CN104873970A - 鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂，包括下列质量份的原料组成，卡波姆934P 0.05-3、羟丙甲基纤维素0.15-4、黄芪多糖1-55、壳聚糖0.5-30、泊洛沙姆0.9-35。本发明的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂的制备方法是：按上述质量份分别取卡波姆、羟丙甲基纤维素4、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆，常温下将其搅拌混匀后，常温下储存即可。本发明增效助悬剂的使用方法是首先将按本发明制备的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂1份投放到25份清水中，搅拌5-10分钟，稀释成助悬液，然后把每一羽份球虫活疫苗加入6ml助悬液中搅拌混匀，让鸡自由饮用。本发明的助悬剂悬浮效果持久，免疫效果高效、可缩短免疫产生期，达到免疫前无须停水、免疫剂量均匀且免疫产生期短的效果。

Description

鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫苗助悬剂，具体涉及一种用于饮水免疫的鸡球虫病活卵囊疫苗免疫增效助悬剂。

背景技术

鸡球虫病（coccidiosis）是由九种艾美耳属球虫中的一种或多种寄生于肠道上皮细胞内所引起的一种原虫病，主要以下痢、肠道损伤或血便为特点。它是一种发生普遍且危害十分严重的疾病。几乎所有的养鸡场都有鸡球虫病的发生。集约化养鸡场则是球虫病暴发的最主要场所，其球虫病的发病率为50％～70％，死亡率为20％～30％，严重时更可高达80％。在所有鸡病中，球虫病的发病率最高，约占20%左右。即使耐过的病鸡也不能恢复到未感染前水平，生长发育严重受阻。成年鸡多半是带虫者，严重影响增重和产蛋率，给养鸡业带来巨大的经济损失。根据Allen报道，全世界每年仅球虫病造成的经济损失就达80多亿美元。目前，在养鸡业中，主要依靠药物来控制鸡球虫病的发生和扩散，但药物残留、鸡产生耐药性、家禽免疫力受抑制、研制费用高且成功率低等问题日益突出，迫使人们不得不寻求新的更有效方法来预防鸡球虫病。免疫预防是控制鸡球虫病的一种理想方法，国内外学者对球虫病的免疫进行了广泛而深入的研究，先后研制出多种有效的鸡球虫病疫苗。鸡球虫病疫苗的研制成功和在生产中的逐步推广使用，均取得的良好的效果，为鸡球虫病的防治开辟了一条新的有效途径。

目前鸡球虫病疫苗免疫接种的常用方法有：滴口、饮水及拌料法等。其中滴口属于单体免疫法，这种方法能保证每只鸡都可以得到均匀免疫，但费时费力，当鸡场鸡只数量特别大时，工作量也会随之增大，无形当中增加了生产成本，同时由于抓鸡动作，还会给鸡群带来应激刺激，对鸡群以后的生长发育产生无法估量的影响；饮水法和拌料法属于群体免疫法，其突出优点是省时省力，可以在短时间内完成对整个鸡群的全体免疫。由于球虫卵囊在干燥环境中很快死亡而不能拌入饲料中让鸡长时间采食，而饮水法免疫操作简单，对鸡群应激小，无疑是现阶段球虫的最佳免疫方法，但是球虫卵囊密度比水大时，将活疫苗加入水中，球虫卵囊会因为重力作用很快沉降到饮水器底部，造成免疫不均匀或漏免。导致未获得免疫的鸡在吃到大量子代卵囊时发病；或鸡只吞食剂量没达到免疫剂量，不能产生足够强的免疫保护力；或部分鸡免疫过量而致病。目前所用的鸡球虫病活疫苗多在免疫后14天（18日龄以上）才能产生免疫保护，而鸡只多在10日龄左右就易感染球虫，出现免疫空挡期。因此，在免疫时需要助悬剂和增效剂使虫苗均匀的悬浮于水中，延长鸡只饮水时间，使鸡快速获得均一有效的球虫免疫保护力。

