CN107446858A - 一株鸽支原体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鸽支原体及其应用，所述的鸽支原体为鸽支原体(Mycoplasma columbinum)HNMcol，保藏编号：CGMCC NO：14300，保藏日期：2017年6月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。本发明中的鸽支原体菌株HNMco1分离自发生典型呼吸困难、鼻窦炎的成年赛鸽，具有稳定的生物学特性，对鸽具有较强的致病力，能够引起鸽发生典型的鼻窦炎、呼吸困难、死亡症状，且具有良好的免疫原性。利用本发明中的鸽支原体菌株HNMco1制备的疫苗安全可靠，对鸽的慢性呼吸道疾病具有较好的保护效果。

Description

一株鸽支原体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株鸽支原体及其应用。

背景技术

鸽支原体(Mycoplasma columbinum，MC)是引起鸽慢性呼吸道病的病原，该病以鼻流清水继而发展为粘性分泌物、张口呼吸、眼睛单侧流泪、呼吸不畅、排绿色稀便、传播迅速为特征。今年来，该病发病率逐年上升。尤其公棚(春棚)更为严重。疗程长、混合感染严重。该病的流行特点：1、不分季节性。一年四季均有发生，但以冬初、早春较为多发及梅雨季节较为严重。各种日龄的鸽子都能发生。2、传播速度加快，病程变长。给治疗也带来一定的难度。3、混合感染也严重。近年来本病常和衣原体、传支、毛滴虫、大肠杆菌等混合感染，病情变得愈来愈复杂。从而造成赛鸽死亡速度加快，死亡率增加。

由于该病近几年来发病率越来越高，药物使用过多，耐药性越来越强，治疗效果越来越差。因此疫苗免疫是预防该病的首要手段。目前没有预防鸽支原体的疫苗，因此亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对该病进行防治。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株鸽支原体及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗安全、免疫性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株鸽支原体，所述的鸽支原体为鸽支原体(Mycoplasma columbinum)HNMcol，保藏编号：CGMCC NO：14300，保藏日期：2017年6月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

一种鸽支原体在制备鸽支原体灭活疫苗方面的应用。

所述的鸽支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的鸽支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

所述的鸽支原体灭活疫苗的制备方法为：将鸽支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸽支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得鸽支原体灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的鸽支原体菌株HNMco1分离自发生典型呼吸困难、鼻窦炎的成年赛鸽，在PPLO液体培养基上传代、固体培养基上分离得到，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达10⁷CFU/mL以上。

2、本发明中的鸽支原体菌株HNMco1具有稳定的生物学特性，对鸽具有较强的致病力，能够引起鸽发生典型的鼻窦炎、呼吸困难、死亡症状，且具有良好的免疫原性。

3、利用本发明中的鸽支原体菌株HNMco1制备的疫苗安全可靠，对鸽的慢性呼吸道疾病具有较好的保护效果。

附图说明

图1为菌株HNMco1菌落4×显微镜下形态。

图2为菌株HNMco1菌体吉姆萨染色100×显微镜下形态。

图3为菌株HNMco1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为引物MB1，MB2对鸽支原体FG295株(GenbankNo.EU859979)的扩增结果；2为引物MB1，MB2对菌株HNMco1的扩增结果；3为阴性对照；从图中可以看出，模板PCR扩增片段约为1493bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、鸽支原体的分离和鉴定

1.1病料采集

病料来自于2017年4月在河南省柘城县某大型赛鸽场发生鼻窦炎、呼吸困难死亡的赛鸽的肺脏。

1.2培养基的制备

PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5g，葡萄糖2.5g，酵母粉2.5g，溶于440mL超纯水中，115℃灭菌15min，加入MEM培养基5mL、马血清50mL、青霉素8万单位、无菌质量分数10％精氨酸10mL和1％(w/v)酚红500μL。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

PPLO固体培养基：加入1.5％(w/v)琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

1.3支原体的分离培养

取适量病变肺组织放入研磨器中剪碎，加入2mL的灭菌PBS缓冲液，研磨，取上清液于EP管中。然后5000r/min低速离心5min后，用针管取上清液，在针管部安装0.22μm滤膜过滤，加入PPLO液体培养基中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养近一周后，取1mL转接10mLPPLO液体培养基中再次培养，传代2～5代后液体颜色由红色变为黄色，取100μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。3～10d后，肉眼观察可见有圆形、微小、光滑、透明、露珠状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为圆形或不规则形状，菌落中央有颜色较深的且致密的乳头状突起，呈脐状或乳头状(见图1)。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态，为多形态，呈球形、卵圆形、弯曲的丝状、螺旋状(见图2)，命名为菌株HNMco1。

