CN104147599A - 一种疫苗佐剂、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水包油型疫苗佐剂、其制备及应用。所述的水包油型纳米乳疫苗佐剂,按照质量百分比包括0.1%~10%的油相、0.1%~10%的乳化剂、0.1%~3%的稳定剂、0.1%~3%的络合剂以及0.01%~10%的免疫增强剂。其制备方法包括以下步骤:(1)将免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中,获得水相;(2)将油相和乳化剂混合,获得油相;(3)将油相缓慢加入到水相中并持续搅拌,形成稳定的乳液;(4)调节乳液的pH值并定容得到初乳;(5)将初乳进行高速剪切和高压均质。本发明提供的疫苗佐剂,制备简单,使用方便,副反应小,用于稀释疫苗,尤其是猪瘟活疫苗,稳定性高,免疫效果好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种疫苗佐剂、其制备方法及应用。
背景技术
佐剂是指加入疫苗制剂后能促进、增强或延长机体对抗原特异性免疫应答的物质。佐剂也是一种抗原辅助剂,与疫苗共同使用可以明显提高疫苗的免疫效果。佐剂被用来增强疫苗免疫作用已有80多年的历史。免疫佐剂可辅佐免疫原刺激机体产生较早、较强、持久的免疫应答,理想的免疫佐剂应该能满足以下条件:在有效剂量内无毒或毒性极小;能刺激机体产生强大的体液免疫和/或细胞免疫应答;具有持久的免疫力;不诱导自身免疫;无致突变、致癌、致畸形作用等。
虽然现在已有许多佐剂应用于动物,但还没有哪一种佐剂能完全满足以上要求。猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种死亡率极高的急性败血性、接触性传染病,具有流行广泛、发病率高等特点,对养猪业危害极大。世界动物卫生组织将猪瘟列为A类16种法定传染病之一,我国也将猪瘟定为一类烈性传染病,属于危害严重、需要采取紧急严厉的强制预防、控制和扑灭的动物疫病之一。
预防猪瘟最有效的方法就是接种猪瘟疫苗。尽管猪瘟兔化弱毒苗的广泛应用及其它综合防治措施的实施,已控制了猪瘟的大规模流行,但近年来,猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势。目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种:乳兔苗、细胞苗和淋脾苗,这三种均为活疫苗,在临 床使用上有一定的功效,但是,疫苗的免疫成功率不高,除了疫苗质量、免疫程序、接种部位等因素以外,机体免疫功能低下以及免疫刺激不够是一个重要因素,某些病原感染导致机体的免疫功能低下或者免疫抑制。而且部分疫苗,尤其是一些油佐剂疫苗接种后免疫应激反应很大,使用一些低免疫应激反应佐剂是发展趋势。已有研究发现,免疫增强剂在猪瘟疫苗使用中能提高猪免疫力,对猪瘟疫苗的抗体水平有不同程度的影响。但是,目前尚无性能稳定的猪瘟活疫苗佐剂上市。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种疫苗佐剂、其制备方法及应用,其目的在于通过添加免疫增强剂,使水包油型纳米乳疫苗佐剂增强疫苗本身的细胞及体液免疫刺激能力,尤其是该疫苗佐剂还可能同时含有适用于提高猪瘟活疫苗效力的其他水性佐剂成分,进一步提高活疫苗的攻毒保护效力,解决目前疫苗刺激不够的技术问题。
为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种疫苗佐剂,其特征在于,所述疫苗佐剂为pH值在4.0至9.0之间的水包油型纳米乳,优选pH值在7.5至9.0之间的水包油型纳米乳,按照质量百分比包括0.1%~10%的油相、0.1%~10%的乳化剂、0.1%~3%的稳定剂、0.1%~3%的络合剂以及0.01%~10%的免疫增强剂。
优选地,所述疫苗佐剂,其所述水包油型纳米乳其平均粒径在10nm~2000nm之间,优选在50nm~500nm之间。
优选地,所述疫苗佐剂,其免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类;所述的多肽优选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽;所述多糖优选为黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖;所述黄酮类优选为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、 白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮;
所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。
优选地,所述疫苗佐剂,其乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间,优选在1:1至1.5:1之间。
优选地,所述疫苗佐剂,其亲油性表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间;
所述亲油性表面活性剂优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二缩甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油酸甘油酯和单油酸缩山梨醇酯中的一种或多种;所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80或司盘85;
所述亲油性表面活性剂更优选为司盘80或二缩甘露醇单油酸酯。
优选地,所述疫苗佐剂,其亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间;
