CN113855797A - 一种兽用免疫疫苗的稀释剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种兽用免疫疫苗的稀释剂及其制备方法，其由以下组分按质量百分比组成：匹多莫德1‑5％、油相1‑10％、表面活性剂5‑30％、助表面活性剂2.5‑18％、余量为蒸馏水。本发明制备的稀释剂是W/O/W型双连续相匹多莫德纳米乳，其主要成分匹多莫德以单分子状态分布于该纳米乳中，这种分布状态使得该制剂注入畜禽机体后，有效成分匹多莫德可被组织吸收、分布，进而迅速提高免疫系统中免疫因子或免疫细胞的活性。本发明制备的稀释剂为匹多莫德纳米乳，其主要成分匹多莫德以单分子状态分布于该纳米乳中。作为一种新型药物载体，匹多莫德纳米乳免疫佐剂具有缓释、协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及畜禽用疫苗专用稀释剂制造领域,更具体的说是涉及一种兽用免疫疫苗的稀释剂及其制备方法。
背景技术
当前复杂的饲养环境下，畜禽群因饲养管理、环境不良或营养不良的影响，导致机体处于亚健康状态时，会抑制免疫应答，以及一些免疫抑制性疾病的出现，常常导致免疫失败。因此既能提高机体免疫力，又能保护疫苗，提高疫苗抗体滴度的专用稀释剂显得尤为重要，匹多莫德作为优良的免疫增强及保护剂脱颖而出。
匹多莫德是一种人工合成的免疫促进剂，其结构类似于二肽，其化学名称为(R)-3-(S)-(5-氧代-2-吡咯烷基)羰基]-四氢噻唑-4-羧酸。匹多莫德本身不具有直接抗微生物的作用，其药效主要是通过调节免疫系统中免疫因子或免疫细胞的活性来实现；主要通过对机体免疫功能的促进，发挥显著的治疗细菌(肺炎球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等)及病毒(流感病毒、单纯疱疹病毒、心肌炎病毒等)感染的疗效；与抗菌药合用用于细胞免疫受抑制反复发作的呼吸道感染、耳鼻喉科感染、泌尿系统感染等的治疗。疫苗稀释剂对于保护和提高疫苗免疫效果至关重要，在免疫稀释剂中加入匹多莫德免疫促进剂，可进一步提高免疫效果。
由于匹多莫德在体内快速分布、排泄，“缓释”成为制约其作为免疫促进剂的重要因素。纳米乳作为一种新型药物载体，利用该载体制备含匹多莫德的免疫稀释剂，减缓了匹多莫德的代谢，为免疫疫苗稀释剂的开发提供了新的方向。
匹多莫德目前主要应用于人药领域，在兽药领域鲜有报道。中国专利申请号为CN103182067A介绍了一种匹多莫德作为免疫促进剂在畜禽上的应用，是将匹多莫德原料作为添加应用于畜禽的饲料当中，并未有相关剂型的报道，更未报道与疫苗的连用及对疫苗的保护作用。目前尚未有关于匹多莫德纳米乳的制备及作为免疫促进剂在兽用疫苗专用稀释剂领域的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兽用免疫疫苗的稀释剂及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种兽用免疫疫苗的稀释剂，其由以下组分按质量百分比组成：
匹多莫德1-5％
油相1-10％
表面活性剂5-30％
助表面活性剂2.5-18％
余量为蒸馏水。
进一步方案，所述的油相包括玉米油、肉豆蔻酸异丙酯、油酸、肉桂醛、油酸聚乙二醇甘油酯、三乙酸甘油酯或液体石蜡中一种或混合物。
进一步方案，所述的表面活性剂包括吐温-80、司盘-80、OP-10、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH-40、蓖麻油聚氧乙烯醚EL-40中的一种或混合物。
进一步方案，助表面活性剂包括乙醇、正丁醇、1,2-丙二醇、丙三醇中的一种。
本发明另一个发明目的是提供上述一种兽用免疫疫苗的稀释剂的制备方法，其步骤如下：
(1)将匹多莫德加入蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)将油相、表面活性剂、助表面活性剂混合置于容器中，70℃水浴搅拌至少30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
本发明制备的稀释剂是W/O/W型双连续相匹多莫德纳米乳，其油相、表面活性剂、助表面活性剂的配比合理，主要成分匹多莫德以单分子状态分布于该纳米乳中，这种分布状态使得该制剂注入畜禽机体后，有效成分匹多莫德可迅速被组织吸收、分布，进而迅速提高免疫系统中免疫因子或免疫细胞的活性，这种动物体免疫活性的改变可极大的提高疫苗的免疫抗体滴度和疫苗保护效力，保证疫苗免疫的成功率，是现行常规稀释剂的最佳替代品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例1
制备100kg 1％的W/O/W型双连续匹多莫德纳米乳：
(1)将1kg匹多莫德加入46kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的5kg IPM、20kg RH-40、10kg EL-40、18kg无水乙醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用1％匹多莫德纳米乳稀释液500ml。
