CN103143012A - 中药组合物及其在制备仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物，由中草药有效成分天门冬多糖和田七皂苷经合理配比获得。本发明的中药组合物及其中药复方注射液能够增强仔猪伪狂犬疫苗免疫效力，具有资源丰富、毒性小、效果好的优点，在应对养猪业面临的伪狂犬病方面有广阔应用前景。

Description

中药组合物及其在制备仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂方面的应用

技术领域

本发明属于药物领域，尤其涉及一种中药组合物及其在制备仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂方面的应用，具体是能够增强仔猪伪狂犬病疫苗免疫效力的中药复方注射液。

背景技术

猪伪狂犬病是危害全球养猪业最严重的传染病之一。伪狂犬病毒又称Aujeszky病毒，主要侵害猪的神经系统，容易引起并发症乃至猪的死亡。伪狂犬病毒属于疱疹病毒科疱疹病毒Ⅰ型，双股DNA病毒，可引起种猪繁殖障碍。新生仔猪感染该病毒后死亡率较高，有时可达100%。成年猪呈隐性感染，可导致猪群处于免疫抑制状态。鉴于伪狂犬病对养猪业的危害如此严重又无有效的抗病毒药物进行治疗，只有采取防重于治的方法。

疫苗免疫效果受多方面因素影响，如疫苗本身差异、个体的差异、母源抗体水平的影响、接种方法等。有些猪场免疫采用基因缺失疫苗，这类疫苗免疫原性较低，因此需要一种有效的佐剂能激活潜在的免疫反应。佐剂是一种潜在的免疫调节剂，尤其中药类免疫增强剂，因其具有资源丰富、毒性小、功能广等特点，成为近年来研究的热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种毒性小、免疫作用好的中药组合物及其在制备仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：中药组合物，含有天门冬多糖和三七皂苷。

上述中药组合物，天门冬多糖和三七皂苷各占组合物总重的70～90%和10～30%。

上述中药组合物在制备仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂方面的应用。

上述仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂为中药复方注射液。

上述中药复方注射液由每100克的中药组合物用1500～2500mL注射用水溶解制成。

上述中药复方注射液还含有注射液总重0.5～1%的吐温-80。

上述中药复方注射液按以下方法制备：

<1>配制

按配方重量称取天门冬多糖和田七皂苷混合均匀，加注射用水并超声溶解，注射用水加至接近配方注射用水量时，加入配方重量的吐温-80，调节pH值至5.5～7.0，再用注射用水稀释至配方注射用水量；

<2>过滤、分装

用0.65μm的滤膜进行过滤，灌装入2mL安瓿瓶，封口，100℃灭菌30min，即得。

天门冬多糖采用碱提醇沉法提取，冷冻干燥后密封保存备用；田七皂苷采用95%乙醇提取，冷冻干燥后密封保存备用。

针对目前伪狂犬病对养猪业危害严重的现状，发明人采用中草药有效成分天门冬多糖和田七皂苷，经合理配比获得了本发明的中药组合物，具体方析如下：天门冬多糖具有抗菌抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、调节免疫力等药理作用，同时天门冬多糖还具有杀灭蚊蝇幼虫软体动物的作用和降血糖的作用；田七皂苷对中枢神经系统具有镇静、镇痛、益智作用，对心血管系统具有保护心肌、抗心律失常、降血脂，防止动脉粥样硬化，对脑血管系统可改善脑血循环，对实验性脑缺血具有保护作用，对血液和造血系统可对抗血栓的形成，促进造血细胞的生长，在对免疫系统上可起到抗炎、抗菌、增强免疫力的作用，同时田七皂苷还具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效。

注射伪狂犬疫苗后第1天起，复方注射液按0.0625～0.25mL/kg肌肉注射，1天1次，连用3天。实验证明，本发明的中药组合物和中药复方注射液能够增强仔猪伪狂犬疫苗免疫效力，具有资源丰富、毒性小、效果好的优点。

具体实施方式

实施例1中药复方注射液的制备

<1>配制

按配方重量称取检验合格的天门冬多糖45g和田七皂苷5g混合均匀，加注射用水并超声溶解，注射用水加至接近配方注射用水量900ml时，加入10ml吐温-80，调节pH值至6.8，再用注射用水稀释至配方注射用水量1000ml；

