CN110559421A - 胎盘转移因子的医药用途及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胎盘转移因子的医药用途及其制备方法。所述医药用途包括胎盘转移因子在制备缩短病猪潜伏期的药物中的用途，在制备诊断病猪的药物中的用途，以及在制备提高抗非洲猪瘟免疫力的药物中的用途。本发明通过将胎盘进行匀浆处理和酶解制备了胎盘转移因子，在非州猪瘟窗口期采取注射胎盘转移因子，采用免疫刺激可实现集中精准快速拔牙(发现疑似非洲猪瘟症状)，并在非感染非洲猪瘟正常猪继续使用胎盘转移因子，可以提高正常猪的免疫力。

Description

胎盘转移因子的医药用途及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品和兽医领域，尤其涉及胎盘转移因子的医药用途及其制备方法。
背景技术
2005年7月，国际病毒分类委员会(ICTV)最新病毒分类第八次报告中指出，非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus，ASFV)属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)家族的唯一成员，并且主要在细胞的细胞质中复制。
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，非洲猪瘟病毒主要经呼吸道和消化道进入猪体内，感染靶细胞主要是单核-巨噬细胞。强毒株可在感染的约5-14天内杀死家猪，其中死亡率接近100％，暂无有效预防疫苗，无特效治疗药物。各阶段家猪、野猪和软蜱是非洲猪瘟自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播，也可通过蜱虫叮咬传播，还可以通过污染了病毒的泔水、饲料以及腌制的干火腿等猪肉产品跨国家和地区传播。发现疫情必须进行扑杀，是全球防范内危害猪群最严重的传染病之一，是我国重点防范的头号外来动物疫病。
非洲猪瘟潜伏期长，自然感染情况下非洲猪瘟潜伏期4-19天，最长21天。亚急性和慢性型非洲猪瘟临床症状表现如下：
0-3天：无症状期(病毒接触和感染扁桃体)：仅表现轻微不适：精神沉郁、减料、目光呆滞，厌食；
4-6天：症状表现期(从扁桃体进入血液，口鼻腔排毒，血液散毒)：扎堆，皮肤发红、体温升高至40.5-42℃，打颤，肌肉酸痛；
7-9天：症状明显期(口鼻、粪便和血液大量排毒)：皮肤潮红，败血，皮下出血，呼吸急促，耳缘发绀，喜卧，驱赶不动，后肢腹部发红，耳朵发绀死亡；
10-15天：死亡高峰期：败血、发绀、血便、流鼻血、血凝不佳、死亡高峰。死亡、耐过。
ASFV感染猪只排毒量大，发病后期血液病毒滴度高达108.0HAD50/ML；器官组织(肝、脾、淋巴结等)病毒滴度高达105.0-108.0HAD50/ML；依据测定Pig/HLJ/18毒株对猪半数致死剂量(PLD50)结果：病死猪每毫升血液所含PLD50病毒量达100万以上，每克组织所含PLD50病毒量达10万以上。意味着1ml血液所含的ASFV病毒可至100万头猪感染发病！
针对非洲猪瘟以上特点，“拔牙式清除”ASFV感染猪是阻止非洲猪瘟传播扩散的常用方法。“拔牙式清除”的关键在于猪群早期的检测预警，如0～3天内扁桃体感染，这阶段猪只不散毒，因此能够及时检测出便只需要淘汰一头猪；时间越长，猪感染到周边猪群的可能性越大，需要淘汰的猪也越多。目前筛查是当猪场发生首个疑似病例，如表现为发热、全身发红、皮肤出血、呕吐、便血、流产等疑似症状时，立即采集发病动物的血液样本进行实验室荧光定量PCR方法，确诊之后，立马对该栋栏舍进行全面封锁，直到解除封锁。
发明内容
目前对非洲猪瘟防治最有效的办法就是早期感染预警排查，清除。由于非洲猪瘟潜伏期长，感染猪排毒量大，一旦发现个体发病，往往大部分群体已经发生了感染。虽然感染初期，鼻、咽、直肠分泌液比血液先出现病毒，但病毒量较低，很难做到早发现早处置。因此，本发明要解决的技术问题是：排查早期感染病猪，及早发现并清除感染病猪。
