CN113559256B - 一种诺卡氏菌免疫增强剂及其在制备猪用疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种诺卡氏菌免疫增强剂及其在制备猪用疫苗中的应用，所述诺卡氏菌免疫增强剂包括诺卡氏菌发酵产物、辅助组合物和稳定剂。本发明通过诺卡氏菌发酵产物和辅助组合物间的相互作用，能够有效地对机体免疫系统进行调整，调动机体的抗应激能力，提高机体免疫功能和防御机能，同时加入稳定剂能够显著地增强制备得到诺卡氏菌免疫增强剂的稳定性，进一步保证其制备成猪用油乳剂灭活疫苗后的依旧能够保持较高的免疫活性，达到提高猪只机体免疫功能和防御技能的作用效果。

Description

一种诺卡氏菌免疫增强剂及其在制备猪用疫苗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诺卡氏菌免疫增强剂及其在制备猪用疫苗中的应用。

背景技术

近年来，食品安全引起人们的广泛关注，禽病的有效防治切实关系到人们的餐桌安全，因此要提高对禽疫病预防控制的重视度，有针对性的做好免疫工作。

诺卡氏菌(Nocardia,N.)是一种广泛存在于土壤、海水、淡水、尘埃中的细菌。它属于细菌界，放线菌门，放线菌纲，放线菌亚纲，放线菌目，棒状杆菌亚目，诺卡菌科，诺卡菌属。以前曾将放线菌目归为真菌，这是由于放线菌目含有真菌特有的气生菌丝，后来通过研究其细胞壁,特别是对膜磷脂和肽聚糖组成分析，确定该菌目为需氧型细菌。诺卡氏菌是具有较强免疫活性的微生物，其主要结构中的诺卡式霉菌酸，可非特异性刺激细胞免疫功能，并且促进多种细胞因子分泌，其添加到猪用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生，并且明显改善猪只养殖过程。

中药及其提取的某些多糖成分具有免疫佐剂的活性，机体的多种生命活动离不开多糖类物质的调节参与，已有研究将其进行了在疫苗中的佐剂效应研究。中医免疫药理研究结果指出，中药中的多糖、苷类、维生素、氨基酸以及生物碱等成分不仅能激活自然杀伤细胞，还能活化巨噬细胞和单核细胞，促进T和B淋巴细胞活化增殖，增加IL-2等多种细胞因子分泌以及活化补体，以此提高机体体液和细胞免疫功能，增强机体的抗病力，同时中草药源于自然，资源丰富且价格低廉，它除了具有抑菌效力外，与西药不同的是在作用完成后残留少，不易导致病原菌产生耐药性，更重要的是它可通过对机体免疫系统的调整，调动机体的抗应激能力，提高机体免疫功能和防御机能。

专利文献CN110935017A公开了一种诺卡氏菌免疫增强剂在禽用疫苗制备中的应用，所述免疫佐剂是利用诺卡氏菌经发酵罐培养，高压灭菌后进行提取而制得的。本发明通过将诺卡氏菌的培养物或者发酵物作为免疫佐剂，用于制备禽用疫苗，具有安全性高，疫苗注射无残留，可以显著提高动物的免疫力，但具有的稳定性较差。

专利文献CN107661489A公开了疫苗用中药免疫增强剂及其制备方法与应用，该疫苗用中药免疫增强剂是由牛膝多糖、MEM干粉、胸腺五肽、HEPES和水制成的混合溶液，每1000ml疫苗用中药免疫增强剂中各组分的含量为：牛膝多糖15-30g、MEM干粉8-18g、胸腺五肽2-10g、HEPES 2-3g，余量为水。本发明还公开了疫苗用中药免疫增强剂的制备方法及应用。该疫苗用中药免疫增强剂能调节或增强机体免疫功能，提高机体抗病能力，同时增强猪瘟活疫苗的免疫效果，但具有的稳定性较差。

