CN105112328B

CN105112328B - 一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法与应用

Info

Publication number: CN105112328B
Application number: CN201510518958.4A
Authority: CN
Inventors: 赵晓娜; 陈抗; 李刚; 付荣强; 赵彦; 孙明珠; 陈芳
Original assignee: SHANDONG ENKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANDONG ENKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2015-08-21
Publication date: 2019-03-08
Anticipated expiration: 2035-08-21
Also published as: CN105112328A

Abstract

本发明涉及一种白术多糖‑芽孢杆菌发酵液的制备方法与应用。所述制备方法步骤如下：将活化后的枯草芽孢杆菌接入白术多糖液体培养基中，在发酵培养后，制得白术多糖‑芽孢杆菌发酵液；本发明制备的白术多糖‑芽孢杆菌发酵液，能增强动物免疫功能，提高动物的抗病力和疫苗的保护率，特别是与新城疫疫苗配合使用，效果更为显著，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价值。

Description

一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法与应用，特别涉及一种白术多糖-芽孢杆菌发酵制得发酵液的方法及该发酵液应用于增强畜禽免疫力的应用，属于畜禽免疫技术领域。

背景技术

随着中国经济的发展、畜牧业快速增长，动物疫病不仅给畜牧业生产造成巨大的经济损失，而且某些人兽共患病，直接威胁着人类的生存和发展。现在人们已经认识到，机体免疫系统的紊乱更易发生感染。但由于化学药物有用药时间长、疗效持续时间短、药物残留、环境污染等缺点，而且动物机体的免疫应答，有着极其复杂的过程，多种因素的参与，所以免疫抑制产生时，常不是单一的化学免疫增强剂所能奏效，因此目前特别缺乏高效低毒的免疫增强剂。而中药在这方面则有比较明显的特色和优势。许多中药及其复方以整体调整、平衡阴阳为特点,使机体达到和维持免疫稳定，具有持续作用时间长、无残留、对动物机体刺激小等优点，所以成为较理想的免疫增强剂。

随着微生态学的发展，人们逐渐认识到生物体内的微生态系对口服中草药药理作用的发挥有着重要的作用，同时中草药又有助于维持生物微生态系的平衡，二者间不仅在理论上有共通性，而且在治疗疾病的过程中亦相互作用，相互影响。益生菌可以促进中草药的吸收和利用，中草药可以促进益生菌的增殖,实践证明中草药和益生菌在防病促生长方面是相辅相成的，这也为本研究的选题提供了理论依据。

中国专利文献CN 104642800A(申请号201510049371.3)公开了一种促进仔猪生长的中草药发酵制剂，由如下重量份的原料制备而成：山楂10～25、陈皮8～15、牡丹皮10～25、大黄8～15、当归10～25、甘草10～25、白术8～15、枯草芽孢杆菌活菌数2×10⁸-2×10⁹CFU/g。制备步骤如下：步骤一将上述原料按比例称重混匀粉碎后过筛；步骤二将经步骤一制备的原料与蒸馏水混合经X射线辐照杀菌后用芽孢杆菌液体发酵；步骤三真空冷冻干燥。上述枯草芽孢杆菌的加入目的主要是为了调节肠道菌群，从而促进仔猪生长。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种白术多糖-芽孢杆菌发酵增免剂，主要采用白术多糖、芽孢杆菌，通过发酵制得，其重要成分为白术多糖；采用这种免疫增强剂，与疫苗配合使用，能增强动物免疫功能，提高动物的抗病力和疫苗的保护率，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价值。

本发明的具体技术方案如下：

一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

将活化后的枯草芽孢杆菌接入白术多糖液体培养基中，在35～38℃条件下发酵培养40～52h，制得白术多糖浓度为0.8～0.9mg/mL的白术多糖-芽孢杆菌发酵液；

所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

白术多糖0.8～0.9g，硫酸铵0.35～0.45g，肉汤180～250mL，水定容至1L，氢氧化钠调pH值7.5～8.5，即得。

根据本发明优选的，所述活化后的枯草芽孢杆菌接入量为体积百分比2～4％。

根据本发明优选的，所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

白术多糖0.8～0.9g，硫酸铵0.4g，肉汤200mL，水定容至1L，氢氧化钠调pH值8.0，即得。

根据本发明优选的，所述的枯草芽孢杆菌为来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：1.4255或CGMCC NO：1.3382。

