JP6473748B2

JP6473748B2 - 鳥類のｉｎｏｖｏワクチン接種のための抗原性を増強したワクチン

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Publication number: JP6473748B2
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Inventors: ベンアルースジュリエット; デュピュイローラン; リレホジュヒョン
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Filing date: 2014-11-12
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Description

本発明は鳥類疾患の予防を目的とし、ｉｎｏｖｏ投与（卵への注射）による適用が意図されたワクチン組成物を配合するためのアジュバントの使用に関する。該アジュバントは少なくとも１つの油相と少なくとも１つの薬学的に許容可能な二価無機塩とを含むものである。

ワクチンアジュバントは、該アジュバントと結び付いたワクチンの抗原に対する免疫応答を増大させる賦形剤である。これらのアジュバントは本質的に多様なものである。アジュバントは等しく、リポソーム、少なくとも１つの油相と少なくとも１つの水相とを含むエマルション、例えば「フロイント」アジュバント、生体由来のアジュバント（サイトカイン、オリゴヌクレオチド等）、又は非水溶性無機塩からなり得る。ワクチン組成物アジュバントとして使用される無機塩の中でも、例えばよく一般的に使用されるものとして水酸化アルミニウムに言及することができる。不活化抗原を含有し、鳥類への注射が意図されるワクチン組成物の配合のために、油中水型エマルションタイプのアジュバントが主に使用される。

ワクチン組成物にアジュバントを使用することで、特に下記のことが可能となる：
・１回分のワクチンによりもたらされる保護応答の強度を増大させることで、より良好な保護レベルをもたらすことが可能となり、
・１回分のワクチンによりもたらされる保護期間を延ばすことで、成長期間に亘って、農場にいる動物のより長期的な保護をもたらすことが可能となり、
・アジュバントなしで用いられる完全用量によりもたらされるものと同等の有効性をより低用量の抗原を用いて得ることが可能となる。そのため、ワクチン生産施設（entity）では、同じ生産能にて、より多くのワクチン用量を生産することが可能である。同様に、既存の条件（conditioning）でより多くの動物をワクチン接種することが提唱され、
・ワクチン保護をもたらすために必要となる免疫付与の回数を減らすことが可能となる。

ウイルス、細菌又は寄生生物由来の感染性鳥類疾患の予防は、家禽生産の発展を支えるのに必須である。ワクチン接種は、多くの鳥類の疾患、例えばニューカッスル病、鳥インフルエンザ、ガンボロ病、マレック病、コクシジウム症、伝染性気管支炎、家禽コレラ等を予防するのに推奨される方法である。ブロイラー鶏は長くても数ヶ月しか生存しないため、生きているうちに、特に生後数日間に複合ワクチンを接種する。

鳥用ワクチンは、若鶏若しくは成鶏への皮下若しくは筋肉内注射、経粘膜（経口、鼻内、眼内）、大量投与（噴霧又は飲料水への投与）、又は胚が受精後１８日若しくは１９日を経過した際の卵への注射（ｉｎｏｖｏ投与）により投与することができる。

注射経路を介したワクチン接種が、鳥用ワクチンの投与に従来用いられている。しかしながら、非常に多くの動物のワクチン接種には、集約農業条件下において高い労働コストがかかることから、近年では新たな方法が開発されている。このようにｉｎｏｖｏワクチン接種は、繁殖施設（breeding establishments）（孵化場）にて直接適用可能であり、ワクチン接種にかかるコスト及び時間を大幅に削減することが可能であることから、支持されるようになってきているワクチン投与方法である。

鳥用ワクチン組成物に用いられる（devoted to）抗原は、死滅病原体（不活化ワクチン）、病原性を低減した生きた病原体（弱毒化した生ワクチン）、組換え免疫原性タンパク
質（サブユニットワクチン）又は組換え生ベクター（ベクターワクチン）からなり得る。弱毒化した生ワクチン及びベクターワクチンは一般に、例えば特許文献１に記載されるように好適なアジュバントを用いて生ワクチンの有効性を増大させることが可能であったとしても、アジュバントの組織的な添加が必要ではない程度に十分有効である。反対に、不活化ワクチン及びサブユニットワクチンの配合物は一般に、要求されるワクチンの有効性を達成するには、免疫アジュバントの添加が必要となる。

