CN112294954B - 一种禽用佐剂组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种禽用佐剂组合物，该佐剂组合物包含水相和油相：水相含有占该疫苗组合物总体积的0.2～1.0％w/v DEAE葡聚糖、0.1～1.0％w/v人参茎叶皂苷。本发明还提供了含有该佐剂组合物的疫苗组合物，该疫苗组合物能避免联苗中拮抗作用，显著增加抗原的免疫效果。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及佐剂组合物。
背景技术
为了减少鸡的应激反应，通常采用联苗免疫，例如重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗、(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re2株)三价疫苗、鸡新支流法四联灭活疫苗(LaSota株+M41株+SZ株+rVP2蛋白)，但这类疫苗的一个典型问题是免疫后多种抗原之间产生免疫干扰，造成联苗免疫的效果不如对应的单苗。
为解决这一问题，通常采用两种方法，其一是增加抗原的含量，但增加抗原的含量也相应地增加了生产成本，同时有些抗原，即使增加抗原含量也不能达到理想的免疫效果；另外一种方法是是加入免疫增强剂，但是现有技术的免疫增强剂有一个显著问题，使用的成份的没有经过安全性验证，这些成份可能会带来安全性问题或者药物残留，例如CN101850117使用了咪喹莫特和CpG溶液的技术方案，CN102743750胞壁酰二肽、雷西莫特的技术方案。这些免疫成份没有批准在兽用疫苗中使用，使用后可能会产生药物残留或者安全性风险。
现有禽用疫苗佐剂的第二个问题是在油佐剂中加入硬脂酸铝作为稳定剂，硬脂酸铝会造成潜在铝的残留。
因此，现有技术缺少一种不含硬脂酸铝，没有残留和安全性风险，能够增强联苗的免疫效果的禽用疫苗免疫佐剂。
发明内容
为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种禽用佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物包含免疫增强剂和油包水佐剂，所述免疫增强剂含有占配制的疫苗组合物总体积的0.2～1.0％w/v DEAE葡聚糖、0.1～1.0％w/v人参茎叶皂苷。
本发明通过使用上述免疫增强剂，使得常规油包水佐剂对于抗原的免疫增强作用显著提高，降低了联苗中多种抗原成分之间的干扰作用。
术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。
DEAE葡聚糖含量可以任意选自0.2％w/v、0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v、0.6％w/v、0.7％w/v、0.8％w/v、0.9％w/v、1.0％w/v。
人参茎叶皂苷含量可以任意选自0.1％w/v、0.2％w/v、0.3％w/v、0.4％w/v、0.5％w/v、0.6％w/v、0.7％w/v、0.8％w/v、0.9％w/v、1.0％w/v。
术语“油包水”佐剂，是指连续相为油相的佐剂，包括但不限于用矿物油加上表面活性剂配制而成的佐剂，例如矿物油、司本系列吐温系列表面剂，所述的司本系列例如“司本60、司本65、司本80司本85司本83”所述的吐温系列例如“吐温60、吐温65、吐温80吐温85吐温83”。表面活性剂的用量本领域技术人员可以根据制备成稳定剂乳剂进行用量选择。
作为本发明的一种实施方式，本发明的禽用佐剂组合物中，所述禽用佐剂组合物不含有硬脂酸铝。
在本发明的禽用佐剂组合物中不加入硬脂酸铝稳定剂，避免了铝的残留，保证了生物安全性。
作为本发明的一种实施方式，本发明的禽用佐剂组合物中，所述油包水佐剂含有维生素E。
通过在本发明佐剂组合物的油包水佐剂中添加维生素E，能更进一步增强联苗中各抗原的免疫反应，降低联苗中多种抗原成分之间的干扰作用。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的禽用佐剂组合物中，所述油包水佐剂含有占所述疫苗组合物总体积5％w/v维生素E。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的佐剂组合物中，所述佐剂组合物包括，油相包含5％w/v维生素E，水相包含0.25％w/v DEAE葡聚糖和0.25％人参茎叶皂苷。
