CN117442716B - 兽用疫苗佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种兽用疫苗佐剂及其制备方法和应用。本发明所述兽用疫苗佐剂由包括特定重量百分比的注射用油、精制司本‑80、精制吐温‑80、卡波姆和香菇多糖制备得到，其获得的产品性质稳定，可解决溶液因表面张力改变而引起的疫苗乳剂不稳定的问题，有助于延长疫苗保质期并改善疫苗品质，同时，香菇多糖的添加能显著提升疫苗产生高水平免疫反应。
Description
技术领域
本发明涉及兽用疫苗佐剂技术领域，尤其涉及一种兽用疫苗佐剂及其制备方法和应用。
背景技术
表面张力是一种特殊的力，它是液体(纯净液体、溶液)性质的一种表现，从微观上看，表面张力是因液体表面薄层内分子间的相互作用，它不同于液体内部分子间的相互作用，从而使液体表面层具有一种特殊性质，表面张力是分子力的一种宏观表现，在内聚力的作用下，表面层液体分子的移动总是尽量地使表面积减小。在液体表面形成一层弹性薄膜，这样便出现了表面张力。表面张力起源于分子引力，从其作用效果来看，它属一种拉力。不同液体表面张力不同，是由于它们有不同的摩尔体积、分子极性和分子力。分子间作用力越大，密度越大，越不容易蒸发的液体，其表面张力越大，比如：水分子是由氢键缔合的，因此水的表面张力较大。液态汞原子是由金属键缔合的，其表面张力更大。一般液体表面张力系数约为40mN/m左右。
乳化剂是一种双亲分子，是有一个亲油端及一个亲水端在体系中，分散相称为不连续相，是一种能够调整液体表面张力的物质，其作用机理是通过改变液体表面的力学性质，降低液体表面张力，加强液体间相互作用力，从而实现互不相溶的水、油两相得以乳化形成均匀、稳定的乳状液，保持油和水的两相稳定。乳化剂表面张力的具体数值与乳化剂的种类、浓度、温度等因素有关。通过调整乳化剂的种类、浓度和温度等因素，可以获得理想的乳化效果和有效降低溶液表面张力值。在正常情况下，乳化剂的浓度越高，则表面张力值越低。一般来说，表面张力使用的标准单位是mN/m（米牛顿/米）。在温度为20℃的常温下，常用的几种乳化剂如矿物油表面张力是30-35mN/m，吐温-80表面张力是25-30 mN/m，司本-80表面张力是30-45 mN/m。
兽用疫苗种类繁多，制备工艺包含上游病毒分离、增殖、浓缩、纯化、灭活等，下游包含疫苗制剂冻干、乳化。乳化过程将抗原包覆于油滴中，抗原水相与佐剂油相混合形成疫苗制剂时，依赖油相中的乳化剂降低水相和油相的表面张力。而在上游的一系列培养工艺中因病毒液培养方式、浓缩纯化方法、及各类工艺不同，使得不同的疫苗其抗原表面张力有所不同，盲目的选择佐剂或乳化剂，导致疫苗制剂保存期内出现各类性状和稳定性的改变，甚至保存期内出现水油分离，严重影响产品品质。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种兽用疫苗佐剂，可解决溶液因表面张力改变而引起的疫苗乳剂不稳定的问题。
具体地，本发明提供的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种兽用疫苗佐剂，该兽用疫苗佐剂由原料制备得到，所述原料按照重量百分比计包括：75wt%-86wt%的注射用油、1wt%-10wt%的精制司本-80、10wt%-20wt%的精制吐温-80和1wt%-5wt%的卡波姆和1wt%-3wt%的香菇多糖；所述精制司本-80由司本-80经H2O2预处理得到；所述精制吐温-80由吐温-80经H2O2预处理得到。
本发明在前期研发过程中发现，采用常规市售来源的乳化剂配制兽用水包油包水佐剂，其虽然能获得一些性质稳定且效果符合预期的佐剂产品，但存在批间稳定性差异较大等问题，给疫苗生产带来较大的经济损失。本发明在兽用疫苗上游研发的基础上收集了大量不同兽用疫苗病毒的抗原样本，并进一步检测得到大量水相抗原的表面张力数据，进而根据表面张力数据情况调整疫苗佐剂组分和用量。在此过程中，本发明将精制司本-80、精制吐温-80、卡波姆和香菇多糖共同用于配制兽用疫苗佐剂，最终获得了一种具有良好稳定性的兽用疫苗佐剂。各组分在前述特定用量比例下，获得的产品性质稳定，可解决溶液因表面张力改变而引起的疫苗乳剂不稳定的问题，进而有助于延长疫苗保质期并改善疫苗品质，提高产品价值。
在本发明中，精制司本-80、精制吐温-80配合卡波姆能更好地对抗原水相表面张力进行调整，进而使油相的表面张力与水相的表面张力相匹配。进而使获得的兽用疫苗产品质量稳定、保存期更长。同时，本发明在兽用疫苗佐剂原料中还添加了香菇多糖，在各组分的协调配合下，香菇多糖的免疫增强效果明显，且令人惊讶的是超过保存期后的疫苗制剂还能够诱发机体产生合格的抗体（例如保存24个月的口蹄疫O型灭活疫苗免疫仔猪后4个月的抗体效价仍达到1:256）。
在本发明所述兽用疫苗佐剂中，所述注射用油的含量为75wt%-86wt%，所述精制司本-80的含量为1wt%-10wt%，所述精制吐温-80的含量为10wt%-20wt%，所述卡波姆的含量为1wt%-5wt%，所述香菇多糖的含量为1wt%-3wt%。可选地，所述注射用油的含量为75wt%、76wt%、77wt%、78wt%、79wt%、80wt%、81wt%、82wt%、83wt%、84wt%、85wt%、86wt%或者上述任意两数值构成的区间范围内的值。
