CN113730565B - 一种融合蛋白疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白疫苗组合物及其制备方法，属于兽用蛋白疫苗技术领域，该融合蛋白疫苗组合物，由抗原蛋白混合物和佐剂按用量比200‑300μg：1g组成，抗原蛋白混合物包括多种抗原蛋白，佐剂包括如下原料：白矿油、乳化剂、稳定剂、络合剂、增效剂、去离子水；该佐剂为一种水包油型乳剂可以对疫苗起到很好的保护作用，且添加了一种增效剂，由酶解后的壳聚糖为基体改性制备，具有抗氧化活性的酚羟基与巯基，酚羟基还具有抗菌活性，一方面可以有效延长疫苗组合物的保存期限，且在使用时可以有效的对猪体内的自由基进行清除，可以有效提升猪的机体性能，对疫苗的效用起到增强效果，进一步加强猪的身体机能。

Description

一种融合蛋白疫苗组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽用蛋白疫苗技术领域，具体涉及一种融合蛋白疫苗组合物及其制备方法。
背景技术
随着畜牧业的发展和人民生活水平的不断提高，人们对畜产品的质量与安全问题日益重视，尤其猪肉产品是我国的主要肉食品之一，猪肉产品的质量与安全更是关注的热点。因此，把握好生猪的健康无疾病，提供安全优质的猪肉产品是保障人们的饮食安全和身体健康的关键。
猪常常会受到各种病毒的侵扰产生各种疾病，若感染后再医治可能会导致猪的身体健康受到影响，所以需要在其生病之前进行疫苗注射，保证其不受疾病的侵害，但现有疫苗注射方式基本上多个疫苗分开注射导致注射次数过多，耗时耗力，效率低下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种融合蛋白疫苗组合物及其制备方法，用于解决背景技术中的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种融合蛋白疫苗组合物，由抗原蛋白混合物和佐剂按用量比200-300μg：1g组成。
进一步地，所述抗原蛋白混合物为SaoA蛋白、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、大肠杆菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原按等质量比混合而成。
进一步地，所述佐剂包括如下重量份原料：白矿油2-10份、乳化剂1-8份、稳定剂1.5-3份、络合剂1.2-3.2份、增效剂1.1-3.3份、去离子水50-100份；
该佐剂由如下步骤制成：
步骤A1：将增效剂、稳定剂、络合剂加入去离子水分散，制得A相；将白矿油、乳化剂混合制得B相；
步骤A2：将A相与B相混合，持续搅拌40-60min，然后进行高速剪切与高压均质，使用微孔滤膜除菌后制得佐剂。
进一步地，所述乳化剂为质量比为1:1的甘露糖油酸酯与吐温80混合而得。
进一步地，所述稳定剂为可溶性二价无机盐，其中阳离子为钙离子或锌离子，阴离子为磷酸氢根离子或磷酸二氢根离子。
进一步地，所述络合剂为乙二胺四乙酸。
进一步地，所述增效剂由如下步骤制成：
步骤S1：按用量比1g：50mL将壳聚糖置于质量分数为1％的醋酸溶液中，搅拌分散后按5U/g的比例加入壳聚糖酶，在50℃水浴下，搅拌酶解5-6h，然后沸水浴10min灭酶，8000r/min离心5min，取上清液冻干制得酶解壳聚糖粉末；
步骤S2：将无水氯化锌加入烧瓶，然后加入冰醋酸，加热至98℃，然后加入间苯二酚，回流反应1-2h，降温至室温，然后加入冰水中，边搅拌边缓慢加入质量分数为36％的盐酸溶液，冰浴至10℃以下，抽滤后使用冷的6mol/L的盐酸洗涤，再使用去离子水洗涤，干燥后制得中间物1；所述无水氯化锌、冰醋酸、间苯二酚的用量比为15g：16mL：11g；
反应过程如下所示：
步骤S3：将中间物1、L-半胱氨酸以及去离子水加入烧瓶中，升温至100℃，回流反应8h，制得中间物2；所述中间物1、L-半胱氨酸、去离子水的用量比为0.01mol：0.01mol：50mL；中间物1与L-半胱氨酸的氨基发生胺酮缩合反应，制得中间物2；
反应过程如下所示：
