CN115633780A - 一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品生物加工领域，涉及一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，包括如下步骤：步骤一、取破壁松花粉溶于柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中，搅拌均匀；步骤二、将松花粉培养基进行巴氏杀菌，沸水浴加热，保温，冰水降温至室温；步骤三、用Na2HPO4溶液调节pH；步骤四、接种米根霉菌，发酵；步骤五、发酵后固液分离，重复提取，合并滤液，冻干，得到提取物。本发明通过米根霉发酵的方法释放松花粉中酚类活性物质，提升松花粉酚类含量，得到具有更强降脂活性的发酵松花粉提取物，所述提取物具有更强的减脂活性，且该方法温和绿色、安全性高、成本低，便于大规模生产，为开发具有更高降脂活性的松花粉产品提供理论指导。
Description
技术领域
本发明属于食品生物加工技术领域，尤其涉及一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法。
背景技术
松花粉是我国药食同源的花粉品种，富含酚类等活性物质。研究表明，松花粉具有保护肝脏、调节糖脂代谢、免疫调节、卵巢保护等功效。马尾松花粉可显著控制小鼠的体重增长以及改善体内脂质代谢水平，且酚类成分可能是控制肥胖的有效成分。然而，前期研究结果发现，松花粉中的酚类活性成分大多以结合态形式存在，导致其无法充分地发挥功效。微生物发酵可以促进活性物质的释放及转化。为了提升松花粉中活性成分的释放及功能，目前多采用破壁的方法以破坏细胞壁中结合的活性成分，但尚未有采用发酵方法的研究。
发明内容
本发明针对上述的现有技术存在的不足，提供一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法。
本发明的具体技术方案如下：
一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，包括如下步骤：
步骤一、取破壁松花粉溶于柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中，搅拌均匀；
步骤二、将松花粉培养基进行巴氏杀菌，沸水浴加热至中心温度达到80-90℃，置于80-90℃水浴中保温20-40min，保温时间到后立即冰水降温至室温；
步骤三、用Na2HPO4溶液和松花粉培养基混匀，调节pH；
步骤四、从活化好的菌悬液中接种米根霉菌，在20-40℃、150-250r/min条件下，摇瓶发酵3-5天；
步骤五、发酵结束后，以3500-5500rpm离心10-20min，固液分离；所得固体用体积浓度为70％乙醇在40-50℃下超声搅拌提取2-3h，重复提取三次，合并滤液，冻干，得到提取物。
本发明采用上述技术特征具有如下技术效果：
利用所发现的酚类含量的增加是由于米根霉发酵产生蛋白酶、淀粉酶以及糖化酶，使结合在细胞壁上的多酚类物质被释放出来，从而提升了松花粉酚类含量，得到具有更强降脂活性的发酵松花粉提取物。所述提取物具有更强的减脂活性，且该方法温和绿色、安全性高、成本低，便于大规模工厂化生产。
进一步地，所述柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，PH为4.3。
进一步地，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.2mol/L。
进一步地，所述步骤五中，所述所得固体与所述体积浓度为70％乙醇的质量比为1:(15-25)。
进一步地，所述米根霉菌为3010米根霉菌。
进一步地，所述破壁后松花粉与(柠檬酸缓冲液+Na2HPO4溶液)的重量比为1:(15-25)；
进一步地，所述Na2HPO4溶液调节的pH为6.2-6.8。
进一步地，所述活化好的菌悬液的孢子数为106个/mL。
进一步地，所述步骤四中米根霉菌的接菌量为10％(V/V)。
本发明的有益效果为：
本发明通过米根霉发酵的方法释放松花粉中酚类活性物质，提升松花粉酚类含量，得到具有更强降脂活性的发酵松花粉提取物。而呈现更强抑制脂质积累作用的原因可能是由于酚类含量的增加，利用3T3-L1细胞模型验证所述提取物更强的减脂活性，且该方法温和绿色、安全性高、成本低，便于大规模工厂化生产，为开发具有更高降脂活性的松花粉产品提供理论指导。
附图说明
图1为本发明发酵前后松花粉酚类物质的高效液相色谱图；
a-未发酵(NFPP)；b-发酵(FPP)；c-标准品；
1-与胺儿茶酸；2-儿茶素；3-对香豆酸；4-花旗松素；5-柚皮素；
图2为本发明油红染色3T3-L1细胞脂质积累效果图；
a-空白组；b-未发酵组(200μg/mL)；c-未发酵组(400μg/mL)；d-绿原酸组；e-发酵组(200μg/mL)；f-发酵组(400μg/mL)。
图3为本发明松花粉和柚皮素对3T3-L1细胞脂质积累的定量结果图；不同字母标识有显著性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，包括如下步骤：
步骤一、取6.5g的破壁松花粉溶于65ml浓度为0.1mol/L，pH为4.3的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中，搅拌均匀；
步骤二、将松花粉培养基进行巴氏杀菌，沸水浴加热至中心温度达到85℃，置于85℃水浴中保温30min，保温时间到立即冰水降温至室温；
步骤三、在超净台上，用0.2mol/LNa2HPO4溶液和松花粉培养基混匀，调节pH为6.6；其中，松花粉与培养基的重量比为1:20；
步骤四、从活化好的菌悬液(孢子数106个/mL)中以10％接种量(V/V)接种3010米根霉菌，在30℃、180r/min条件下，用摇床摇瓶发酵4天；
步骤五、发酵结束后，以5000rpm离心15min，固液分离；所得固体用体积浓度为70％乙醇在45℃下超声搅拌3h提取，所得固体与体积浓度为70％乙醇的质量比为1:20；重复提取三次，合并滤液，冻干，得到提取物。
(1)HPLC检测发酵前后酚类物质的变化