可选地，所述精制司本-80的含量为1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、6wt%、7wt%、8wt%、9wt%、10wt%或者上述任意两数值构成的区间范围内的值。
可选地，所述精制吐温-80的含量为10wt%、11wt%、12wt%、13wt%、14wt%、15wt%、16wt%、17wt%、18wt%、19wt%、20wt%或者上述任意两数值构成的区间范围内的值。
可选地，所述卡波姆的含量为1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%或者上述任意两数值构成的区间范围内的值。
可选地，所述香菇多糖的含量为1wt%、2wt%、3wt%或者上述任意两数值构成的区间范围内的值。本发明对所述注射用油、所述司本-80、所述吐温-80、所述卡波姆和所述香菇多糖的来源不作特别限定，本领域常规市售来源，符合兽用疫苗使用标准的产品均可。
在本发明提供的更为具体的实施方式中，所述注射用油包括注射用矿物油和/或注射用植物油。
优选地，所述注射用矿物油包括白油。
更优选地，所述白油包括Marcol-52白油、Primol 352白油、Total130#白油、Total150#白油、Total170#白油、Drakeol-5白油、Drakeol-7白油、Sonneborn 4#白油、Sonneborn 10#白油、PARACOS KF40、PARACOS KF50、角鲨烯或角鲨烷中的至少一种。
在本发明中，所述精制司本-80由司本-80经H2O2预处理得到；所述精制吐温-80由吐温-80经H2O2预处理得到。
优选地，所述预处理后，还包括过滤。
更优选地，所述过滤包括第一步粗滤和第二步精滤，所述第一步粗滤的孔径为0.4-0.65μm；所述第二步精滤的孔径为0.10-0.22μm。该过滤步骤获得的精制司本-80及精制吐温-80具有相较更好的乳化特性，用于兽用疫苗佐剂的制备，获得的兽用疫苗佐剂性质更稳定，相应的疫苗产品品质更好。
本发明对所述过滤使用的装置或器械不作特别限定，本领域常规装置或器械均可。
在本发明提供的更为具体的实施方式中：
所述精制司本-80的制备方法包括如下步骤：
（1）使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物；
（2）去除所述第一处理产物中未反应的H2O2，得到第二处理产物；
（3）对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80。
所述精制吐温-80的制备方法包括如下步骤：
（1）使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物；
（2）去除所述第三处理产物中未反应的H2O2，得到第四处理产物；
（3）对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。
本发明对去除H2O2的具体方法不作特别限定，本领域常规方法（如抽真空法等）均可。
在本发明提供的更为具体且优选的实施方式中，所述卡波姆购自陕西唐尧生物科技有限公司。
第二方面，本发明提供了所述兽用疫苗佐剂的制备方法，包括如下步骤：将注射用油加热至30-40℃，再加入精制司本-80、精制吐温-80、卡波姆和香菇多糖。
本发明提供的制备方法先将注射用油加热至30-40℃，再添加其他成分，有助于各原料更为快速的混合。
各组分混合后，优选还包括过滤步骤。
所述过滤步骤优选先对混合物用聚四氟乙烯滤膜进行0.45μm~0.65μm粗滤除去杂质，然后将滤液转接到无菌环境内，再用0.1μm~0.22 μm滤膜过滤除菌得到无菌佐剂。
本发明提供的制备方法步骤简单，适于工业化生产。
第三方面，本发明提供了所述兽用疫苗佐剂，或者所述制备方法制备得到的兽用疫苗佐剂在制备兽用疫苗中的应用。
在本发明中，所述兽用疫苗为水包油包水剂型。
进一步地，本发明所述兽用疫苗可以在水包油包水剂型基础上进一步配合本领域常用疫苗载体，组合获得相应兽用疫苗产品。
第四方面，本发明提供了一种兽用疫苗，其包括所述兽用疫苗佐剂，或者所述制备方法制备得到的兽用疫苗佐剂。
优选地，所述兽用疫苗还包括灭活抗原。
所述灭活抗原包括口蹄疫O型抗原、牛病毒性腹泻抗原、传染性鼻气管炎抗原、伪狂犬基因缺失标记抗原、牛流行热抗原、猪塞内卡抗原中的至少一种。
经验证，本发明提供的兽用疫苗性质稳定，免疫动物后获得的抗体效价较高。
有益效果：
本发明提供了一种兽用疫苗佐剂及其制备方法和应用。本发明所述兽用疫苗佐剂由包括特定重量百分比的注射用油、精制司本-80、精制吐温-80、卡波姆和香菇多糖，其获得的产品性质稳定，可解决溶液因表面张力改变而引起的疫苗乳剂不稳定的问题，进而有助于延长疫苗保质期并改善疫苗品质，提高产品价值。在进一步优选的方案中，使用本发明提供的兽用疫苗佐剂，其后续制备得到的兽用疫苗产品质量稳定、保存期更长，且令人惊讶的是超过保存期后的疫苗制剂还能够诱发机体产生合格的抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为实施例1制得的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图。