步骤S4：将中间物2与去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度为70-80℃条件下反应3h，制得中间物3，所述中间物2、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.01mol：200mL：0.01mol：0.05mL；中间物2的羧基在二氯亚砜以及催化剂DMF的作用下发生酰化转变为酰氯基团；
反应过程如下所示：
步骤S5：将中间物3与四氢呋喃加入烧瓶中，室温下搅拌30min，然后将没食子酸与吡啶加入烧瓶中，在温度40℃下条件下，反应3h，制得中间物4；所述中间物3、四氢呋喃、没食子酸、吡啶的用量比为0.01mol：150mL：0.008mol：0.01mol；中间物3的酰氯基团与没食子酸的一个羟基发生酯化反应制得中间物4；
反应过程如下所示：
步骤S6：将中间物4、去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度75℃下反应3h，制得功能组分；所述中间物4、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.008mol：200mL：0.008mol：0.05mL；中间物4的羧基在二氯亚砜的作用下转变为酰氯，便于与壳聚糖上的氨基与羧基反应，将活性成分接枝到壳聚糖分子上；
反应过程如下所示：
步骤S7：将酶解壳聚糖粉末加入装有二氯甲烷的烧瓶中，搅拌后加入功能组分与三乙胺，在室温下搅拌反应4-6h，制得增效剂；所述酶解壳聚糖粉末、二氯甲烷、功能组分、三乙胺的用量比为0.5g：50mL：0.02mol：0.02mol；功能组分与壳聚糖上的氨基与羧基反应将壳聚糖进行改性，得到具有功能组分活性的增效剂。
一种融合蛋白疫苗组合物的制备方法，具体包括如下步骤：
将抗原蛋白混合物和佐剂按用量比200-300μg：1g在无菌、室温条件下进行混合，即制得该融合蛋白疫苗组合物。
本发明提供了一种融合蛋白疫苗组合物及其制备方法。与现有技术相比具备以下有益效果：本发明在制备该疫苗组合物时，选择SaoA蛋白、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原等多种抗原进行混合，对猪的大多数疾病起到防疫的效果，且制备了一种佐剂，为一种水包油型乳剂，可以对疫苗起到很好的保护作用，且在制备时添加了一种增效剂，由酶解后的壳聚糖为基体改性制备，通过酰氯与氨基和羟基会发生反应的机理将功能成分接到壳聚糖分子上，该功能成分带有具有抗氧化活性的酚羟基与巯基，酚羟基还具有抗菌活性，一方面可以有效延长疫苗组合物的保存期限，且在使用时可以有效的对猪体内的自由基进行清除，可以有效提升猪的机体性能，对疫苗的效用起到增强效果，进一步加强猪的身体机能。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
制备功能组分
步骤B1：将无水氯化锌加入烧瓶，然后加入冰醋酸，加热至98℃，然后加入间苯二酚，回流反应1h，降温至室温，然后加入冰水中，边搅拌边缓慢加入质量分数为36％的盐酸溶液，冰浴至10℃以下，抽滤后使用冷的6mol/L的盐酸洗涤，再使用去离子水洗涤，干燥后制得中间物1；所述无水氯化锌、冰醋酸、间苯二酚的用量比为15g：16mL：11g；
步骤B2：将中间物1、L-半胱氨酸以及去离子水加入烧瓶中，升温至100℃，回流反应8h，制得中间物2；所述中间物1、L-半胱氨酸、去离子水的用量比为0.01mol：0.01mol：50mL；
步骤B3：将中间物2与去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度为70℃条件下反应3h，制得中间物3，所述中间物2、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.01mol：200mL：0.01mol：0.05mL；
步骤B4：将中间物3与四氢呋喃加入烧瓶中，室温下搅拌30min，然后将没食子酸与吡啶加入烧瓶中，在温度40℃下条件下，反应3h，制得中间物4；所述中间物3、四氢呋喃、没食子酸、吡啶的用量比为0.01mol：150mL：0.008mol：0.01mol；
