CN101843901A - 以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其由下列质量比的组分组成：稀释流感病毒疫苗1～30％，油相1～50％，乳化剂20～70％，助乳化剂20～70％。所述以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其中的佐剂即纳米乳剂具有毒性小，性质温和，增溶药物效果明显，流动性良好，对机体刺激性极小等优点，从而极大增强了流感病毒疫苗的免疫效果，本发明提供的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，较无佐剂的流感病毒疫苗具有给药量小、生物利用度高的优点；较其他佐剂流感疫苗具有极大增强疫苗生物利用度、减小刺激性、降低不良反应、延长疫苗释放时间以及增强疫苗靶向性和降低损耗率等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种流感病毒疫苗，具体涉及以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。
技术背景
流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道感染，主要通过飞沫或人与人密切接触传播。流感传染性强、流行快、变异迅速，能够引起多种严重的并发症并导致较高的死亡率，已对世界公共卫生安全构成严重威胁。根据流感的流行特点，可将其分为季节性流感和大流行流感。季节性流感多发于冬季，引起季节性流感的病毒通常已存在于人群中，对人体免疫系统而言并非是首次接触，所以危害性较小。但是流感病毒一旦突变或者跨越物种而从其他动物感染给人类，则容易造成大流行流感。自2009年首次在美洲出现甲型H1N1流感流行以来，甲型H1N1流感已经在世界各国迅速流行，在数月间世界卫生组织(WHO)就将甲型H1N1流感警戒级别提高为6级，代表全球性流感大流行的发作。目前防止流感最有效的手段就是接种流感疫苗。每年WHO会根据全球流感流行情况选择流行毒株并提供给各研究机构和疫苗生产厂家用以应对流行。但面对大流行的暴发，要在短时间内提供足够多的疫苗免疫易感人群，目前尚无法做到，这是全世界面临的难题。
佐剂是一种抗原辅助剂，与疫苗共同使用可以明显提高疫苗的免疫效果。由于流感疫苗的生产在时间上具有一定的后延性，当流感大流行暴发时，要在短时间内生产出能够满足大流行期间使用的疫苗是较为困难的。若辅以较好的佐剂，即可在增强流感疫苗免疫效果的同时，减少每剂流感疫苗的使用量，让更多的易感人群能够接种疫苗，达到迅速应对大流行暴发的目的。常见的疫苗佐剂种类很多，目前已经应用于流感疫苗的佐剂有：铝佐剂、MF59、LTK63等。铝佐剂可以增强初次免疫，减少每次免疫抗原量和免疫次数，但是对于嗣后加强免疫效果较小，且可能发生多种不良反应。其他流感疫苗佐剂的不良反应较少，但对于疫苗免疫原性的增强作用较为有限。
在乳剂中，通常将粒径小于100nm的乳剂称为纳米乳剂，纳米乳剂是一种自发形成的，热力学稳定，外观透明或近似透明的体系。纳米乳剂通常由油相-水相-乳化剂-助乳化剂组成，连续相为水相、分散相为油相的纳米乳剂为O/W型，连续相为油相、分散相为水相的纳米乳剂为W/O型。纳米乳剂具有粒径小且均匀，易于制备，稳定性、流动性均较好，易于注射等优点，可作为药物载体应用于多种吸收方式的药物制剂中，90年代后开始在世界上广泛使用。
发明内容
为克服现有疫苗佐剂存在的不良反应以及疫苗免疫原性的增强作用较为有限等不足，本发明提供一种以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，可以极大增强疫苗免疫效果，降低不良反应，减少每剂流感疫苗的使用量。
本发明的另一个目的在于提供一种制备以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗的方法。
本发明提供的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗通过下列技术方案完成：它由下列质量比的组分组成：
稀释流感病毒疫苗 1～30％
油相 1～50％
乳化剂 20～70％
助乳化剂 20～70％。
所述稀释流感病毒疫苗为将流感病毒疫苗原液或半成品或成品用注射用水稀释到血凝素含量为15～180g/株.ml的流感病毒疫苗。
所述流感病毒疫苗原液是用世界卫生组织(WHO)提供的毒种所制备的公知公用产品。
所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯(IPM)或油酸乙酯(EO)或注射用大豆油中的一种。
所述乳化剂为常规的Tween80或聚氧乙烯蓖麻油(EL)中的一种，或者为质量混合比为3∶2～2∶3的常规Tween80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1∶1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。
所述助乳化剂为常规的1，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。
本发明提供的制备以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗至血凝素达15～180μg/株.ml，得稀释流感病毒疫苗；
B、按下列质量比备料：
稀释流感病毒疫苗 1～30％
油相 1～50％
乳化剂 20～70％
助乳化剂 20～70％
C、将乳化剂、助乳化剂和油相混合后，在20～60℃温度下，按50-500转/分钟的转速，搅拌均匀，得混合溶液；
D、将步骤A所得的稀释流感病毒疫苗缓慢滴入步骤C中的混合溶液中，同时按50-500转/分钟的速度搅拌混合，直至得到均匀分散的透明的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