<2>过滤、分装

用0.65μm的滤膜进行过滤，灌装入2mL安瓿瓶，封口，100℃灭菌30min，灭菌后经灯检，记录灯检结果。

实施例2中药复方注射液的制备

制备基本同实施例1，天门冬多糖40g和田七皂苷10g，配方注射用水量1000ml，7.5ml吐温-80，pH值5.5。

实施例3中药复方注射液的制备

制备基本同实施例1，天门冬多糖35g和田七皂苷15g，配方注射用水量1000ml，5ml吐温-80，pH值6.0。

上述实施例中天门冬多糖和田七皂苷分别按以下方法制备。

天门冬多糖采用碱提醇沉法提取，具体如下：取烘干至恒重的天门冬，按照1:6～15的比例加5～50%的乙醇溶液（PH=7～13），浸泡0.5～2.5h，浸泡末再调节pH一次到7～13，于60～100℃水浴提取0.5～2.5h，四层纱布过滤，残渣用pH为7～13的溶液浸泡后同上再处理一次，合并滤液病浓缩至1/4。浓缩液放置室温冷却。缓慢加入5倍量的95%的乙醇进行醇沉，边加边搅拌，室温静置过夜12h以上，随后弃掉上清液，加入5倍量的蒸馏水溶解沉淀，3000r/min离心十分钟，收集上清，再加入5倍量95%乙醇进行醇沉，室温放置过夜。静置过夜后，3000r/min离心10min，弃上清，加入适量的95%乙醇搅拌离心同前，再弃上清，加入无水乙醇搅拌，再离心，最后收集沉淀，冷冻干燥后既得天门冬多糖。

田七皂苷采用95%乙醇提取法提取，具体如下：称取50g田七粗粉置于圆底烧瓶中，加入95%乙醇500ml，浸泡0.5h后，90℃水浴回流提取2h，过滤，将滤渣重倒回圆底烧瓶中，再加入95%乙醇400ml，回流提取1.5h，合并两次滤液。3000r/min离心30min，取上层清液用旋转蒸发仪回收乙醇，剩余少量液体时，加蒸馏水定容至150ml。上述醇提取物150ml倒入分液漏斗中，然后用正丁醇进行液液萃取4次，正丁醇的用量依次为150ml、130ml、100ml、70ml，取正丁醇层合并，真空浓缩，90℃回收溶剂，得正丁醇提取物，溶于少量95%乙醇中，然后滴加入搅拌中的大量乙醚，待沉淀完全析出为止，过滤，将沉淀90℃水浴烘干或冷冻干燥器烘干备用。

本发明中药复方注射液对仔猪伪狂犬疫苗免疫效力的研究

以下实验使用的实施例1制得的中药复方注射液。

1.方法

1.1动物分组及处理

从42日龄～56日龄的杜洛克×长白×大约克三元杂交猪中筛选40头猪，用猪伪狂犬野毒抗体检测试剂盒检测母源抗体，至母源抗体下降到临界线下或检测不出抗体，并检测猪野毒抗体。选择30头，随机分为6组，每组5头，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别为猪伪狂犬疫苗+中药复方注射液（高：0.25mL/kg、中：0.125mL/kg、低：0.0625mL/kg）三个剂量组，Ⅳ组为猪伪狂犬疫苗+阳性药物对照组（瘟毒清），Ⅴ组为疫苗对照组，Ⅵ组为空白对照组。Ⅰ～Ⅴ组，第1天颈部肌内注射猪伪狂犬病活疫苗2mL。Ⅰ组：第1天开始，复方注射液按0.25mL/kg肌内注射，1次/d，连用3d。Ⅱ组：第1天开始，复方注射液按0.125mL/kg肌内注射，1次/d，连用3d。Ⅲ组：第1天开始，复方注射液按0.0625mL/kg肌内注射，1次/d，连用3d。Ⅳ组：第1天开始，盐酸左旋咪唑+黄芪多糖可溶性粉0.4g/L饮水，1次/d，连用3天。Ⅴ组：疫苗对照组,不用药。Ⅵ空白对照组，不免疫、不用药。

1.2饲养条件、用药观察与日常管理

实验在同一栋猪舍进行，猪舍为半敞开式，平养，定时采食，自由饮水，饲料为猪场购买的全价料。实验期间，每周对猪舍进行二次常规消毒，仔细观察猪只健康状况，对试验期间感染疾病的病例及时隔离剔除处理，并进行针对性用药治疗，以减少损失。严格按照猪场的免疫程序进行免疫。

1.3检测指标

1.3.1样本采集

于疫苗接种前（0d）、疫苗接种后的7d、14d、21d、28d对每头试验猪前腔静脉采血10mL，血液样品于室温下静置2小时，然后以2500rpm离心5min，取上层血清，-20℃保存，用于抗体、IL-2测定和血液生化指标分析。