实施例2
制备100kg 1.5％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
制备100kg 1％的W/O/W型双连续匹多莫德纳米乳：
(1)将1.5kg匹多莫德加入53kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的6kg肉桂醛、25kg EL-40、15kg异丙醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用1.5％匹多莫德纳米乳稀释液334ml。
实施例3
制备100kg 2％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将2kg匹多莫德加入60kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的7kg液体石蜡、21kg吐温-80、7kg司盘-80、3kg丙二醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用2％匹多莫德纳米乳稀释液250ml。
实施例4
制备100kg 2.5％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将2.5kg匹多莫德加入65kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的10kg油酸、12kg OP-10、10.5kg丙二醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用2.5％匹多莫德纳米乳稀释液200ml。
实施例5
制备100kg 3％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将3kg匹多莫德加入68kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的1kg玉米油、14kg吐温-80、14kg无水乙醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用3％匹多莫德纳米乳稀释液167ml。
实施例6
制备100kg 3.5％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将3.5kg匹多莫德加入75kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的2kg油酸聚乙二醇甘油酯、7.5kgEL-40、6kg司盘-80、6kg丙三醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用3.5％匹多莫德纳米乳稀释液143ml。
实施例7
制备100kg 4％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将4kg匹多莫德加入78kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的1kg IPM、1kg玉米油、8kgRH-40、4kg司盘-80、4kg丙三醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用4％匹多莫德纳米乳稀释液125ml。
实施例8
制备100kg 4.5％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将4.5kg匹多莫德加入81kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的0.5kg液体石蜡、8kg吐温-80、6kg无水乙醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用4.5％匹多莫德纳米乳稀释液约111ml。
实施例9
制备100kg 5％的W/O/W型匹多莫德纳米乳：
(1)将5kg匹多莫德加入85.5kg蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)称取灭菌后的2kg三乙酸甘油酯、2.5kg吐温-80、2.5kg司盘-80、2.5kg正丁醇，70℃条件下搅拌30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
临床使用量为每1000羽份使用5％匹多莫德纳米乳稀释液100ml。
上述实施例制备的W/O/W型匹多莫德纳米乳，可有效提高兽用疫苗的免疫抗体滴度，增强疫苗保护效力。
试验设计及结果如下：
(1)试验方法