制得的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗应进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径在10～100nm范围内为合格；2.经1500-8000rpm，15min离心，纳米乳剂体系不分层为合格；3.经4℃～60℃放置7～60天，纳米乳剂体系无变化为合格。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，即可获得以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其中的佐剂即纳米乳剂具有毒性小，性质温和，增溶药物效果明显，流动性良好，对机体刺激性极小等优点，从而极大增强了流感病毒疫苗的免疫效果，本发明提供的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，较无佐剂的流感病毒疫苗具有给药量小、生物利用度高的优点；较其他佐剂流感疫苗具有极大增强疫苗生物利用度、减小刺激性、降低不良反应、延长疫苗释放时间以及增强疫苗靶向性和降低损耗率等优点。
附图说明
图1为不同接种组在8周内血凝抑制效价的变化；
图2为不同接种组在接种一周内的体重增长情况。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，本发明包括但不仅限于以下实施例。
本发明实施例所用的流感病毒疫苗原液为公知公用产品，并且是按照《中国药典》三部2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制备的，依据《中国药典》三部2010版所述各项检定标准检验合格的流感病毒疫苗原液。
实施例1
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为30μg/(株.ml)，得稀释流感病毒疫苗；
B、按下列质量比备料：稀释流感病毒疫苗10g，肉豆蔻酸异丙酯50g，1，2-丙二醇20g，Tween80 20g；
C、向混合搅拌瓶内加入20g Tween80，20g 1，2-丙二醇，60℃温度下持续搅拌，转速维持在50转/分钟，之后加入50g肉豆蔻酸异丙酯，得混合溶液；
D、在上述混合溶液中缓慢滴入步骤A的稀释流感病毒疫苗，同时维持转速在50转/分钟，搅拌至液体为透明，得到以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
制得的流感病毒疫苗进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为18.059～20.921nm，合格；2.经1500rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经4℃放置60天，纳米乳剂体系无变化，合格。
实施例2
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为15μg/(株.ml)，得稀释流感病毒疫苗；
B、按下列质量比备料：30g稀释流感病毒疫苗，30g注射用大豆油，20g聚乙二醇400，12g Tween80，8g Span80；
C、向混合搅拌瓶内加入12g Tween80和8g Span80及20g聚乙二醇400，20℃温度下持续搅拌，转速维持在500转/分钟，之后加入30g注射用大豆油，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗，同时维持转速在500转/分钟，搅拌至液体为透明，得到以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
制得的流感病毒疫苗进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为19.997～26.263nm，合格；2.经3000rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经20℃放置30天，纳米乳剂体系无变化，合格。
实施例3
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为50μg/(株.ml)；
B、按下列质量比备料：20g稀释流感病毒疫苗，20g注射用大豆油，40g聚乙二醇400，8g Tween80，12g Span80；
C、向混合搅拌瓶内加入8g Tween80，12g Span80，40g聚乙二醇400，40℃温度下持续搅拌，转速维持在200转/分钟，之后加入20g注射用大豆油，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗，同时维持转速在200转/分钟，搅拌至液体为透明，得到以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
制得的流感病毒疫苗进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为18.906～24.854nm，合格；2.经4000rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经26℃放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。
实施例4
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为180μg/(株.ml)
B、按下列质量比备料：3g稀释流感病毒疫苗，7g肉豆蔻酸异丙酯，20g聚乙二醇400，70g聚氧乙烯蓖麻油；
C、向混合搅拌瓶内加入70g聚氧乙烯蓖麻油，20g聚乙二醇400，30℃温度下持续搅拌，转速维持在300转/分钟，之后加入7g肉豆蔻酸异丙酯，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗，同时维持转速在300转/分钟，搅拌至液体为透明，得到以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
制得的流感病毒疫苗进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为16.6258～18.1162nm，合格；2.经6000rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经30℃放置20天，纳米乳剂体系无变化，合格。