所述亲水性表面活性剂优选为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或多种;所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯,优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物,优选为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407;
所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆407。
优选地,所述疫苗佐剂,其稳定剂为可溶性的二价无机盐,所述二价无机盐的阳离子为锰离子、钙离子、锌离子或亚铁离子,所述二价无机盐的阴离子为葡萄糖酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子或氯离子。
优选地,所述疫苗佐剂,其络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠, 优选乙二胺四乙酸。
优选地,所述疫苗佐剂,其油相为精加工烃类矿物油,优选为美孚白矿油Marcol52、美孚白矿油Marcol82、白矿油Drakeol5或白矿油Drakeol6;优选为美孚白矿油Marcol52或白矿油Drakeol5。
优选地,所述的疫苗佐剂,还可以进一步包括一些添加剂,如抗氧化剂(二丁基羟基甲苯、维生素E、茶多酚等)、防腐剂(羟苯乙酯、苯甲酸钠等)。所述添加剂占纳米乳佐剂总重量的0%~0.5%
按照本发明的另一方面,提供了一种所述的疫苗佐剂的制备方法
包括以下步骤:
(1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中,获得水相;
(2)将配方比例的油相和乳化剂混合,获得含乳化剂的油相;
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌,使得形成稳定的乳液;
(4)调节步骤(3)中获得的乳液的pH值并定容得到初乳;
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。
优选地,所述的制备方法,其步骤(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中持续搅拌为磁力搅拌10min~40min。
优选地,所述的制备方法,其步骤(5)所述高速剪切速率为8000~15000rpm,剪切时间为1~7min;所述高压均质压力为600~2000bar,循环次数为1~9次,优选800~1600bar压力条件下匀质3~5个循环。
本发明提供的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗的稀释,有助于发挥免疫作用。
在5至6周的SPF级的Balb/c小鼠上对所述的纳米疫苗佐剂进行了安 全性评价,结果发现,免疫之后无一只死亡,同样也未观察到明显的全身和局部反应,充分证明本发明的纳米疫苗佐剂是安全、可靠的。所述的纳米疫苗佐剂跟猪瘟活疫苗混合后免疫小鼠后,检测到CSFV抗体,并能诱导小鼠的明显的细胞和体液免疫反应。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,由于采用含有免疫增强剂的水包油型纳米乳,可与疫苗的混合使用,与现有的生理盐水稀释疫苗技术相比,能够取得以下有益效果:
1.本发明的纳米疫苗佐剂,可以显著增强疫苗的细胞及体液免疫刺激能力,提高活疫苗的攻毒保护效力。以猪瘟疫苗为例,目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种:乳兔苗、细胞苗和淋脾苗,并且这三种均为活疫苗,在临床使用上也显示出明显的功效。然而,仍不能达到令人满意的完全保护的效果。采用本发明提供的疫苗佐剂,能明显提高免疫应答效果。
2.本发明提供的纳米疫苗佐剂稀释猪瘟活疫苗疫苗的效果,相较于单独使用生理盐水等稀释猪瘟活疫苗对小鼠的免疫作用更明显,增强了疫苗的效价,节约了成本。
3.本发明的纳米疫苗佐剂制备方法,工艺简单,成本低,得到的剂型稳定。制备的水包油型纳米乳剂,稳定期长,易储存,免疫效果好,保护期延长,易于注射,副反应很小。
附图说明
图1是实施例10皮下注射该佐剂稀释剂后小鼠的体重变化;
图2是实施例11免疫后血清中ELISA抗体动态变化;
图3是实施例11的IL-4标准曲线;
图4是实施例11接种疫苗后小鼠血清中IL-4水平;
图5是实施例11的IL-6标准曲线;
图6是实施例11接种疫苗后小鼠血清中IL-6水平;
图7是实施例11的IFN-r标准曲线;
图8是实施例11接种疫苗后小鼠血清中IFN-r水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的疫苗佐剂,为pH至在4.0至9.0之间的水包油型纳米乳,优选pH值在7.5至9.0之间的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括0.1%~10%的油相、0.1%~10%的乳化剂、0.1%~3%的稳定剂、0.1%~3%的络合剂以及0.01%~10%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径在10nm~2000nm之间,优选在50nm~500nm之间;多分散指数PDI≤0.50。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类;所述的多肽优选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽;所述多糖优选为黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖;所述黄酮类优选为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮;所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间,优选在1:1至1.5:1之间。