本发明人为解决上述技术问题，在未出现病症之前对猪注射羊胎盘转移因子，可以将感染非洲猪瘟猪的临床症状提前表现，及早发现病猪。
具体来说，本发明提出了如下技术方案：
一方面，本发明提供了胎盘转移因子在制备缩短病猪潜伏期的药物中的用途，优选地，所述病猪是非洲猪瘟感染猪。
另一方面，本发明提供了胎盘转移因子在制备诊断病猪的药物中的用途，优选地，所述病猪是非洲猪瘟病毒感染猪。
另一方面，本发明提供了胎盘转移因子在制备提高抗非洲猪瘟免疫力的药物中的用途。
优选地，上述的用途，其中，所述药物是注射剂。
优选地，上述的用途，其中，所述胎盘转移因子选自羊胎盘转移因子、猪胎盘转移因子、牛胎盘转移因子、鸡胎盘转移因子和/或兔胎盘转移因子；优选地，所述胎盘转移因子为羊胎盘转移因子。
另一方面，本发明提供了胎盘转移因子的制备方法，包括如下步骤：将胎盘进行匀浆处理和酶解；优选地，所述胎盘转移因子选自羊胎盘转移因子、猪胎盘转移因子、牛胎盘转移因子、鸡胎盘转移因子和/或兔胎盘转移因子；进一步优选地，所述胎盘转移因子为羊胎盘转移因子。
优选地，上述的制备方法，其中，所述匀浆处理是采用酸性缓冲液对胎盘组织进行处理，优选地，酸性缓冲液pH为3.6～4.6。
优选地，上述的制备方法，其中，所述酶解为两步酶解；优选地，所述两步酶解包括一级酸性酶解和二级碱性酶解；进一步优选地，一级酸性酶解pH为3.5-5.0，进一步优选地，一级酸性酶解温度为40-50℃；进一步优选地，二级碱性酶解pH为7.5-8.0，进一步优选地，二级碱性酶解温度为37-55℃。
优选地，上述的制备方法，其中，所述一级酸性酶解用胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶；优选地，所述胃蛋白酶活力单位以10万U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％；优选地，所述木瓜蛋白酶活力单位以80万U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％；优选地，反应温度为40-50℃；优选地，反应时间为2-3h；更优选地，反应温度为45℃，反应时间为2.5h。
优选地，上述的制备方法，其中，所述二级碱性酶解用胰蛋白酶和/或碱性蛋白酶，优选地，所述胰蛋白酶活力单位以4000U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％，优选地，反应温度为37-45℃，优选地，反应时间为1-2h；更优选地，反应温度为37℃，反应时间2h；优选地，所述碱性蛋白酶活力单位以20万U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％，优选地，反应温度为50-55℃，优选地，反应时间为1-2h；更优选地，反应温度为50℃，反应时间2h。
优选地，上述的制备方法，其中，所述制备方法还包括乳化步骤，优选地，所述乳化步骤中加入的乳化剂选自吐温、甲基纤维素、羟丙甲纤维素和/或海藻酸钠，优选地，所述乳化剂为以胎盘酶解液重量百分比计，包括0.1％-2.0％吐温-20、0.1％-2.0％的吐温-80、0.2％-0.5％甲基纤维素、0.2％-0.5％羟丙甲纤维素和/或0.5％-2.0％海藻酸钠；更优选地，所述乳化剂为0.1％-2.0％的吐温-80。
优选地，上述的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1：匀浆：对胎盘组织进行匀浆处理，得到胎盘匀浆液；优选地，采用酸性缓冲液进行胎盘组织低温匀浆；优选地，采用胶体磨匀浆；进一步优选地，胶体磨转速3000-5000r/min；更优选地，反复3-5次，优选3次；