作为本发明的一种实施方式，本发明的禽用佐剂组合物中，所述油包水佐剂为白油、司本表面活性剂、吐温表面活性剂；或所述油包水佐剂为ISA 70VG；或所述油包水佐剂为白油、司本表面活性剂。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的禽用佐剂组合物中，所述油包水佐剂含有占所述疫苗组合物总体积的72.2％w/v白油、7.8％w/v司本-80、1.9％w/v吐温-85。
作为本发明的一种实施方式，本发明的油包水佐剂还可以为商品化的油包水佐剂，包括但不限于ISA 70VG。
作为本发明的另外一种实施例方式，所述油包水佐剂为配比为94份：6份的白油和司本-80。
本发明的禽用佐剂组合物使用的油包水佐剂不含硬脂酸铝，规避了潜在铝的残留的问题。
作为本发明的一种实施方式，本发明的禽用佐剂组合物中，所述佐剂组合物含有占疫苗组合物总体积的1.0％w/v DEAE葡聚糖、1.0％w/v人参茎叶皂苷、72.2％w/v白油、7.8％w/v司本-80、1.9％w/v吐温-85；或所述佐剂组合物含有占所述疫苗组合物总体积的0.5％w/v DEAE葡聚糖、0.5％w/v人参茎叶皂苷、72.2％w/v白油、7.8％w/v司本-80、1.9％w/v吐温-85；或所述佐剂组合物含有占所述疫苗组合物总体积的0.25％w/v DEAE葡聚糖、0.25％w/v人参茎叶皂苷、72.2％w/v白油、7.8％w/v司本-80、1.9％w/v吐温-85、5％w/v维生素E；或所述佐剂组合物含有占所述疫苗组合物总体积的0.25％w/v DEAE葡聚糖、0.25％w/v人参茎叶皂苷、72.2％w/v白油、7.8％w/v司本-80、1.9％w/v吐温-85；或所述佐剂组合物含有占所述疫苗组合物总体积的0.2％w/v DEAE葡聚糖、0.1％w/v人参茎叶皂苷、72.2％w/v白油、7.8％w/v司本-80、1.9％w/v吐温-85。
本发明上述实施方式的佐剂组合物，与多种联苗共同施用，可使其中的多种抗原免疫干扰显著降低，在低含量的抗原时仍能保证免疫效果。
本发明还提供了一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有所述的佐剂组合物和免疫量的抗原。
本发明通过使用具有免疫增强剂的佐剂组合物，可使联苗中的多种抗原之间的免疫干扰作用显著降低，且油包水佐剂不含硬脂酸铝，规避了潜在铝的残留的问题。
术语“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者。
术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、传染性支气管炎病毒、鼻病毒属(rhinovirus)、副流感病毒、细小病毒属(parvovirus)(例如鸭细小病毒)、腺病毒属(adenovirus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)、禽类白血病、传染性法氏囊病(infectious bursal disease)、呼肠孤病毒属(reovirus)、痘病毒(pox)、喉气管炎、马立克氏病(Marek′s disease)、破伤风、B型肝炎、疟疾、肺炎球菌肺炎、轮状病毒属(rotavirus)、细小病毒属、冠状病毒属(caronavirus)、大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)。
在某些实施例中，抗原是流感病毒，例如经灭活的流感病毒在本发明内容中可使用任何经灭活的流感病毒，包括任何经灭活的流感A病毒株(例如禽流感病毒株)。
在某些实施例中，抗原是新城疫病毒，例如经灭活的新城疫病毒La Sota株或基因改造后新城疫基因VII型毒株。
可在本发明内容中用作抗原的示范性灭活流感病毒包括具有H1、H5、H7或H9血球凝集素与N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中任一者组合的病毒。一般来说，抗原的血球凝集素亚型是基于通过循环传染性流感病毒株所呈现的血球凝集素亚型加以选择。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原为灭活抗原或亚单位抗原；所述抗原选自流感病毒抗原、新城疫病毒抗原(Newcastle disease virus)、传染性支气管炎病毒抗原、鼻病毒属(rhinovirus)抗原、副流感病毒抗原、细小病毒属抗原(parvovirus)(例如鸭细小病毒)、腺病毒属(adenovirus)抗原、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)抗原、禽类白血病抗原、传染性法氏囊病(infectious bursal