1.3.2利用以下公式计算阻断率

%INH=（ODm NC-OD Sample）×100/ODm NC。

试验满足ODm NC–ODm PC＞0.6；%Inh PC＞60%。

1.3.3伪狂犬抗体的判断标准

阴性：%INH.<45%；可疑：45%≤%INH.≤50%；阳性：%INH.＞50%。

1.3.4猪血液生理生化指标的检测

总蛋白（TPR）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）溶菌酶等指标分析。

1.3.5体重

称量试验前和接种疫苗后28d的体重，计算增重和饲料消耗量。

1.3.6数据处理

数据以Mean±SD表示，用SPSS18.0软件进行单因子方差分析。显著性用P值表示，其中P＜0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2.结果

2.1猪群伪狂犬野毒抗体的检测结果

40份样本送广西兽医研究所检验，均不含野毒抗体。

2.2中药复方注射液对猪伪狂犬抗体的影响（见表1）

复方高剂量组和复方低剂量组配合疫苗注射7天后，抗体水平呈下降趋势，到21天时抗体水平逐渐上升。阳性药物配合疫苗免疫7天后，抗体水平呈下降趋势，到14天时抗体水平逐渐上升，然后逐渐下降。复方中剂量组抗体水平一直保持稳定。空白对照组、疫苗对照组抗体水平一直呈现下降的趋势。

表1中药复方注射液对猪伪狂犬抗体的影响（%INH）

2.3中药复方注射液对猪血清细胞因子IL-2的影响（见表2）

表2中药复方注射液对猪血清细胞因子IL-2水平的影响（Mean±SD）

表中肩标不同的小写字母表示差异显著P<0.05，肩标不同的大写字母表示差异极显著P<0.05，有相同的字母表示差异不显著P>0.05（同一时期的各组之间相互比较），以下各表类似。

可见，免疫后21天，复方高剂量组IL-2水平与药物对照组、疫苗对照组、空白对照组相比显著升高（P<0.05）。

2.4中药复方注射液对总蛋白的影响（见表3）

免疫后14天，复方中剂量组和药物对照组相比极显著降低（P<0.01）。在28天时，复方高剂量组、中剂量组与药物对照组相比极显著升高（P<0.01）。

表3中药复方注射液对猪血清总蛋白的影响（Mean±SD）

2.5中药复方注射液对白蛋白和球蛋白的影响

2.5.1中药复方注射液对白蛋白影响(见表4)

免疫后28天时，复方高剂量组和复方中剂量组能提高血清中白蛋白水平，与空白组、疫苗组相比差异均显著（P<0.05）。复方高剂量组和复方中剂量组血清中白蛋白的水平与药物对照组相比极显著升高（P<0.01）。

表4中药复方注射液对猪血清白蛋白的影响（Mean±SD）

2.5.2中药复方注射液对球蛋白的影响(见表5)

免疫后28d，复方高中剂量组球蛋白的水平极显著的高于药物对照组（P<0.01）。复方中剂量组球蛋白的水平显著的高于药物对照组（P<0.05）。

表5中药复方注射液对猪血清球蛋白的影响（Mean±SD）

2.6中药复方注射液对溶菌酶的影响(见表6)

免疫后28天，复方中剂量组溶菌酶水平显著高于疫苗对照组（P<0.05）。复方中剂量组溶菌酶水平极显著高于Ⅳ药物对照组（P<0.01）。

表6复方注射液对猪血清溶菌酶的影响（Mean±SD）

结论

本发明的的中药复方注射液可提高猪血清细胞因子IL-2水平、溶菌酶等的含量，能够提高猪的非特异性免疫功能。其中，中药复方注射液中剂量组可以保持猪伪狂犬抗体水平的稳定，作为免疫增强剂配合疫苗应用效果较好。

Claims (8)

1.一种中药组合物，其特征在于含有天门冬多糖和三七皂苷。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：所述天门冬多糖和三七皂苷各占组合物总重的70～90%和10～30%。

3.根据权利要求1或2所述中药组合物在制备仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述仔猪伪狂犬病疫苗免疫增强剂为中药复方注射液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述中药复方注射液由每100克的中药组合物用1500～2500mL注射用水溶解制成。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述中药复方注射液还含有注射液总重0.5～1%的吐温-80。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述中药复方注射液按以下方法制备：

<1>配制

按配方重量称取天门冬多糖和田七皂苷混合均匀，加注射用水并超声溶解，注射用水加至接近配方注射用水量时，加入配方重量的吐温-80，调节pH值至5.5～7.0，再用注射用水稀释至配方注射用水量；

<2>过滤、分装

用0.65μm的滤膜进行过滤，灌装入2mL安瓿瓶，封口，100℃灭菌30min，即得。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述天门冬多糖采用碱提醇沉法提取，冷冻干燥后密封保存备用；所述田七皂苷采用95%乙醇提取，冷冻干燥后密封保存备用。