ｉｎｏｖｏにて現在投与されている市販のワクチンは、アジュバントを含まない弱毒化した生ワクチンである。弱毒化した生ワクチンには病原性復帰のリスクがあることから、ｉｎｏｖｏワクチン接種には不活化ワクチン又はサブユニットワクチンの開発が有益である。しかしながら、不活化抗原又はサブユニット抗原と油中水型の油性アジュバントとを含む鳥用ワクチン組成物は、若鶏又は成鶏への注射による投与に極めて広く用いられているが、ｉｎｏｖｏ投与にそのまま使用することはできない。これは若鶏及び成鶏のワクチン接種に一般に用いられる油性アジュバントが卵内の胚の発生に対して有毒であるためである。そのため、ｉｎｏｖｏでの不活化抗原の使用を可能にする特別なアジュバントの開発が必要とされている。

したがってｉｎｏｖｏ投与が意図されたアジュバントには下記の特異的な特徴がある：
・鳥類胚の発生に対して有毒ではなく、
・弱毒化した生（非殺ウイルス）ワクチンに適合し、
・先に記載の形態に従ってワクチン抗原により与えられる保護を増大する。

様々なアジュバント技術がｉｎｏｖｏワクチン接種について既に試験されており、例には水酸化アルミニウム塩、カルボマー型のポリマー、生体由来のアジュバント、例えばＣＰＧ、サイトカイン及びケモカイン、並びにサポニンがある。しかしながら、コンセンサスは取れておらず、ｉｎｏｖｏワクチン接種に見合うコストの新たな効果的なアジュバント配合物の開発が依然必要とされている。

若鶏又は成鶏に注射可能な鳥用ワクチンに関して、最も効果的なアジュバント技術は水相と鉱油ベースの油相とで構成される油中水型エマルションである。しかしながら、特に毒性の問題からこれまでｉｎｏｖｏワクチン接種に効果的な油性エマルションベースのアジュバントは見出されていない。

水中油型エマルション又はマイクロエマルションタイプのアジュバントは生ワクチンに適合しており、生ワクチンのための免疫アジュバントとして使用することができることがこれまでに分かっている（特許文献１）。しかしながら、これらの技術の中でもこのファミリーのアジュバントの殆どが卵内の胚の発生に対して有毒であることが分かっている。

国際公開第２０１１／１１７５０７号

結論として、例えば下記のような要求される特徴を備える水中油型エマルションを含むアジュバントの使用が必要とされる：
・若鶏の胚の発生に対して有毒ではなく、
・ｉｎｏｖｏにて実施される鳥類のワクチン接種に用いられるサブユニット抗原により与えられる保護を増大させることが可能である。

したがって、本発明の主題は、鳥類のｉｎｏｖｏワクチン接種のためのワクチン組成物中のアジュバントとしての使用が意図される、少なくとも１つの鉱油と、ＨＬＢ値が１２に等しいことが特徴である親水性を有する界面活性剤と、二価無機塩とを含む組成物であって、水中油型エマルション又はマイクロエマルションであることを特徴とする、組成物である。

また、本発明の実施の形態は、以下の特徴の１つ又は複数を含むことができる。

組成物の重量１００％に対して、
・５０％〜９７％の水、より特には７０％〜９７％の水、更により特には８０％〜９７％の水と、
・１％〜４５％の油性アジュバント、より特には１％〜３０％の油性アジュバント、更により特には２％〜１０％の油性アジュバントと、
・０．１％〜１０％、より特には０．１％〜８％、更により特には０．２％〜３％の少なくとも１つの二価無機塩と、
・０％〜１０％、より特には０％〜８％、更により特には０％〜３％の少なくとも１つの錯化剤と、
を含む、上に規定の組成物。

上記油性アジュバントが、該油性アジュバントの重量１００％に対して、
４０％〜９５％の少なくとも１つの鉱油、より特には５０％〜９５％の少なくとも１つの鉱油、更により特には５０％〜９０％の少なくとも１つの鉱油と、
５％〜６０％の少なくとも１つの界面活性剤、より特には５％〜５０％の少なくとも１つの界面活性剤、更により特には１０％〜５０％の少なくとも１つの界面活性剤と、
を含むことを特徴とする、上に規定の組成物。

