CN107488612A - 一株猪肺炎支原体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪肺炎支原体及其应用，所述的猪肺炎支原体为猪肺炎支原体(Mycoplasma bovis)HNMhy1，保藏编号：CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1分离自发生典型呼吸困难、肺脏发生实变的保育猪，具有稳定的生物学特性，对保育猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发生典型的喘气病症状，且具有良好的免疫原性。利用本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1制备的疫苗安全可靠，对猪的支原体肺炎具有较好的保护效果。

Description

一株猪肺炎支原体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株猪肺炎支原体及其应用。

背景技术

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumonia of Swine，MPS)的主要病原。猪支原体肺炎是一种慢性、接触性传染病，具有高发病率和低病死率的特点，主要表现为食欲减退、发热、咳嗽、气喘、呼吸困难等症状，患病猪生长缓慢，饲料转化率下降，常诱发其他病原的感染，特别是免疫抑制性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine cirovirus 2，PCV-2)，引起免疫抑制诱导，常因同时继发细菌感染引起死亡，是世界上最主要的猪病之一。

Mhp缺乏细胞壁，是一种介于细菌和病毒之间的、最简单且能够自行繁殖的原核生物，自然宿主仅见于猪。通过发病猪的咳嗽、打喷嚏或喘气排出体外。已有研究表明，它是一种黏膜病原体，主要存在于猪气管及支气管中，通过附着于猪气管和支气管上皮组织的纤毛而定植于呼吸道中。Mhp在呼吸道中的附着可造成纤毛的聚集和上皮细胞的病变或坏死，甚至破坏呼吸道黏膜层，使纤毛发生萎缩或脱落，不能有效清除呼吸道中的碎片及侵入的病原菌，导致黏膜纤毛功能的降低，从而引起猪的呼吸道疾病。本病广泛存在于世界各地，持续感染且难以治愈，同时由于感染猪较高的治疗费用并造成生产性能降低，从而给养猪业造成严重危害。亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对该病进行防治。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株猪肺炎支原体及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗免疫性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株猪肺炎支原体，所述的猪肺炎支原体为猪肺炎支原体(Mycoplasma bovis)HNMhy1，保藏编号：CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

一种猪肺炎支原体在制备猪肺炎支原体灭活疫苗方面的应用。

所述的猪肺炎支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的猪肺炎支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

所述的猪肺炎支原体灭活疫苗的制备方法为：将猪肺炎支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中猪肺炎支原体的菌数为2×10⁹CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得猪肺炎支原体灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1分离自发生典型呼吸困难、肺脏发生实变的保育猪，在PPLO液体培养基上传代、固体培养基上分离得到，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达10⁹CFU/mL以上。

2、本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1具有稳定的生物学特性，对保育猪具有较强的致病力，能够引起保育猪发生典型的喘气病症状，且具有良好的免疫原性。

3、利用本发明中的猪肺炎支原体菌株HNMhy1制备的疫苗安全可靠，对猪的支原体肺炎具有较好的保护效果。

附图说明

图1为菌株HNMhy1菌落4×显微镜下形态。

图2为菌株HNMhy1菌体吉姆萨染色100×显微镜下形态。

图3为菌株HNMhy1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为引物MB1，MB2对猪肺炎支原体疫苗株168株的扩增结果；2，3为引物MB1，MB2对菌株HNMhy1的扩增结果；4为阴性对照；从图中可以看出，模板PCR扩增片段约为1483bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、猪肺炎支原体的分离和鉴定

1.1病料采集

病料来自于2017年4月在河南省濮阳市某大型猪场发生重症肺炎呼吸困难的2月龄保育猪的发生实变的猪的肺脏。

1.2培养基的制备

PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5g，葡萄糖2.5g，酵母粉2.5g，溶于440mL超纯水中，115℃灭菌15min，加入MEM培养基5mL、马血清50mL、青霉素8万单位、无菌质量分数10％精氨酸10mL和1％(w/v)酚红500μL。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

PPLO固体培养基：加入1.5％(w/v)琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

1.3支原体的分离培养

取适量病变肺组织放入研磨器中剪碎，加入2mL的灭菌PBS缓冲液，研磨，取上清液于EP管中。然后5000r/min低速离心5min后，用针管取上清液，在针管部安装0.22μm滤膜过滤，加入PPLO液体培养基中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养近一周后，取1mL转接PPLO液体培养基中再次培养，传代3～5代后液体颜色由红色变为黄色，取100μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。5～7d后，肉眼观察可见有无色透明针尖状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为典型的支原体“煎荷包蛋样”(见图1)。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态，为多形态，呈球菌样、弯曲的丝状、螺旋状(见图2)，命名为菌株HNMhy1。

