苗组合物的方法，所述疫苗组合物用于对禽类病毒性疾病并且尤其是禽类感染性支气管炎的局部施药治疗。

禽类感染性支气管炎是急性的接触传染疾病，其主要通过呼吸症状侵袭家禽。禽类感染性支气管炎病毒(或IBV)是冠状病毒属(Coronavirus)，冠状病毒科(Coronaviridae)，网巢病毒目(Nidovirales)的成员。此单链RNA病毒具有强的进化能力，并且病毒颗粒可以在外部环境中存活一个月的时间。

IBV侵袭所有年龄的家禽并且不仅靶向呼吸道。事实上，IBV首先在气管中复制并且随后可以蔓延至受侵袭的家禽的全身，侵袭多个内部器官。

发病率很高并且死亡率可以根据养殖场、养殖条件以及细菌超感染的位点而变化。

临床体征为下面的类型：

-呼吸的(咳嗽、气管罗音、窦肿大、结膜炎等)；

-生殖的(产蛋减少，产生薄的、畸形的或有色的壳的蛋)；

-肾脏，强烈的干渴，等。

IBV尤其通过呼吸途径或者经由气溶胶传播。毒性物质由鼻排出物和滴下物构成。传播是水平的、直接的(从患病鸟类到敏感性鸟类)或者间接的(经由水、物质等)。

IBV对于多数消毒剂敏感，但是最佳的控制手段由联合采用生物安全性步骤(净化步骤、消毒步骤等)的接种疫苗组成。

接种疫苗在于用一些量的被杀死的病原体(失活疫苗)或者毒性减小的病原体(减活疫苗)来接种要保护的物种以便引发宿主的生物应答，在随后发生疾病期间对其进行保护。

活疫苗通常是足够有效的而不需要使用佐剂。

疫苗佐剂是放大对其所结合的抗原的生物应答的赋形剂。例如，可提及氢氧化铝，以及由SEPPIC公司以名称Montanide^TM出售的油性佐剂。这些佐剂有多种性质。它们也可以仅由脂质体组成，由包含至少一种油相和至少一种水相的乳剂组成，由″福氏(Freund)″佐剂型组成，或者更通常地由不可水溶的无机盐组成。在这些用作疫苗组合物佐剂的无机盐中，可提及例如，氢氧化铝、硝酸铈、硫酸锌、胶体氢氧化铁或氯化钙。氢氧化铝是最常使用的佐剂。这些用作疫苗组合物佐剂的无机盐尤其描述于Rajesh K.Gupta等人的文章″Adjuvants，balance between toxicity andadjuvanticity″，Vaccine，第11卷，第3期，1993，第293-306页。

疫苗可以通过注射(皮下或肌肉内注射)或局部(例如，通过雾化的大规模疫苗接种，添加到饮用水中用于与喙和鼻孔以及眼鼻复合体相互接触)施用。

即使已证明通过注射接种疫苗是有效的，但是它具有不适于家禽养殖场的经济环境(高劳动力成本)的缺点，并且它也造成被处理的家禽的压力，这在产蛋的情形下，在由注射造成物理创伤后，可以造成产蛋中断。

在疫苗组合物中以及在旨在防止感染性支气管炎发生的疫苗组合物中使用有效佐剂使得下述成为可能：

·增加保护性应答的强度，使得能够提供给更佳水平的保护；

·延长由疫苗剂量所赋予的保护持续期，为养殖场中的动物提供贯穿其生长的持续更长的保护；

·在没有这些免疫应答放大剂而需要两种治疗时，以单次治疗提供足够的保护。节省下来的是待注射的剂量数(减半)，动物处理(劳动)以及在处理动物期间造成的压力(也减半)；

·具有以较低的抗原剂量获得与由没有使用佐剂的完整剂量所赋予的效力相当的效力的可能性。因此，疫苗生产厂将以相同的生产能力，能够生产更多的疫苗剂量。同样，可建议现有的包装用于对更大量的动物进行疫苗接种。