发明内容

本发明旨在提供一种诺卡氏菌免疫增强剂及其制备方法和应用，该诺卡氏菌免疫增强剂能够有效地提高灭活疫苗在机体内对机体免疫系统的调整，调动机体的抗应激能力，提高机体免疫功能和防御机能，同时稳定剂的加入可以有效地增强诺卡氏菌免疫增强剂的稳定性，保证其制备成猪用油乳剂灭活疫苗后的依旧能够保持较高的免疫活性，达到提高猪只机体免疫功能和防御技能的作用效果。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种诺卡氏菌免疫增强剂，包括以下原料组分和重量份数：诺卡氏菌发酵产物20.0～50.0份、辅助组合物10.0～30.0份和稳定剂3.0～7.0份。

优选地，所述辅助组合物由当归酮和葡聚糖组成。

优选地，所述当归酮和葡聚糖的重量比为2：(3～7)。

优选地，所述稳定剂为聚氧乙烯蓖麻油、甘氨酸和亚硫酸钠的组合物。

优选地，所述聚氧乙烯蓖麻油、甘氨酸和亚硫酸钠的重量比为(1～3)：(2～5)：1。

此外，本发明还提供了一种所述的诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，包括以下制备步骤：

S1、诺卡氏菌发酵产物的制备；

S2、诺卡氏菌免疫增强剂制备：称取配方量的辅助组合物和稳定剂加入到配方量步骤S1得到的诺卡氏菌发酵产物中，均匀混合，制得诺卡氏菌免疫增强剂。

优选地，所述诺卡氏菌发酵产物的制备方法包括以下步骤：

S11、发酵培养基的制备：在发酵罐中加入1～5％葡萄糖、1～3％酵母粉、1～5％胰蛋白和85～95％纯化水，并调节培养基的pH值为7.0-7.2；

S12、发酵方法：将诺卡氏菌置于步骤S11的发酵罐中培养24～48h，发酵结束后在120～125℃，100～105kPa的条件下灭活20～30min，即得诺卡氏菌发酵产物。

进一步地，所述步骤S12中发酵罐的培养条件：搅拌转速为300～350r/min、通气量为1.0V/V·min、诺卡氏菌的接种量为接种后培养液体积的6～10％、培养基溶液体积为罐容积的60～70％和发酵温度保持在30～40℃。

本发明还提供了一种所述诺卡氏菌免疫增强剂在制备猪用油乳剂灭活疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明制备得到的诺卡氏菌免疫增强剂，通过诺卡氏菌发酵产物和辅助组合物间的相互作用，能够有效地对机体免疫系统进行调整，调动机体的抗应激能力，提高机体免疫功能和防御机能。

(2)本发明中稳定剂的加入能够有效地增强制备得到诺卡氏菌免疫增强剂的稳定性，进一步保证诺卡氏菌免疫增强剂在注射到畜禽类后发挥增强机体免疫的作用功效。

(3)本发明选用天然的原料组分，来源丰富，对机体的毒副作用较小，且制备方法简单，成本低，有利于工业的大规模生产。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、本发明诺卡氏菌免疫增强剂及其制备方法

配方：聚氧乙烯蓖麻油10.0g、甘氨酸20.0g和亚硫酸钠10.0g；

诺卡氏菌发酵产物200.0g、当归酮40.0g、葡聚糖60.0g和稳定剂30.0g。

制备方法：

S11、发酵培养基的制备：在发酵罐中加入1％葡萄糖、1％酵母粉、1％胰蛋白和85％纯化水，并调节培养基的pH值为7.0；

S12、发酵方法：将诺卡氏菌置于步骤S11的发酵罐中培养24h，发酵结束后在120℃，100kPa的条件下灭活20min，即得诺卡氏菌发酵产物。

步骤S12中发酵罐的培养条件为：搅拌转速为300r/min、通气量为1.0V/V·min、诺卡氏菌的接种量为接种后培养液体积的6％、培养基溶液体积为罐容积的60％和发酵温度保持在30℃。