步骤B5：将中间物4、去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度75℃下反应3h，制得功能组分；所述中间物4、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.008mol：200mL：0.008mol：0.05mL。
实施例2
制备功能组分
步骤B1：将无水氯化锌加入烧瓶，然后加入冰醋酸，加热至98℃，然后加入间苯二酚，回流反应1.5h，降温至室温，然后加入冰水中，边搅拌边缓慢加入质量分数为36％的盐酸溶液，冰浴至10℃以下，抽滤后使用冷的6mol/L的盐酸洗涤，再使用去离子水洗涤，干燥后制得中间物1；所述无水氯化锌、冰醋酸、间苯二酚的用量比为15g：16mL：11g；
步骤B2：将中间物1、L-半胱氨酸以及去离子水加入烧瓶中，升温至100℃，回流反应8h，制得中间物2；所述中间物1、L-半胱氨酸、去离子水的用量比为0.01mol：0.01mol：50mL；
步骤B3：将中间物2与去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度为75℃条件下反应3h，制得中间物3，所述中间物2、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.01mol：200mL：0.01mol：0.05mL；
步骤B4：将中间物3与四氢呋喃加入烧瓶中，室温下搅拌30min，然后将没食子酸与吡啶加入烧瓶中，在温度40℃下条件下，反应3h，制得中间物4；所述中间物3、四氢呋喃、没食子酸、吡啶的用量比为0.01mol：150mL：0.008mol：0.01mol；
步骤B5：将中间物4、去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度75℃下反应3h，制得功能组分；所述中间物4、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.008mol：200mL：0.008mol：0.05mL。
实施例3
制备功能组分
步骤B1：将无水氯化锌加入烧瓶，然后加入冰醋酸，加热至98℃，然后加入间苯二酚，回流反应2h，降温至室温，然后加入冰水中，边搅拌边缓慢加入质量分数为36％的盐酸溶液，冰浴至10℃以下，抽滤后使用冷的6mol/L的盐酸洗涤，再使用去离子水洗涤，干燥后制得中间物1；所述无水氯化锌、冰醋酸、间苯二酚的用量比为15g：16mL：11g；
步骤B2：将中间物1、L-半胱氨酸以及去离子水加入烧瓶中，升温至100℃，回流反应8h，制得中间物2；所述中间物1、L-半胱氨酸、去离子水的用量比为0.01mol：0.01mol：50mL；中；
步骤B3：将中间物2与去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度为80℃条件下反应3h，制得中间物3，所述中间物2、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.01mol：200mL：0.01mol：0.05mL；
步骤B4：将中间物3与四氢呋喃加入烧瓶中，室温下搅拌30min，然后将没食子酸与吡啶加入烧瓶中，在温度40℃下条件下，反应3h，制得中间物4；所述中间物3、四氢呋喃、没食子酸、吡啶的用量比为0.01mol：150mL：0.008mol：0.01mol；
步骤B5：将中间物4、去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度75℃下反应3h，制得功能组分；所述中间物4、去离子水、二氯亚砜、DMF的用量比为0.008mol：200mL：0.008mol：0.05mL。
实施例4
制备酶解壳聚糖粉末
按用量比1g：50mL将壳聚糖置于质量分数为1％的醋酸溶液中，搅拌分散后按5U/g的比例加入壳聚糖酶，在50℃水浴下，搅拌酶解5h，然后沸水浴10min灭酶，8000r/min离心5min，取上清液冻干制得酶解壳聚糖粉末。
实施例5
制备酶解壳聚糖粉末
