CN102028945B - 螺旋藻多糖免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种螺旋藻多糖免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗，其特征在于所述螺旋藻多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成：螺旋藻多糖0.001～100%，载体0～99.999%。可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量，以螺旋藻多糖为佐剂使用的疫苗抗原用量，仅是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，同样可以达到理想的免疫保护效果，且其安全性高、副作用小，用螺旋藻多糖为佐剂的流感疫苗，制备方法简便，疫苗质量容易控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种螺旋藻多糖免疫佐剂，还涉及含有螺旋藻多糖免疫佐剂的流感疫苗，属于生物技术领域。
技术背景
螺旋藻(Spirulina)是一种营养丰富，分布广泛，且极具开发潜力的水生生物资源，1974年联合国粮农组织会议确定其为“最佳蛋白源之一”和“全球人类最理想的食品”。研究表明，螺旋藻多糖（PSP）具有促进细胞生长、提高机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等功能，是螺旋藻体中的重要天然生物活性物质之一，也是目前国内外海洋药物研究开发的热点。
螺旋藻多糖是采用现代化生物化学技术与工艺，从螺旋藻中提取的，含多种且生物活性更高的纯天然生物制品，它是九十年代中期开发出的。螺旋藻多糖被广泛用于化妆、保健、医药等行业。
研究表明螺旋藻多糖具有免疫调节作用，从云南螺旋藻中分离纯化出螺旋藻多糖。腹腔内注射能显著增加小鼠脾重，促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能及小鼠血清溶血素的形成，对环磷酰胺所致小鼠免疫器官萎缩，白细胞减少，腹腔巨噬细胞吞噬功能降低及小鼠血清溶血素的形成减少等有明显对抗作用。同时具有明显提高荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用，以MTT法检测的荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化和对NK细胞活性的影响,也显示具有提高淋巴细胞转化率和促进NK细胞杀伤靶细胞的作用。
另外，螺旋藻多糖还具有促进细胞生长、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗衰老、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能的重要天然生物活性物质。
佐剂是一类能增强抗原的免疫原性、提高疫苗效果的物质，正是佐剂技术,使国产疫苗在价格上具有明显优势。在流感疫苗中使用佐剂不仅可以增强免疫原性，还可以降低抗原用量。特别在应对大流行流感时，使用佐剂降低抗原用量进而扩大接种人群数量的特性显得尤为重要。在大流行流感疫苗研究中应用到的佐剂主要有:铝佐剂(氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝)、MF59(是一种水包油的乳剂,包含1%鲨烯, 0.5%Tween80和0.5%三油酸聚山梨脂的水包油乳液)、LTK63和新型佐剂等。
目前上市流感疫苗使用的佐剂主要是铝佐剂和MF59。但事实上铝佐剂对蛋白亚单位疫苗诱导抗体产生的能力较弱, 不能有效地诱导免疫应答, 在一些情况下还可产生与超敏反应有关的IgE；MF59作为佐剂使用在增免疫原性的同时,也增强了反应原性,如接种部位红、肿、热、痛等症状增加。此外，由于安全性、副作用等问题，LTK63和新型佐剂等其他物质，包括壳聚糖、ISCOMs等作为流感疫苗佐剂也还只限于研究阶段。因此，随着各种新发流感在世界的爆发和对人感染性的增强, 加快新型流感疫苗的研究,寻求更高安全性和免疫原性的佐剂仍然是流感疫苗发展的一个需要。