所述亲油性表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间,优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二缩甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油酸甘油酯和单油酸缩山梨醇酯中的一种或多种;所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80或司盘85。所述亲油性表面活性剂更优选 为司盘80或二缩甘露醇单油酸酯。所述亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间,优选为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或多种;所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯,优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物,优选为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407。所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆407。
所述稳定剂为可溶性的二价无机盐,所述二价无机盐的阳离子为锰离子、钙离子、锌离子或亚铁离子,所述二价无机盐的阴离子为葡萄糖酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子或氯离子。所述稳定剂优选为葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、磷酸钙、葡萄糖酸铁和氯化钙,优选葡萄糖酸锰或葡萄糖酸钙。
所述络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠,优选乙二胺四乙酸。
所述油相为精加工烃类矿物油,通过蒸馏油以及通过实施后续加工步骤而获得的烃类矿物油,后续加工步骤例如脱硫作用、脱沥青作用、芳香化合物提取以及蜡提取步骤以及其他精加工步骤,优选为美孚白矿油Marcol52、美孚白矿油Marcol82、白矿油Drakeol5或白矿油Drakeol6;优选为美孚白矿油Marcol52或白矿油Drakeol5。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中,获得水相。
(2)将油相和乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌,优选磁力搅拌10min~40min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液的pH值并定容得到初乳。优选使用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为8000~15000rpm,剪切时间为1~7min;高压均质压力为600~2000bar,循环次数为1~9次,优选800~1600bar压力条件下匀质3~5个循环。微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
本发明提供的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗稀释。目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种:乳兔苗、细胞苗和淋脾苗,并且这三种均为活疫苗,在临床使用上也显示出明显的功效。然而,仍不能达到令人满意的完全保护的效果。用本发明的佐剂稀释所述三种,可以显著增强疫苗的细胞及体液免疫刺激能力,提高活疫苗的攻毒保护效力,减少疫苗用量,从而降低成本。
以下为实施例:
实施例1
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为8.0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括5%的油相、5%的乳化剂、1%的稳定剂、3%的络合剂以及0.5%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为108.4±17.6nm;多分散指数PDI为0.174。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1.5:1。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇油酸酯,其亲水亲油平衡值为4.3。所述亲水性表面活性剂为吐温80,其亲水亲油平衡值为15。
所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
所述络合剂为乙二胺四乙酸。
所述油相为美孚白矿油Marcol52。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将0.5%的免疫增强剂、1%的稳定剂和3%的络合剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将5%的油相和5%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为10000rpm,剪切时间为3min;高压均质压力为1000bar,循环次数为3次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例2