根据本发明优选的，所述的发酵培养温度为37℃，发酵培养时间48h。

根据本发明优选的，所述白术多糖采用如下方法制备：

将白术与水按质量比1:7～9混合，浸泡后，煮沸0.8～1.2h，过滤制得一次滤液和一次药渣；将一次药渣与水按质量比1:(5.5～6.5)混合，煮沸0.8～1.2h，过滤制得二次滤液和二次药渣；将二次药渣与水按质量比1:(5.5～6.5)混合，煮沸0.8～1.2h，过滤制得三次滤液和三次药渣；合并一次滤液、二次滤液和三次滤液，加热浓缩，冷却后离心，然后加入乙醇至乙醇质量浓度为80wt％，醇沉20～28h，离心，干燥，制得白术多糖。

该方法制备的白术多糖较普通市售白术多糖有效成分得到增加，可以提高疗效，降低毒性，产生新的活性物质。

根据本发明进一步优选的，所述的离心条件均为：3000rpm离心10min。

根据本发明进一步优选的，所述的干燥温度为55℃～65℃。

上述制得的白术多糖-芽孢杆菌发酵液在制备增强畜禽免疫力产品中的应用。

根据本发明优选的，所述的应用为与新城疫疫苗配合使用的增强畜禽免疫力产品。更优的，所述的新城疫疫苗为新城疫IV系弱毒苗。

枯草芽孢杆菌的作用机理

生物夺氧机制：正常情况下，畜禽肠道内的优势菌群为厌氧菌(如乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌等)，占99％以上，而枯草芽孢杆菌是严格的好氧菌，在其生长繁殖过程中会消耗掉肠内过量的气体，造成消化道内的厌氧环境，因此有利于促进双歧杆菌及乳酸菌等有益菌的生长，同时对需氧的大肠杆菌、链球菌等有抑制作用。

生物拮抗机制：枯草芽孢杆菌对乳酸菌、双歧杆菌等有促生长作用，这些有益菌相互协同作为一个整体发挥作用，它们能够竞争肠黏膜上皮结合位点，抑制病原微生物在肠黏膜上皮细胞的吸附，促使其从粪便排出体外。

产生有益代谢产物：枯草芽孢杆菌代谢过程中产生的代谢产物主要有酶类(淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等)、维生素类(硫胺素、核黄素、烟酸等)、有机酸类(乙酸、丙酸、丁酸等)和细菌素(枯草菌素、制霉菌素、短杆菌肽)等。这些酶和维生素可以直接参与机体的新陈代谢。

提高机体免疫功能：枯草芽孢杆菌等有益菌定植于肠道，对肠黏膜免疫系统产生有益影响。肠黏膜免疫系统由肠上皮细胞、肠上皮淋巴细胞、固有层淋巴细胞及派伊氏结等构成，这使得肠道不仅是消化吸收的场所，也是重要的免疫器官。

有益效果

本发明制备的白术多糖-芽孢杆菌发酵液，能增强动物免疫功能，提高动物的抗病力和疫苗的保护率，特别是与新城疫疫苗配合使用，效果更为显著，因而在预防和控制动物传染性疾病上有很大的推广价值。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

菌株来源

实施例2和实施例3的枯草芽孢杆菌为来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：1.4255；

实施例4的枯草芽孢杆菌为来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：1.3382；

白术购自泰安市永春堂大药房；

肉汤采用如下方法制备:

蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g，蒸馏水定容至1000mL，煮沸后调节pH7.2～7.4，121℃高压灭菌15min。

实施例1白术多糖的制备

以白术1000g计，加入8倍质量的水浸泡30min；之后煮沸1h，过滤后药渣加入6倍质量的水煮沸1h，过滤后滤渣再次加入6倍质量的水煮沸1h过滤，合并三次滤液，将滤液加热浓缩至1000mL，冷却后3000rpm离心10min，除去杂质，蒸馏水定容制成1000mL；用一步醇沉法提取，向上述浓缩液中缓慢加入95wt％乙醇使混合液中乙醇的终浓度达80wt％，边加边搅拌，添加完成后静置24h，离心，取沉淀置于60℃烘干箱干燥，即得白术多糖。