图2为实施例2制得的牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗粒径分布图。
图3为实施例3制得的伪狂犬基因缺失标记灭活疫苗（rPRV-3P1株）粒径分布图。
图4为实施例4制得的牛流行热灭活疫苗（ZJ株）粒径分布图。
图5为实施例5猪塞内卡病毒病灭活疫苗粒径分布图。
图6为比较例1制得的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图。
图7为比较例2制得的牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗粒径分布图。
图8为比较例3制得的伪狂犬基因缺失标记灭活疫苗（rPRV-3P1株）粒径分布图。
图9为比较例4制得的牛流行热灭活疫苗（ZJ株）粒径分布图。
图10为比较例5猪塞内卡病毒病灭活疫苗粒径分布图。
图11为比较例6制得的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图。
具体实施方式
针对由现有的油佐剂制备的疫苗可能存在稳定性的缺陷，本发明旨在提供一种动物疫苗用油佐剂，将其用于制备不同类型的灭活疫苗时，能够有效提高疫苗的质量稳定性，且能够有效提高疫苗的免疫持续期。本发明还提供了该油佐剂的制备方法。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。文中“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等适用于区分类似的对象，不作为特定顺序或先后次序的限定，也不作为对象个数的限定。
在本发明的第一方面，提供一种畜类动物疫苗用油佐剂，其原料按照重量百分比计可包括：75 wt%-86 wt%的注射用油、1 wt%-10 wt%的精制司本-80、10wt%-20 wt%的精制吐温-80、1 wt%-5wt%的卡波姆和1 wt%-3wt%的香菇多糖。
其中：
所述卡波姆是一种聚丙稀酸交联聚合物，可增强疫苗产品的稳定性，延长保存期，可以通过储库作用增强疫苗免疫能力。
所述香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，香菇多糖的免疫调节作用是其生物活性的重要基础，是典型的T细胞激活剂，促进白细胞介素的产生，还能促进单核巨噬细胞的功能，被认为是一种特殊免疫增强剂。其免疫作用特点在于它能促进淋巴细胞活化因子（LAE）的产生，释放各种辅助性T细胞因子，增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率，恢复或刺激辅助性T细胞的功能。另外，香菇多糖还能促进抗体生成，抑制巨噬细胞释放。是一种具有免疫调节作用的抗肿瘤辅助药物，能促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，提高NK细胞的活性。具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫、促进干扰素形成等作用。
所述精制司本-80可为通过以下方式对司本-80进行处理获得的产物，其中司本-80可为商售获得，也可以按照常规的司本-80制备方法获得：
1）使用H2O2对司本-80进行处理，使所述司本-80的颜色由深至浅变化，待所述司本-80的颜色不再变化时，得到第一处理产物。该步骤具体可包括以下操作：称取司本-80投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700 mmHg，釜内压力0.15-0.25 MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内司本-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15 min；
2）除去所述第一处理产物中未反应的H2O2（例如可通过抽真空脱水的方式），得到第二处理产物。该步骤具体可包括以下操作：待反应釜内司本-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时，将反应釜升温至110±5℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3-5 min；
3）对所述第二处理产物进行过滤，得到所述精制司本-80。该步骤具体可包括以下操作：停止步骤2）的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第二处理产物从反应釜中出料；出料连接0.40 μm-0.65 μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.10 μm-0.22 μm滤膜过滤除菌得到精制司本-80。
所述精制吐温-80可为通过以下方式对吐温-80进行处理获得的产物，其中吐温-80可为商售获得，也可以按照常规的吐温-80制备方法获得：