上記少なくとも１つの二価無機塩が、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、アスパラギン酸カルシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸鉄及び塩化カルシウムから選ばれることを特徴とする、上に規定の組成物。

上記少なくとも１つの錯化剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム及びポリアクリル酸ナトリウムから選ばれることを特徴とする、上に規定の組成物。

上記界面活性剤がエトキシル化糖エステルであることを特徴とする、上に規定の組成物。

上記鉱油が注射品質の白色液体ワセリンであることを特徴とする、上に規定の組成物。

別の態様によると、本発明の主題は、少なくとも１つの抗原と上に規定の免疫アジュバント組成物とを含む、鳥類のｉｎｏｖｏワクチン接種が意図されるワクチン組成物である。

上記抗原が少なくとも１つの組換えサブユニットタンパク質を含有することを特徴とする、上に規定の組成物。

上記サブユニットタンパク質が、鳥類コクシジウム症に対する保護を目的として、アイメリア、より特にはアイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）由来のタンパク質、より特にはプロフィリン３−１Ｅであることを特徴とする、上に規定の組成物。

上記サブユニットタンパク質が、壊死性腸炎に対する保護を目的として、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）由来のタンパク質、より特にはＮｅｔＢトキシン、又はアルファトキシン、又はピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯ）タンパク質、又は伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）であることを特徴とする、上に規定の組成物。

上記抗原が、鳥類コクシジウム症及び鳥類壊死性腸炎に対する保護を目的として、クロストリジウム・パーフリンジェンス由来の少なくとも１つのタンパク質、より特にはＮｅｔＢトキシン、又はアルファトキシン、又はピルビン酸：フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯ）タンパク質、又は伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）と、アイメリア、より特にはアイメリア・アセルブリナ由来のタンパク質、より特にはプロフィリン３−１Ｅとを含有することを特徴とする、上に規定の組成物。

コクシジウム症の少なくとも１つの抗寄生虫性の生きた抗原を含む、上に規定の組成物。

鳥類のワクチン接種に用いられる少なくとも１つの生きた抗原を含む、上に規定の組成物。

「マイクロエマルション」という用語は、１つ（又は複数）の界面活性剤により安定化された、２つの非混和性液体の熱力学的に安定した分散液を意味するものと理解される。これらの分散液は、中間相の典型サイズが光の波長未満であり、ナノメートル規模であるため、ほぼ透明である。

例として界面活性剤により安定化された小さい油滴の水分散液が挙げられる。その直径（数十ナノメートル）から、油滴は肉眼及び顕微鏡下であっても視認することができない。そのサイズは小角放射散乱等の顕微鏡技法により測定することができる。

本発明の主題であるエマルション又はマイクロエマルションは青みがかった色から白色の範囲に亘る巨視的規模での色を呈する。

油性アジュバントを作製するのに用いられる鉱油は、石油の蒸留、及び例えば脱硫、脱歴、芳香族化合物の抽出及びワックス抽出工程、並びに他の仕上げ加工工程等の続くプロセス工程の実施により得られる、鉱油、炭化水素からなる群から選択される（例えば、Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｍａｒｃｏｌ８２、Ｄｒａｋｅｏｌ５、Ｄｒａｋｅｏｌ６、Ｅｏｌａｎｅ１７０等のタイプのオイルに言及することができる）。