目前没有在通过使用活疫苗局部施药而实施疫苗接种技术期间描述或使用佐剂。

需要开发也具有上述改善免疫应答的佐剂功能的稀释剂。这些组合物被称作佐剂稀释剂(AD)。

在开发AD中遇到的主要困难是所述佐剂稀释剂(AD)保持活疫苗存活以便维持其免疫原性特性的能力。

开发用于活疫苗的佐剂的重要因素在于当它们在注射前接触时，佐剂制剂不杀死组成疫苗抗原的活微生物的特异性。AD在市场上可见(例如来自Intervet公司的包括在Diluvac

下的生育酚乙酸酯)并且AD被推荐用于某些活疫苗。

此外，活疫苗在法国专利申请FR 2 385 401中是已知的。

然而，此活疫苗不是用佐剂物质制备的。迄今为止毋庸置疑，例如通过增加病毒含量，或者通过使用更具免疫原性的毒株，用活疫苗可以产生更大的免疫应答。

根据本发明，发现了用于制备活病毒疫苗的方法，其特征在于，该活疫苗是通过连续水性相乳剂类型(例如油包水乳剂或微乳剂)的佐剂来制备。

出人意料地注意到，水包油(O/W)乳剂作为活疫苗的“稀释剂”的用途对于被疫苗接种的动物中的血清学和免疫应答有正面作用。在此水包油乳剂中，外部水性相允许疫苗(通常是冻干的)易于溶解。

本发明的另一方面是水包油乳剂作为活疫苗的佐剂稀释剂的用途造成仍具有母体免疫性的幼小动物中的非常高的血清学应答。此出人意料的作用可由乳剂针对动物中存在的抗体的中和作用的对活病毒的保护性作用造成的。

本发明的一个目的是克服上面指出的现有技术的所有或者一些缺陷。

为此目的，本发明的主题是制备用于对禽类病毒性疾病进行局部施药治疗的疫苗组合物的方法，至少包括下面的步骤：

a)即时混合包含至少一种选自属于所述禽类疾病的一种或多株毒株的病毒的活病毒的疫苗和佐剂稀释剂(AD)，其特征在于所述佐剂稀释剂是水包油连续水性相乳剂或水包油微乳剂。

术语“禽类病毒性疾病”旨在意指：

-呼吸病毒性疾病，例如感染性喉气管炎、禽类感染性支气管炎、鸽疱疹病毒感染、火鸡鼻气管炎；

-消化病毒性疾病，例如鸭瘟、鸭病毒性肝炎、禽类嗜肝DNA病毒；

-病毒性皮肤疾病，例如禽类痘；

-神经系统的病毒性疾病，例如禽类脑脊髓炎、东方马脑炎、西尼罗热、狂犬病、″跳跃病″；

-全身病毒性疾病，例如鸡瘟(avian pseudo-plague)(新城病(Newcastle disease))、马立克氏病(Marek’s disease)、古姆博罗病(Gumboro disease)、禽疫、禽类造白细胞组织增生、鸡感染性贫血病、Derszy病、卵膜软化病(soft-egg disease)。