（1）使用H2O2对吐温-80进行处理，使所述吐温-80的颜色由深至浅变化，待所述吐温-80的颜色不再变化时，得到第三处理产物。该步骤具体可包括以下操作：称取吐温-80投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700 mmHg，釜内压力0.15-0.25 MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内吐温-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15 min；
（2）除去所述第三处理产物中未反应的H2O2（例如可通过抽真空脱水的方式），得到第四处理产物。该步骤具体可包括以下操作：待反应釜内吐温-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时，将反应釜升温至110±5℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3-5 min；
（3）对所述第四处理产物进行过滤，得到所述精制吐温-80。该步骤具体可包括以下操作：停止步骤（2）的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第四处理物从反应釜中出料；出料连接0.40 μm-0.65 μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.10 μm-0.22 μm滤膜过滤除菌得到精制吐温-80。
在本发明中，相对于使用市售的未经处理的司本-80和/或吐温-80配制的疫苗佐剂以及ISA206佐剂，使用精制司本-80和精制吐温-80配制的疫苗佐剂能够有效提高制备得到的疫苗的质量稳定性、安全性，并能够延长疫苗的保存期稳定性和免疫效力。
本发明以注射用油、精制司本-80和精制吐温-80，搭配卡波姆和香菇多糖，获得的油佐剂，其制备获得的疫苗不仅稳定性强，保存期达24个月，质量稳定，且能诱导机体产生高效的免疫反应。因此本发明提供的油佐剂是一种可用作不同畜类动物疫苗的安全有效的油佐剂。
在一些实施方式中，所述注射用油可包括注射用矿物油、注射用植物油、或其组合。
在一些实施方式中，所述注射用矿物油可包括白油。
在一些实施方式中，所述白油包括但不限于Marcol-52白油、Primol 352白油、Total130#白油、Total150#白油、Total170#白油、Drakeol-5白油、Drakeol-7白油和Sonneborn 4#白油、Sonneborn 10#白油、PARACOS KF40、PARACOS KF50、角鲨烯、角鲨烷，这些组分可从任何商业来源获得。
本发明疫苗佐剂的原料按照重量百分比计可包括：75 wt%-86 wt%的注射用油、1wt%-10 wt%的精制司本-80、10wt%-20 wt%的精制吐温-80、1 wt%-5 wt%的卡波姆、1 wt%-3wt%的香菇多糖；在这种情况下获得的油佐剂可进一步提供增强动物机体对疫苗中抗原的特异性免疫应答水平。
由本发明提供的油佐剂制备的动物疫苗产品为水包油包水颗粒，该颗粒为水包油包水的三层结构：最外层为水相（即抗原），中间层为油相（即本发明佐剂），内层为水相（即抗原）。当疫苗注射入机体后，颗粒随动物体体温而破裂，释放其中的抗原物质，进而将抗原递呈给抗原递呈细胞，经抗原递呈细胞处理后递呈给T细胞，诱导机体产生特异性免疫反应。
在本发明的第二方面，提供一种疫苗佐剂的制备方法，其可包括以下步骤：
S1：将按照重量百分比计为75 wt%-86 wt%的注射用油加热至30℃-40℃；
S2：将按照重量百分比计为1 wt%-10 wt%的精制司本-80、10 wt%-20 wt%的精制吐温-80、1 wt%-5 wt%的卡波姆和1 wt%-3 wt%的香菇多糖加入步骤S1中加热后的注射用油中，混匀后经过滤处理得到疫苗佐剂。
其中：所述精制司本-80和精制吐温-80均可为按照本发明的第一方面中描述的处理方法获得。所述卡波姆优选购自陕西唐尧生物科技有限公司，所述香菇多糖够自武汉克米克生物医药技术有限公司。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1
本实施例制备一种油佐剂作为疫苗佐剂，并利用该疫苗佐剂和口蹄疫O型全病毒灭活抗原MYA98株（由金宇保灵生物药品有限公司提供）按照质量1:1配制成口蹄疫O型灭活疫苗。
1.1、疫苗佐剂的制备方法包括以下步骤：
S1：对口蹄疫O型全病毒灭活抗原MYA98株进行表面张力的检测，测得的表面张力是27.88mN/m；
S2：将根据灭活抗原的表面张力选择最佳浓度的乳化剂制备油佐剂，以使其水相和油相的表面张力降低，便于形成稳定的疫苗乳剂，按照重量百分比计为84 wt%的Marcol-52白油加热至35℃；
S3：将按照重量百分比计为2 wt%的精制司本-80、12 wt%的精制吐温-80、1wt%的卡波姆、1wt%香菇多糖加入步骤S1中加热后的注射用油中，开启搅拌桨，搅拌速度200rpm/min，搅拌时间30min，混合均匀，经过滤处理（0.22μm滤膜）得到疫苗佐剂，测得的表面张力是27.92mN/m。其中：
步骤S3中所述精制司本-80通过以下方式获得：