基于上述原因，技术人员不断尝试利用各种助悬剂以及它们之间的协同作用进行配比，研制具有免疫高效、免疫产生期短、溶解方便迅速、受水温影响小的球虫疫苗增效助悬剂。球虫疫苗助悬剂的技术已有记载，例如，中国专利200510036004.6公开了一种球虫疫苗助悬剂及其加工工艺为下述原料及工艺制备而成：其组分含量（以助悬剂重量为100%计）羧甲基纤维素5%-20%，吹干粉0.5%-3%，其余为低聚糖，可使球虫卵囊悬浮于水中6h不沉降，但不具有增效和缩短免疫产生期的作用。因此，有待进一步研发免疫高效、缩短免疫产生期的鸡球虫病活卵囊疫苗免疫增效助悬剂。

发明内容

本发明的目的是克服已现有技术存在的不足，提供一种鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂，该助悬剂悬浮效果持久，免疫效果高效、可缩短免疫产生期，达到免疫前无须停水、免疫剂量均匀且免疫产生期短的效果。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂包括下列质量份的原料，卡波姆934P 0.05-3、羟丙甲基纤维素0.15-4、黄芪多糖1-55、壳聚糖0.5-30、泊洛沙姆0.9-35。

本发明的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂优选下列质量份的原料组成，卡波姆934P 0.1-1.5、羟丙甲基纤维素0. 5-1、黄芪多糖5-20、壳聚糖3-10、泊洛沙姆5-15。

本发明组分中的卡波姆934P是一种引湿性很强的白色松散粉末，其水溶液为酸性，粘度高，因此一般需用无机碱调节至中性。卡波姆934P溶液在pH6~11时有最大粘度。羟丙甲基纤维素溶于水，在乙醚、丙酮、无水乙醇中不溶，在冷水中溶胀成澄清或微浊的胶体溶液。水溶液具有表面活性，透明度高、性能稳定。黏度一般在5～200000mPa.s之间，其可形成高粘度的胶体或溶液，有增稠、乳化、保水、耐盐、耐酸等特性，且生理无害，在食品、医药等领域生产中得到广泛应用。黄芪多糖可以加快T、B细胞增殖分化，有研究显示黄芪多糖可明显增强刀豆蛋白激发的T淋巴细胞增殖反应，另有研究结果表明黄芪多糖与兔出血症灭活冻干苗合用，能迅速刺激体液免疫和细胞免疫，且可使抗体水平较长时间维持在较高水平。壳聚糖可通过刺激巨噬细胞分泌细胞因子增强机体免疫功能，从而增强T细胞活性，其对细胞免疫反应的增强能力尤为明显。此外，壳聚糖还有增加抗原递呈速度和黏膜佐剂的作用。泊洛沙姆为非离子型高分子表面活性剂，其表面活性与其结构有关，泊洛沙姆的HLB值为16，有较强的表面活性。泊洛沙姆常用浓度为待分散溶质质量的25%左右，在固体分散体中，泊洛沙姆可以提高药物的湿润性，从而提高内在溶解度，加快药物内在的溶出速率。

本发明的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂的制备方法是：按质量份分别取卡波姆934P 0.05-3、羟丙甲基纤维素0.15-4、黄芪多糖1-55、壳聚糖0.5-30、泊洛沙姆0.9-35，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀后，常温下储存即可。

使用方法：首先将按本发明制备的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂1份投放到25份清水中，搅拌5-10分钟，稀释成助悬液，然后把每一羽份球虫活疫苗加入6ml助悬液中搅拌混匀，让鸡自由饮用。

下面报告本发明鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂有益效果的试验：

1、本发明鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂悬浮卵囊效果试验

1.1试验方法

(1) 球虫卵囊液配制将柔嫩艾美耳球虫山西早熟株（PTsx）、堆型艾美耳球虫山西早熟株（PAsx）、毒害艾美耳球虫山西早熟株（PNsx）和巨型艾美耳球虫山西早熟株（PMsx）卵囊按1：1：1：1混合，用2.5%重铬酸钾溶液配制成50万/ml的球虫卵囊液。

(2) 鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂的制备按质量份分别取卡波姆934P 2、羟丙甲基纤维素2、黄芪多糖20、壳聚糖15、泊洛沙姆10，首先将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀后，加到1225份清水中，搅拌5-10分钟，制成免疫增效助悬液。