术语“稀释剂”旨在意指为了降低效价、丰富度或其百分比而加入到另一者的物质。

为了相关，用于局部施用的疫苗的佐剂稀释剂(ADLAV)将必须：

·在重构后，保持疫苗存活达给定的时间段；

·允许制备对于粘膜易于喷涂及润湿(亲水性)的制剂(疫苗组合物)以允许有效且容易的治疗；

·相比于没有佐剂而使用的抗原，显著提高抗原的免疫有效性，并且不造成副作用。

此外，本发明的实施方式可包括下面特征中的一种或多种：

-如上所限定的方法，其特征在于在所述疫苗中含有的所述病毒属于IBV(感染性支气管炎病毒)的一种或多种毒株；

-如上所限定的方法，其特征在于所述疫苗中含有的所述病毒是新城病病毒；

-如上所限定的方法，其特征在于所述疫苗中含有的所述病毒属于IBV(感染性支气管炎病毒)的一种或多种毒株、新城病病毒或这些病毒的混合物。

新城病病毒，也称作″鸡瘟″、″禽类肺脑炎″或拉尼克赫特病(Ranikhetdisease)，是由病毒造成的鸟类人畜共患病。

根据毒株的毒性、动物的免疫性和状况以及其他环境因素，发病率和死亡率变化很大。

新城病病毒是副粘病毒科(Paramyxoviridae)，腮腺炎病毒属(Rubulavirus)的病毒。

其是具有单链的RNA病毒(不同于具有8条链的流感病毒)，称作单链的。RNA病毒易于且经常突变，这会使得制造药物和疫苗的策略更加复杂困难。

被膜直径为从150至300nm，其具有两种类型的糖蛋白针状体(spicule)。其特征在于：

·HN糖蛋白，具有使血细胞凝集以及神经酰胺酶活性，允许病毒体附着于细胞表面的膜受体以及其释放；

·F糖蛋白，允许病毒被膜和细胞膜之间的融合。

病毒易于在含胚的母鸡卵中培养或者在体外(在鸡胚胎成纤维细胞或在鸡肾细胞上)培养。

该病毒在环境温度下非常具有抗性，其仍旧有感染性：

·在排泄物中持续长时间(几个月)，

·在鸡舍中地面上持续2至3个月，

·在污染的壳上持续7至8个月，

·在未烹饪的以及冷冻的尸体中持续2年及更长时间。

对于流感，根据毒株的毒性对它们分类，区别是：

·强毒株(高毒性，诱发接近或达到100％的死亡率，其攻击全身或至少攻击内脏，或涉及神经系统，可能与呼吸问题相关)，

·中等毒力株(中度毒性，产生具有神经系统问题的呼吸疾病，幼鸟中死亡率达到50％)，

·轻型毒株(弱毒性，非致死的，产生一些呼吸问题，并且有时不诱发症状)。例如，这些是Hitchner B1和La Sota毒株。

病毒的来源与病毒所靶向的器官(根据病毒毒株而改变)，以及受侵袭的鸟类的状况和免疫史相关联，鸟类将病毒表达于：

·支气管分泌物和排泄物中，

·尸体的所有部分。

从孵育开始分泌病毒并且在恢复期期间的可变化的时期中，分泌几天至两周，在少数情形下更长。

为了抗击病毒，现有的可由养殖者实施的预先警戒和预防措施可以由例如隔离被感染的动物、使被感染的动物安乐死、卫生措施以及用常规消毒剂对处所消毒以及有规律的清洁组成。

接种疫苗也构成预防的手段。

本发明的主题也是：

-如上所限定的方法，其特征在于，佐剂稀释剂(AD)包含油性佐剂、水性相、至少一种二价无机盐以及至少一种络合剂；

-如上所限定的方法，其特征在于，在步骤a)前冻干所述活疫苗中含有的病毒。

活疫苗通常冻干存储并且必须即时用水性相重悬。由此重构的疫苗必须在添加稀释剂后几小时内使用。

-如上所限定的方法，其特征在于，所述佐剂稀释剂是水包油乳剂，对于其重量的100％，其包含：

·从50％至97％的水，更特别地是从70％至97％的水，以及甚至更特别地是从80％至97％的水；

·从1％至45％的油性佐剂，更特别地是从1％至30％的油性佐剂，以及甚至更特别地是从2％至10％的油性佐剂；

·从0.1％至10％的至少一种二价无机盐，更特别地是从0.1％至8％，以及甚至更特别地是从0.2％至3％；