按用量比1g：50mL将壳聚糖置于质量分数为1％的醋酸溶液中，搅拌分散后按5U/g的比例加入壳聚糖酶，在50℃水浴下，搅拌酶解5.5h，然后沸水浴10min灭酶，8000r/min离心5min，取上清液冻干制得酶解壳聚糖粉末。
实施例6
制备酶解壳聚糖粉末
按用量比1g：50mL将壳聚糖置于质量分数为1％的醋酸溶液中，搅拌分散后按5U/g的比例加入壳聚糖酶，在50℃水浴下，搅拌酶解6h，然后沸水浴10min灭酶，8000r/min离心5min，取上清液冻干制得酶解壳聚糖粉末。
实施例7
制备增效剂
将实施例5制备的酶解壳聚糖粉末加入装有二氯甲烷的烧瓶中，搅拌后加入实施例2制备的功能组分与三乙胺，在室温下搅拌反应4h，制得增效剂；所述酶解壳聚糖粉末、二氯甲烷、功能组分、三乙胺的用量比为0.5g：50mL：0.02mol：0.02mol。
实施例8
制备增效剂
将实施例5制备的酶解壳聚糖粉末加入装有二氯甲烷的烧瓶中，搅拌后加入实施例2制备的功能组分与三乙胺，在室温下搅拌反应5h，制得增效剂；所述酶解壳聚糖粉末、二氯甲烷、功能组分、三乙胺的用量比为0.5g：50mL：0.02mol：0.02mol。
实施例9
制备增效剂
将实施例5制备的酶解壳聚糖粉末加入装有二氯甲烷的烧瓶中，搅拌后加入实施例2制备的功能组分与三乙胺，在室温下搅拌反应6h，制得增效剂；所述酶解壳聚糖粉末、二氯甲烷、功能组分、三乙胺的用量比为0.5g：50mL：0.02mol：0.02mol。
实施例10
制备佐剂，该佐剂包括如下重量份原料：白矿油2份、乳化剂1份、稳定剂1.5份、络合剂1.2份、实施例8制备的增效剂1.1份、去离子水50份；
该佐剂由如下步骤制成：
步骤A1：将增效剂、稳定剂、络合剂加入去离子水分散，制得A相；将白矿油、乳化剂混合制得B相；
步骤A2：将A相与B相混合，持续搅拌40min，然后进行高速剪切与高压均质，使用微孔滤膜除菌后制得佐剂。
实施例11
制备佐剂，该佐剂包括如下重量份原料：白矿油6份、乳化剂4.5份、稳定剂2份、络合剂2.2份、实施例8制备的增效剂2.23份、去离子水75份；
该佐剂由如下步骤制成：
步骤A1：将增效剂、稳定剂、络合剂加入去离子水分散，制得A相；将白矿油、乳化剂混合制得B相；
步骤A2：将A相与B相混合，持续搅拌50min，然后进行高速剪切与高压均质，使用微孔滤膜除菌后制得佐剂。
实施例12
制备佐剂，该佐剂包括如下重量份原料：白矿油10份、乳化剂8份、稳定剂3份、络合剂3.2份、实施例8制备的增效剂3.3份、去离子水100份；
该佐剂由如下步骤制成：
步骤A1：将增效剂、稳定剂、络合剂加入去离子水分散，制得A相；将白矿油、乳化剂混合制得B相；
步骤A2：将A相与B相混合，持续搅拌60min，然后进行高速剪切与高压均质，使用微孔滤膜除菌后制得佐剂。
实施例13
一种融合蛋白疫苗组合物，由抗原蛋白混合物和实施例11制备的佐剂按用量比200μg：1g组成。
所述抗原蛋白混合物为SaoA蛋白、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、大肠杆菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原按等质量比混合而成。
实施例14
一种融合蛋白疫苗组合物，由抗原蛋白混合物和实施例11制备的佐剂按用量比250μg：1g组成。
所述抗原蛋白混合物为SaoA蛋白、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、大肠杆菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原按等质量比混合而成。
实施例15
一种融合蛋白疫苗组合物，由抗原蛋白混合物和实施例11制备的佐剂按用量比300μg：1g组成。
所述抗原蛋白混合物为SaoA蛋白、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、大肠杆菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原按等质量比混合而成。
对比例1：与实施例14相比，佐剂替换成生理盐水。
对比例2：与实施例14相比，抗原蛋白混合物替换成生理盐水。