disease)抗原、呼肠孤病毒属抗原(reovirus)、痘病毒(pox)抗原、喉气管炎抗原、马立克氏病(Marek′s disease)抗原、破伤风抗原、B型肝炎抗原、疟疾抗原、肺炎球菌肺炎抗原、轮状病毒属(rotavirus)抗原、细小病毒属抗原、冠状病毒属(caronavirus)抗原、大肠杆菌抗原、和/或沙门氏菌属(Salmonella)抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原为H9亚型禽流感病毒灭活抗原、新城疫病毒灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白抗原和/或鸡传染性支气管炎病毒灭活抗原。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原为H9亚型禽流感病毒SZ株灭活抗原、新城疫病毒La Sota株灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒成都株VP2蛋白抗原和/或鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活抗原；所述H9亚型禽流感病毒SZ株保藏号为CCTCC NO:V201240。
其中，鸡传染性支气管炎病毒M41株可以商业上获得，H9亚型禽流感病毒SZ株保藏信息公开于CN104274829A。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述抗原为HA效价为26的H7N9 Re2株的HA、NA和M蛋白组成的病毒样颗粒抗原、HA效价为26的H5N1 Re-11株HA、NA和M蛋白组成的病毒样颗粒抗原、和/或HA效价为26的H5N1 Re-12株的HA、NA和M蛋白组成的病毒样颗粒抗原。
本发明还提供了所述疫苗组合物在制备药物中的应用。
本发明的疫苗组合物能以低含量的抗原进行免疫，各种抗原成分不产生免疫干扰，且不会产生潜在铝的残留。
本发明的有益效果
本发明的禽用佐剂组合物，其各组分单独使用并无明显免疫增强作用，但作为组合物使用，产生了明显的免疫增强作用，可以普遍将常见禽用抗原的抗体滴度提高2-10倍。
本发明的禽用佐剂组合物能够解决禽用多联多价疫苗各种抗原可能存在的相互干扰问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、DEAE葡聚糖溶液的制备
称取DEAE葡聚糖(分子量5×105)10.0g，加入注射用水100ml，搅拌使DEAE葡聚糖全部溶解，热压灭菌，含量为10％w/v。
实施例2、人参茎叶皂苷溶液的制备
人参茎叶皂苷10g溶解于蒸馏水，0.22微米滤膜过滤，制备成10％(w/v)的溶液。
实施例3油相制备
白油75g中加入司本-80 6.5g、吐温-85 1.6g，混合均匀，制备成油相。
实施例4本发明的佐剂在制备疫苗鸡新支流法四联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SZ株+rVP2蛋白)中的应用
4.1抗原：新城疫抗原和禽流感H9抗原、新城疫抗原、法氏囊抗原和传染性支气管炎病毒抗原(按照中国专利CN104274829A实施例4制备，配制疫苗的抗原浓度CN104274829A实施例4一致)。
4.2油相的制备：按照表1的量将实施例3制备的油相加入维生素E。
水相的制备：4.1的抗原溶液中加入表1的量加入实施例1制备的人参茎叶皂苷溶液和实施例2DEAE葡聚糖溶液为水相。
疫苗的制备：60g左右的油相加入水相，4000转/分钟，乳化40分钟，各组中抗原含量与CN104274829A实施例4一致。
表1佐剂组合物的配制表(最终配制的疫苗为100ml)
对照疫苗按照CN 104274829佐剂进行制备，对照疫苗含对应的单一抗原，抗原用量与联苗相同，配制4个对照疫苗1～4，依次是禽流感病毒灭活疫苗，新城疫病毒灭活疫苗，禽传染性法氏囊病亚单位疫苗、鸡传染性支气管炎病毒灭活疫苗。
4.4效力检验
4.3制备的疫苗鸡新支流法四联灭活疫苗(La Sota株+M41株+SZ株+rVP2蛋白)，根据农业部公告第2400号效力检验项下进行效力检验，结果见表2，对照疫苗1、2、3、4分别为含有与联苗中对应抗原相当含量的单个抗原而制备的疫苗。
表2疫苗组合物的效力检验
注：表中效价为几何平均值,ND为新城疫的简写，AI为禽流感的简写，IBD为传染性法氏囊的简写，IB为传染性支气管炎的简写。