1.4菌株的鉴定

1.4.1设计引物

根据猪肺炎支原体16S rRNA的序列设计一对通用引物，用于猪肺炎支原体的扩增，引物序列如下：

MB1：5’-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(SEQ ID NO.1)

MB2：5’-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)

预期扩增片段大小为1483bp。

1.4.2 PCR鉴定

将菌株HNMhy1接种PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNMhy1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，用MB1，MB2扩增进行PCR鉴定。同时，设置猪肺炎支原体疫苗株168株为阳性对照。

PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM/L通用引物MB1，MB2各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH₂O至25μL。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃30s，57℃30s，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。图3看出，MB1，MB2扩增出符合预期大小片段，经测序与猪肺炎支原体传代致弱疫苗株168株(Genbank No.CP002274)同源性78％，测序结果如下。证明所分离的菌株HNMhy1为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)。

ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAGCATCTTCGGATGCTTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTAGATAACCTACCTTTAACTCGAGGATAACTCCGGGAAACTGGAGCTAATACTGGATAGGATGTGTGCATGAAAAAAACACATTTAAAGATTTATCGGTTTAAGAGGGGTCTGCGGCGCATTAGTTAGTTGGTGGGGTAAGAGCCTACCAAGACGATGATGCGTAGCCGGACTGAGAGGTCTACCGGCCACATTGGGACTGAGAACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCGGCAATGGGGGAAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAACGACGAAGTACTTCGGTATGTAAAGTTCTTTTATATGGGAAGAAAAATTAAAAATTGACGGTACCATATGAATAAGCCCCGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGGGGCGAGCGTTATCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTATAAAAGTTTGTGGTGTAAGTGCAGTGCTTAACGCTGTGAGGCTATGAAAACTATATAACTAGAGTGAGACAGAGGCAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTAAAATGCGTAAATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGTCTATACTGACACTGATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGAACTAAGTGTTGGCCATAAGGTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGTTCTCCGCCTGAGTAGTACGTACGCAAGTATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGACCCCGCACAAGCGGTGGATCATGTTGTTTAATTCGAAGATACACGAAAAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCTGCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAGGCTAACAGATGTACAGGTGGTGCACGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGCTAGTTACCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGCGAGACTGCCAGTGATAAATTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACAAACGTGATACAATGGCTGGAACAAAGAGAAGCGATAGGGTGACCTGGAGCGAAACTCACAAAAACAGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGCATGTTGCGGTGAATACGTTCTCGGGGTTTGTACACACCGCCCGTCAAACCACGAAAGTGGGCAATACCCAACGCCGGTGGCCTAACCCGAAAGGGAGGGAGCCGTCTAAGGTAGGGTCCATGATTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTAGCGGATCCGCG(SEQ ID NO.3)

1.5毒力试验

试验猪为15日龄健康的保育猪20头，均为猪肺炎支原体ELISA抗体阴性。试验动物分为两组，对照组10头，试验组10头，两组试验动物随机分组。将HNMhy1接种PPLO液体培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体浓度，调整至10⁸CFU/mL，试验组动物通过喉气管接种3mLHNMhy1液体培养物，对照组动物通过喉气管接种3mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为15d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于15d试验结束时，剖杀所有试验动物。

试验组动物在接种支原体24h后表现出口鼻流沫、呼吸困难、咳嗽等症状，体温正常，减食，张口伸舌、犬坐式腹式呼吸，7d后窒息死亡1头，10d后死亡1头。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀10头对照组动物。采集病料，进行支原体分离。试验组剖检，肺的尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的10份病料均未分离到支原体，试验组的10份病料中均分离到猪肺炎支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMhy1一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将猪肺炎支原体菌株HNMhy1接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中猪肺炎支原体的菌数为2×10⁹CFU/mL，每1000mL培养物加2mL甲醛溶液(质量分数37％)，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂(Sigma公司，F5881)，混合制得猪肺炎支原体灭活疫苗，疫苗中猪肺炎支原体的菌数约为1×10⁹CFU/mL。

2.2疫苗的安全性试验：

选取15日龄健康仔猪10头，均为猪肺炎支原体ELISA抗体阴性。分为2组，每组5头。疫苗组：颈部肌肉注射10mL本疫苗；对照组：颈部肌肉注射10mL灭菌生理盐水。观察30d。观察期间，疫苗组和对照组的仔猪均健康活泼，早晚体温、采食量差异均不显著，未见精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。