1.4菌株的鉴定

1.4.1设计引物

根据鸽支原体16SrRNA的序列设计一对通用引物，用于鸽支原体的扩增，引物序列如下：

MB1：5’-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(SEQ ID NO.1)

MB2：5’-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)

预期扩增片段大小为1493bp。

1.4.2PCR鉴定

将菌株HNMco1接种PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNMco1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，用MB1，MB2扩增进行PCR鉴定。同时设置鸽支原体FG295株(Genbank No.EU859979)为阳性对照。

PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM/L通用引物MB1，MB2各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH₂O至25μL。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃30s，57℃30s，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

扩增产物进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。图3看出，MB1，MB2扩增出符合预期大小片段，经测序与鸽支原体FG295株(GenbankNo.EU859979)同源性99％，测序结果如下。证明所分离的菌株HNMco1为鸽支原体(Mycoplasma columbinum)。

ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCTGTGTGCCTAATACATGCATGTCGAGCGAAGTTCTTCGGAACTTAGCGGCGAATGGGTGAGTAACACGTACTCAACGTACCCTTTAGATTGGGATAGCGGTTGGAAACAGCCGATAATACCAAATATGCACATTTTTCGCATGAAAAGTGTGTGAAAGGAGCAATTGTTCCGCTAAAGGAGCGGGGTGCGCAACATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGGCGATGATGTTTAGCGGGGTTGAGAGACTGAACCGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCGACACAGCGTGCAGGATGAAGGCCCCATGGGTTGTAAACTGCTGTGGTAAGGGAAGAAAAAGCAGAAGAGTGGAACGCTTTTGCCTTGACGGTACCTTATTAGAAAGCGACGGCTAACTATGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACATAGGTCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGTCTGTAGGTTGTTTGTTAAGTCTGACGTCAAATTTTGGGGCTCAACTCCAAACCGCGTTGGATACTGGCATACTAGAGTTATGTAGAGGTTAGCGGAATTCCTTGTGAAGCGGTGGAATGCGTAGATATAAGGAAGAACACCAATATGGCGAAGGCAGCTAACTGGACATATACTGACGCTGAGAGACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGATCATTAGCTGATGGAAAATTCATCGGCGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTACGTTCGCAAGAATAAAACTTAAAGGAATTGACGGGGATCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGATGCTACGCGTAGAACCTTACCCACTCTTGACATCTTCTGCAAAGCTATAGAGATATAGTGGAGGTTAACAGAATGACAGATGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTACGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACTAACATTAAGTTGAGCACTCTAAGGAGACTGCCCGAGTAATTGGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCTCTTACGAGTGGGGCAACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGAGAAGCAAACTGGTGACAGGGAGCAAACCTCAAAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCTACGCTACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAACCATGGGAGCTGGTAATGCCCGAAGTCGGTTTATAAACAAACTGCCTAAGGCAGGACTGGTGACTGGGGTTAAGTCGTAACAAGGTAGCGGATCCGCG(SEQ ID NO.3)

1.5毒力试验

试验鸽为45日龄健康的肉鸽20只。试验动物分为两组，对照组10只，试验组10只，两组试验动物随机分组。将HNMco1接种PPLO液体培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体浓度，调整至10⁷CFU/mL，试验组动物通过鼻内接种1mL鸽支原体液体培养物，对照组动物通过喉气管接种1mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为30d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于30d试验结束时，剖杀所有试验动物。

试验组动物在接种鸽支原体HNMco1 7d后表现出临床症状：流水样清涕，后边浆液性、黏性，继而分泌物干结堵住鼻孔，打喷嚏，结膜炎，咳嗽、呼吸困难、头部肿胀等症状，14d后共死亡3只。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀10只头对照组动物。采集病料，进行支原体分离。试验组剖检，鼻腔有大量浆液性、黏液性分泌物，气囊增厚混浊、附着黄色干酪样渗出物，肺部淤血、炎症。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的10份病料均未分离到支原体，试验组的10份病料中均分离到鸽支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMco1一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将鸽支原体菌株HNMco1接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸽支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，每1000mL培养物加2mL甲醛溶液(质量分数37％)，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂(Sigma公司，F5881)，混合制得鸽支原体灭活疫苗，疫苗中鸽支原体的菌数约为1×10⁷CFU/mL。

2.2疫苗的安全性试验：

选取45日龄健康鸽20只。分为4组，每组5只。疫苗组3组，每组分别颈部皮下注射0.5mL、1mL、2mL本疫苗；对照组1组，颈部皮下注射2mL灭菌生理盐水。观察14d。观察期间，疫苗组和对照组的鸽精神状况、采食正常，未见精神不振、采食减少、流涕、呼吸困难、眼脸肿胀等不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。