实施例5
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗原液至血凝素浓度为120μg/(株.ml)；
B、按下列质量比备料：1g稀释流感病毒疫苗，1g注射用大豆油，1，2-丙二醇70g，聚氧乙烯蓖麻油14g，Span80 14g；
C、向混合搅拌瓶内加入14g聚氧乙烯蓖麻油，14g Span80，70g 1，2-丙二醇，50℃温度下持续搅拌，转速维持在100转/分钟，之后加入1g注射用大豆油，得混合物；
D、在上述混合物中缓慢滴入稀释的流感病毒疫苗，同时维持转速在100转/分钟，搅拌至液体为透明，得到以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
制得的流感病毒疫苗进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为18.378～21.222nm，合格；2.经8000rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经60℃放置7天，纳米乳剂体系无变化，合格。
免疫效果试验：
用实施例1提供的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗注射小鼠。小鼠为标准体重昆明种雄性小鼠，每只注射血凝素含量相当于按照体重换算的成人剂量的10倍的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。0d接种一针，21d补种一针，每隔7d采尾血分离血清测定血凝抑制效价。同时设立注射等量生理盐水的空白对照组、等血凝素含量的Al(OH)3佐剂流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的流感疫苗对照组。
图1为等量生理盐水空白对照组、等血凝素含量的流感疫苗单独注射组、等血凝素含量的Al(OH)3佐剂流感疫苗组、等血凝素含量的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗组，其四个组注射昆明种小鼠，每隔7天采尾血，分离血清测定血凝抑制效价的比较图。其中未经疫苗注射的空白对照组小鼠血清血凝抑制效价均为0；其余三组疫苗接种8周内的血凝抑制效价见表1。
表1不同接种组在8周内的血凝抑制效价变化
自首次接种后每隔一天称量体重，各组小鼠平均体重变化直观表现见图2。计算出前6天内单独流感疫苗组、以纳米乳剂为佐剂的流感疫苗组和空白对照组的每只小鼠增加的体重，并进行方差分析以确认以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗对小鼠机体的刺激性。各组小鼠6天内体重变化见表2。
表2各组小鼠首次接种后6天内体重增长数据表
使用SPSS V13.0对以上数据进行方差分析，以确定变化的显著性。数据描述见表3。
表3数据描述表
方差分析见表4，由方差分析表可见，实际计算的差异显著性水平Sig.＝0.960＞0.05，表明三组小鼠体重增长并无显著差异。F值＝0.041＜F0.05(2，12)＝3.89，同样表明三组小鼠体重增长并无显著差异。证明纳米乳剂型佐剂对小鼠机体刺激性较小，对其生长并无显著影响。
表4方差分析表
通过以上数据可见，以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗的增强作用远远优于传统的以Al(OH)3为佐剂的流感疫苗，能够提高流感疫苗的生物利用度，减少每次接种剂量，并且对动物的刺激性较小，制备方法简单，可作为流感疫苗的新型佐剂，并且可作为其它疫苗的佐剂候选。
Claims (6)
1.一种以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于由下列质量比的组分组成：
稀释流感病毒疫苗 1～30％
油相 1～50％
乳化剂 20～70％
助乳化剂 20～70％。
2.如权利要求1所述的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于所述稀释流感病毒疫苗为将流感病毒疫苗原液或半成品或成品用注射用水稀释到血凝素含量为15～180μg/株.ml的流感病毒疫苗。
3.如权利要求1所述的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯IPM或油酸乙酯EO或注射用大豆油中的一种。
4.如权利要求1所述的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于所述乳化剂为常规的Tween80或聚氧乙烯蓖麻油EL中的一种，或者为质量混合比为3∶2～2∶3的常规Tween80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1∶1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。
5.如权利要求1所述的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗，其特征在于所述助乳化剂为常规的1，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。
6.一种如权利要求1所述的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
A、用注射用水稀释流感病毒疫苗至血凝素达15～180μg/株.ml，得稀释流感病毒疫苗；
B、按下列质量比备料：
稀释流感病毒疫苗 1～30％
油相 1～50％
乳化剂 20～70％
助乳化剂 20～70％
C、将乳化剂、助乳化剂和油相混合后，在20～60℃温度下，按50-500转/分钟的转速，搅拌均匀，得混合溶液；
D、将步骤A所得的稀释流感病毒疫苗缓慢滴入步骤C中的混合溶液中，同时按50-500转/分钟的速度搅拌混合，直至得到均匀分散的透明的以纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。
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