1）称取司本-80（购自北京益利精细化学品有限公司），投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700 mmHg，釜内压力0.2 MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内司本-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15 min。
2）待反应釜内司本-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时（得到第一处理产物），将反应釜升温至110℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3min，得到第二处理产物。
3）停止步骤2）的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第二处理产物从反应釜中出料。出料连接0.45 μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.22 μm滤膜过滤除菌得到精制司本-80。
步骤S3中所述精制吐温-80通过以下方式获得：
（1）称取吐温-80（购自北京益利精细化学品有限公司），投入不锈钢反应釜内，开启搅拌至均匀搅拌，随后通入氮气减压升温至80±5℃/700 mmHg，釜内压力0.2 MPa，缓慢加入H2O2，为控制H2O2的添加量，量取少量H2O2，连接真空泵缓慢滴入，观察反应釜内吐温-80颜色的变化，颜色由深入浅变化时，停止加入H2O2，保持反应时间10-15 min。
（2）待反应釜内吐温-80颜色不再变化，且呈微黄澄清透明状时（得到第三处理产物），将反应釜升温至110℃，抽真空脱水将未反应的过量H2O2抽出反应釜，抽真空脱水时间3min（得到第四处理产物）。
（3）停止步骤（2）的抽真空，继续通入氮气保压降温，将第四处理产物从反应釜中出料。出料连接0.45 μm过滤装置以对料液进行粗滤除去未反应物，然后将滤液转接到无菌环境内，再次用0.22 μm滤膜过滤除菌得到精制吐温-80。
1.2、口蹄疫O型灭活疫苗的配制方法包括以下步骤：
将疫苗佐剂与口蹄疫O型抗原液（146S浓度为15ug/ml）按照1:1的质量比混合，在30-32℃，600 rpm/min下乳化15分钟，制备成口蹄疫O型灭活疫苗。
如图1所示本实施例获得的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.089-0.393 μm。
实施例2
本实施例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，抗原因种类不同其表面张力不同，具体地：
本实施例制备的疫苗是牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗，测得牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联抗原液（由金宇保灵生物药品有限公司提供）的表面张力是68.66mN/m。
本实施例制备疫苗佐剂的原料为：77 wt%的Marcol-52白油、5 wt%的精制司本-80和15 wt%的精制吐温-80，2wt%的卡波姆，1wt%香菇多糖，测得的表面张力是67.99mN/m。
如图2所示本实施例制备得到的牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.112-0.932 μm。
实施例3
本实施例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和伪狂犬基因缺失标记灭活疫苗（rPRV-3P1株），不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，抗原因种类不同其表面张力不同，具体地：
本实施例制备疫苗是伪狂犬基因缺失标记灭活疫苗（rPRV-3P1株），测得伪狂犬基因缺失标记（rPRV-3P1株）抗原液（由金宇保灵生物药品有限公司提供）的表面张力是43.12mN/m。
本实施例制备疫苗佐剂的原料为：80 wt%的Marcol-52白油、3 wt%的精制司本-80和13.5wt%的精制吐温-80，1.5wt%的卡波姆，2wt%香菇多糖，测得的表面张力是43.54mN/m。
如图3所示本实施例制备得到的伪狂犬基因缺失标记灭活疫苗（rPRV-3P1株）的粒径分布图，可见其粒径约为0.106-0.393 μm。
实施例4
本实施例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和牛流行热灭活疫苗（ZJ株），不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，抗原因种类不同其表面张力不同，具体地：
本实施例制备疫苗是牛流行热灭活疫苗（ZJ株），测得牛流行热抗原液（由金宇保灵生物药品有限公司提供）的表面张力是55.60mN/m。
本实施例制备疫苗佐剂的原料为：79 wt%的Marcol-52白油、4 wt%的精制司本-80和14wt%的精制吐温-80，1.5wt%的卡波姆，1.5wt%香菇多糖，测得的表面张力是56.01mN/m。
如图4所示本实施例制备得到的牛流行热灭活疫苗（ZJ株）的粒径分布图，可见其粒径约为0.114-0.988 μm。
实施例5
