CN109908339A - 一种片状磷酸钙疫苗佐剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种片状磷酸钙疫苗佐剂及其制备方法，制备方法为：（1）将一定量的壳聚糖溶于水中，用盐酸调节PH至壳聚糖完全溶解，将一定量的3，4‑二羟基苯基丙酸和碳二亚胺（EDC）分别溶于乙醇和水中，并将两者混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为5.5左右，反应一定时间，透析，冻干，即得儿茶酚修饰的壳聚糖（CSC）。（2）将蛋白质模拟抗原加入到CSC水溶液中，搅拌至其混合均匀；随后，加入磷酸盐缓冲溶液，搅拌一段时间，之后加入CaCl2水溶液中，搅拌相同的时间，离心，水洗即得到片状磷酸钙疫苗佐剂。本发明保证了蛋白质疫苗的活性及佐剂使用的安全性；制备工艺简便，原料廉价，产物快速易得。
Description
技术领域
本发明涉及一种片状磷酸钙疫苗佐剂及其制备方法，属于纳微材料、生物医药制备领域。
背景技术
佐剂是一种在疫苗中添加的能够提高抗原免疫原性的物质，它可以诱导更强的免疫反应，降低对疫苗免疫产生不良反应人群使用疫苗的剂量和生产成本。多糖佐剂由于具有内在免疫调节、生物相容性、生物降解性、低毒性和安全性等特点，在疫苗和药物的制备中引起了广泛的关注。此外，已证实多种天然多糖具有较好的免疫促进作用，可增强体液、细胞和粘膜的免疫功能，因此多糖作为免疫佐剂受到广泛的关注。
壳聚糖是天然阳离子高分子多糖，具有良好的生物相容及血液相性、安全性、微生物降解性等，其在免疫调节方面具有巨大的潜力，故常用作免疫佐剂，其可以刺激细胞因子的分泌以及活化树突状细胞等。壳聚糖具有诱导磷酸钙矿化，形成无机物的能力。磷酸钙是骨骼的主要无机成分，其作为载体可以稳定蛋白质防止其变性。因此，采用壳聚糖诱导磷酸钙矿化形成无机纳米材料，并将其用作疫苗佐剂，同时可以增强体液和细胞免疫应答。
发明内容
本发明的目的在于克服现有疫苗佐剂的缺点，提供一种提高肿瘤免疫治疗效果的片状磷酸钙疫苗佐剂及其制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
.一种片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将壳聚糖分散于水中，用盐酸调节pH至壳聚糖完全溶解，使得最终的质量百分浓度为0.5%-4%，将浓度为10-40 mg mL-1的3，4-二羟基苯基丙酸的乙醇溶液和浓度为10-40 mgmL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液按:0.5:1-4:1比例混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为5.0-6.0，反应2-12 h，在pH5.0-7.0的盐酸水溶液中透析1-3天后，去离子水透析2-10 h，冻干，即得儿茶酚改性壳聚糖（CSC）；
（2）将0.5-10 ml蛋白质模拟抗原加入到等体积的CSC的水溶液中，搅拌至混合均匀；
（3）将0.4-8 ml磷酸盐缓冲溶液（PBS）加入上述（2）中，400-800r/min搅拌5 min-20min，之后加入2-30 ml CaCl2水溶液，搅拌5 min-20 min，离心，用去离子水洗涤2-4次，得到片状磷酸钙疫苗佐剂。
进一步，所述蛋白质模拟抗原为鸡卵清白蛋白（OVA），所述蛋白质模拟抗原浓度为0.5-5mg/ml。
进一步，所述儿茶酚改性壳聚糖（CSC）的浓度为4-12mg/ml。
进一步，所述磷酸盐缓冲溶液（PBS）的浓度为0.1-0.5 mol/L，PH为5-7。
进一步，所述CaCl2水溶液的浓度为100 mmol/L。
本发明的有益效果：
1、 本发明片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法整个制备过程在室温即可，所需材料安全易得，制备过程简便。
2、 本发明片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法与游离的抗原相比，将抗原包裹在疫苗载体里，可以增强细胞对其包吞量，从而达到更好的免疫治疗效果。