(3) 球虫卵囊混悬剂配制与测定

取(2)制备的增效助悬液9ml加入到10ml试管中，再取(1)制备的球虫卵囊液1ml加入试管，充分搅拌使球虫在试管内均匀分布，于0、1、2、4、6h用毛细管吸取试管顶部溶液，用血球计数板显微镜下计数，每个时间点重复计数3次取其平均值。

(4)统计方法及标准

球虫沉降率=（加入卵囊数-实测卵囊数）/加入卵囊数×100%；

根据中国药典（2010年版第二增补本）关于助悬剂悬浮效果的规定：3h内球虫沉降比例低于5%，即为合格，此基础上沉降比例越低助悬效果越好。

1.2 试验结果

鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂悬浮卵囊效果试验效果见表1。

 由表1可知，本发明的鸡球虫病疫苗增效助悬剂能使球虫在水中6小时沉降率保持在3.33%，表明本发明的增效助悬剂可使球虫病疫苗接种前无需停水，省时省力又减少应激，避免鸡群抢水现象；可延长饮水时间至6小时，使鸡只饮水量相对均匀，确保球虫免疫的均匀性，为球虫疫苗的推广提供了简便易行的方案。

2、本发明鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂免疫产生期试验

2.1试验方法

(1)试验虫株

早熟虫株：堆型艾美耳球虫山西早熟株（PAsx）批号：    201316        

强毒虫株：堆型艾美耳球虫山西株（Asx）批号：    201311        

(2) 雏鸡：SPF雏鸡200只，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供SPF种鸡蛋孵化而来。

 (3)球虫疫苗助悬剂配制(现有技术作对照)：取球苗助悬剂（佛山市正典生物技术有限公司生产）按1g加120ml水搅拌混匀。

(4)本发明鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂的配制：取卡波姆934P 0.6质量份，羟丙甲基纤维素2.5质量份，黄芪多糖6质量份，壳聚糖10质量份、泊洛沙姆4质量份搅拌混匀即可。

(5) 试验分组

将体重相近的 7日龄SPF雏鸡随机分为20组，每组10只鸡，分别记为一免球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₁₁ ～T₁₂、助悬液组T₁₃ ～T₁₄、攻毒对照组C₁₁～C₁₂ ，空白组C₁₀，二免球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₂₁～T₂₄、助悬液组T₂₅～T₂₈、攻毒对照组C₂₁～C₂₄和空白组C₂₀。

(6) 一次免疫后免疫产生期试验

本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₁₁ 和T₁₂、助悬液组T₁₃ 和T₁₄各组分别于7日龄，用新鲜早熟堆型艾美耳孢子化卵囊，剂量为12000个/组，加入到球虫疫苗增效助悬液和助悬液各40ml/组中混匀，饮水免疫4h。4h后换回原来的饮水，一免后第8、9天分别对球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₁₁ 和T₁₂、助悬液组T₁₃ 和T₁₄、攻毒对照组C₁₁和C₁₂组空腹称重后，灌胃攻20×10 ⁴个/只堆型艾美耳强毒株，攻毒后观察鸡的精神状态和血便情况（粪便记分），各组攻毒后第8 天空腹称重后剖杀，记录攻毒前和剖杀前体重、死亡率、十二指肠病变记分、粪便重量和OPG，计算相对增重率、病变记分减率、卵囊减少率。

(7) 二次免疫后免疫产生期试验

球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₂₁和T₂₄、助悬液组T₂₅和T₂₈各组分别于7日龄，用新鲜早熟堆型艾美耳孢子化卵囊，剂量为12000个/组，加入到球虫疫苗增效助悬液和助悬液40ml/组中饮水免疫4h。4h后换回原来的饮水，一免后第10天进行二免，球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₂₁和T₂₄、助悬液组T₂₅和T₂₈各组分别用早熟卵囊，剂量为9000个/组，加入到球虫疫苗增效助悬液和助悬液240ml/组中饮水免疫4h。4h后换回原来的饮水，二免后第5、6、7、14天分别对球虫疫苗免疫增效助悬剂组T₂₁和T₂₄、助悬液组T₂₅和T₂₈、攻毒对照组C₂₁和C₂₄组空腹称重后，灌胃攻20×10 ⁴个/只堆型艾美耳强毒株，攻毒后观察鸡的精神状态和血便情况（粪便记分），各组攻毒后第8 天空腹称重后剖杀，记录攻毒前和剖杀前体重、死亡率、十二指肠病变记分、粪便重量和OPG，计算相对增重率、病变记分减率、卵囊减少率。