本实施例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和猪塞内卡病毒病灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，抗原因种类不同其表面张力不同，具体地：
本实施例制备疫苗是猪塞内卡病毒病灭活疫苗，测得塞内卡抗原液（由金宇保灵生物药品有限公司提供）的表面张力是21.09mN/m。
本实施例制备疫苗佐剂的原料为：84 wt%的Marcol-52白油、2 wt%的精制司本-80和11wt%的精制吐温-80，1wt%的卡波姆，2wt%香菇多糖，测得的表面张力是56.01mN/m。
如图5所示本实施例制备得到的猪塞内卡病毒病灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.128-0.996μm。
比较例1-5
比较例1-5将SEPPIC ISA206疫苗佐剂与实施例1-5不同的灭活抗原按照1:1的质量比混合，在30-32℃，600 rpm/min下乳化15分钟，制备成不同的灭活疫苗，测得的SEPPICISA206的表面张力是23.67mN/m。
比较例1制备疫苗所用的抗原类型和浓度与实施例1相同，测得抗原的表面张力是27.88mN/m。
如图6所示本比较例制备得到的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.117-0.999 μm。
比较例2制备疫苗所用的抗原类型和浓度与实施例2相同，测得抗原的表面张力是68.66mN/m。
如图7所示本比较例制备得到的牛病毒性腹泻、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.141-3.059μm。
比较例3制备疫苗所用的抗原类型和浓度与实施例3相同，测得抗原的表面张力是43.12mN/m。
如图8所示本比较例制备得到的伪狂犬基因缺失标记灭活疫苗（rPRV-3P1株）的粒径分布图，可见其粒径约为0.049-0.910μm。
比较例4制备疫苗所用的抗原类型和浓度与实施例4相同，测得抗原的表面张力是55.60mN/m。
如图9所示本比较例制备得到的牛流行热灭活疫苗（ZJ株）的粒径分布图，可见其粒径约为0.117-3.059μm。
比较例5制备疫苗所用的抗原类型和浓度与实施例5相同，测得抗原的表面张力是21.09mN/m。
如图10所示本比较例制备得到的猪塞内卡病毒病灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.128-3.059μm。
比较例6
本比较例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型全病毒MYA98株灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，具体地：
本比较例制备疫苗是口蹄疫O型全病毒MYA98株灭活疫苗，所用的抗原类型和浓度与实施例1相同，测得抗原表面张力是27.88mN/m。
本比较例制备疫苗佐剂的原料为：80 wt%的Marcol-52白油、5 wt%的精制司本-80和15 wt%的精制吐温-80，测得的表面张力是67.99mN/m。
如图11所示本比较例制备得到的口蹄疫O型灭活疫苗的粒径分布图，可见其粒径约为0.117-3.112μm。
比较例7
本比较例按照实施例1的操作步骤制备佐剂和口蹄疫O型全病毒MYA98株灭活疫苗，不同之处仅在于：
本比较例制备疫苗佐剂中精制司本-80精制吐温-80替换为司本-80和吐温-80（均购自北京益利精细化学品有限公司），测得的表面张力是47.99mN/m。
比较例8
本比较例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型全病毒MYA98株灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，具体地：
本比较例制备疫苗佐剂的原料为：84 wt%的Marcol-52白油、2 wt%的精制司本-80和12 wt%的精制吐温-80，1wt%的卡波姆，测得的表面张力是29.92mN/m。
比较例9
本比较例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型全病毒MYA98株灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料中各成分的含量不同，具体地：
本比较例制备疫苗佐剂的原料为：84 wt%的Marcol-52白油、2 wt%的精制司本-80和12 wt%的精制吐温-80，1wt%的香菇多糖，测得的表面张力是40.09mN/m。
比较例10
本比较例按照实施例1的操作步骤制备疫苗佐剂和口蹄疫O型全病毒MYA98株灭活疫苗，不同之处仅在于制备疫苗佐剂的原料不同，具体地：
本比较例制备疫苗佐剂的原料为：84 wt%的Marcol-52白油、2 wt%的精制司本-80和12 wt%的精制吐温-80，1wt%的壳聚糖（购自德国默克公司），1wt%的黄芪多糖（够自西安天瑞生物技术有限公司），测得的表面张力是40.31mN/m。
实验例1