附图说明
图1为实施例一、二所制得的片状磷酸钙疫苗佐剂的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例一、二所制得的片状磷酸钙疫苗佐剂的XRD能谱分析图；
图3为用绿色荧光染料对OVA进行染色，之后按照实施例二的方法制备得到的疫苗被小鼠树突状细胞系（BMDC）的吞噬情况图；
图4为实施例二所制得的疫苗佐剂刺激BMDC分泌TNF-α和IL-6的水平图；
图5为实施例三所制得的疫苗佐剂刺激BMDC表面共刺激信号分子的表达程度图；
图6为实施例四所制得的疫苗佐剂刺激BMDC分泌IFN-γ的水平图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明所述实施例中所用到的儿茶酚改性壳聚糖（CSC）是通过如下方法制备得到的：
实施例一
将壳聚糖分散于水中，用盐酸调节pH至壳聚糖完全溶解，使得最终的质量百分浓度为0.5%，将浓度为10 mg mL-1的3，4-二羟基苯基丙酸的乙醇溶液和浓度为10mg mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液按:0.5:1比例混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为5.5，反应3 h，在pH 5.0的盐酸水溶液中透析1天后，去离子水透析2 h，冻干，即得儿茶酚改性壳聚糖（CSC）；
在3ml，2mg/ml的CSC水溶液中，将1.2mL的PBS（0.2M PH=6）水溶液加入上述中，600r/min搅拌10min，再加入4.2mL，100mM的CaCl2水溶液中，搅拌10min，离心，用去离子水洗涤2次，得到不含OVA片状磷酸钙疫苗佐剂。
实施例二
将壳聚糖分散于水中，用盐酸调节pH至壳聚糖完全溶解，使得最终的质量百分浓度为3%，将浓度为30 mg mL-1的3，4-二羟基苯基丙酸的乙醇溶液和浓度为30 mg mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液按:1:1比例混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为5.5，反应10 h，在pH 6.0的盐酸水溶液中透析3天后，去离子水透析8 h，冻干，即得儿茶酚改性壳聚糖（CSC）；
将相同体积的OVA加入到1.5ml，4mg/ml的CSC水溶液中，使OVA的终浓度为1 mg/ml，搅拌至混合均匀；
将1.2mL PBS（0.5M PH=6）水溶液加入上述（1）中，600r/min搅拌10min，再加入4.2mL，100mM的CaCl2水溶液中，搅拌10 min，离心，用去离子水洗涤2次，得到含有OVA的片状磷酸钙疫苗佐剂。
从图1可以看出，相比于没有加入抗原的纳米片，加入抗原之后所形成的片状磷酸钙疫苗尺寸更小，表面更粗糙。从图2可以看出，抗原的加入对纳米片的晶型没有影响，都是（CaHPO4·2H2O, PDF#09-0077）。从图4的表征来看，片状磷酸钙疫苗促进小鼠树突状细胞（BMDC）分泌TNF-α和IL-6水平情况， TNF-α和IL-6水平越高，说明疫苗可能具有更强的抗肿瘤能力。
实施例三
将壳聚糖分散于水中，用盐酸调节pH至壳聚糖完全溶解，使得最终的质量百分浓度为4%，将浓度为40 mg mL-1的3，4-二羟基苯基丙酸的乙醇溶液和浓度为40 mg mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液按2:1比例混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为6.0，反应12 h，在pH 7.0的盐酸水溶液中透析2天后，去离子水透析10 h，冻干，即得儿茶酚改性壳聚糖（CSC）；
将相同体积的OVA加入到1.5ml，8mg/ml的CSC水溶液中，使OVA的终浓度为5mg mL-1，搅拌至混合均匀；
将4mL的PBS（0.2M pH=7）水溶液加入上述（1）中，800r/min搅拌10 min，再加入4.2mL，100mM的CaCl2水溶液中，搅拌10 min，离心，用去离子水洗涤3次，得到含有OVA的片状磷酸钙疫苗佐剂。