试验结果表明，新支流法四联灭活疫苗四联灭活疫苗，相对于单苗，抗体效价,ND和IBD均有较大程度的下降，加入免疫增强剂单用，加入维生素E对各种抗原均有增强作用，但增强效果不明显，与单苗还有较大差异(参见疫苗6～10与对照疫苗1～4之间的对比)，加入本发明的佐剂后可以达到或者超过单苗免疫效果，特别是在油相中加入维生素E后，其免疫效果增强更为明显(参见疫苗1～5与对照疫苗1～4之间的对比)，在本发明选择的含量范围内加入的量与免疫效果相关度不大，也即免疫增强剂中两种组分可以选择一定含量范围均能有效增强免疫反应。
实施例5、本发明的佐剂在制备二价禽流感亚单位疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re2株)中的应用
5.1.制备禽流感病毒样颗粒抗原
用杆状病毒表达H7N9 Re2株HA、NA和M蛋白，制备HA、NA和M蛋白组成病毒样颗粒抗原，灭活后HA效价为28；杆状病毒表达H5N1 Re-11株HA、NA和M蛋白，制备HA、NA和M蛋白组成病毒样颗粒抗原，灭活后HA效价为28；杆状病毒表达的H5N1 Re-12株HA、NA和M蛋白，HA、NA和M蛋白组成病毒样颗粒灭活后HA效价为28。
5.2疫苗制备
油相的制备：按照表1的量将实施例3制备的油相，其中部分试验例加入维生素E。
水相的制备：5.1的抗原溶液(按照最终疫苗抗原量为HA效价26)中加入表1各试验例的量的实施例1制备的DEAE葡聚糖溶液和实施例2制备的人参茎叶皂苷溶液为水相。
疫苗的制备：60g左右油相加入水相，总体积100ml，4000转/分钟，乳化40分钟，各疫苗组中抗原含量为26。
5.3效力检验
对照疫苗按常规佐剂制备的单苗，对照疫苗为单一抗原，抗原用量与联苗相同，配制3个疫苗。
制备的疫苗按农业农村部99号公告效力检验项下进行效力检验，结果见表3，对照疫苗5、6、7分别为含有与联苗中对应抗原相当含量的单个抗原而制备的疫苗。
表3疫苗组合物的效力检验
试验结果表明，二价禽流感亚单位疫苗，相对于单苗，在抗体效价方面，三种抗原均有一定程度的下降(参见疫苗K与对照疫苗5～7之间抗体效价的对比)，加入免疫增强剂组分DEAE葡聚糖或人参茎叶皂苷单用，或加入维生素E对各种抗原均有增强作用，但增强效果不明显，与单苗还有较大差异(参见疫苗G、H、J与对照疫苗5～7之间抗体效价的对比)，加入维生素E和人参皂苷为免疫增强剂效果可以基本达到与单苗相当水平(参见疫苗I与对照疫苗5～7之间抗体效价的对比)，而加入DEAE葡聚糖与人参皂苷为增强剂则有明显的增强作用(参见疫苗A、B、D、E与对照疫苗5～7之间抗体效价的对比)。最好的效果是加入维生素E人参皂苷和DEAE的组(参见疫苗C与对照疫苗5～7之间抗体效价的对比)。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种禽用佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物包含免疫增强剂和油包水佐剂，所述免疫增强剂含有占配制的疫苗组合物总体积的0.2~1.0%w/v DEAE葡聚糖、0.1~1.0% w/v人参茎叶皂苷；
所述油包水佐剂含有占所述疫苗组合物总体积5%w/v维生素E。
2.根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中，所述禽用佐剂组合物不含有硬脂酸铝。
3.根据权利要求1所述的佐剂组合物，其中，所述佐剂组合物含有占所述疫苗组合物总体积的0.25%w/v DEAE葡聚糖、0.25% w/v人参茎叶皂苷、72.2%w/v白油、7.8%w/v司本-80、1.9%w/v吐温-85和5%w/v维生素E。
4.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物含有权利要求1~3任一项所述的佐剂组合物和免疫量的抗原。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为H9亚型禽流感病毒SZ株灭活抗原、新城疫病毒La Sota株灭活抗原、鸡传染性法氏囊病病毒成都株VP2蛋白抗原和鸡传染性支气管炎病毒M41株灭活抗原；所述H9亚型禽流感病毒SZ株保藏号为CCTCC NO:V201240。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为HA效价为26的H7N9 Re2株的HA、NA和M蛋白组成的病毒样颗粒抗原、HA效价为26的H5N1 Re-11株HA、NA和M蛋白组成的病毒样颗粒抗原和HA效价为26的H5N1 Re-12株的HA、NA和M蛋白组成的病毒样颗粒抗原。
7.权利要求4~6任一项所述疫苗组合物在制备药物中的应用。
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