实施例2、本发明诺卡氏菌免疫增强剂及其制备方法

配方：聚氧乙烯蓖麻油20.0g、甘氨酸30.0g和亚硫酸钠10.0g；

诺卡氏菌发酵产物300.0g、当归酮57.1g、葡聚糖142.9g和稳定剂50.0g。

制备方法：

S11、发酵培养基的制备：在发酵罐中加入3％葡萄糖、2％酵母粉、3％胰蛋白和90％纯化水，并调节培养基的pH值为7.1；

S12、发酵方法：将诺卡氏菌置于步骤S11的发酵罐中培养36h，发酵后在121℃，101kPa的条件下灭活20min，即得诺卡氏菌发酵产物。

步骤S12中发酵罐的培养条件为：搅拌转速为310r/min、通气量为1.0V/V·min、诺卡氏菌的接种量为接种后培养液体积的8％、培养基溶液体积为罐容积的65％和发酵温度保持在30℃。

实施例3、本发明诺卡氏菌免疫增强剂及其制备方法

配方：聚氧乙烯蓖麻油30.0g、甘氨酸50.0g和亚硫酸钠10.0g；

诺卡氏菌发酵产物500.0g、当归酮66.7g、葡聚糖233.3g和稳定剂70.0g。

制备方法：

S11、发酵培养基的制备：在发酵罐中加入5％葡萄糖、3％酵母粉、5％胰蛋白和95％纯化水，并调节培养基的pH值为7.2；

S12、发酵方法：将诺卡氏菌置于步骤S11的发酵罐中培养48h，发酵后在125℃，105kPa的条件下灭活30min，即得诺卡氏菌发酵产物。

步骤S12中发酵罐的培养条件为：搅拌转速为350r/min、通气量为1.0V/V·min、诺卡氏菌的接种量为接种后培养液体积的10％、培养基溶液体积为罐容积的70％和发酵温度保持在40℃。

实施例4、禽用油乳剂疫苗的制备

I.诺卡氏菌免疫增强剂样本灭菌处理及定量

取诺卡氏菌免疫增强剂液体样本若干，采用121℃高压蒸汽灭活30min，灭菌后样本待温度降至室温时，4℃保存备用。

免疫增强剂样本使用前，需进行定量。定量方法如下：无菌移取2mL佐剂样本平分到2支1.5mL eppendorf管中，12000rpm/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量。

II.添加诺卡氏菌免疫增强剂的油乳剂灭活疫苗的制备

⑴高致病性蓝耳病灭活疫苗的制备

①抗原水相的制备

取经过定量的诺卡氏菌免疫增强剂样本适量(1～10mg)，添加入高致病性蓝耳病抗原中，按照乳化配方量添加TWEEN80，充分混合溶解后，最终总体积为100mL。同时设立未添加诺卡氏菌免疫增强剂的高致病性蓝耳病对照组，对照组与试验组的差异仅为是否添加佐剂，其他均相同处理。

②乳化制备疫苗

取上述制备的抗原水相100mL，缓慢加入200mL按照乳化配方制备的油相中，使用IKA T25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为15000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

对比例1、诺卡氏菌免疫增强剂及其制备方法

与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有聚氧乙烯蓖麻油、甘氨酸和亚硫酸钠。

制备方法同实施例2。

对比例2、诺卡氏菌免疫增强剂及其制备方法

与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有甘氨酸。

制备方法同实施例2。

对比例3、免疫增强剂及其制备方法

与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有诺卡氏菌发酵产物。

制备方法同实施例2。

对比例4、免疫增强剂及其制备方法

与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有辅助组合物。

制备方法同实施例2。

对比例5、免疫增强剂及其制备方法

与实施例2相比，本对比例的区别仅在于：不含有当归酮。

制备方法同实施例2。

试验例一、安全性试验

一、实验样品

实施例1～3按照实施例4制备方法得到的猪用油乳剂灭活疫苗。

二、实验方法

取3日龄～5日龄仔猪20头，分为4组，每组5头，实施例1～3三组为试验组，1组为空白对照组。每种疫苗颈部肌肉注射接种一组猪，2.0mL/头，对照组以相同方式注射生理盐水2.0mL/头。免疫后14d内，每天测定各组猪体温，观察各组猪采食、饮水、精神是否正常，有无不良临床反应，疫苗的吸收情况及注射部位是否有异常反应。