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为8.5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括10%的油相、10%的乳化剂、2%的稳定剂、2%的络合剂以及1%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为745.2±20.8nm;多分散指数PDI为0.207。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的香菇多糖。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为2:1。所述亲油性表面活性剂为聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物。其亲水亲油平衡值为3.0。所述亲水性表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油,其亲水亲油平衡值为13.3。
所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
所述络合剂为乙二胺四乙酸。
所述油相为美孚白矿油Marcol52。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将1%的免疫增强剂、2%的稳定剂以及2%的络合剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将10%的油相、10%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌30min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.5之间并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为15000rpm,剪切时间为3min;高压均质压力为1200bar,循环次数为3次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例3
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为4.0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括0.5%的油相、1%的乳化剂、0.5%的稳定剂、2%的络合剂以及0.01%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为55.9±13.1nm;多分散指数PDI为0.108。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的大豆黄酮。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1:1。所述亲油性表面活性剂为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯,其亲水亲油平衡值为8.0。所述亲水性表面活性剂为聚氧乙烯月桂醇醚,其亲水亲油平衡值为9.5。
所述稳定剂为葡萄糖酸钙。
所述络合剂为乙二胺四乙酸。
所述油相为美孚白矿油Marcol52。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将0.01%的免疫增强剂、0.5%的稳定剂以及2%的络合剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将0.5%的油相和1%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌40min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至4.0并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为8000rpm,剪切时间为7min;高压均质压力为1600bar,循环次数为5次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例4
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为7.5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括0.1%的油相、0.1%的乳化剂、0.1%的稳定剂、0.2%的络合剂以及0.05%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为108.3±27.5nm;多分散指数PDI为0.133。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的淫羊藿黄酮。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1.5:1。所述亲油性表面活性剂为单硬脂酸甘油酯,其亲水亲油平衡值为5.5。所述亲水性表面活性剂为吐温85,其亲水亲油平衡值为11。
所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
所述络合剂为聚丙烯酸钠。