步骤2：超声提取：将步骤1所得的胎盘匀浆液于超声提取仪中提取，得到胎盘超声提取液；优选地，超声功率为300-500w/L；进一步搅拌转速为1000～1200r/min；更优选地，超声时间为30～50min；优选地，超声功率为350w/L，搅拌转速为1000r/min，超声时间为30min；
步骤3：离心：将步骤2所得的胎盘超声提取液进行离心处理，得胎盘离心上清液；优选地，采用低温离心分离；进一步优选地，温度为1～10℃，更优选地，温度2～4℃；进一步优选地，离心转速为3000-5000r/min；优选地，离心20-40min，更优选地，离心30min；
步骤4：高压均质剪切：将步骤3所得的胎盘离心上清液进行剪切处理，得到胎盘均质液；优选地，均质压力为5000-7000Pa；优选地，均质速度为500～600ml/min，更优选地，均质速度为500ml/min；
步骤5：两步酶解：将步骤4所得的胎盘均质液进行两步酶解，得胎盘酶解液；
优选地，还包括步骤6：低温均质乳化：将步骤5所得的胎盘酶解液进行低温均质乳化，优选地，均质频率15k-100k Hz；优选地，乳化时间为20-30min；优选地，乳化温度为5-10℃；更优选地，加入0.1％-2.0％的吐温-80，乳化30min，均质频率为45kHz。
另一方面，本发明提供了上述的制备方法得到的胎盘转移因子。
优选地，上述的胎盘转移因子，其中，小分子肽含量为2.5mg/ml以上；优选地，所述小分子肽含量为2.72～2.82mg/ml；进一步优选地，所述小分子肽的分子量为3000-5000Da。
本发明的有益效果包括：
1.通过缩短潜伏期可以及早发现病猪，第一时间对病猪采用“拔牙式清除”，清除潜伏感染猪只，减少排毒，从而实现非瘟净化生产。
2.通过注射转移因子缩短潜伏期发现感染病猪的方法，简单、快速、易操作，特别适合条件较差的养殖场，只需对出现临床症状的猪只精准拔牙，即可减少经济损失。
3.通过注射转移因子，提高猪群免疫力与抗病力。
附图说明
图1为实施例2的羊胎盘转移因子制备工艺流程图。
具体实施方式
如上所述，非洲猪瘟在发病前具有21天的潜伏期(窗口期)，难以发现，如何及时发现(感染早期)无临床症状潜伏感染的猪，为快速拔牙创造条件，减少猪的排毒，从而实现非瘟净化生产，已成为世界处置非洲猪瘟面临的最为迫切的问题。本发明为了能够尽早发现病猪，将转移因子注射到猪体内，从而缩短潜伏期，及时发现并隔离病猪。
本文中，术语“拔牙”指的是隔离或无害化处理感染个体或群体，其中无害化处理方式为深埋或焚烧。
术语“潜伏期”指病原体侵入身体至最早出现临床症状的这段时间。
术语“转移因子”又称传输因子，由具有细胞性免疫功能的淋巴细胞产生。转移因子属多肽类物质，含多种氨基酸，分子量在10000道尔顿(Da)以内。根据制备转移因子的组织来源，可将转移因子分为脾转移因子、胎盘转移因子和白细胞转移因子等。
术语“存栏”指的是牲畜在饲养中，用于统计饲养中的牲畜头数。
术语“两步酶解”指的是酸性酶解与碱性酶解两个阶段的酶解。
本发明优选的技术方案，提供了胎盘肽转移因子在制备缩短病猪潜伏期的药物中的用途，或者在制备诊断病猪的药物中的用途。
本发明优选的技术方案，提供了羊胎盘肽转移因子在制备缩短病猪潜伏期的药物中的用途，或者在制备诊断病猪的药物中的用途。羊胎盘肽转移因子激活猪的单核巨噬细胞系统，特别是将羊胎盘肽转移因子用在非洲猪瘟感染猪上，能够明显缩短非洲猪瘟的潜伏期，提前表现感染症状，及时诊断出非洲猪瘟感染，从而实现快速、精确拔牙。
本发明优选的技术方案，提供了羊胎盘肽转移因子对疑似非洲猪瘟潜伏期的猪只进行快速拔牙(非洲猪瘟潜伏期的早期发现和筛查)的用途。优选地，将羊胎盘转移因子通过肌肉注射到猪只即可根据临床筛查指标(扎堆，皮肤发红、体温升高至40.5-42℃，打颤，肌肉酸痛、呕吐、便血、孕猪流产、停食)，快速排除非洲猪瘟阳性和疑似感染的猪群，及时进行拔牙处理。优选地，连续2-3天对猪只注射羊胎盘转移因子(2-10ml/头)，进一步优选地，注射剂量为：小猪(15～30公斤)2ml/头，中猪(30～60公斤)5ml/头，大猪(60公斤以上的育肥猪)8ml/头，母猪(性成熟的雌性猪，包括后备母猪、孕猪和经产母猪)10ml/头。进一步优选地，所述胎盘转移因子的给药剂量为每头猪按体重计0.07～0.08ml/kg。