(8) 检测指标与方法

A  OPG

称取2g鸡粪，溶于20mL水中制成10倍的稀释液，经充分搅拌均匀后，用血球记数板进行计数，计算1g粪便中卵囊数（OPG）。

B死亡率

死亡率=组内死亡鸡数／组内总鸡数×100％

C增重情况

平均增重=（末重－初重）×100％

相对增重率=感染组鸡平均增重／空白组鸡平均增重×100％

D 十二指肠病变记分

参照Johnson和Reid分法进行十二指肠病变记分。

E  RLS（病变记分降低率）

RLS＝（不免疫攻毒组的平均病变记分－免疫攻毒组的平均病变记分）/不免疫攻毒组的平均病变记分×100％

按Martin等标准计算病变记分降低率，降低率≥70%时判为有保护力。

F 卵囊抑制率

卵囊抑制率＝（不免疫攻毒组卵囊平均产量－免疫攻毒组卵囊平均产量）/不免疫攻毒组卵囊平均产量×100％

按McDonald等的标准计算卵囊抑制率，抑制率≥75%时判为有保护力。

(9) 免疫效果判定标准：将十二指肠病变记分≤1、病变记分减少率≥70%；死亡率为0；相对增重率≥80%；卵囊抑制率≥75%判定为免疫效果良好。

2.2 试验结果

(1) 一次免疫的免疫产生期试验结果

一次免疫1200个/只堆型早熟孢子化卵囊并于第8天攻毒，本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组相对增重率（77.9%）高于对照技术球虫助悬液组相对增重率（74.9%）；本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组平均病变记分（1.2）低于对照技术助悬液组（1.6）；本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组卵囊减少率（69.5%）高于对照技术助悬液组(65.1%)；本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组RLS（66.7%）高于对照技术助悬液组（55.6%）；于免疫后第9d攻毒，本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组相对增重率（78.2%）高于对照技术助悬液组相对增重率（76.2%）；本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组平均病变记分（1.1）低于对照技术助悬液组（1.5）。本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组卵囊减少率（72.8%）高于对照技术对照技术助悬液组(68.7%)；本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组RLS（68.4%）高于对照技术助悬液组（58.3%）。

试验结果经统计分析表明，本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组和对照技术助悬液组鸡群平均病变记分明显低于攻毒对照组（3.6），差异极显著（P＜0.01），并且能对大剂量强毒株攻击产生保护力，但平均病变记分＞1，相对增重未达到80%，还未达到良好免疫效果，详见表2。

(2) 二次免疫的免疫产生期试验结果

一次免疫1200个/只堆型早熟孢子化卵囊，10d后二免900个/只，二免后第5天攻毒，本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组相对增重率81.8%，平均病变记分1.1，卵囊减少率74.8%，表明已产生较好的免疫保护力；二免后第6天攻毒，本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组相对增重率85.0%，平均病变记分1.0，RLS 71.4%，卵囊减少率83.4%，产生良好免疫保护，而对照技术助悬液免疫组于二免后第6天攻毒相对增重率82.3%，平均病变记分1.1，卵囊减少率79.7%未达到良好免疫；二免后第7天攻毒，对照技术助悬液组对增重率89.2%，平均病变记分1.0，卵囊减少率88.7%，RLS 77.8%，达到良好免疫，表明本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂可较对照技术使球虫疫苗免疫产生期缩短一天。详见表3。

 

、不同水温下搅拌时间对球虫疫苗免疫增效助悬剂溶解速度的影响

将球虫疫苗免疫增效助悬剂分别用10℃、17℃、24℃、31℃的水溶解，除10℃下溶解时间8min稍长外，17℃、24℃、31℃下溶解时间均在5-6min，详见表4。