所述油相为白矿油Drakeol5。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将0.1%的稳定剂、0.2%的络合剂以及0.05%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将0.1%的油相和0.1%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌10min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.5并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为10000rpm,剪切时间为3min;高压均质压力为2000bar,循环次数为9次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例5
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为8.0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括5%的油相、5%的乳化剂、1%的稳定剂、3%的络合剂以及1%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为200.4±17.7nm;多分散指数PDI为0.104。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的黄芪多糖。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1.5:1。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇单油酸酯,其亲水亲油平衡值为4.3。所述亲水性表面活性剂为吐温80,其亲水亲油平衡值为15。
所述稳定剂为葡萄糖酸锰。
所述络合剂为乙二胺四乙酸。
所述油相为美孚白矿油Marcol52。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将1%的稳定剂、3%的络合剂以及1%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将5%的油相和5%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.0并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为12000rpm,剪切时间为5min;高压均质压力为1000bar,循环次数为4次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例6
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为9.0的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括2%的油相、7.5%的乳化剂、1%的稳定剂、3%的络合剂以及10%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为502.3±20.1nm;多分散指数PDI为0.237。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的枸杞多糖。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1.25:1。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇单油酸酯,其亲水亲油平衡值为4.3。所述亲水性表面活性剂为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯,其亲水亲油平衡值为8.0。
所述稳定剂为葡萄糖酸钙。
所述络合剂为乙二胺四乙酸。
所述油相为白矿油Drakeol5。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将1%的稳定剂、3%的络合剂以及10%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将2%的油相和7.5%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至9.0并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为10000rpm,剪切时间为3min;高压均质压力为800bar,循环次数为7次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例7
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为7.5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括3%的油相、2%的乳化剂、0.5%的稳定剂、0.1%的络合剂以及0.1%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为1069.7±53.2nm;多分散指数PDI为0.324。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的沙棘黄酮。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1:1。所述亲油性表面活性剂为司盘80,其亲水亲油平衡值为4.3。所述亲水性表面活性剂为泊洛沙姆407,其亲水亲油平衡值为15。
所述稳定剂为葡萄糖酸锌。
所述络合剂为聚丙烯酸钠。