将36只ICR雌性小鼠随机分成6组，每组6只。每只小鼠滴鼻免疫20ul(含1羽份新城疫疫苗)的疫苗稀释液。5组稀释液匹多莫德纳米乳浓度分别为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/ml。另设一组常规疫苗稀释液作为对照组(0mg/ml)。D0进行首免，D14二次免疫。
(2)采样与抗体检测
采样与血清制备：二免后7、14、21d对小鼠进行采血，全血37℃静置2h。转入4℃放置3h后，2500r/min离心8min。吸取上层血清，于-20℃冻存。
间接ELISA测定血清中的总IgG水平：新城疫血凝试验标准抗原(按HA实验2单位抗原稀释度，CBS稀释)包被96孔酶标板，每孔100ul，置4℃过夜。PBST洗涤5次，每次3min。每孔加封闭液(5％脱脂乳-PBS稀释)300μl，37℃作用1h，洗涤同上。加入现配的试验血清(1:400,5％脱脂乳-PBS稀释)，每孔100ul，37℃作用1h，洗涤。加入现配的酶标抗体(1:2000,5％脱脂乳-PBS稀释)，每孔100ul，37℃作用1h，洗涤。加入现配的TMB，每孔100ul，37℃显色10-15min。每孔加2M硫酸50ul，终止反应，检测450nm处OD值(ELASA所需的抗原包被浓度、血清稀释度、酶标抗体稀释度由预试进行方阵试验得出)
(3)统计学分析
采用SPSS统计软件，对3周数据进行单因素方差分析。多重比较采用单因素方差分析检验，小写字母不同表示差异显著(p<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(p<0.01)。
(4)试验结果
通过三种方法制备的O/W匹多莫德纳米乳对小鼠血清中新城疫病毒抗体水平的影响分别见表1、表2、表3。
表1实施例1小鼠血清中新城疫病毒抗体水平的变化
表2实施例2小鼠血清中新城疫病毒抗体水平的变化
表3实施例3小鼠血清中新城疫病毒抗体水平的变化
由以上三个实施例的小鼠血清抗体水平统计结果可以看出，采用匹多莫得纳米乳作为疫苗稀释剂对小鼠进行新城疫疫苗免疫后，在一定浓度范围内，可显著的提高疫苗免疫后小鼠血清中的特异性抗体水平。以实施例1为例进行分析，与对照组相比，添加0.125mg/mL，0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL的匹多莫德纳米乳时均可显著提高小鼠血清中新城疫抗体的水平，而添加2mg/mL时则极显著降低。
实施例1-3制备的匹多莫德纳米乳对小鼠血清中新城疫病毒抗体水平的影响是一致的，即随着匹多莫德纳米乳添加浓度的提高，小鼠血清中新城疫抗体水平呈现先升高后降低的变化趋势。该试验结果提示，本匹多莫得纳米乳可有效提高疫苗的免疫抗体滴度和疫苗保护效力，且在合适的浓度下能够达到最佳的免疫促进效果。
三种方法制备的W/O/W匹多莫德纳米乳对小鼠血清新城疫病毒抗体水平影响的原始数据资料，如下表4-6所示：
表4实施例1抗体水平分析表
表5实施例2抗体水平分析表
表6实施例3抗体水平分析表
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种兽用免疫疫苗的稀释剂，其特征在于：其由以下组分按质量百分比组成：
匹多莫德1-5％
油相1-10％
表面活性剂5-30％
助表面活性剂2.5-18％
余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的一种兽用免疫疫苗的稀释剂，其特征在于：所述的油相包括玉米油、肉豆蔻酸异丙酯、油酸、肉桂醛、油酸聚乙二醇甘油酯、三乙酸甘油酯或液体石蜡中一种或混合物。
3.根据权利要求1所述的一种兽用免疫疫苗的稀释剂，其特征在于：所述表面活性剂包括吐温-80、司盘-80、OP-10、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH-40、蓖麻油聚氧乙烯醚EL-40中的一种或混合物。
4.根据权利要求1所述的一种兽用免疫疫苗的稀释剂，其特征在于：所述助表面活性剂包括无水乙醇、正丁醇、1,2-丙二醇、异丙醇、丙三醇中的一种。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的一种兽用免疫疫苗的稀释剂的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：
(1)将匹多莫德加入蒸馏水中，超声溶解，形成水相，置70℃水浴中备用；
(2)将油相、表面活性剂、助表面活性剂混合置于容器中，70℃水浴搅拌至少30min，得到均匀的混合液，备用；
(3)将水相置于喷雾器中缓慢加入置于70℃水浴中的混合液，边加边搅拌，至少30min，停止搅拌，冷却至室温，制成W/O/W型双连续相纳米乳。
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| GR01 | Patent grant | ||
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