以未发酵的松花粉为对照，实验结束后，用HPLC检测发酵前后酚类物质的变化。色谱柱：X-Bridge(250×4.6mm，5μm)，柱温35℃，进样量10μL，检测波长200-600nm；流动相：B相：0.1％甲酸，C相：乙腈，流速1.0mL/min。洗脱方法：0-6.0min，5％～25％C；6.0-15.0min，25％～40％C；15.0～18.0min，40％～70％C；18.0～20.0min，70％～100％C，其检测结果如图1、表1所示。
表1发酵前后松花粉的酚类组成和含量
如图1和表1所示，经米根霉发酵后，松花粉中酚类的种类无变化，但含量发生了显著变化。与未发酵组(NFPP)相比，米根霉发酵组(FPP)中的原儿茶酸、对香豆酸、花旗松素以及柚皮素的含量分别增加了176.30％、10.42％、88.43％和326.75％，儿茶素的含量降低了32.51％，酚类物质的总量从2091.63μg/g增加到3685.62μg/g，其中柚皮素含量增加最为明显，从475.06μg/g增加到了2027.30μg/g。
(2)对3T3-L1细胞O油红染色测试
将3T3-L1细胞以一定密度接种到6孔板，培养48h，细胞达到接触抑制后，进行诱导分化。以100μg/mL的绿原酸为阳性对照组，未加样品组为空白对照组。取200μg/mL、400μg/mL的未发酵样品以及发酵样品，加入3T3-L1细胞培养。
分化结束后，细胞用PBS洗涤2次，用4％的多聚甲醛固定10min，PBS漂洗两次；加入改良油红O染液，染色30min，倒置显微镜拍照，测试结果如图2所示。
如图2所示，a图为空白对照，脂质积累为100％，d图为阳性对照(100μg/mL的绿原酸处理3T3-L1细胞)，与空白对照组相比，用发酵前后松花粉提取物处理的脂肪细胞中的脂滴数量减少，且发酵松花粉提取物(FPP)处理组的细胞脂滴数量少于未发酵松花粉组(NFPP)。
(3)对3T3-L1细胞脂质积累作用检测
将3T3-L1细胞以一定密度接种到6孔板，培养48h，细胞达到接触抑制后，进行诱导分化。以100μg/mL的绿原酸为阳性对照组，未加样品组为空白对照组。取200μg/mL、400μg/mL的未发酵样品以及发酵样品，加入3T3-L1细胞培养。
分化结束后，细胞用PBS洗涤2次，用100％异丙醇提取细胞脂质，测OD520表征细胞脂质含量，结果如图3所示。
如图3所示，与NFPP组相比，FPP组显示对3T3-L1脂肪细胞中脂质积累的良好抑制作用。与空白对照相比，发酵前后松花粉提取物在不同浓度(200μg/mL、400μg/mL)下均可显著减少3T3-L1脂肪细胞中的脂质积累，呈现剂量依赖，且FPP组抑制3T3-L1细胞的脂质积累作用显著优于NFPP组(P<0.05)，在400μg/mL的作用浓度下，脂质积累仅为对照组的57.59％。结果表明，发酵能显著增加松花粉减少脂肪积累的程度，且有剂量依赖关系。
由此可见，本发明所提供的发酵提升松花粉酚类物质进而提升其降脂活性的方法，能有效提升多酚含量及降脂活性(抑制3T3-L1细胞脂质积累)。该方法温和绿色、安全性高、成本低，便于大规模工厂化生产。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。
Claims (9)
1.一种利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、取破壁松花粉溶于柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中，搅拌均匀；
步骤二、将松花粉培养基进行巴氏杀菌，沸水浴加热至中心温度达到80-90℃，置于80-90℃水浴中保温20-40min，保温时间到后立即冰水降温至室温；
步骤三、用Na2HPO4溶液和松花粉培养基混匀，调节pH；
步骤四、从活化好的菌悬液中接种米根霉菌，在20-40℃、150-250r/min条件下，摇瓶发酵3-5天；
步骤五、发酵结束后，以3500-5500rpm离心10-20min，固液分离；所得固体用体积浓度为70％乙醇在40-50℃下超声搅拌提取2-3h，重复提取三次，合并滤液，冻干，得到提取物。
2.根据权利要求1所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，PH为4.3。
3.根据权利要求2所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述Na2HPO4溶液的浓度为0.2mol/L。
4.根据权利要求1所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，在所述步骤五中，所述所得固体与体积浓度为70％乙醇的质量比为1:(15-25)。
5.根据权利要求1所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述米根霉菌为3010米根霉菌。
6.根据权利要求1所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述破壁后松花粉与(柠檬酸缓冲液+Na2HPO4溶液)的重量比为1:(15-25)。
7.根据权利要求2所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述Na2HPO4溶液调节的pH为6.2-6.8。
8.根据权利要求1所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述活化好的菌悬液的孢子数为106个/mL。
9.根据权利要求1所述的利用米根霉菌发酵提升松花粉降脂活性的方法，其特征在于，所述步骤四中米根霉菌的接菌量为10％(V/V)。
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| KR20160020807A (ko) * | 2014-08-14 | 2016-02-24 | (주)하이모 | 황국균 및 유산균 복합발효기술을 이용한 홍삼을 함유하는 발효 효소 식품의 제조 방법 |
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