佐剂发挥作用是由于能增强抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐剂一般可在多种疫苗中进行使用，如目前的铝佐剂。所以佐剂的研究不仅对流感，而且对其它感染性疾病的防治也有很高的价值。
流行性感冒（简称流感）是指由流感病毒引起，具有高度传染性的急性呼吸道传染病。流感发病快，传染性强，发病率高，主要通过空气飞沫传播。流感的流行没有明显的季节性,只是冬末春初发病率稍高一点，而且几乎每年都会发生,或者局部爆发,或者大规模流行，甚至造成世界规模的大流行，严重危害了人类的健康和生命，给社会造成了沉重的负担。到目前为止，接种流感疫苗被认为是预防流感发生与传播的最佳方法。由于流感病毒变异很快，通常每年的流行类型都有所不同，生产企业一般都在世界卫生组织（WHO）指导下选择流感病毒毒株进行疫苗生产，每年接种最新的流感疫苗才能达到预防的效果。一旦流感病毒变异造成大规模流行或者是世界性流行，疫苗需求量会大量增加，但由于目前流感疫苗生产工艺的限制，短时间内不可能提供足量疫苗，所以，应用免疫佐剂，减少疫苗用量并提高其效果就显得非常重要。
经系统查阅文献和专利，目前未发现关于螺旋藻多糖具有免疫佐剂作用的报道。
发明内容
为解决目前免疫佐剂单一，副作用难以避免，疫苗生产供应量有限，难以应付感染性疾病暴发时疫苗需求量大，疫苗起效时间慢等问题，本发明提供一种能提高疫苗免疫效果，同时带来巨大的经济效益和社会效益的螺旋藻多糖免疫佐剂。
本发明的另一个目的在于提供一种含有螺旋藻多糖免疫佐剂的流感疫苗。
本发明提供的螺旋藻多糖免疫佐剂是由下列质量比的组分组成的：
螺旋藻多糖 0.001～100%
载体 0～99.999%。
所述载体由下列质量比的组分组成：
乳化剂 20～70%
助乳化剂 20～70%
油相 1～50%
水相 1～30%。
所述乳化剂为常规的Tween80或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3∶2～2∶3的常规Tween80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1∶1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物。
所述助乳化剂为常规的1，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种。
所述油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种。
所述水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。
本发明提供的螺旋藻多糖免疫佐剂，优选下列质量比：
螺旋藻多糖 0.1～100%
载体 0～99.9%。
本发明提供的一种含有螺旋藻多糖免疫佐剂的流感疫苗的组成是：螺旋藻多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为75~150000，其中，所述螺旋藻多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成：
螺旋藻多糖 0.001～100%
载体 0～99.999%。
所述螺旋藻多糖为市售产品。
本发明提供的螺旋藻多糖免疫佐剂与传统氢氧化铝佐剂相比，具有以下优点：
1）螺旋藻多糖制备方法简单、经济、环保。
2）螺旋藻多糖是一种天然物质，常作为保健品使用。螺旋藻多糖作为免疫佐剂的应用，以流行性感冒（简称流感）病毒疫苗为例得到了应用性的实验结果，在流感疫苗中作为佐剂使用，其安全性高、副作用小。例如用含螺旋藻多糖的流感疫苗肌肉注射小鼠，4小时内观察小鼠活动性无明显减弱，未见全身不良反应。而用含氢氧化铝佐剂流感疫苗注射，可观察到小鼠活动性明显减弱，注射局部肿胀明显。
3）用螺旋藻多糖为佐剂的流感疫苗，制备方法简便，疫苗质量容易控制；而以氢氧化铝为佐剂制备流感疫苗，制备和存储过程中，影响因素较多，对于疫苗的质量较难控制。
4）用螺旋藻多糖作为流感疫苗佐剂，可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗抗原用量。例如通过以螺旋藻多糖为佐剂的流感疫苗和以氢氧化铝为佐剂的流感疫苗免疫小鼠发现，以螺旋藻多糖为佐剂使用的疫苗抗原用量即使是以氢氧化铝为佐剂的疫苗抗原用量的一半或者更少，同样可以达到理想的免疫保护效果。
附图说明