本发明优选的技术方案，提供了羊胎盘转移因子在制备提高猪免疫能力的药物中的用途，羊胎盘肽转移因子激活猪的单核巨噬细胞系统，产生多种免疫细胞因子，提高机体抵抗力，用于早期防治疑似非洲猪瘟(ASFV)，实现非瘟净化生产。
本发明优选的技术方案，对阴性猪只采用羊胎盘肽转移因子注射液肌肉注射刺激猪单核巨噬细胞系统，激活特异和非特异免疫功能，提高猪只免疫力。优选地，对猪只肌肉注射羊胎盘转移因子(2-10ml/头)，三天一次，连续三月。进一步优选地，注射剂量为：小猪(15～30公斤)2ml/头，中猪(30～60公斤)5ml/头，大猪(60公斤以上的育肥猪)8ml/头，母猪(性成熟的雌性猪，包括后备母猪、孕猪和经产母猪)10ml/头。进一步优选地，所述胎盘转移因子的给药剂量为每头猪按体重计0.07～0.08ml/kg。
本发明优选的技术方案，提供了一种羊胎盘转移因子的制备方法，通过将羊胎盘匀浆进行酶解得到。
本发明优选的技术方案，选用2-3月孕羊剖腹，取其羊胎盘进行匀浆和酶解，制备羊胎盘肽转移因子。
本发明优选的技术方案，羊胎盘肽转移因子制法，采用酸性缓冲液进行羊胎盘组织匀浆处理，并进行两步酶解，制备羊胎盘肽转移因子。优选地，酸性缓冲液pH为3.6～4.6；进一步优选地，采用0.1M的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。进一步优选地，采用胶体磨进行匀浆；进一步优选地，胶体磨转速3000-5000r/min。
本发明优选的技术方案，所述两步酶解包括一级酸性酶解和二级碱性酶解，其中一级酸性酶解pH3.5-5.0，二级碱性酶解pH7.5-8.0。优选地，一级酸性酶解加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，二级碱性酶解加入胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
本发明优选的技术方案，匀浆处理后将匀浆液进行超声提取。优选地，超声功率300-500w/L。
本发明优选的技术方案，对超声提取得到的胎盘匀浆液进行低温离心分离。优选地，温度为1～10℃。进一步优选地，离心转速为3000-5000r/min。
本发明优选的技术方案，对低温离心分离得到的上清匀浆液进行高压均质机剪切，优选地，均质压力为5000-7000Pa。
本发明优选的技术方案，提供了羊胎盘肽转移因子制备方法，采用酸性缓冲液进行羊胎盘组织低温匀浆(胶体磨转速3000-5000r/min，反复3-5次)；匀浆液进行超声提取(超声功率300-500w/L，搅拌转速为1000～1200r/min，超声时间30～50min)；低温离心分离超声提取液(温度2～4℃，离心转速3000-5000r/min)；上清匀浆液进行高压均质机剪切(局部枪头压力5000-7000Pa，均质速度500～600ml/min)；两步酶解羊胎盘。
本发明优选的技术方案，所述羊胎盘两步酶解方法，一级酶解在酸性条件下pH3.5-5.0，加入按胎盘投料重量计1-2wt.％胃蛋白酶(活力单位10万U/g)，1-2wt.％木瓜蛋白酶(80万U/g)；一级酶解后反应液调节pH7.5-8.0，加入按胎盘投料重量计1-2wt.％胰蛋白酶(4000U/g)，再加入按胎盘投料重量计1-2wt.％碱性蛋白酶(20万U/g)。
本发明优选的技术方案，所述羊胎盘两步酶解方法，一级酶解在酸性条件下pH3.5-5.0，加入按胎盘投料重量计1-2wt.％胃蛋白酶(活力单位10万U/g)，1-2wt.％木瓜蛋白酶(80万U/g)，温度40-50℃；一级酶解后反应液调节pH7.5-8.0进行二级酶解，加入按胎盘投料重量计1-2wt.％胰蛋白酶(4000U/g)，温度37-45℃，再加入按胎盘投料重量计1-2wt.％碱性蛋白酶(20万U/g)，温度50-55℃。