实施例2

一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

将活化后的枯草芽孢杆菌接入白术多糖液体培养基中，在37℃条件下发酵培养48，制得白术多糖浓度为0.8mg/mL的白术多糖-芽孢杆菌发酵液；

所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

实施例1制得的白术多糖0.8g，硫酸铵0.4g，肉汤200mL，水定容至1L，氢氧化钠调pH值8，即得。

实施例3

一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

将活化后的枯草芽孢杆菌接入白术多糖液体培养基中，在35℃条件下发酵培养52h，制得白术多糖浓度为0.9mg/mL的白术多糖-芽孢杆菌发酵液；

所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

实施例1制得的白术多糖0.9g，硫酸铵0.45g，肉汤180mL，水定容至1L，氢氧化钠调pH值7.5，即得。

实施例4

一种白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备方法，步骤如下：

将活化后的枯草芽孢杆菌接入白术多糖液体培养基中，在38℃条件下发酵培养40h，制得白术多糖浓度为0.85mg/mL的白术多糖-芽孢杆菌发酵液；

所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

实施例1制得的白术多糖0.85g，硫酸铵0.35g，肉汤250mL，水定容至1L，氢氧化钠调pH值8.5，即得。

对比例

将活化后的枯草芽孢杆菌接入枸杞多糖液体培养基中，在37℃条件下发酵培养48，制得枸杞多糖浓度为0.8mg/mL的枸杞多糖-芽孢杆菌发酵液；

所述的枸杞多糖液体培养基每升组分如下：

市售枸杞多糖0.8g，硫酸铵0.4g，肉汤200mL，水定容至1L，氢氧化钠调pH值8，即得。

试验例

方法：

施用0.8mg/mL实施例2～4制备的白术多糖-芽孢杆菌发酵液并采用新城疫IV系苗免疫注射的试验鸡分组为实验组1～3；

施用0.8mg/mL未发酵白术多糖并采用新城疫IV系苗免疫注射的试验鸡为对照组1；

施用0.8mg/mL对比例制得的发酵液并采用新城疫IV系苗免疫注射的试验鸡做为对照组2；

单独采用新城疫IV系苗免疫注射的试验鸡做为对照组NA；

不注射疫苗不给药的试验鸡做为空白对照组BC；

单独采用新城疫IV系苗免疫并注射Lev(盐酸左旋咪唑)的试验鸡做为Lev对照组，用以评价免疫增强效果；

测定新城疫疫苗免疫雏鸡的血清抗体效价，外周淋巴细胞增殖率，免疫雏鸡淋巴细胞周期分布的变化，及免疫雏鸡T淋巴细胞亚群CD4⁺,CD8⁺分布情况，免疫雏鸡免疫器官指数，来比较发酵增免剂对新城疫疫苗的免疫效果。

用量

30只鸡的用量为：100mL待实验样品兑1L水，4～5小时饮完，每日1～2次。

结果：

(1)外周血T淋巴细胞增殖的变化

在免疫后所有时间点，实验组1～3和对照组1的A₅₇₀值均显著高于其他对照组(P<0.05)。

免疫后第7～28d，实验组1、实验组2的A₅₇₀值均显著高于Lev对照组(P<0.05)。

实验组3和对照组1，分别在免疫后第21d的A₅₇₀值均显著高于Lev对照组(P<0.05)。

表1外周血T淋巴细胞增殖的变化(A₅₇₀值，n＝30)

注：同列数据标注不同字母者差异显著(P<0.05)；以下同。

(2)血清ND-HI抗体效价变化

免疫后所有时间点，实验组1～3和对照组1的抗体效价显著高于其他对照组(P<0.05)；

免疫后第7～28d，实验组1、实验组2的A570值均显著高于Lev对照组(P<0.05)。实验组3和对照组1，分别在免疫后第21d,28d的A570值均显著高于Lev对照组(P<0.05)。