本发明的有益效果

(1) 助悬效果好

本发明的鸡球虫病疫苗增效助悬剂能使球虫在水中6h沉降率保持在3.33%，表明本发明的增效助悬剂可使球虫病疫苗接种前无需停水，省时省力又减少应激，避免鸡群抢水现象；可延长饮水时间，鸡只饮水量相对均匀，确保球虫免疫的均匀性，为球虫疫苗的推广提供了简便易行的方案。

 (2) 免疫增效效果显著

采用本发明对球虫的免疫效果优于单纯免疫，7日龄一免1200个/只堆型艾美耳球虫早熟株，免疫后第8天接种20×10⁴个/只堆型艾美耳强毒株，本发明免疫增效助悬剂组比对照技术免疫组相对增重率高3.00%，平均病变记分低25.00%，卵囊减少率高4.40%；7日龄一免1200个/只堆型艾美耳球虫早熟株，一免后10d二免900个/只，二免后第6天接种20×10⁴个/只堆型艾美耳强毒株，本发明免疫增效助悬剂组比对照技术免疫组相对增重率高2.7%，平均病变记分低9.09%，卵囊减少率高3.70%。

    (3) 免疫产生期短

本发明球虫疫苗免疫增效助悬剂组较对照技术免疫组免疫产生期可提前一天，本发明免疫增效助悬剂于二免后第6天达到良好免疫效果，单纯免疫组于二免后第7天达到良好免疫效果。

（4）环保无污染

本发明提供的球虫疫苗免疫增效助悬剂可广泛适用于鸡场的球虫免疫，不会对环境造成污染和破坏，对环境保护与禽类耐药性具有重要意义。

具体实施方式

实施例1

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P 0.05、羟丙甲基纤维素0.15、黄芪多糖1、壳聚糖0.5、泊洛沙姆0.9，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例2

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P 3、羟丙甲基纤维素4、黄芪多糖55、壳聚糖30、泊洛沙姆35，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例3

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P 0.05、羟丙甲基纤维素4、黄芪多糖1、壳聚糖30、泊洛沙姆0.9，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例4

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P 3、羟丙甲基纤维素0.15、黄芪多糖55、壳聚糖0.5、泊洛沙姆35，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例5

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P0.1、羟丙甲基纤维素0.5、黄芪多糖5、壳聚糖3、泊洛沙姆5，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例6

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P1.5、羟丙甲基纤维素1、黄芪多糖20、壳聚糖10、泊洛沙姆15，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例7

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P0.1、羟丙甲基纤维素1、黄芪多糖5、壳聚糖10、泊洛沙姆5，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例8

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P1.5、羟丙甲基纤维素0.5、黄芪多糖20、壳聚糖3、泊洛沙姆15，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例9

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P1、羟丙甲基纤维素0.8、黄芪多糖10、壳聚糖5、泊洛沙姆10，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例10

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P0.5、羟丙甲基纤维素0.6、黄芪多糖8、壳聚糖8、泊洛沙姆7，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

实施例11

制备鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂。

取下列质量份的原料，卡波姆934P 1.2、羟丙甲基纤维素0.9、黄芪多糖16、壳聚糖5、泊洛沙姆12，常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀即可。

Claims (3)

1.一种鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂，其特征在于，免疫增效助悬剂包括下列质量份的原料，卡波姆934P 0.05-3、羟丙甲基纤维素0.15-4、黄芪多糖1-55、壳聚糖0.5-30、泊洛沙姆0.9-35。

2.根据权利要求1所述的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂，其特征在于，免疫增效助悬剂包括下列质量份的原料，卡波姆934P 0.1-1.5、羟丙甲基纤维素0. 5-1、黄芪多糖5-20、壳聚糖3-10、泊洛沙姆5-15。

3.根据权利要求1所述的鸡球虫病疫苗免疫增效助悬剂的制备方法是：按质量份分别取卡波姆934P 0.05-3、羟丙甲基纤维素0.15-4、黄芪多糖1-55、壳聚糖0.5-30、泊洛沙姆0.9-35常温下将卡波姆、羟丙甲基纤维素、黄芪多糖、壳聚糖、泊洛沙姆搅拌混匀后，常温下储存即可。