本发明优选的技术方案，所述羊胎盘两步酶解方法，一级酶解在酸性条件下pH3.5-5.0，按胎盘投料重量计加入1-2wt.％胃蛋白酶(活力单位10万U/g)，1-2wt.％木瓜蛋白酶(80万U/g)，温度40-50℃，反应时间2-3h；一级酶解后反应液调节pH7.5-8.0进行二级酶解，加入按胎盘投料重量计1-2wt.％胰蛋白酶(4000U/g)，温度37-45℃，反应时间1-2h，再加入按胎盘投料重量计1-2wt.％碱性蛋白酶(20万U/g)，温度50-55℃，反应时间1-2h。
本发明优选的技术方案，对两步酶解所得的羊胎盘肽进行均质乳化得到羊胎盘肽转移因子。优选地，均质频率15k-100k Hz，乳化时间20-30min。
本发明优选的技术方案，对两步酶解所得的羊胎盘肽进行低温均质乳化，均质频率15kHz-100k Hz，乳化时间20-30min，温度5-10℃，得到羊胎盘肽转移因子。
本发明优选的技术方案，所述乳化剂为按胎盘投料重量百分比计：0.1％-2.0％吐温-20、0.1％-2.0％的吐温-80、0.2％-0.5％甲基纤维素、0.2％-0.5％羟丙甲纤维素和0.5％-2.0％海藻酸钠。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚地展示，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1羊胎盘转移因子对疑似非洲猪瘟感染猪的诊断应用：精准拔牙
拔牙操作方法：疑似感染栋舍猪只紧急肌肉注射羊胎盘转移因子，剂量：小猪(15～30公斤)2ml/头，中猪(30～60公斤)5ml/头，大猪(60公斤以上的育肥猪)8ml/头，母猪(性成熟的雌性猪，包括后备母猪、孕猪和经产母猪)10ml/头；第二天加强一次。使用一次性注射器和针头，先打相对健康猪只，再打临近感染栏舍猪只。经注射羊胎盘转移因子后，感染猪只出现扎堆，皮肤发红、体温升高至40.5-42℃，打颤，肌肉酸痛，呕吐、便血、孕猪流产、停食等临床筛查指标，立即对感染猪只进行无害化处理。保留未出现临床筛查指标的阴性猪。
拔牙第3-5天，之前未出现临床筛查指标的阴性猪一旦出现疑似症状，如食欲下降、厌食、呕吐、发热等症状时，无需确诊直接进行无害化处理，精神沉郁不吃料者马上无害化处理。当15天内没有出现新发病例时，对全群用羊胎盘转移因子加强免疫一次，且15天内无疑似临床病例出现，可以认为疫情得到控制，可以解除被封锁的栏舍。
注射羊胎盘转移因子后加强带猪消毒(用1:50配比10％的过硫酸钾带猪消毒)，防止交叉感染。第一周猪和猪栏消毒2次；第二周猪栏猪消毒2次；以后每周带猪消毒1次。
本实施例对5个猪场进行了试验，对疑似发病猪进行PCR检测，一旦发现阳性猪，对发病猪进行清理，并对其他猪进行羊胎盘转移因子注射，临床试验结果如表1所示。
表1临床试验及结果
本次实验猪只共1904头，合计淘汰222头，存活率88.34％，五个猪场拔牙全部成功。实验证明：对早期非瘟污染场注射羊胎盘转移因子免疫调节，快速拔牙，清除ASFV潜伏感染猪，减少排毒，从而实现非瘟净化生产，对现阶段恢复生猪生产具有重要的经济价值与社会效益。
实例2：羊胎盘转移因子制备
本实施例中所用到各试剂和仪器来源如下表2所示，未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容。
表2羊胎盘转移因子制备用试剂和仪器
试剂/仪器 型号/规格 厂家
胶体磨 JM-65 温州市龙湾永兴华威机械厂
超声波提取机 Scientz-50T 宁波新芝生物科技股份有限公司
高速冷冻离心机 TGC-16M 湖南迈克尔实验仪器有限公司
高压均质机 ATS-AH08-100 安拓思纳米技术(苏州)有限公司
乳化机 ZJR-10 无锡意凯自动化技术有限公司