三、实验结果

将实施例1～3制备得到的疫苗分别以2.0mL/头的剂量免疫试验猪，并在免疫前1d和免疫当天及免疫后14d内每天测定各组试验猪体温，试验结果如表1所示。

表1疫苗接种试验猪体温测定结果

从表1的实验数据可以得知，本发明实施例1～3的疫苗免疫组猪及空白对照组猪体温均正常。同时，免疫后14d内，实施例1～3制备得到的疫苗免疫猪在采食、饮水、精神状况上均正常，均无不良临床反应，且疫苗吸收良好，注射部位均无红肿、硬块等局部异常反应，与对照组无明显差异，表明将本发明实施例1～3的免疫增强剂制备成疫苗的安全性高，不会给猪只带起其他的不良反应。

试验例二、稳定性试验

一、实验样品

实施例1～3、对比例1～2按照实施例4制备得到的猪用油乳剂灭活疫苗。

二、实验方法

取上述制备的疫苗各10mL置离心管中，3 000r/min离心15min，观察这疫苗的水相析出量，水相析出不超过0.5mL。

三、实验结果

实验结果如表2所示。

表2稳定性试验结果

从表2中的数据可以得知，本发明实施例1～3免疫增强剂制备得到的疫苗几乎没有水相析出，具有较高的稳定性；从实施例1～3与对比例1～2的实验数据可以得知，对比例1～2由于缺少稳定剂组分聚氧乙烯蓖麻油、甘氨酸和亚硫酸钠，使得制备得到的疫苗的稳定性降低，且均差于本发明实施例1～3。因此可以证明，本发明稳定剂组分的加入能够有效地增强免疫增强剂的稳定性，进一步增强制备得到的疫苗的稳定性，保证疫苗对机体免疫系统进行调整，调动机体的抗应激能力，提高机体免疫功能和防御机能。

试验例三、免疫效果试验

一、实验样品

实施例1～3、对比例3～5按照实施例4制备得到的猪用油乳剂灭活疫苗

二、实验方法

免疫效果试验使用91头高致病性蓝耳病阳性母猪，分7组，每组13头，其中1组为空白对照组。在产前40d每头母猪颈部肌肉注射疫苗2mL，产前20d按照同样的剂量和方法进行二次免疫。对照组接种2mL灭菌生理盐水。统计产仔数量，仔猪情况和仔猪16日龄存活数量。

二、实验结果

实验结果如表3所示。

表3免疫效果试验结果

从表3的数据可以得知，本发明实施例1～3免疫增强剂制备得到的疫苗在注射到高致病性蓝耳病阳性母猪后，分别产仔164、168和165头，其中的异常胎儿分别为2、0和2头，16日龄存活85、92和866头；对照组共产仔155头，其中异常胎儿中有4头弱胎，2头死胎，16日龄存活38头，由此可以得到本发明实施例1～3组的的仔猪存活率显著高于对照组。从实施例1～3与对比例3～5组的实验结果可以得知，本发明中实施例1～3组仔猪的16日龄存活数均显著高于对比例3～5组，进一步证明了本发明诺卡氏菌发酵产物与辅助组合物间的协同作用能够有效地增强免疫疫苗在提高机体免疫功能和防御机能，调动机体的抗应激能力，提高机体体液和细胞免疫功能，增强机体的抗病力等方面的作用效果。

从以上试验可以得出本项发明技术中诺卡氏菌发酵产物与辅助组合物间的协同作用能够显著地增强疫苗在提高机体免疫功能和防御机能，调动机体的抗应激能力，提高机体体液和细胞免疫功能，增强机体的抗病力等的作用效果，同时本发明加入了稳定剂组分能够有效地增强制备得到的免疫增强剂的稳定性，保证其免疫功能可以发挥到最大化。此外，选用天然的原料组分大部分属于天然来源，资源丰富，对机体的毒副作用较小，且制备方法简单，成本低，有利于工业的大规模生产。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (8)