所述油相为美孚白矿油Marcol52。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将0.5%的稳定剂、0.1%的络合剂以及0.1%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将3%的油相和2%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.5并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为8000rpm,剪切时间为1min;高压均质压力为600bar,循环次数为1次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例8
本发明提供的疫苗佐剂,为pH为8.5的水包油型纳米乳。所述疫苗佐剂,按照质量百分比包括7.5%的油相、3%的乳化剂、3%的稳定剂、3%的络合剂以及0.1%的免疫增强剂,余量为水。所述水包油型纳米乳其平均粒径为1832.2±40.4nm;多分散指数PDI为0.250。
所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的赛弗诺多肽,购于武汉光谷世傲生物科技有限公司。
所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例为1:2。所述亲油性表面活性剂为二缩甘露醇单油酸酯,其亲水亲油平衡值为4.3。所述亲水性表面活性剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油,其亲水亲油平衡值为15。
所述稳定剂为氯化钙。
所述络合剂为乙二胺四乙酸。
所述油相为美孚白矿油Marcol52。
本发明提供的疫苗佐剂,其制备方法,包括以下步骤:
(1)将3%的稳定剂、3%的络合剂以及0.1%的免疫增强剂均匀分散于30ml水中,获得水相。
(2)将7.5%的油相和3%的乳化剂混合,获得含乳化剂的油相。
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续磁力搅拌20min,使得形成稳定的乳液。
(4)调节步骤(3)中获得的乳液用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至8.5并定容得到初乳。
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。高速剪切速率为10000rpm,剪切时间为3min;高压均质压力为600bar,循环次数为3次;微孔滤膜为0.22μm的微孔滤膜。
按照本方法制得的疫苗佐剂,宜充氮灌装,可室温下放置。
实施例9
纳米疫苗佐剂稳定性参数Ke的测定
稳定性常数的计算公式如下:Ke=(A0-A)/A0×100%(0<Ke<1)。式中A0为乳剂的稀释液在设定波长处测得的吸光度;A为经离心后离心管底部乳剂的稀释液在同一波长处测得的吸光度。稳定性常数Ke越小,说明乳剂在离心前后变化越小,乳剂越稳定。
取乳剂5mL置于10mL离心试管中,4000r·min-1,离心15min,用微量进样器精密量取试管底部样品50μL置10mL刻度试管中,用超纯水稀释至刻度,摇匀,以超纯水为空白,在可见区波长500nm处测定吸光度。同法将未离心的乳剂用微量进样器精密量取试管底部样品50μL置10mL刻度试管中,同法测定,计算Ke。
样品 | 稳定性参数Ke |
实施例1 | 0.24 |
实施例2 | 0.32 |
实施例3 | 0.43 |
实施例4 | 0.26 |
实施例5 | 0.19 |
实施例6 | 0.65 |
实施例7 | 0.47 |
实施例8 | 0.16 |
实施例10
纳米疫苗佐剂的安全性检验
1.方法
试验动物:Balb/c小鼠,18~22g,SPF级,由中国医学科学院动物实验研究所提供。
体重为18~22g的SPF级的Balb/c小鼠雌雄各10只分为两组,选择实施例5制备的纳米疫苗佐剂,分别在皮下注射纳米疫苗佐剂0.2ml/只,生理盐水0.2ml/只,连续观察两周。是否出现由佐剂引起的死亡或者明显的局部和全身不良反应。检查注射部位有无异常。
2.实验结果
体重为18~22g的SPF级的Balb/c小鼠雌雄各10只分为两组,选择实施例5制备的纳米疫苗佐剂,分别在皮下注射纳米疫苗佐剂0.2ml/只,生理盐水0.2ml/只,连续观察两周。每隔一天称量小鼠的体重,其体重随时间的变化如图1所示,与对照组相比较没有较大的差异。也没有出现由佐剂引起的死亡或者明显的局部和全身不良反应。两周后解剖小鼠,检查注射其 部位,以及其心、肝、脾、肺、肾均正常,没有中毒症状。
实施例11
使用纳米疫苗佐剂与猪瘟活疫苗的免疫原性评价
1.材料与方法
市售猪瘟疫苗购自福州大北农生物科技有限公司(批号:2013012-02)。试验动物:Balb/c小鼠,18~22g,SPF级,由中国医学科学院动物实验研究所提供。选择实施例5制备的纳米疫苗佐剂。主要仪器:超净工作台,购自苏净集团安泰公司;TGL-20M高速离心机,购自长沙平凡仪器有限公司;Heal Force SMART-N型超纯水制备系统,购自香港力康生物医疗科技公司;Sartorius Bsl24s型电子分析天平,购自德国sartorius公司;318C-Microplate Reader型酶标仪,购自上海三科仪器有限公司。主要试剂:CSFV ELISA抗体检测试剂盒购自IDEXX公司,小鼠细胞因子白介素4、6(IL-4、6)试剂盒.小鼠干扰素r(IFN-r)试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司;其余试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1动物分组及免疫
将体重为18~22g的Balb/c小鼠72只分为4组,每组18只,雌雄各半。选择实施例5制备的纳米疫苗佐剂,各组按照表3进行免疫,通过体重换算,每份用0.5ml佐剂或者生理盐水稀释,免疫途径均采用肌肉注射免疫,两周后用同样剂量进行第二次免疫。
表3试验小鼠分组及免疫情况
组别 | 免疫种类 | 剂量 |
I | 佐剂+疫苗 | 0.2ml/只 |