对比例3：与实施例14相比，抗原蛋白混合物与佐剂均替换成生理盐水。
选择25-30日龄、健康的实验用仔猪对实施例13-15和对比例1-3进行性能测试，每组使用10头仔猪，每只猪颈部肌肉注射疫苗1mL，单次免疫，免疫21天后，对实验仔猪进行腹腔注射攻毒，选择猪伪狂犬病病毒、猪霍乱病原，攻毒计量为5×108CFU，攻毒后观察10天，得到结果如下表所示：
样本数量 死亡数 保护率(％)
实施例13 10 0 100％
实施例14 10 0 100％
实施例15 10 0 100％
对比例1 10 2 80％
对比例2 10 9 10％
对比例3 10 10 0％
由上表可知，注射实施例13-15的疫苗后的仔猪，具有良好的免疫力，且由对比例1可知佐剂对疫苗的效果具有提升作用。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种融合蛋白疫苗组合物，其特征在于，由抗原蛋白混合物和佐剂按用量比200-300μg：1g组成；
所述佐剂包括如下重量份原料：白矿油2-10份、乳化剂1-8份、稳定剂1.5-3份、络合剂1.2-3.2份、增效剂1.1-3.3份、去离子水50-100份；
其中，增效剂由如下步骤制成：
将酶解壳聚糖粉末加入装有二氯甲烷的烧瓶中，搅拌后加入功能组分与三乙胺，在室温下搅拌反应4-6h，制得增效剂；
所述酶解壳聚糖粉末由如下步骤制成：
按用量比1g：50mL将壳聚糖置于质量分数为1％的醋酸溶液中，搅拌分散后按5U/g的比例加入壳聚糖酶，在50℃水浴下，搅拌酶解5-6h，然后沸水浴10min灭酶，8000r/min离心5min，取上清液冻干制得酶解壳聚糖粉末；
所述功能组分由如下步骤制成：
步骤B1：将无水氯化锌加入烧瓶，然后加入冰醋酸，加热至98℃，然后加入间苯二酚，回流反应1-2h，降温至室温，然后加入冰水中，边搅拌边缓慢加入质量分数为36％的盐酸溶液，冰浴至10℃以下，抽滤后使用冷的6mol/L的盐酸洗涤，再使用去离子水洗涤，干燥后制得中间物1；
步骤B2：将中间物1、L-半胱氨酸以及去离子水加入烧瓶中，升温至100℃，回流反应8h，制得中间物2；
步骤B3：将中间物2与去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度为70-80℃条件下反应3h，制得中间物3；
步骤B4：将中间物3与四氢呋喃加入烧瓶中，室温下搅拌30min，然后将没食子酸与吡啶加入烧瓶中，在温度40℃下条件下，反应3h，制得中间物4；
步骤B5：将中间物4、去离子水加入烧瓶中，然后加入二氯亚砜与DMF，在温度75℃下反应3h，制得功能组分。
2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂由如下步骤制成：
步骤A1：将增效剂、稳定剂、络合剂加入去离子水分散，制得A相；将白矿油、乳化剂混合制得B相；
步骤A2：将A相与B相混合，持续搅拌40-60min，然后进行高速剪切与高压均质，使用微孔滤膜除菌后制得佐剂。
3.根据权利要求1所述的一种融合蛋白疫苗组合物，其特征在于，所述乳化剂为质量比为1:1的甘露糖油酸酯与吐温80混合而得。
4.根据权利要求1所述的一种融合蛋白疫苗组合物，其特征在于，所述稳定剂为可溶性二价无机盐，其中阳离子为钙离子或锌离子，阴离子为磷酸氢根离子或磷酸二氢根离子。
5.根据权利要求1所述的一种融合蛋白疫苗组合物，其特征在于，所述络合剂为乙二胺四乙酸。
6.根据权利要求1所述的一种融合蛋白疫苗组合物，其特征在于，所述抗原蛋白混合物为SaoA蛋白、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、大肠杆菌抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原按等质量比混合而成。
7.根据权利要求1所述的一种融合蛋白疫苗组合物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将抗原蛋白混合物和佐剂在无菌、室温条件下进行混合，即制得该融合蛋白疫苗组合物。
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