2.3疫苗的效力试验

选取15日龄健康仔猪50头，均为猪肺炎支原体ELISA抗体阴性。分为5组，每组10头。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.5mL、1mL、1.5mL和2mL，第5组为未免疫组，注射0.5mL灭菌生理盐水。疫苗组和为免疫组21d后二免注射同等剂量的疫苗和灭菌生理盐水。二免后60d用10⁹CFU的HNMhy1采取气管注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后25d内，观察所有猪的临床症状。在攻毒后25d后，对所有猪进行剖检，确定攻毒保护率，采集肺脏等器官进行猪肺炎支原体分离培养。

疫苗组与未免疫组仔猪攻毒后有明显的差异，攻毒后，未免疫组第二天开始出现临床症状，流涕，呼吸困难，减食甚至绝食，7d后开始出现死亡，2周后共死亡2头。剖检结果：肺脏尖叶、心叶、隔叶部分出现两侧对称性“肉样变”的实变，与周围组织界限明显。而疫苗组中，0.5mL疫苗组的10头仔猪中有2头出现临床症状和病例变化；1mL疫苗组的10头仔猪中有1头出现临床症状和病例变化；1.5mL和2mL疫苗组的10头仔猪没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。

注：“—”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.5mL，含菌量为1×10⁹CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株猪肺炎支原体及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgcgtcgac agagtttgat cctggct 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcggatccg ctaccttgtt acgactt 27

<210> 3

<211> 1483

<212> DNA

<213> 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）

<400> 3

acgcgtcgac agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg 60

caagtcgaac gaagcatctt cggatgctta gtggcgaacg ggtgagtaac acgtagataa 120

cctaccttta actcgaggat aactccggga aactggagct aatactggat aggatgtgtg 180

catgaaaaaa acacatttaa agatttatcg gtttaagagg ggtctgcggc gcattagtta 240

gttggtgggg taagagccta ccaagacgat gatgcgtagc cggactgaga ggtctaccgg 300

ccacattggg actgagaacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaattttcgg 360

caatggggga aaccctgacc gagcaacgcc gcgtgaacga cgaagtactt cggtatgtaa 420

agttctttta tatgggaaga aaaattaaaa attgacggta ccatatgaat aagccccggc 480

taactatgtg ccagcagccg cggtaataca tagggggcga gcgttatccg gatttactgg 540

gcgtaaaggg tgcgtaggtg gttataaaag tttgtggtgt aagtgcagtg cttaacgctg 600

tgaggctatg aaaactatat aactagagtg agacagaggc aagtggaatt ccatgtgtag 660

cggtaaaatg cgtaaatata tggaggaaca ccagtggcga aggcggcttg ctgggtctat 720

actgacactg atgcacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagaacta agtgttggcc ataaggtcag tgctgcagtt aacgcattaa 840

gttctccgcc tgagtagtac gtacgcaagt atgaaactca aaggaattga cgggaccccg 900

cacaagcggt ggatcatgtt gtttaattcg aagatacacg aaaaacctta ccaggtcttg 960

acatactctg caaaggctta gaaataagtt cggaggctaa cagatgtaca ggtggtgcac 1020

ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080

attgctagtt accatcatta agttggggac tctagcgaga ctgccagtga taaattggag 1140

gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca aacgtgatac 1200

aatggctgga acaaagagaa gcgatagggt gacctggagc gaaactcaca aaaacagtct 1260

cagttcggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgcaaa 1320

tcagcatgtt gcggtgaata cgttctcggg gtttgtacac accgcccgtc aaaccacgaa 1380

agtgggcaat acccaacgcc ggtggcctaa cccgaaaggg agggagccgt ctaaggtagg 1440

gtccatgatt ggggttaagt cgtaacaagg tagcggatcc gcg 1483

Claims (5)

1.一株猪肺炎支原体，其特征在于：所述的猪肺炎支原体为猪肺炎支原体(Mycoplasmabovis)HNMhy1，保藏编号：CGMCC NO：13858，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

2.一种如权利要求1所述的猪肺炎支原体在制备猪肺炎支原体灭活疫苗方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的猪肺炎支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的猪肺炎支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的猪肺炎支原体灭活疫苗的制备方法为：将猪肺炎支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中猪肺炎支原体的菌数为2×10⁹CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得猪肺炎支原体灭活疫苗。