油性アジュバントに存在する界面活性剤はＨＬＢ値が８〜１５であることが特徴である親水性を有する乳化界面活性剤である。そのＨＬＢ値は１２に等しいことが好ましい。このような界面活性剤は、アルキルポリグリコシド又はアルキルポリグリコシドの混合物；サポニン；レシチン；ポリエトキシル化アルカノール；ポリオキシエチレンブロックとポリオキシプロピレンブロックとを含むポリマー；脂肪酸、有益には２０℃にて液体の脂肪酸と、糖、ソルビトール、マンニトール又はグリセロールとの縮合により得られたエステルからなり得る。上記糖はグルコース又はスクロース又は好ましくはマンニトールからなり得る。好ましいエステルについては、ソルビトール若しくはマンニトールを用いる脂肪酸のエステル化により、又は更には１−４位若しくは２−６位にて環化しているソルビト
ール若しくはマンニトールのポリヒドロキシル化鎖の無水化（anhydrization）により得られた生成物を用いるエステル化、又は更にはソルビトール若しくはマンニトールと、１−４位若しくは２−６位にて環化しているソルビトール若しくはマンニトールのポリヒドロキシル化鎖の無水化により得られた生成物とを用いるエステル化により得られた、脂肪酸、例えばオレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸又はラウリン酸とソルビトール又はマンニトールとのエステルに言及することができる。特に好ましいマンニトールエステルとして、オレイン酸マンニトール、オレイン酸マンニタン、５ｍｏｌ又は１０ｍｏｌ又は１５ｍｏｌ又は２０ｍｏｌのエチレンオキシドを含むエトキシル化オレイン酸マンニトール、及び５ｍｏｌ又は１０ｍｏｌ又は１５ｍｏｌ又は２０ｍｏｌのエチレンオキシドを含むエトキシル化オレイン酸マンニタンに言及することができる。ポリエチレングリコール、ソルビトール又はグリセロール糖エステル誘導体も使用することができる。他のタイプの好ましい界面活性剤は、エトキシル化植物油、例えば３ｍｏｌ〜４０ｍｏｌのエチレンオキシドを有するエトキシル化コーン油、３ｍｏｌ〜４０ｍｏｌのエチレンオキシドを有するエトキシル化ナタネ油、又は３ｍｏｌ〜６０ｍｏｌのエチレンオキシドを有するエトキシル化ヒマシ油からなる。

本発明は下記の実施例及び図面の観点からより明らかになると理解される。

感染前のワクチン接種後１８日目の抗３−１Ｅ血清抗体。感染前のワクチン接種後１８日目の抗ＮｅｔＢ血清抗体。ワクチン接種後１６日目のＮｅｔＢ抗原による脾臓細胞の特異的刺激に対する指数。

実施例１：アジュバントと鳥類胚の発生との適合性
アジュバントと鶏胚のｉｎｏｖｏワクチン接種との適合性を測定するために、様々な弱毒化した生ワクチンと適合する水中油型エマルションタイプの様々なアジュバントをプラシーボワクチンとして配合した（水相：ＰＢＳ）。０．１ｍｌのこれらのプラシーボ配合物をそれぞれ、Ｉｎｔｅｌｌｉｊｅｃｔインジェクタ（Avitech）及び１７．５ｃｍの１８ゲージ針を用いて、１８日齢の受精卵の羊膜腔に注射した。

毒性は０．１ｍｌの抗原性を増強していない（nonadjuvanted：非アジュバント）ＰＢＳの注射後に孵化した若鶏の数と比較して、抗原性を増強した（adjuvanted：アジュバント）プラシーボワクチンの注射後に孵化した若鶏の数として測定する。比較のために、成鶏をワクチン接種するのに使用される油中水型エマルションタイプの参照鳥類アジュバントベースのプラシーボを試験に含めた。２つの一連の試験を行い、結果を下記に示す。

群２〜群５はエマルション１〜エマルション４を使用している。これらの組成物において、非水性画分は最終的に、調製ワクチンで６％〜１２％の範囲の割合を占める（油＋界面活性剤＋塩）。界面活性剤１はエトキシル化糖エステルファミリーのものである。界面活性剤２はエトキシル化脂肪族アルコールファミリーのものである。鉱油１及び鉱油２は注射品質の白色液体ワセリン（例えばExxon製のＭａｒｃｏｌ５２（登録商標））である。二価塩はマンガン塩又はカルシウム塩である。標準的な配合スキームは、１０％を占めるベース（鉱油＋界面活性剤ＨＬＢ１２）に、２％の塩水溶液を１００％となるまで適量加えたものである。これらの調製により、アジュバントなしで注射された群（群１）と有意に異ならない出生率を得ることが可能であり、良好な忍容性を示す。組成の質及び量が同様な群６〜群８が高い死亡率（４６％〜６２％の出生率）を誘導する。これらの配合物は油＋界面活性剤のみの混合物に基づくものである。

観察結果：孵化した若鶏の数は群１〜群３で同等である。その数は群５にて顕著に低くなる。

この試験では、タイプ２及びタイプ３のエマルションが死亡率を誘導しないことからｉｎｏｖｏワクチン接種に適合するものであり、Ｗ／Ｏエマルションが高い死亡率を誘導し、試験条件下ではこの用途に適合しないことが確認されている。