胃蛋白酶 9001-75-6 solarbio
木瓜蛋白酶 9001-73-4 都莱生物
胰蛋白酶 T8151 solarbio
碱性蛋白酶 B8360 solarbio
采用如下步骤制备羊胎盘转移因子。
步骤1：羊胎盘预处理：取新鲜或冷冻的2-3月龄羊胎盘2kg，去除脂肪和结缔组织，清洗去除血水，剪成2×2cm碎块，称重1.5kg。
步骤2：匀浆：步骤1所得1.5kg胎盘碎块，按1:6(W:V)加入酸性缓冲液(0.1M的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液)9.0L，于胶体磨中匀浆，匀浆转速为3000-5000r/min，反复3次。
步骤3：超声提取：步骤2所得胎盘匀浆液于超声提取仪中提取，超声功率350w/L，搅拌转速为1000r/min，超声时间30min。
步骤4：低温离心：于冷冻离心机中，4℃，将步骤3所得胎盘超声提取液3000-5000r/min，离心30min。
步骤5：高压均质剪切：步骤4所得离心上清液进行高压均质机剪切，剪切压力5000-7000Pa，均质速度500ml/min。
步骤6：两步酶解：步骤5所得的提取液进行两步酶解。具体如下：一级酶解在酸性条件下pH 3.5-5.0，用胃蛋白酶(活力单位10万U/g)200g，木瓜蛋白酶(80万U/g)100g，温度45℃，反应时间2.5h；一级酶解后反应液调节pH7.5-8.0，应用胰蛋白酶(4000U/g)1％，温度37℃，反应时间2h，再应用碱性蛋白酶(20万U/g)1％，温度50℃，反应时间2h。
步骤7：低温均质乳化：将步骤6所得的胎盘酶解液中加入0.1％-2.0％的吐温-80，乳化30min，均质频率为45kHz，得羊胎盘转移因子成品。
实例3羊胎盘转移因子成品中有效成分含量测定
羊胎盘转移因子成品中有效成分主要是小分子肽，通过福林酚法进行检测，检测试剂和仪器如表3所示，未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容。
表3小分子肽含量检测试剂与仪器
试剂/仪器 型号/规格 厂家
牛血清白蛋白 PB10056 北京普博欣生物科技有限责任公司
五水硫酸铜 XK13-011-00011 天津永大化学试剂有限公司
福林酚试剂 73104861 国药集团化学试剂有限公司
氢氧化钠 20170910 天津永晟精细化工有限公司
碳酸钠 20110513 天津永大化学试剂有限公司
酒石酸钾 20180307 天津福晨化学试剂厂
数显恒温水浴锅 DK-98-11 天津市泰斯特仪器有限公司
双光束紫外分光光度计 P7紫外/可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司
小分子肽含量检测的具体步骤如下：
I.对照品溶液的制备
精密称取牛血清白蛋白对照品(批号：PB10056)0.30g，加水至100ml，制成每1.0ml含牛血清白蛋白0.03mg的溶液。
II.待检样品的制备
取实施例2制备的羊胎盘转移因子样品5ml，加水至50ml，作为待检样品。
III.对照品的制备
取转移因子溶液(批号：201710051，山东信得科技股份有限公司)5ml，加水至50ml，待检。
IV.标准曲线的制备
精密量取步骤I制备的对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml，分别置具塞刻度试管中，各加水至1ml，再分别加入碱性铜溶液(五水硫酸铜、酒石酸钾、氢氧化钠的混合溶液)1ml，摇匀，各加入福林酚试液4ml，立即混匀，置55℃水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白对照，以吸收度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。