II | 生理盐水+疫苗 | 0.2ml/只 |
III | 佐剂 | 0.2ml/只 |
IV | 生理盐水 | 0.2ml/只 |
1.2.2抗体水平的测定
分别于免疫后0、1、2、3、4、5、6周,每组随机抽取3只小鼠断尾采血,分离血清,56℃水浴30min灭活补体。按照CSFV ELISA抗体检测试剂盒使用说明书进行操作,应用阻断ELISA方法检测小鼠血清中抗CSFV的抗体。如果被检样品中存在猪瘟病毒抗体,它们就会阻断辣根过氧化物酶标记(HRPO)的抗猪瘟病毒的单克隆抗体。单克隆抗体与猪瘟病毒抗原的结合可以通过辣根过氧化物酶与底物的显色程度进行判定,即用酶标仪在单波长450nm或双波长450nm与650nm测定该反应体系的吸光度。当被检样品中含有猪瘟病毒抗体(阳性结果)时,显色就会变浅,当被检样品中不含有抗猪瘟病毒抗体(阴性结果)时,显色就会变深。样本的阻断率可以通过450nm波长样本吸光度与阴性对照吸光度的比值来确定。
1.2.3细胞因子IL-4、IL-6和IFN-γ的测定
分别于免疫后0、1、2、3、4、5、6周,每组随机抽取3只小鼠断尾采血,分离血清,按照IL-4、IL-6和IFN-γELISA诊断试剂盒使用说明书进行操作,检测小鼠血清中IL-4、IL-6和IFN-γ的含量。以测定标准品的OD值为纵坐标,标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。查出浓度再乘以样品稀释倍数即得出IL-4、IL-6和IFN-γ的具体含量。
1.2.4统计学方法
用SPSS11.5及Excel统计软件将所得数据进行统计学处理,计算其平均值,数据以Means±SD表示。
2.实验结果及分析
2.1免疫后抗体水平的测定
分别于免疫后0、1、2、3、4、5、6周,每组随机抽取3只小鼠断尾采血,分离血清,56℃水浴30min灭活补体。按照猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒使用说明书进行操作,应用阻断ELISA方法检测小鼠血清中抗CSFV的抗体,通过阻断率来反应免疫前后的抗体水平变化。比较不同 试验组产生抗体水平,结果显示佐剂疫苗组能够诱导机体产生很好的体液免疫应答。
分别对每周收集的血清进行ELISA抗体水平的测定,对各组所测数据进行统计分析,得到的抗体消长曲线如图2。经统计分析表明,免疫前各组之间的抗体水平无明显的差异(P>0.05),免疫后各疫苗组均能刺激机体产生CSFV抗体,首次免疫后第1周,生理盐水疫苗组抗体水平迅速升高,高于其他各组;首次免疫后第2周,佐剂疫苗组抗体水平缓慢升高,而生理盐水疫苗组略有下降趋势,其他各组变化不明显;在二免后第2周,各疫苗组均达到抗体高峰,且与生理盐水对照组差异显著(p<0.05),随后呈下降趋势,但下降趋势较其他各组缓慢,抗体水平持续较长的时间。从抗体水平的高峰值来看,结果为佐剂疫苗组>生理盐水疫苗组>佐剂组>生理盐水组。说明佐剂疫苗组能够诱导机体产生很好的体液免疫应答。
2.2免疫小鼠血清中细胞因子水平的测定
IL-4、IL-6和IFN-γ是重要的免疫调节因子,具有多种生物学活性。白介素4(IL-4)是一种多功能细胞因子,主要是由激活的T淋巴细胞、肥大细胞与骨髓基质细胞表达。IL-4可以对多种细胞起到调节免疫反应功能的作用。白细胞介素4参与多种B-细胞等此类细胞的激活过程,是DNA合成的协同刺激分子,它能诱导静息B细胞上II型MHC(主要组织相容复合体)分子的表达。能增强IgE与IgG1的分泌以及在细胞表面的表达,还可以调节淋巴细胞和单核细胞上对IgE低亲和Fc受体的表达。IL-4在抗体亚型转换中也起到重要的调节作用,是T辅助前体细胞向Th2细胞分化的重要调节因子,从而间接调节体液免疫以及抗体的生成。
白细胞介素-6为活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子。能使B细胞前体成为产生抗体的细胞;和集落刺激因子协同,能促进原始骨髓源细胞的生长和分化,增强自然杀伤细胞的裂解功能。IL-6是一种多效应细胞因子,主要以自分泌或旁分泌方式发挥效应,在免疫应答、急性期反应、造血调节 中发挥重要作用,它可激活靶基因,不仅可作为造血源细胞、B细胞、T细胞、破骨细胞、内皮细胞等的分化和生长因子,而且对外周和中枢神经系统的神经细胞的生长、分化、再生和降解起到了非常重要的作用。
IFN-γ主要由活化的T细胞和NK细胞产生,其生物学功能主要是免疫调节,诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子,活化单核、巨噬细胞并增强起溶菌活性及分泌IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-a等。IFN-γ还能活化中性粒细胞、NK细胞,刺激血管内皮细胞和白细胞合成的粘附分子,促进Th1细胞发育和抑制Th2细胞活化与增殖,刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变,调节巨噬细胞、T细胞、B细胞之间的关系,增强免疫应答能力。
为检测不同的佐剂疫苗的免疫是否影响细胞因子的分泌水平,测量免疫小鼠血清中的IL-4、IL-6和IFN-γ的质量浓度,根据试剂盒说明书,按照特定的软件“Curve Expert1.3”绘制出标准曲线并求得细胞因子的具体含量。
按照试剂盒的说明书,进行标准曲线测定的操作,软件“Curve Expert1.3”会产生一系列拟合曲线,根据拟合的曲线选取ELISA拟合度最佳的曲线(相关关系r值越接近1,拟合度越好)。
2.2.1细胞因子IL-4水平的测定
由图3可知,该标准曲线相关系数r值为0.9998。图4为免疫后各组小鼠血清中白介素4的动态变化,分析该图可以看出,在首次免疫后第一周,添加疫苗组的白介素4的水平均有所升高,与对照组差异显著;在二免后第二周,添加疫苗组的白介素4的水平达到峰值,其中佐剂+疫苗组升高较快,与对照组差异显著;二免后第5至6周,各组白介素4的水平逐渐趋于平缓,与免疫刺激有关。
