CN107281482A - 一种免疫佐剂组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含卵磷脂、油和油包水乳化剂的佐剂以及疫苗组合物，具有稳定、提高免疫效果和良好的安全性。

Description

一种免疫佐剂组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，涉及免疫佐剂和疫苗组合物。
背景技术
灭活抗原单独免疫动物时，不足于产生免疫原性，特别是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同种类的佐剂来增强抗原所诱导的免疫应答。
现有技术采用油包水(W/O)型油佐剂疫苗是由抗原液、稳定剂及矿物质油混合后，在高剪切力作用下制备而成。其免疫机理是在接种部位贮存一段时间，局部产生肉芽肿和炎症反应，吸引巨噬细胞、淋巴细胞等聚集以识别抗原，产生抗体。其油的用量偏大，现有技术尚无一种合适的佐剂能够解决油佐剂的免疫效果提高的问题。
能够减低矿物质油的使用量，剂型稳定，并且提高免疫效果的免疫佐剂以及使用所述免疫佐剂制备的疫苗是本领域技术人员的所要解决的技术问题。
发明内容
一种免疫佐剂，其特征在于，所述的佐剂包含油、卵磷脂、油包水乳化剂。
所述的油包水乳化剂选自聚氧乙烯-30-二聚羟基硬脂酸酯、聚甘油-2-二聚羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯二缩甘露醇油酸酯的任一种或几种混合。
所述的油选自矿物油、合成油和天然油脂的任一种或者任一种或几种组合。
优选地，所述的油为矿物油。
作为本发明的一种实施方式，所述的免疫佐剂含有助乳化剂，所述的助乳化剂包括但不限于，吐温(Tween)系列和司本(span)系列聚乙二醇脂肪酸酯系类列，其具体化合物包括但不限于Tween20，Tween21，Span20、Tween40、Span40、Tween60、Tween61、Span60、Tween65、Span65、Tween80、Tween81、Span80Tween85、Span85、Span83、聚乙二醇油酸酯。
本发明的佐剂组合物还可以含有TLR7激动剂，优选地TLR7激动剂为咪喹莫特(imiquimod)和/或瑞喹莫特(resiquimod)。
术语“TLR7激动剂”，即可使Toll样受体促效的化合物。具有代表性的化合物为咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)。
TLR7激动剂每剂量0.01μg～50μg。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种抗原的水溶液和佐剂，所述佐剂包含油、卵磷脂、油包水乳化剂。
所述的油包水乳化剂选自聚氧乙烯-30-二聚羟基硬脂酸酯、聚甘油-2-二聚羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯二缩甘露醇油酸酯的任一种或几种混合。
所述的油选自矿物油、合成油和天然油脂的任一种或几种组合。
优选地，所述的油为矿物油。
作为本发明的一种实施方式，所述的疫苗组合物含有助乳化剂，所述的助乳化剂包括但不限于，吐温(Tween)系列和司本(span)系列聚乙二醇脂肪酸酯系类列，其具体化合物包括但不限于Tween20，Tween21，Span20、Tween40、Span40、Tween60、Tween61、Span60、Tween65、Span65、Tween80、Tween81、Span80Tween85、Span85、Span83、聚乙二醇油酸酯。
本发明的疫苗组合物还可以含有TLR7激动剂，优选地TLR7激动剂为咪喹莫特(imiquimod)和/或瑞喹莫特(resiquimod)。
术语“TLR7激动剂”，即可使Toll样受体促效的化合物。具有代表性的化合物为咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)。
TLR7激动剂每剂量0.01μg～50μg。
优选地，所述佐剂的油的浓度为15％-50％(V/V)，卵磷脂浓度0.5％-8％(w/V)，所述的油包水乳化剂浓度为0.5％-5％(V/V)；再优选地，所述佐剂油的浓度为20％-40％(V/V)卵磷脂浓度为1％-3％(w/V)，所述的油包水乳化剂浓度为1％-3％(V/V)。
所述的油包水乳化剂选自聚氧乙烯-30-二聚羟基硬脂酸酯、聚甘油-2-二聚羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯二缩甘露醇油酸酯的任一种或几种混合。
所述的油选自矿物油、合成油和天然油脂的任一种或几种组合。
优选地，所述的油为矿物油。
TLR 7激动剂是指可使Toll样受体促效的化合物。具有代表性的化合物为咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)，
TLR 7激动剂每剂量0.01μg～50μg。
作为本发明的一种实施方式，所述的疫苗组合物含有助乳化剂所述的助乳化剂包括但不限于，吐温(Tween)系列和司本(span)系列聚乙二醇脂肪酸酯系类列，其具体化合物包括但不限于Tween20，Tween21，Span20、Tween40、Span40、Tween60、Tween61、Span60、Tween65、Span65、Tween80、Tween81、Span80Tween85、Span85、Span83、聚乙二醇油酸酯。