本实验例对上述制备的实施例1-5和比较例1-6的疫苗理化性质进行检验，包括观察疫苗的外观、剂型和检测疫苗的pH值，并通过以下方式检验疫苗的黏度、稳定性和粒径分布情况。
黏度检验：从实施例1-5和比较例1-6制备的不同的灭活疫苗中各吸取1 mL，分别缓缓加入样品杯内，在扭矩40%-60%、转子转速6-16 r/min的条件下，用黏度计测定疫苗黏度。
粒径分布检验：从实施例1-5和比较例1-6制备的不同的灭活疫苗中各吸取1 mL，用美国贝克曼粒径仪检测器探测散射光强度，计算颗粒粒度分布。
稳定性检验：以8000rpm，离心15min的条件分别对实施例1-5和比较例1-6制备的不同的灭活疫苗进行处理。
疫苗理化性质检验结果如下表1所示，可见实施例1-5和比较例1-6的疫苗的外观均为乳白色略带粘滞性乳状液，剂型均为WO/W型，pH值均在7-8范围内。相对于比较例1-6的疫苗，实施例1-5制备的灭活疫苗的黏度均较低，有利于疫苗的注射，减少应激反应；且实施例1-5的疫苗经过离心处理后均无水相，表现出稳定性高的优点，有利于疫苗的长时间储存；2-8℃放置18个月后检测疫苗黏度、稳定性及粒径，实施例1-5未出现异常指标，仍表现出极强的稳定性，比较例1-6则出现黏度增加、离心有水相析出和粒径多峰等不稳定性结果。
表1：疫苗理化性质检验结果
实验例2
本实验例对实施例1和比较例1、比较例6的疫苗的免疫效力进行检验。
挑选28日龄抗体阴性的仔猪20头（细胞中和抗体效价不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4，且3ABC抗体检测为阴性），分为4组，每组5头，每头肌肉注射疫苗2.0ml上述实施例1、比较例1和比较例6制得的口蹄疫O型灭活疫苗，另5头作为空白对照组，不免疫疫苗。分别于注射后第28天、60天、90天、120天、150天、180天，用液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性）对各实验组仔猪测定抗体效价，并分别于注射前三天、注射后第1天、注射后第2天、注射后第3天，到注射后第14天的上午和下午监测各实验组和空白对照组仔猪的体温，同时观察各组仔猪的采食活动及注射后部位有无肿胀、结节、溃烂等情况并记录。各实验组仔猪的抗体效价测定结果如下表2所示，各组仔猪的体温监测结果如下表3所示。
表2：各组仔猪的抗体效价测定结果
表3：各组仔猪的体温监测结果（以各组仔猪监测体温的平均值计，单位℃）
由上表2所记载的结果可知，实施例1、比较例1和比较例6的三组口蹄疫O型灭活疫苗在免疫28天至免疫180天，阻断ELISA抗体有相似的趋势，在免后60天-90天达到峰值，免后120天开始下降，但比较三组的个体值及抗体平均水平，发现实施例1较比较例1和比较例6，表现出较高的抗体水平、较好的整体度及较长的免疫持续期。比较例1在免疫后28天，100%的个体抗体效价大于1:360，免后60天至120天，抗体值仍然保持在1:360及以上，免后150天至180天抗体开始下降，最低值为1:90。比较例1在免后28天至免后150天，因个体差异较大，抗体效价平均值低于实施例1，保持在1:256以上，抗体持续期也较差。比较例6因佐剂配方中无卡波姆和香菇多糖，在抗体上升阶段及持续期阶段，均低于实施例1和比较例1，且抗体整齐度较差。由上表3所记载的结果可知，实施例1、比较例1和比较例6的三组口蹄疫O型灭活疫苗免后体温基本趋于正常，无明显的升高，未出现疫苗引起的局部或全身不良反应，注射部位正常。因此，三组口蹄疫O型灭活疫苗安全性均合格。
实验例3
本实验例对实施例1和比较例7-10的疫苗的免疫效力进行检验。
挑选28日龄抗体阴性的仔猪30头（细胞中和抗体效价不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4，且3ABC抗体检测为阴性），分为5组，每组5头，每头肌肉注射疫苗2.0ml上述实施例1、比较例7、比较例8、比较例9、和比较例10的制得的口蹄疫O型灭活疫苗，另5头作为空白对照组，不免疫疫苗。分别于注射后第28天、60天、90天、120天、150天、180天，用液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性）对各实验组仔猪测定抗体效价，并分别于注射前三天、注射后第1天、注射后第2天、注射后第3天，到注射后第14天的上午和下午监测各实验组和空白对照组仔猪的体温，同时观察各组仔猪的采食活动及注射后部位有无肿胀、结节、溃烂等情况并记录。各实验组仔猪的抗体效价测定结果如下表4所示，各组仔猪的体温监测结果如下表5所示。
表4：各组仔猪的抗体效价测定结果
表5：各组仔猪的体温监测结果（以各组仔猪监测体温的平均值计，单位℃）
由上表4所记载的结果可知，免疫前后空白对照组口蹄疫O型ELISA抗体均为阴性，各疫苗免疫组抗体水平呈上升后下降的趋势，本次实验成立。实施例1为本发明佐剂制备的口蹄疫O型灭活疫苗，免疫实施例1的疫苗抗体效价上升快，免后28天均达到效力要求的水平（＞1：180），合格率100%，免后60至150天，抗体水平均保持在较高的水平（＞1：360），免后180天的抗体虽有下降但仍高于1:180；比较例7与实施例1的区别是司本-80和吐温-80不同，未精制的司本-80和吐温-80制备的佐剂抗体效力提升速度和维持时间仅次于精制后的司本-80和吐温-80，但免疫后表现有轻微体温升高的安全性问题，见表5；比较例8与实施例1的不同之处在于佐剂成分中无香菇多糖，抗体上升速度慢且低，持续期短；比较例9与实施例1的不同之处在于无卡波姆，抗体效力低，持续期短；比较例10与实施例1的区别在于卡波姆替换为壳聚糖，香菇多糖替换为黄芪多糖，仍表现为抗体效力低，持续期短的特点。使用本发明佐剂制备的口蹄疫O型灭活疫苗显著提升疫苗抗体水平及免疫持续期，从而能长期有效保护机体不受口蹄疫病毒的攻击。