V.精密量取步骤II制备的羊胎盘转移因子待检样品与步骤III制备的对照品各1ml，照步骤IV标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，自标准曲线上查得待检样品溶液的浓度，并乘以稀释倍数即为羊胎盘转移因子待检样品与对照品的多肽含量。
VI.检验结果：
表4羊胎盘转移因子有效成分---小分子肽的检测结果
由检测结果可知，本发明羊胎盘转移因子有效成分(小分子肽)含量平均为2.78mg/ml，超过了2.5mg/ml，远高于其他转移因子含量。
实例6羊胎盘转移因子有效成分分子量测定
按照GB31645-2018附录A公开的检测方法，利用高效体积排阻色谱法测定实施例2制得的羊胎盘转移因子有效成分(小分子肽)的分子量分布范围，检测试剂和仪器如表5所示，未记载的试剂或仪器或操作步骤均是本领域普通技术人员可常规确定的内容。
表5小分子肽分子量测定试剂与仪器
试剂/仪器 型号/规格 厂家
乙腈 M157-4 MREDA TECHNOLOGY INC.
三氟乙酸 Q71516 山东西亚化学工业有限公司
细胞色素C C0180 Biosun
抑肽酶 C1254 Biosun
杆菌酶 C0123 Biosun
乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸 C2583 Biosun
乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸 C1524 Biosun
高效液相色谱仪 S3000 Biosun
电子天平 GL224i-1SCN 昆山市超声仪器有限公司
超声波清洗仪 KQ-100DE 赛多利斯
检测结果：本发明羊胎盘转移因子有效成分---小分子肽的分子量在3000-5000Da之间，说明本发明制备的羊胎盘转移因子分子量小，且分子量的分布集中。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (14)

1.胎盘转移因子在制备缩短病猪潜伏期的药物中的用途，优选地，所述病猪是非洲猪瘟感染猪。
2.胎盘转移因子在制备诊断病猪的药物中的用途，优选地，所述病猪是非洲猪瘟病毒感染猪。
3.胎盘转移因子在制备提高抗非洲猪瘟免疫力的药物中的用途。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中，所述药物是注射剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中，所述胎盘转移因子选自羊胎盘转移因子、猪胎盘转移因子、牛胎盘转移因子、鸡胎盘转移因子和/或兔胎盘转移因子；优选地，所述胎盘转移因子为羊胎盘转移因子。
6.胎盘转移因子的制备方法，包括如下步骤：将胎盘进行匀浆处理和酶解；
优选地，所述胎盘转移因子选自羊胎盘转移因子、猪胎盘转移因子、牛胎盘转移因子、鸡胎盘转移因子和/或兔胎盘转移因子；进一步优选地，所述胎盘转移因子为羊胎盘转移因子。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述匀浆处理是采用酸性缓冲液对胎盘组织进行处理，优选地，酸性缓冲液pH为3.6～4.6。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其中，所述酶解为两步酶解；优选地，所述两步酶解包括一级酸性酶解和二级碱性酶解；
进一步优选地，一级酸性酶解pH为3.5-5.0，进一步优选地，一级酸性酶解温度为40-50℃；
进一步优选地，二级碱性酶解pH为7.5-8.0，进一步优选地，二级碱性酶解温度为37-55℃。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述一级酸性酶解用胃蛋白酶和/或木瓜蛋白酶；
优选地，所述胃蛋白酶活力单位以10万U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％；