これら２つの試験から、エマルションと薬学的に許容可能な二価塩とを含むアジュバントのみが鳥類胚の発生に適合するものであることが示されている。

実施例２：第１の有効性試験：コクシジウム症に対する組換えｉｎｏｖｏワクチンモデル
次いで、無害検査後に選択されたアジュバントの有効性をｉｎｏｖｏにて注射されたコクシジウム症に対するサブユニットワクチンモデルにて調べた。コクシジウム症はアイメリア属の寄生生物により引き起こされる腸寄生性の鳥類疾患である。

油中水型アジュバントを用いて抗原性を増強し、抗原として組換えアイメリア・アセルブリナプロフィリン３−１Ｅを含むサブユニットワクチンを鶏に注射することによるワクチン接種によって、Ｅ．アセルブリナ（E. acervulina）感染に対する同種保護、及びコクシジウム症に関連するアイメリアの他の２種の主な株（Ｅ．マキシマ（E. maxima）、Ｅ．テネラ（E. tenella））に対する交差保護を誘導することが可能となることがこれまでに示されてきた。

この場合、抗原単独では、保護を誘導するのに十分な免疫原性とはいえず、アジュバントの添加が必要とされる（S.I. Jang, H.S. Lillehoj, S.H. Lee, K.W. Lee, E.P. Lillehoj, F. Bertrand, L. Dupuis, S. Deville. Montanide^TM ISA 71 VG adjuvant enhances
antibody and cell-mediated immune responses to profilin subunit antigen vaccination and promotes protection against Eimeria acervulina and Eimeria tenella. Experimental Parasitology 127 (2011) 178-183、及びまたS.I. Jang, D.K. Kim, H.S. Lillehoj, S.H. Lee, K.W. Lee, F. Bertrand, L. Dupuis, S. Deville, J. Ben Arous, E. P. Lillehoj Evaluation of MontanideTM ISA 71 VG Adjuvant during Profilin Vaccination against Experimental Coccidiosis. PLoS ONE 8(4) (2013) e59786を参照されたい）。

したがって、アイメリア・アセルブリナ３−１Ｅ抗原（５０μｇ／用量）を、ｉｎｏ
ｖｏ注射のために先の工程にて選択されたアジュバントと組み合わせた。

ワクチン接種群は下記のように表される。０．１ｍｌのこれらのワクチンをそれぞれ、Ｉｎｔｅｌｌｉｊｅｃｔインジェクタ（Avitech）及び１７．５ｃｍの１８ゲージ針を用いて、１８日齢の受精卵の羊膜腔に注射した。

観察結果：孵化した若鶏の数は群１〜群５で同等である。

孵化後、ｉｎｏｖｏにてワクチン接種した鶏に対して、ワクチン接種後１８日目（孵化後１５日目）にアイメリア・アセルブリナの１００００個の胞子形成卵母細胞を用いた食道での接種による感染チャレンジを行う。感染に対する耐性を、感染後の体重増加を記録し、排泄された卵母細胞を数え、腸病変及び血清学的な抗プロフィリン３−１Ｅ応答を測定することにより測定する。

結果はＡＮＯＶＡ分析により統計的に分析する。差はｐ＜０．０５で有意であるとみなす。２つの有意差の値は異なる符号にて表す。

結果：
１−体重増加：
体重増加は感染日と感染後１０日目との間で測定する。

２−腸病変：
コクシジウム症により引き起こされる特異的な腸病変のスコアは３人の独立した観察者によって与えられるスコアの平均を表す。病変は病変の重症度が増すにつれ１から４に等級付けられる。

３−卵母細胞の糞便排泄：
各群の糞便を感染後６日目〜１０日目に回収し、感染後に排泄されたアイメリアの卵母細胞を数えた。

４−抗３−１Ｅ血清抗体：
プロフィリン３−１Ｅに対する特異的な血清抗体を、血液サンプルを採取し、免疫付与後１８日目の感染前にＥＬＩＳＡ分析を行うことにより測定した。結果を図１に示す。