图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化；
图2为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价；
图3为不同接种组在接种后7天内的体重增长情况；
图4为不同接种组在加免后2周的血凝抑制抗体效价。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。
本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。
实施例1
纳米乳剂载体的制备：
1）按下列质量比备料：3g注射用水, 3g注射用大豆油, 2g聚乙二醇400, 1.2g Tween80，0.8g Span80；
2）向混合搅拌瓶内加入1.2g Tween80，0.8g Span80，及2g聚乙二醇400，在转速为200转/分钟，室温条件下，持续搅拌1～10分钟，混匀后加入3g注射用大豆油，混合均匀得混合物；
3）在上述2）的混合物中滴入3g注射用水，同时在转速为200转/分钟，室温下，搅拌混合物至液体为透明，得到纳米乳剂；
4）对3）制得的纳米乳剂进行如下检测：1.经马尔文粒径检测仪检测，粒径范围为28.985～56.493nm，合格；2.经3000rpm，15min离心分离，纳米乳剂体系不分层，合格；3.经4℃放置50天，纳米乳剂体系无变化，合格。
实施例2
1）称取市购的螺旋藻多糖10mg，溶于1000μl无水乙醇中，制成螺旋藻多糖溶液，备用；
2）将上述1）制备的螺旋藻多糖溶液与1075μl市购的H3N2流感病毒裂解疫苗（血凝素含量为43.67μg/ml）混合，然后再向其混合物中加入925μl生理盐水，得总体积为3000μl的含螺旋藻多糖的流感疫苗，备用；
3）称取3g注射用大豆油, 2g聚乙二醇400, 1.2g Tween80，0.8g Span80于搅拌瓶中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌1～10分钟，至充分混匀，得混合溶液；
4）在上述3）的混合溶液中缓慢滴入2）的含螺旋藻多糖的流感疫苗3000μl，同时维持转速在200转/分钟，搅拌至呈淡红棕色的透明溶液，得到以螺旋藻多糖、纳米乳剂为佐剂的流感病毒疫苗。其中：螺旋藻多糖的质量比为0.143%，载体质量比为99.857%；螺旋藻多糖纳米佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为：149467。
用实施例2制备的螺旋藻多糖纳米乳剂流感病毒疫苗肌肉注射标准体重昆明种雌性小鼠，每只小鼠200μl。此200μl注射疫苗中流感疫苗血凝素含量为0.94μg，螺旋藻多糖0.2mg。同时设立注射等量的生理盐水空白对照组、等血凝素含量的Al(OH)3佐剂流感疫苗的佐剂对照组、等血凝素含量的单独流感疫苗对照组。间隔3周，免疫2次。于首次免疫后第一周开始，每隔7天采尾血，分离血清测定血凝抑制抗体效价。所测结果显示藻多糖纳米乳剂型佐剂疫苗组血凝抑制抗体效价水平整体明显高于铝佐剂组及单独疫苗组，具体结果见附图1。
实施例3
1）称取市购的螺旋藻多糖7.6mg，溶于400μl无水乙醇中，得螺旋藻多糖溶液，备用；
2）将1）的螺旋藻多糖溶液与3.4ml市购的H3N2流感病毒裂解疫苗（血凝素含量43.67μg/ml）混合，得3.8ml含螺旋藻多糖的流感疫苗；
3）取1.1g聚氧乙烯蓖麻油,1.6g Span80, 6g 1，2-丙二醇，3g肉豆蔻酸异丙酯放于搅拌瓶中，转速维持在200转/分钟，室温搅拌10分钟，至充分混匀，得混合溶液；
4）在上述3）的混合溶液中缓慢滴入2）制备的含螺旋藻多糖的流感疫苗3.8ml，同时维持转速在200转/分钟，搅拌至溶液为淡黄色透明，得到以螺旋藻多糖、纳米乳剂载体为佐剂的流感病毒疫苗，其中：螺旋藻多糖的质量比为0.065%，载体质量比为99.935%；螺旋藻多糖纳米乳剂与流感疫苗血凝素的质量比为：78850。
实施例4
1）制备下列不同的佐剂或溶液：
a）取市购的螺旋藻多糖0.2 mg，溶于30ul无水乙醇，然后与110μl生理盐水混合，得140ul螺旋藻多糖溶液，备用；
b）取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝12.5 μl，其中含AL(OH)3 0.2mg，加入生理盐水至体积为140 μl，备用；