进一步优选地，所述木瓜蛋白酶活力单位以80万U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％；
进一步优选地，反应温度为40-50℃；进一步优选地，反应时间为2-3h；
进一步优选地，反应温度为45℃，反应时间为2.5h。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其中，所述二级碱性酶解用胰蛋白酶和/或碱性蛋白酶；
优选地，所述胰蛋白酶活力单位以4000U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％，进一步优选地，反应温度为37-45℃，进一步优选地，反应时间为1-2h；进一步优选地，反应温度为37℃，反应时间为2h；
进一步优选地，所述碱性蛋白酶活力单位以20万U/g计，加入量为胎盘投料重量的1-2％，进一步优选地，反应温度为50-55℃，进一步优选地，反应时间为1-2h；进一步优选地，反应温度为50℃，反应时间为2h。
11.根据权利要求6-10任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括乳化步骤；
优选地，所述乳化步骤中加入的乳化剂选自吐温、甲基纤维素、羟丙甲纤维素和/或海藻酸钠；
进一步优选地，所述乳化剂为以胎盘酶解液重量百分比计，包括0.1％-2.0％吐温-20、0.1％-2.0％的吐温-80、0.2％-0.5％甲基纤维素、0.2％-0.5％羟丙甲纤维素和/或0.5％-2.0％海藻酸钠；
进一步优选地，所述乳化剂为0.1％-2.0％的吐温-80。
12.根据权利要求6-11任一项所述的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1：匀浆：对胎盘组织进行匀浆处理，得到胎盘匀浆液；优选地，采用酸性缓冲液进行胎盘组织低温匀浆；进一步优选地，采用胶体磨匀浆；进一步优选地，胶体磨转速3000-5000r/min；进一步优选地，反复3-5次，优选3次；
步骤2：超声提取：将步骤1所得的胎盘匀浆液于超声提取仪中提取，得到胎盘超声提取液；优选地，超声功率为300-500w/L；进一步优选地，搅拌转速为1000～1200r/min；进一步优选地，超声时间为30～50min；进一步优选地，超声功率为350w/L，搅拌转速为1000r/min，超声时间为30min；
步骤3：离心：将步骤2所得的胎盘超声提取液进行离心处理，得胎盘离心上清液；优选地，采用低温离心分离；进一步优选地，温度为1～10℃，进一步优选地，温度为2～4℃；进一步优选地，离心转速为3000-5000r/min；进一步优选地，离心20-40min，进一步优选地，离心30min；
步骤4：高压均质剪切：将步骤3所得的胎盘离心上清液进行剪切处理，得到胎盘均质液；优选地，均质压力为5000-7000Pa；进一步优选地，均质速度为500～600ml/min，进一步优选地，均质速度为500ml/min；
步骤5：两步酶解：将步骤4所得的胎盘均质液进行两步酶解，得胎盘酶解液；
任选地，还包括步骤6：低温均质乳化：将步骤5所得的胎盘酶解液进行低温均质乳化，优选地，均质频率为15k-100k Hz；进一步优选地，乳化时间为20-30min；进一步优选地，乳化温度为5-10℃；进一步优选地，加入0.1％-2.0％的吐温-80，乳化30min，均质频率为45kHz。
13.权利要求6-12任一项所述的制备方法得到的胎盘转移因子。
14.根据权利要求13所述的胎盘转移因子，其中，小分子肽含量为2.5mg/ml以上；
优选地，所述小分子肽含量为2.72～2.82mg/ml；
进一步优选地，所述小分子肽的分子量为3000-5000Da。
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