·从0.1％至10％的至少一种络合剂，更特别地是从0.1％至8％，以及甚至更特别地是从0.2％至3％。

-如上所限定的方法，其特征在于，所述佐剂稀释剂是水包油微乳剂，对于其重量的100％，其包含：

·从50％至97％的水，更特别地是从70％至97％的水，以及甚至更特别地是从80％至97％的水；

·从1％至45％的油性佐剂，更特别地是从1％至30％的油性佐剂，以及甚至更特别地是从2％至10％的油性佐剂；

·从0.1％至10％的至少一种二价无机盐，更特别地是从0.1％至8％，以及甚至更特别地是从0.2％至3％；

·从0.1％至10％的至少一种络合剂，更特别地是从0.1％至8％，以及甚至更特别地是从0.2％至3％。

-如上所限定的方法，其特征在于，所述油性佐剂对于其重量的100％包含：

·从40％至95％的至少一种矿物油，更特别地是从50％至95％的至少一种矿物油，以及甚至更特别地是从50％至90％的至少一种矿物油；

·从5％至60％的至少一种表面活性剂，更特别地是从5％至50％的至少一种表面活性剂，以及甚至更特别地是从10％至50％的至少一种表面活性剂。

-如上所限定的方法，其特征在于，所述至少一种二价无机盐选自葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、天冬氨酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸铁和氯化钙。

-如上所限定的方法，其特征在于，所述至少一种络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾和聚丙烯酸钠。

用于制备油性佐剂的矿物油选自通过蒸馏油以及通过实施后续加工步骤(例如脱硫作用、脱沥青作用、芳香化合物提取以及蜡提取步骤以及其他精加工步骤)而获得的烃类矿物油(例如可提及，Marcol 52、MARCOL82、Drakeol 5和Drakeol 6等类型的油)。

油性佐剂中存在的表面活性剂是亲水性的乳化表面活性剂，其特征为介于8和19之间，更特别地是介于8和15之间的HLB值。

此类表面活性剂可由烷基多糖苷或者烷基多糖苷混合物；皂苷类；卵磷脂类；聚氧乙烯烷醇类；包含聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段(block)的聚合物；或者通过脂肪酸(有利地在20℃为液体的脂肪酸)和糖、山梨醇、甘露醇或丙三醇缩合而获得的酯组成。所述糖可由葡萄糖或蔗糖，或优选地甘露醇组成。对于优选的脂，可提及脂肪酸(例如油酸、硬脂酸、软脂酸或月桂酸)以及山梨醇或甘露醇的脂，所述脂是通过脂肪酸与山梨醇或甘露醇的酯化，或者通过与在位置1-4或位置2-6环化的山梨醇或甘露醇的聚羟化链的酐化作用获得的产物酯化，或者通过与山梨醇或甘露醇和与在位置1-4或位置2-6环化的山梨醇或甘露醇的聚羟化链的酐化作用获得的产物酯化获得的。作为特别优选的甘露醇脂，可提及甘露醇油酸酯、一缩甘露醇油酸酯，包含5mol或10mol或15mol或20mol的环氧乙烷的乙氧基化甘露醇油酸酯，以及包含5mol或10mol或15mol或20mol的环氧乙烷的乙氧基化一缩甘露醇油酸酯。也可使用聚乙二醇、山梨醇或甘油糖脂衍生物。其他类型的优选表面活性剂由乙氧基化植物油(例如具有3mol和40mol之间的环氧乙烷的乙氧基化玉米油，具有3mol和40mol之间的环氧乙烷的乙氧基化菜籽油或者具有3mol和60mol之间的环氧乙烷的乙氧基化蓖麻油)组成。

实施例

佐剂配方与冻干疫苗的存活力的相容性是与此佐剂配方的组成以及其所应用的水平相关的。选择提供良好的实施和佐剂能力的按比例组合的生物相容的组分然后在定量研究方法中评估此选择。具有佐剂的疫苗的存活力(以及因此制剂与该活疫苗的相容性)对于已经证明了比市售参照更高的效力的疫苗必然是良好的。