c）140 μl生理盐水，备用；
d）200 μl生理盐水，备用；
2）制备下列不同的疫苗：
取血凝素含量为43.67 μg/ml的市购H3N2流感病毒裂解疫苗60μl，分别和上述a、b、c不同溶液混合，分别得到含有螺旋藻多糖免疫佐剂的流感疫苗样品A、含有AL(OH)3佐剂的流感疫苗样品B、单独的流感疫苗样品C、不加疫苗仅为生理盐水的空白对照样品D。所配置的上述A、B、C、D四个样品均制备五份，体积均为200 μl，备用；其中含有螺旋藻多糖的流感疫苗样品A中：螺旋藻多糖质量比为100%，载体质量比为0 %；螺旋藻多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为76；
3）免疫接种及检测：
用上述2）所配的A、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雌性昆明小鼠，每组5只，每只肌肉注射200μl，间隔3周，免疫2次。于加免后2周取尾血，分离血清测定血凝抑制效价，所测结果显示螺旋藻多糖佐剂组血凝抑制抗体效价水平明显高于铝佐剂组及单独疫苗组，具体结果见附图2。并于第一天接种前和接种后第8天对各组小鼠进行体重测量，对7天内各组平均增长的体重进行计算，所测结果显示藻多糖佐剂组较之铝佐剂组及单独疫苗组小鼠体重增长受影响最低，并与空白对照组相比，小鼠体重增长幅度反而较大，可能是由于螺旋藻多糖本身具有一定的补益作用，具体结果见附图3。
实施例5
A、取市购的螺旋藻多糖0.3 mg，溶于40μl无水乙醇，再与130μl生理盐水混合，然后加入市购的H3N2流感裂解疫苗30μl至终体积为200 μl，含H3N2流感裂解疫苗的血凝素含量为1.31μg，得含有螺旋藻多糖的流感病毒疫苗，备用；其中：螺旋藻多糖的质量比为100%，载体质量比为0 %；螺旋藻多糖佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为：229。
B、取H3N2流感裂解疫苗60 μl，其中含血凝素2.62μg，与140 μl生理盐水混合至终体积为200 μl，作为单独疫苗对照组，备用；
C、取浓度为15.98 mg/ml的氢氧化铝佐剂12.5 μl，其中含0.2mg AL(OH)3，与含血凝素为2.62μg的流感疫苗60 μl混合，然后加入生理盐水至终体积200 μl，作为AL(0H)3佐剂疫苗对照组，备用：
D、生理盐水200 μl，为空白对照组，备用；
F、免疫接种及抗体检测：
将上述配好的A、B、C、D四个样品分别免疫标准体重昆明雌性小鼠，肌肉注射，每只200 μl，每组5只，间隔3周，免疫2次，于加免后2周进行尾部采血，分离血清，检测血凝抑制抗体效价，所测结果显示，即使在螺旋藻多糖佐剂疫苗组HA（1.31ug）含量减半的情况下，所产生的血凝抑制抗体效价水平也稍微高于HA含量为2.62ug的铝佐剂组及单独疫苗组，说明螺旋藻多糖佐剂能明显降低疫苗抗原用量，具体结果见附图4。
Claims (2)
1.一种螺旋藻多糖在制备免疫佐剂中的应用，其特征在于由下列质量比的组分组成：
螺旋藻多糖 0.1～100%
载体 0～99.9%；
所述载体由下列质量比的组分组成：
乳化剂 20～70%
助乳化剂 20～70%
油相 1～50%
水相 1～30%；
其中：
乳化剂为常规的Tween80或聚氧乙烯蓖麻油中的一种，或者为质量混合比为3∶2～2∶3的常规Tween80与Span80的混合物，或者为质量混合比为1∶1的常规聚氧乙烯蓖麻油与Span80的混合物；
助乳化剂为常规的1，2-丙二醇或聚乙二醇400中的一种；
油相为常规的肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一种；
水相为注射用水或者含有药物或疫苗成分的注射用水溶液。
2.一种如权利要求1所述螺旋藻多糖免疫佐剂在制备流感疫苗中的应用，其特征在于：螺旋藻多糖免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为75~150000，其中，所述螺旋藻多糖免疫佐剂由下列质量比的组分组成：
螺旋藻多糖 0.1～100%
载体 0～99.9%。
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