由上表5所记载的结果可知，比较例7免疫后前三天体温升高，第一天体温升高1.5℃，第二天和第三天逐渐下降，实施例1及比较例8-10五组口蹄疫O型灭活疫苗免后体温均正常，未出现疫苗引起的局部或全身不良反应，注射部位正常。
实验例4
本实验例对实施例1、比较例1、比较例7、比较例8、比较例9和比较10的疫苗保存两年的免疫效力进行检验。
挑选28日龄抗体阴性的仔猪35头（细胞中和抗体效价不高于1:8或液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8或乳鼠中和抗体效价不高于1:4，且3ABC抗体检测为阴性），分为7组，每组5头，每头肌肉注射疫苗2.0ml上述实施例1、比较例1、比较例7、比较例8、比较例9和比较例10保存两年的口蹄疫O型灭活疫苗，另5头作为空白对照组，不免疫疫苗。分别于注射后第28天、60天、120天、180天，用液相阻断ELISA试剂盒（兰州兽医研究所，抗体效价大于1:180判断为阳性）对各实验组仔猪测定抗体效价，测定结果如下表6所示。
表6：各组仔猪的抗体效价测定结果
表6记载了实施例1、比较例1、比较例7、比较例8、比较例9和比较10五组疫苗保存两年的免疫效力，按照抗体平均值由高到低的顺序排列以上五组疫苗，分别是：实施例1＞比较例7＞比较例8≥比较例9＞比较例10＞比较例1。相对于其他四组疫苗，免疫实施例1的疫苗抗体效价上升快，免后28天100%个体达到1:360，高于效力要求的水平（＞1：180），合格率100%，免后180天的抗体效价仍高于1:180，疫苗保存两年后仍表现出抗体上升快、个体均匀度好、免疫持续期长的特点；且在相同的时间点检测的抗体水平均显著高于另外四组疫苗所诱导的抗体水平。相比之下，五组疫苗中免疫比较例1的疫苗后抗体效价上升最慢，诱导的抗体水平较低，且持续期短，免疫28天合格率80%，且免疫持续期较短，免疫180天合格率60%。比较例8的佐剂成分中无香菇多糖，比较例9的佐剂成分中无卡波姆，两组抗体结果相似，表现的结果也相似，与实施例1相比，抗体上升速度慢且低，持续期短，因配方中有增强剂的成分，抗体值总体高于比较例1。比较例7的抗体水平也表现较好，但未精制的司本-80和吐温-80对仔猪的免疫有轻微体温升高的安全性问题，见表5。比较例10代表较好的商品化佐剂配方，体现出个体差异小和均匀度高的优点，但在抗体水平上升速度及持续期方面有一些不足。结果证明，相对于其他四组疫苗，本发明的实施例1中使用含有精制司本-80、精制吐温-80、卡波姆和香菇多糖来制备佐剂，依据灭活抗原的表面张力大小配制具有相似表面张力的定制型水包油包水佐剂，使得制备的疫苗产品质量稳定，保存期延长，同时卡波姆和香菇多糖可增强疫苗中抗原的特异性免疫应答水平，延长疫苗免疫持续期，提升多品种疫苗的产品质量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.兽用疫苗油佐剂，其特征在于，由原料制备得到，所述原料按照重量百分比计为：75wt%-86wt%的注射用油、1wt%-10wt%的精制司本-80、10wt%-20wt%的精制吐温-80、1wt%-5wt%的卡波姆和1wt%-3wt%的香菇多糖；所述注射用油为白油；所述精制司本-80由司本-80经H2O2预处理后过滤得到；所述精制吐温-80由吐温-80经H2O2预处理后过滤得到；所述过滤包括第一步粗滤和第二步精滤，所述第一步粗滤的孔径为0.4-0.65μm；所述第二步精滤的孔径为0.10-0.22μm。
2.根据权利要求1所述兽用疫苗油佐剂，其特征在于，所述白油为Marcol-52白油、Primol 352白油、Total130#白油、Total150#白油、Total170#白油、Drakeol-5白油、Drakeol-7白油、Sonneborn 4#白油、Sonneborn 10#白油、PARACOS KF40、PARACOS KF50中的至少一种。
3.权利要求1或2所述兽用疫苗油佐剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将注射用油加热至30-40℃，再加入精制司本-80、精制吐温-80、卡波姆和香菇多糖。
4.权利要求1或2所述兽用疫苗油佐剂，或者权利要求3所述制备方法制备得到的兽用疫苗油佐剂在制备兽用疫苗中的应用。
5.兽用疫苗，其特征在于，包括权利要求1或2所述兽用疫苗油佐剂，或者权利要求3所述制备方法制备得到的兽用疫苗油佐剂。
6.根据权利要求5所述兽用疫苗，其特征在于，还包括灭活抗原；所述灭活抗原为口蹄疫O型抗原、牛病毒性腹泻抗原、传染性鼻气管炎抗原、伪狂犬基因缺失标记抗原、牛流行热抗原、猪塞内卡抗原中的至少一种。
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