对于养殖者，通过更好的畜牧学性能水平、更低的治疗成本以及节省的时间来反映效力的改善。局部治疗目前并不使用刺激性能的佐剂。

A-感染性支气管炎情形的示范

a)研究主题的产品

制备的多种佐剂稀释剂

表I

-m O/W：O/W微乳剂

-O/W：O/W乳剂

制备的多种疫苗组合物

所用抗原：从含胚的、特异性无病原体(SPF)的鸡卵提取的B1病毒的H-120系的病毒，有效感染效价为7.0 lg EID50/ml。

通过添加下述物质制备每个实验的疫苗(从VA1-VA11，分别包含佐剂稀释剂AD1-AD11)：

-约5％的抗原(对应于上述抗原的冻干材料)，以及

-约95％的实验的佐剂稀释剂(AD1至AD11)。

b)测量对鸡的效力

实验方法

b1)对在各自鼻中接受100μl疫苗治疗的10只鸡的组(每只动物鼻内施用0.2cm³疫苗)，测定每个疫苗组合物(VA1-VA11)的效力。

因此，组i的鸡接受涉及VAi疫苗的治疗，而i＝1至11。用于此实验的上下文中的鸡来自养殖场，22天龄，对于感染性支气管炎IB疾病为血清反应阴性并且是High sex brown品系。

此外：

-根据相同的模式，10只鸡的组(第12组)或阳性对照组接受施用针对感染性支气管炎的商业疫苗。此商业疫苗只含有水作为稀释剂并且没有佐剂或者任何油或表面活性剂。

作为阳性参照，使用FGI″ARRIAH″生产的商业疫苗：IB毒株H-120第211批次；

-10只鸡的组(第13组)或阴性对照组不接受接种疫苗。

对于每组中的每只鸡，在开始接种疫苗后7/14/21/28/35/42/49/56天取血样，以定量所生成的抗体效价。

b2)毒性攻击

第一次疫苗接种日后56天，通过毒性攻击来评估由疫苗产生的保护：为此，用预定负荷的病原体感染动物(使用IB病毒的病原性毒株M-41，剂量为6.46 CD50或6.3 lg EID 50)。

通过测量下述来评估所造成的疾病的强度：

1/感染后7天，每只动物的累积强度分，评分量表(1分：呼吸浅促/2分：呼吸浅促和气管困难/3分：呼吸窘迫、脸肿胀、有排出物、一般症状)。得病时间越长，病得越严重的组，此分数越高；