作为本发明的另外一方面，本发明提供一种药盒，所述药盒包含抗原和本发明所述的佐剂，所述抗原和佐剂分开保存。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供的药盒具有至少2个小瓶，包括在第一个小瓶的抗原和在第二个小瓶的本发明上述的佐剂。
本发明的助乳化剂包括但不限于，吐温(Tween)系列和司本(span)系列聚乙二醇脂肪酸酯系类列，其具体化合物包括但不限于Tween20，Tween21，Span20、Tween40、Span40、Tween60、Tween61、Span60、Tween65、Span65、Tween80、Tween81、Span80Tween85、Span85、Span83、聚乙二醇油酸酯。
本发明的组合物包括TLR 7激动剂，即，可使Toll样受体促效的化合物。最优选地，TLR激动剂是人TLR的激动剂；优选其能够激活TLR7。咪喹莫特(imiquimod)、瑞喹莫特(resiquimod)，每剂量0.01μg～50μg。
术语“卵磷脂”为一种磷脂。卵磷脂的粗的制品可包含甘油三酯。为了本发明的目的，“卵磷脂”包括纯化和粗制品。卵磷脂可为植物或动物来源的。此外，卵磷脂可为合成来源的。
术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。
术语“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者。
术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、传染性支气管炎病毒、鼻病毒属(rhinovirus)、副流感病毒、细小病毒属(parvovirus)、腺病毒属(adenovirus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)、禽类白血病、传染性法氏囊病(infectious bursal disease)、呼肠孤病毒属(reovirus)、痘病毒(pox)、喉气管炎、马立克氏病(Marek′s disease)、破伤风、B型肝炎、疟疾、肺炎球菌肺炎、轮状病毒属(rotavirus)、细小病毒属、冠状病毒属(caronavirus)、大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)。
在某些实施例中，抗原是流感病毒，例如经灭活的流感病毒在本发明内容中可使用任何经灭活的流感病毒，包括任何经灭活的流感A病毒株(例如禽流感病毒株)。
在某些实施例中，抗原是新城疫病毒，例如经灭活的新城疫病毒Losata株或基因改造后新城疫基因VII型毒株。
在某些实施例中，抗原是猪用抗原，例如经灭活的伪狂犬病毒、者细小病毒、圆环病毒。
其它组分，疫苗组合物可包括一种或多种其它组分、缓冲剂和稳定化合物。
本发明的有益效果
1)本发明提供的疫苗组合物，水相的比例能够达到60％v/v以上，保持稳定的油包水乳剂，从而减少了联苗抗原的浓缩的工序，减低了成本；
2)本发明的佐剂能够显著提高疫苗的免疫效果；
3)本发明的疫苗组合物，疫苗副反应小。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
本发明中所用的pH7.2PBS溶液配方为：1000ml蒸馏水中加入NaCl 9g、Na2HPO4·12H2O 6g、NaH2PO4·2H2O 0.4g，经121℃高压灭菌30分钟后使用。
主要试剂注射用白油(法国道达尔)聚氧乙烯-30-二聚羟基硬脂酸酯商品名Arlacel P135(有利凯玛)聚甘油–2–二聚羟基硬脂酸酯DEHYMULS PGPH巴斯夫，聚氧乙烯二缩甘露醇油酸酯未提及的原料均为日常用试剂。
实施例1佐剂组合物的制备
液体矿物油加入卵磷脂、油包水乳化剂和助乳化剂搅拌均匀，110℃灭菌30分钟，即为本发明的免疫佐剂，根据需要最后加入TLR7激动剂。
实例2：本发明的佐剂在禽流感和新城疫疫苗中的应用
2.1制备抗原：按照中国专利CN103789272A实施例5制备禽流感抗原和新城疫抗原。
2.2疫苗组合物的制备：配制100ml按照表1的量加入佐剂(油相)和抗原水溶液(水相)，30℃保持10分钟然后用2500转高剪切混匀。
表1、疫苗组合物的组成
2.3疫苗的稳定性评价
表1制备的疫苗组合物4℃放置18个月，各试验组W/O佐剂均稳定，无油水分层，而对照疫苗组则有少许分层。同样采用聚甘油–2–二聚羟基硬脂酸酯或聚氧乙烯二缩甘露醇油酸酯替换表1的聚氧乙烯-30-二聚羟基硬脂酸酯制备的乳剂均稳定，4℃放置18个月均稳定没有油水分层，也无上清油层。
2.4、疫苗的效力试验
采用血清学方法2.2制备的疫苗组合物进行鸡新城疫部分效力检验。用30～60日龄SPF鸡75只，阴性对照组5日，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡肌肉注射2.2制备的疫苗组合物的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗组5、疫苗8、疫苗9各20μ1，对照组疫苗采用中国专利CN103789272A实施例5方法制备的疫苗为对照另5只作对照。接种后21日，每只鸡各采血，分离血清，进行HI抗体效价测定，免疫组HI抗体效价的几何平均值均不低于4log2未免疫对照组HI抗体效价均不高于2log2。结果详见表2。
表2疫苗组合物的鸡新城疫部分效力检验