从图5可以看出，片状磷酸钙疫苗促进小鼠树突状细胞（BMDC）表面表达共刺激信号分子（CD80和CCR7），CD80和CCR7表达水平的升高，说明片状磷酸钙疫苗能够促进BMDC成熟，使得BMDC具有更高的成熟度，进而具有更强活化CD8 T细胞的能力，即抗肿瘤能力。
实施例四
将壳聚糖分散于水中，用盐酸调节pH至壳聚糖完全溶解，使得最终的质量百分浓度为2%，将浓度为20 mg mL-1的3，4-二羟基苯基丙酸的乙醇溶液和浓度为20 mg mL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液按4:1比例混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为5.0，反应7 h，在pH 6.0的盐酸水溶液中透析2天后，去离子水透析6 h，冻干，即得儿茶酚改性壳聚糖（CSC）；
将相同体积的OVA加入到1.5ml，12 mg/ml的儿茶酚修饰的壳聚糖的水溶液中，使OVA的终浓度为2 mg/ml，搅拌至混合均匀；
将8mL的PBS（0.1 M，pH=6）水溶液加入上述（1）中，600r/min搅拌10 min，再加入4.2mL，100 mM的CaCl2水溶液中，搅拌10 min，离心，用去离子水洗涤3次，得到含有OVA的片状磷酸钙疫苗佐剂。
从图6可以看出，片状磷酸钙疫苗促进小鼠树突状细胞（BMDC）分泌INF-γ水平情况，INF-γ水平越高，说明疫苗可能具有更强的抗肿瘤能力。
实施例五
用绿色荧光染料标记的OVA，按照实施方案二的方法制备疫苗佐剂。将从小鼠股骨和胫骨提取出来的BMDC细胞培养至第六天，收集铺入24孔板，每孔1*106个细胞，待贴壁2h后，加入一定量游离的蛋白和蛋白疫苗载体孵育一定的时间，收集细胞，流式检测。
从图3可以看出，小鼠树突状细胞系（BMDC）对游离抗原和片状磷酸钙疫苗的胞吞情况，以FITC的平均荧光强度来计，强度越高说明BMDC对抗原的胞吞量越高，图中结果说明片状磷酸钙疫苗能显著提高BMDC对抗原的胞吞量。
上面结合具体实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将壳聚糖分散于水中，用盐酸调节pH至壳聚糖完全溶解，使得最终的质量百分浓度为0.5%-4%，将浓度为10-40 mg mL-1的3，4-二羟基苯基丙酸的乙醇溶液和浓度为10-40 mgmL-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）水溶液按:0.5:1-4:1比例混合均匀，在快速搅拌下加入壳聚糖溶液中，用氢氧化钠调其pH为5.0-6.0，反应2-12 h，在pH5.0-7.0的盐酸水溶液中透析1-3天后，去离子水透析2-10 h，冻干，即得儿茶酚改性壳聚糖（CSC）；
（2）将0.5-10 ml蛋白质模拟抗原加入到等体积的CSC的水溶液中，搅拌至混合均匀；
（3）将0.4-8 ml磷酸盐缓冲溶液（PBS）加入上述（2）中，400-800r/min搅拌5 min-20min，之后加入2-30 ml CaCl2水溶液，搅拌5 min-20 min，离心，用去离子水洗涤2-4次，得到片状磷酸钙疫苗佐剂。
2.根据权利要求1所述的片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述蛋白质模拟抗原为鸡卵清白蛋白（OVA），所述蛋白质模拟抗原浓度为0.5-5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述儿茶酚改性壳聚糖（CSC）的浓度为4-12mg/ml。
4.根据权利要求1所述的片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液（PBS）的浓度为0.1-0.5 mol/L，PH为5-7。
5.根据权利要求1所述的片状磷酸钙疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述CaCl2水溶液的浓度为100 mmol/L。
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