2.3疫苗的效力试验

选取45日龄健康鸽100只。分为5组，每组20只。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.1mL、0.2mL、0.3mL和0.5mL，第5组为未免疫组，注射0.5mL灭菌生理盐水。疫苗组和未免疫组4周后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后30d用10⁷CFU的HNMco1采取鼻内注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后14d内，观察所有鸽的临床症状。在攻毒后14d后，对所有鸽进行剖检，确定攻毒保护率，采集肺脏等器官进行鸽支原体分离培养。

疫苗组与未免疫组鸽攻毒后有明显的差异，攻毒后，未免疫组第7d开始出现临床症状，流涕，咳嗽、喘气、张口呼吸，减食甚至绝食，14d后开始出现死亡，共死亡6只，全部发病。剖检结果：鼻腔大量浆液性、黏液性分泌物，气囊混浊、附着黄色干酪样渗出物，肺淤血。而疫苗组中，0.1mL疫苗组的20只鸽中有4只出现临床症状和病例变化；0.2mL疫苗组的20只鸽中有2只出现临床症状和病例变化；0.3mL和0.5mL疫苗组的20只鸽没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。

注：“—”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.1mL，含菌量为1×10⁷CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株鸽支原体及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgcgtcgac agagtttgat cctggct 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcggatccg ctaccttgtt acgactt 27

<210> 3

<211> 1493

<212> DNA

<213> 鸽支原体（Mycoplasma columbinum）

<400> 3

acgcgtcgac agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggctgtgtgc ctaatacatg 60

catgtcgagc gaagttcttc ggaacttagc ggcgaatggg tgagtaacac gtactcaacg 120

taccctttag attgggatag cggttggaaa cagccgataa taccaaatat gcacattttt 180

cgcatgaaaa gtgtgtgaaa ggagcaattg ttccgctaaa ggagcggggt gcgcaacatt 240

agctagttgg tgaggtaacg gcccaccaag gcgatgatgt ttagcggggt tgagagactg 300

aaccgccaca ctgggactga gatacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat 360

attccacaat ggacgaaagt ctgatggagc gacacagcgt gcaggatgaa ggccccatgg 420

gttgtaaact gctgtggtaa gggaagaaaa agcagaagag tggaacgctt ttgccttgac 480

ggtaccttat tagaaagcga cggctaacta tgtgccagca gccgcggtaa tacataggtc 540

gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgtctgta ggttgtttgt taagtctgac 600

gtcaaatttt ggggctcaac tccaaaccgc gttggatact ggcatactag agttatgtag 660

aggttagcgg aattccttgt gaagcggtgg aatgcgtaga tataaggaag aacaccaata 720

tggcgaaggc agctaactgg acatatactg acgctgagag acgaaagcgt ggggagcaaa 780

caggattaga taccctggta gtccacgccc taaacgatga tcattagctg atggaaaatt 840

catcggcgca gctaacgcat taaatgatcc gcctgagtag tacgttcgca agaataaaac 900

ttaaaggaat tgacggggat ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat ttgatgctac 960

gcgtagaacc ttacccactc ttgacatctt ctgcaaagct atagagatat agtggaggtt 1020

aacagaatga cagatggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg tacggttaag 1080

tcctgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttactaacat taagttgagc actctaagga 1140

gactgcccga gtaattggga ggaaggtggg gacgacgtca aatcatcatg cctcttacga 1200

gtggggcaac acacgtgcta caatggtcgg tacaaagaga agcaaactgg tgacagggag 1260

caaacctcaa aaaaccgatc tcagttcgga ttgtagtctg caactcgact acatgaagtc 1320

ggaatcgcta gtaatcgtag atcagctacg ctacggtgaa tacgttctcg ggtcttgtac 1380

acaccgcccg tcaaaccatg ggagctggta atgcccgaag tcggtttata aacaaactgc 1440

ctaaggcagg actggtgact ggggttaagt cgtaacaagg tagcggatcc gcg 1493

Claims (5)

1.一株鸽支原体，其特征在于：所述的鸽支原体为鸽支原体(Mycoplasma columbinum)HNMcol，保藏编号：CGMCC NO：14300，保藏日期：2017年6月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

2.一种如权利要求1所述的鸽支原体在制备鸽支原体灭活疫苗方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的鸽支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的鸽支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的鸽支原体灭活疫苗的制备方法为：将鸽支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸽支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得鸽支原体灭活疫苗。