1.一种诺卡氏菌免疫增强剂，其特征在于，包括以下原料组分和重量份数：诺卡氏菌发酵产物20.0～50.0份、辅助组合物10.0～30.0份和稳定剂3.0～7.0份；

所述辅助组合物由当归酮和葡聚糖组成，所述当归酮和葡聚糖的重量比为2：(3～7)；

所述稳定剂为聚氧乙烯蓖麻油、甘氨酸和亚硫酸钠的组合物，所述聚氧乙烯蓖麻油、甘氨酸和亚硫酸钠的重量比为(1～3)：(2～5)：1；

所述诺卡氏菌发酵产物的制备方法包括以下步骤：

S11、发酵培养基的制备：在30L发酵罐中加入1～5％葡萄糖、1～3％酵母粉、1～5％胰蛋白和85～95％纯化水，并调节培养基的pH值为7.0-7.2；

S12、发酵方法：将诺卡氏菌置于步骤S11的发酵罐中培养24～48h，发酵结束后在120～125℃，100～105kPa的条件下灭活20～30min，即得诺卡氏菌发酵产物。

2.如权利要求1所述的诺卡氏菌免疫增强剂，其特征在于，所述步骤S12中发酵罐的培养条件：搅拌转速为300～350r/min、通气量为1.0V/V·min、诺卡氏菌的接种量为接种后培养液体积的6～10％、培养基溶液体积为罐容积的60～70％和发酵温度保持在30～40℃。

3.一种如权利要求1或2所述的诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

S1、诺卡氏菌发酵产物的制备；

S2、诺卡氏菌免疫增强剂制备：称取配方量的辅助组合物和稳定剂加入到配方量步骤S1得到的诺卡氏菌发酵产物中，均匀混合，制得诺卡氏菌免疫增强剂。

4.如权利要求3所述的诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述诺卡氏菌发酵产物的制备方法包括以下步骤：

S11、发酵培养基的制备：在30L发酵罐中加入1～5％葡萄糖、1～3％酵母粉、1～5％胰蛋白和85～95％纯化水，并调节培养基的pH值为7.0-7.2；

S12、发酵方法：将诺卡氏菌置于步骤S11的发酵罐中培养24～48h，发酵结束后在120～125℃，100～105kPa的条件下灭活20～30min，即得诺卡氏菌发酵产物。

5.如权利要求4所述的诺卡氏菌免疫增强剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S12中发酵罐的培养条件：搅拌转速为300～350r/min、通气量为1.0V/V·min、诺卡氏菌的接种量为接种后培养液体积的6～10％、培养基溶液体积为罐容积的60～70％和发酵温度保持在30～40℃。

6.一种如权利要求1或2所述的诺卡氏菌免疫增强剂和权利要求3～5任一所述诺卡氏菌免疫增强剂制备方法制备得到的诺卡氏菌免疫增强剂在制备猪用油乳剂灭活疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述猪用油乳剂灭活疫苗的制备方法包括以下步骤：

I.诺卡氏菌免疫增强剂样本灭菌处理及定量

取诺卡氏菌免疫增强剂液体样本，高压蒸汽灭活，灭菌后样本待温度降至室温时，4℃保存备用；

免疫增强剂样本使用前，需进行定量，定量方法如下：无菌移取佐剂样本，12000rpm/min高速离心5min，弃除上清液后，置于103℃干燥箱中充分干燥2小时，测定样本干物质重量；

II.添加诺卡氏菌免疫增强剂的油乳剂灭活疫苗的制备

①抗原水相的制备

取经过定量的诺卡氏菌免疫增强剂样本1～10mg，添加入高致病性蓝耳病抗原中，按照乳化配方量添加TWEEN80，充分混合溶解后，最终总体积为100mL，同时设立未添加诺卡氏菌免疫增强剂的高致病性蓝耳病对照组，对照组与试验组的差异仅为是否添加佐剂，其他均相同处理；

②乳化制备疫苗

取上述制备的抗原水相100mL，缓慢加入200mL按照乳化配方制备的油相中，使用IKAT25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为15000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。

8.一种包含权利要求1或2所述的诺卡氏菌免疫增强剂的疫苗。