2.2.2细胞因子IL-6水平的测定
由图5可知,该标准曲线相关系数r值为0.9999。图6为免疫后各组小鼠血清中白介素6的动态变化,分析该图可以看出,在首次免疫后第一周,添 加疫苗组的白介素6的水平均有所升高,与对照组差异显著;在二免后,添加疫苗组的白介素6的水平迅速升高,并逐渐达到峰值,其中佐剂+疫苗组升高较快,与对照组差异显著。
2.2.3细胞因子IFN-γ水平的测定
由图7可知,该标准曲线相关系数r值为0.9997。图8为免疫后各组小鼠血清中IFN-γ的动态变化,分析该图可以看出,在首次免疫后第2周,添加疫苗组的IFN-γ的水平均有所升高,与对照组差异显著;在二免后,添加疫苗组的IFN-γ的水平明显的升高,逐渐达到峰值,其中佐剂+疫苗组升高较快,与对照组差异显著。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种疫苗佐剂,其特征在于,所述疫苗佐剂为pH值在4.0至9.0之间的水包油型纳米乳,优选pH值在7.5至9.0之间的水包油型纳米乳,按照质量百分比包括0.1%~10%的油相、0.1%~10%的乳化剂、0.1%~3%的稳定剂、0.1%~3%的络合剂以及0.01%~10%的免疫增强剂。
2.如权利要求1所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述水包油型纳米乳,平均粒径在10nm~2000nm之间,优选在50nm~500nm之间。
3.如权利要求1所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述免疫增强剂为具有免疫增强作用的蜂胶、多肽、多糖或黄酮类;所述的多肽优选为白蛋白多肽、扇贝多肽和/或赛弗诺多肽;所述多糖优选为黄芪多糖、人参多糖、香菇多糖、锦灯笼多糖、灵芝菌丝体多糖、板蓝根多糖、枸杞多糖、当归多糖、灵芝多糖、红景天多糖、大枣多糖和/或壳聚糖;所述黄酮类优选为淫羊藿黄酮、金橘黄酮、白花蛇舌草黄酮、大豆黄酮和沙棘黄酮;
所述免疫增强剂更优选为黄芪多糖。
4.如权利要求1所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述乳化剂包括亲水性表面活性剂和亲油性表面活性剂,所述亲水性表面活性剂与亲油性表面活性剂的质量比例在1:2至2:1之间,优选在1:1至1.5:1之间。
5.如权利要求4所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述亲油性表面活性剂其亲水亲油平衡值在3至8之间;
所述亲油性表面活性剂优选为脱水山梨醇脂肪酸酯、卵磷脂、甘露醇油酸酯、二缩甘露醇油酸酯、聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、单油酸甘油酯和单油酸缩山梨醇酯中的一种或多种;所述脱水山梨醇脂肪酸酯优选为司盘20、司盘40、司盘60、司盘80或司盘85;
所述亲油性表面活性剂更优选为司盘80或二缩甘露醇单油酸酯。
6.如权利要求4所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述亲水性表面活性剂其亲水亲油平衡值在8至15之间;
所述亲水性表面活性剂优选为聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯月桂醇醇醚和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或多种;所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯,优选为吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或吐温85;所述聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物,优选为泊洛沙姆124、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407;
所述亲水性表面活性剂更优选为吐温80、吐温85、聚氧乙烯氢化蓖麻油或泊洛沙姆407。
7.如权利要求1所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述稳定剂为可溶性的二价无机盐,所述二价无机盐的阳离子为锰离子、钙离子、锌离子或亚铁离子,所述二价无机盐的阴离子为葡萄糖酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子或氯离子。
8.如权利要求1所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述络合剂为乙二胺四乙酸和/或聚丙烯酸钠,优选乙二胺四乙酸。
9.如权利要求1所述的疫苗佐剂,其特征在于,所述油相为精加工烃类矿物油,优选为美孚白矿油Marcol52、美孚白矿油Marcol82、白矿油Drakeol5或白矿油Drakeol6;优选为美孚白矿油Marcol52或白矿油Drakeol5。
10.如权利要求1至9任意一项所述的疫苗佐剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将配方比例的免疫增强剂、稳定剂和络合剂均匀分散于水中,获得水相;
(2)将配方比例的油相和乳化剂混合,获得含乳化剂的油相;
(3)将含乳化剂的油相缓慢加入到水相中并持续搅拌,使得形成稳定的乳液;
(4)调节步骤(3)中获得的乳液的pH值并定容得到初乳;
(5)将步骤(4)中获得的初乳进行高速剪切和高压均质,通过微孔滤膜过滤除菌,获得无菌纳米乳即为所述疫苗佐剂。
11.如权利要求1至9所述的疫苗佐剂应用于猪瘟活疫苗稀释。
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