注：表中HI抗体效价为几何平均值
试验结果表明，本发明的免疫佐剂佐剂组合对鸡新城疫抗原相对于对照疫苗组有更好的免疫效果，而单用油包水乳化剂组合卵磷脂组则与对照组差异不大，而加入TLR7激动剂后效果增强明显。
采用血清学方法进行禽流感(H9亚型)部分效力检验。用30日龄左右SPF鸡75只，70只各肌肉注射2.2制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗组8、疫苗9各0.3m1，另5只作对照。接种后21日，每只鸡各采血，分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于6.5log2，对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于2log2。结果详见表3。
表3疫苗组合物的禽流感(H9亚型)部分效力检验
注：表中HI抗体效价为几何平均值
试验结果表明，本发明的佐剂组合对禽流感抗原能有更好的免疫效果，而单用油包水乳化剂组合卵磷脂组则与对照组差异不大，而加入TLR7激动剂后效果增强明显。
2.5安全检验
用2周龄SPF鸡90只，分为9组，每组10只，各分别注射表1的疫苗组合物每只1.0ml，观察14日，免疫接种后10周后剖检。结果见表4。
表4疫苗组合物的的安全性试验
实施例3本发明的免疫佐剂在猪伪狂犬疫苗中的应用
3.1制备抗原：按照CN103923884A实施例6制备猪伪狂犬抗原。
3.2疫苗组合物的制备：配制100ml按照表1的量加入佐剂(油相)和抗原水溶液(水相)，30℃保持搅拌10分钟然后用2500转高剪切混匀。
表5疫苗组合物的配制
3.3疫苗的中和抗体试验
将21日龄PRV抗体阴性仔猪30头随机分成6组，5头/组，注射疫苗灭活苗组注射.3.2制备的疫苗免疫1ml/头，对照疫苗注射2ml/头，疫苗免疫后，每周参照GB/T18641-2002方法血清中和试验的方法测定灭活疫苗组的中和抗体效价，结果见表6。
表6猪伪狂犬疫苗免疫仔猪后不同时间的抗体情况
表6的结果显示，即使注射剂量减半，本发明提供的免疫组合物依然有较好的免疫效果，显示有较高的中和抗体。
实施例4.疫苗组合物物理指标测定
按照专利CN103789272A实施例5方法，降低注射用白油的用量为50(V/V)、40(V/V)、30(V/V)配制对比疫苗1、对比疫苗2和对比疫苗3，另外按照实施例2，疫苗1方法不加卵磷脂配制疫苗为对比疫苗4，另外用实施例2制备的疫苗3、疫苗5、疫苗11，实施例3制备的疫苗E和疫苗D，进行粘度、液滴粒径和稳定性测定，结果见表7。
表7疫苗组合物的物理指标测定
试验结果表明:本发明的免疫佐剂粘度更小，而且4℃稳定性大于12月，具备较好的实用性，能够作为商品使用，而现有技术的一旦油含量降低，则粘度明显提高，稳定性降低，不能作为商品使用，而不加卵磷脂的对比疫苗体现在粘度增加和液滴粒径变大且不能均一。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种免疫佐剂，其特征在于，所述的佐剂包含油、卵磷脂、油包水乳化剂。
2.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述的油包水乳化剂选自聚氧乙烯-30-二聚羟基硬脂酸酯、聚甘油-2-二聚羟基硬脂酸酯、聚氧乙烯二缩甘露醇油酸酯的任一种或几种混合。
3.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述的佐剂还含有TLR7激动剂；优选地，所述的TLR7激动剂为咪喹莫特（imiquimod）和/或瑞喹莫特(resiquimod)。
4.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述的油选自矿物油、合成油和天然油脂的任一种或几种组合。
5.根据权利要求1或权利要求3所述的佐剂，其特征在于，所述的免疫佐剂还含有助乳化剂；优选地，所述的助乳化剂Tween20、Tween21、Span20、Tween40、Span40 、Tween60、Tween61、Span60、Tween65、Span65、Tween80、Tween81、Span80 Tween85、Span85 、Span83、聚乙二醇油酸酯的一种或者几种混合。
6.一种疫苗组合物，其特征在于，包含至少一种抗原的水溶液和权利要求1-5所述的佐剂。
7.根据权利6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂的油的浓度为15%-50%（V/V），卵磷脂浓度0.5%-8%（w/V），所述的油包水乳化剂浓度为0.5%-5%（V/V）；优选地，所述佐剂油的浓度为20%-40%（V/V） 卵磷脂浓度为1%-3%（w/V），所述的油包水乳化剂浓度为1%-3%（V/V）。
8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的抗原的水溶液为禽用灭活抗原或猪用灭活抗原；优选地，所述的猪用灭活抗原为猪伪狂犬抗原。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的禽用灭活抗原为禽流感抗原和/或新城疫抗原和/或法氏囊抗原。
10.一种药盒，其特征在于，所述药盒包含抗原和权利要求1-5所述的佐剂，所述抗原和佐剂分开保存。
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