表2血清ND-HI抗体效价的变化

Log₂，n＝6

(3)胸腺指数的动态变化见表3。

在免疫后所有时间点，实验组1～3的胸腺指数在28d高于其他对照组(P<0.05)因此，结果表明实验组1～3能显著促进胸腺的发育。

表3各组胸腺指数的动态变化

g.kg^-1，n＝4

(4)脾脏指数的变化

脾脏指数的动态变化检测结果如表4所示。在免疫后所有时间点，实验组1～3的脾脏指数高于其他对照组(P<0.05)。

首免后第7～28d，实验组1、实验组2的脾脏指数显著高于对照组1和Lev对照组(P<0.05)。在免疫后的21～28d实验组3的脾脏指数显著高于对照组1和Lev对照组(P<0.05)因此，结果表明实验组1、实验组2能显著促进脾脏的发育。

表4各组脾脏指数的动态变化

g.kg^-1，n＝4

(5)法氏囊指数的变化

法氏囊指数的动态变化检测结果如表5所示。在免疫后所有时间点，实验组1～3的法氏囊指数均高于其他对照组(P<0.05)。

实验组2在首免后第7～28d，实验组1在首免后第7～21d,实验组3在首免后14～28d的法氏囊指数显著高于对照组1和Lev对照组(P<0.05)。因此，结果表明实验组1、实验组2能显著促进法氏囊的发育，实验组2效果更好。

表5各组法氏囊指数的动态变化

g.kg^-1，n＝4

(6)鸡外周血淋巴细胞周期的影响

免疫后第7～28d，与Lev对照组相比较，实验组1、实验组2、实验组3的G0/G1期细胞的百分比降低，处于S期和G2/M期的细胞百分比增多。与对照组1相比较，实验组1、实验组2免疫7、21和28d，实验组3在免疫21d后G0/G1期细胞的百分比明显降低，S期细胞百分比明显增多(P<0.05)。

表6在不同时间点对鸡淋巴细胞周期分布的影响

n＝4

(7)CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化

免疫后所有时间点，实验组1～3的CD4+、CD8+淋巴细胞百分率均显著高于无佐剂对照组(P<0.05)，试验组2组的CD4+、CD8+淋巴细胞百分率显著高于试验组3、对照组1和Lev对照组(P<0.05)；试验组1，3在免疫后14-28d，CD4+淋巴细胞百分率显著高于对照组1(P<0.05)。因此，试验组2可以显著提高CD4+、CD8+淋巴细胞百分率。结果如表7所示。

表7在不同时间点对鸡淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺的影响

n＝4

结果分析

以上结果表明，白术多糖-芽孢杆菌发酵液作为佐剂配合NDV-IV系弱毒苗免疫雏鸡，在多数时间点能显著提高血清抗体效价，促进胸腺、法氏囊和脾脏的生长发育和免疫功能的发挥，促进淋巴细胞进入S和G2/M期，提高CD4+、CD8+淋巴细胞的百分率，从而增强机体免疫。

通过实验组1～3及对照组的效果数据可以看出，只有采用本发明所述的技术方案制得的白术多糖-芽孢杆菌发酵液，才具有增强NDV-IV系弱毒苗免疫效果的作用。

Claims

1.白术多糖-芽孢杆菌发酵液在制备增强新城疫疫苗的药物中的应用，其特征在于，所述白术多糖-芽孢杆菌发酵液的制备步骤如下：

所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活化后的枯草芽孢杆菌接入量为体积百分比2～4%。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的白术多糖液体培养基每升组分如下：

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO：1.4255或CGMCC NO：1.3382。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养温度为37℃，发酵培养时间48h。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白术多糖采用如下方法制备：

将白术与水按质量比1:7～9混合，浸泡后，煮沸0.8～1.2h，过滤制得一次滤液和一次药渣；将一次药渣与水按质量比1:（5.5～6.5）混合，煮沸0.8～1.2h，过滤制得二次滤液和二次药渣；将二次药渣与水按质量比1: （5.5～6.5）混合，煮沸0.8～1.2h，过滤制得三次滤液和三次药渣；合并一次滤液、二次滤液和三次滤液，加热浓缩，冷却后离心，然后加入乙醇至乙醇质量浓度为80wt%，醇沉20～28h，离心，干燥，制得白术多糖。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的离心条件均为：3000rpm离心10 min。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的干燥温度为55℃～65℃。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的新城疫疫苗为新城疫IV系弱毒苗。