2/该组观察到症状期间的天数总和：此分数定量动物战胜疾病的能力；

3/使得能够评估该组的同质性的该组的具有标准差的分数平均值；

4/引发疾病的延迟：一些治疗延迟症状的出现但有害于战胜疾病的能力；

5/得病动物的比率。

这些评估是由充分合格的兽医进行的，这些兽医受到通常为了评估针对IB的疫苗的性能水平而实施的实验方法的训练。

实验结果

抗体效价：

表II示出结果组。

未进行疫苗接种的动物组(第13组)没有显著地产生抗体(接近1，标准差接近0.2)，这意味着在试验期间没有病毒的污染，因此证实了其他结果。

在28天后，商业疫苗(第12组)产生大于3的效价，早在疫苗接种后14天标准差约0.2，并且稳定为期56天。

从21天开始，并且贯穿试验持续期，第1/3/5/7/9组产生大于3(至多4)的抗体效价，标准差约0.2。

这些组显示出较之商业疫苗的显著更好的结果(表中指出的P)。

其他组显示出与商业疫苗相似或更少的应答水平。

P定义了结果的显著性，即，能够建立差异是否显著的发生的概率。

P＜0.01：与商业疫苗相比差异显著。

P＜0.001：与商业疫苗相比差异非常显著。

表II：毒性攻击前第1-13组的抗体效价结果，为时56天

毒性攻击：

表III：第1-13组响应于毒性攻击的行为对于病毒耐受性分数的结果

未处理的对照组(第13组)产生非常高的症状强度分数(对于100％的动物，每只鸡为约9，患病许多天，并且疾病症状的引发延迟了约7天)。这些结果证实了毒性攻击。

使用商业疫苗(第12组)显著降低所有这些参数，然而，50％的鸡在仅仅两天的延迟后仍然发病，只是中度症状(累积分为22)，持续相对短的时间段(累积天数仅为21)。

第1/3/5/7/9组显示出在短的时间段(累积天数2-5)的非常低的累积分数(0.2-0.5)而不显著延迟疾病症状并且同时保护每组中至少60％的群体。

其他组给出了在商业疫苗和第1/3/5/7/9组之间的中间分数，但没有诱导保护大于50％的群体。

Claims (11)

1.制备用于对禽类病毒性疾病进行局部施药治疗的疫苗组合物的方法，至少包括步骤：

a)即时混合包含至少一种选自属于所述禽类疾病的一种或多种毒株的病毒的活病毒的疫苗和佐剂稀释剂(AD)，其特征在于所述佐剂稀释剂是水包油连续水性相乳剂或水包油微乳剂。

2.如前述权利要求所述的方法，其特征在于所述疫苗中含有的所述病毒属于IBV(感染性支气管炎病毒)的一种或多种毒株。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述疫苗中含有的所述病毒是新城病病毒。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于在所述疫苗中含有的所述病毒属于IBV(感染性支气管炎病毒)的一种或多种毒株、新城病病毒，或这些病毒的混合物。

5.如前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于佐剂稀释剂(AD)包含油性佐剂、水性相、至少一种二价无机盐和至少一种络合剂。

6.如前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于在所述活疫苗中含有的病毒在步骤a)之前被冻干。

7.如前述权利要求中的一项所述的方法，其特征在于，所述佐剂稀释剂是水包油乳剂，对于其重量的100％，其包含：

-从50％至97％的水，更特别地从70％至97％的水，以及甚至更特别地从80％至97％的水；

-从1％至45％的油性佐剂，更特别地从1％至30％的油性佐剂，以及甚至更特别地从2％至10％的油性佐剂；

-从0.1％至10％的至少一种二价无机盐，更特别地从0.1％至8％，以及甚至更特别地从0.2％至3％；

-从0.1％至10％的至少一种络合剂，更特别地从0.1％至8％，以及甚至更特别地从0.2％至3％。

8.根据权利要求1-6中的一项所述的方法，其特征在于，所述佐剂稀释剂是水包油微乳剂，对于其重量的100％，其包含：

-从50％至97％的水，更特别地从70％至97％的水，以及甚至更特别地从80％至97％的水；

-从1％至45％的油性佐剂，更特别地从1％至30％的油性佐剂，以及甚至更特别地从2％至10％的油性佐剂；

-从0.1％至10％的至少一种二价无机盐，更特别地从0.1％至8％，以及甚至更特别地从0.2％至3％；

-从0.1％至10％的至少一种络合剂，更特别地从0.1％至8％，以及甚至更特别地从0.2％至3％。

9.根据权利要求5-8中的一项所述的方法，其特征在于，所述油性佐剂对于其重量的100％，包含：

-从40％至95％的至少一种矿物油，更特别地从50％至95％的至少一种矿物油，以及甚至更特别地从50％至90％的至少一种矿物油；

-从5％至60％的至少一种表面活性剂，更特别地从5％至50％的至少一种表面活性剂，以及甚至更特别地从10％至50％的至少一种表面活性剂。

10.根据权利要求5-9中的一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种二价无机盐选自葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、天冬氨酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸铁和氯化钙。

11.根据权利要求5-10中的一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种络合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾和聚丙烯酸钠。