第１の有効性試験の結論：
得られた結果から、錯体であるか否かに関わらず、二価塩を含む水中油型エマルションタイプのアジュバントは、ｉｎｏｖｏワクチン接種と適合し、サブユニット抗原によりもたらされるコクシジウム症に対する保護を増大させることが示される。抗原性増強群の動物は、感染後に抗原性を増強していない抗原を用いてワクチン接種した動物に比べたより大きな体重増加、並びに寄生生物の排泄及び腸病変の低減を示す。これらの動物は更に、抗原性を増強していない抗原を用いてワクチン接種した動物よりも高い抗原特異的な血清抗体力価を示す。抗原性を増強していないワクチンでは、コクシジウム症に対する保護は不可能である。

実施例３：第２の有効性試験：コクシジウム症及び壊死性腸炎に対する二価の組換えｉｎ
ｏｖｏワクチンモデル
第２に、選択されたアジュバントの有効性を、ｉｎｏｖｏにて注射した、コクシジウム症及び壊死性腸炎に対する二価サブユニットワクチンモデルについて調べた。

コクシジウム症はアイメリア属の寄生生物により引き起こされる腸寄生性の鳥類疾患である。

壊死性腸炎は細菌クロストリジウム・パーフリンジェンスにより引き起こされ、アイメリアによる前感染の存在により増悪する細菌性の鳥類腸疾患である。

抗原として組換えクロストリジウム・パーフリンジェンスＮｅｔＢトキシンを含む抗原性を増強したサブユニットワクチンを鶏に注射することによるワクチン接種により、クロストリジウム・パーフリンジェンス感染に対する保護を誘導することが可能となることがこれまでに示されてきた。

ＮｅｔＢ抗原単独では、保護を誘導するのに十分な免疫原性とはいえず、アジュバントの添加が必要とされる（S.I. Jang, H.S. Lillehoj, S.H. Lee, K.W. Lee, E.P. Lillehoj, Y.H. Hong, D.J. An, W. Jeong, J.E. Chun, F. Bertrand, L. Dupuis, S. Deville, J. Ben Arous - Vaccination with Clostridium perfringens recombinant proteins in combination with Montanide^TM ISA 71 VG adjuvant increases protection against experimental necrotic enteritis in commercial broiler chickens. Vaccine 30 (2012) 5401-5406を参照されたい）。

したがって、アイメリア・アセルブリナ３−１Ｅ抗原（５０μｇ／用量）及びクロストリジウム・パーフリンジェンスＮｅｔＢ抗原（５０μｇ／用量）を、ｉｎｏｖｏ注射に選択されたアジュバントと組み合わせた。

観察結果：孵化した若鶏の数は全ての群で同等であると考えられる。

孵化後、ｉｎｏｖｏにてワクチン接種した鶏（１群当たり５羽の鶏）に対して、ワク
チン接種後１８日目（孵化後１５日目）にアイメリア・アセルブリナの１００００個の胞子形成卵母細胞を用いた食道での接種による感染チャレンジを行い、３日後（ワクチン接種後２１日目）、１０^９ＣＦＵのＣ．パーフリンジェンス（C. perfringens）を用いた感染を行う。

感染に対する耐性を、感染後の体重増加の記録、ＮｅｔＢトキシンを用いた再刺激後の腸病変、抗ＮｅｔＢトキシン血清学的応答及び脾臓細胞の増殖の測定により測定する。

結果：
１−体重増加：
体重増加はアイメリアを用いた感染日（ワクチン接種後１８日目）とクロストリジウムを用いた感染後２日目（ワクチン接種後２３日目）との間で測定する。

２−腸病変：
特異的な腸病変のスコアは３人の独立した観察者によって与えられるスコアの平均を表す。病変は病変の重症度が増すにつれ１から４に等級付けられる。

３−抗ＮｅｔＢ血清抗体：
ＮｅｔＢトキシンに対する特異的な血清抗体を、血液サンプルを採取し、ワクチン接種後１８日目、Ｅ．アセルブリナ及びＣ．パーフリンジェンスを用いた感染前にＥＬＩＳＡ分析を行うことにより測定した。結果を図２に示す。

４−ＮｅｔＢを用いた再刺激による脾臓細胞の特異的増殖：
ワクチン接種により誘導された細胞応答をＮｅｔＢの存在下における脾臓のリンパ球の
再増殖により測定した。

１群当たり２匹の動物について、免疫付与後１６日目に（感染前に）脾臓を取り出した。脾臓細胞を摘出した後、４８時間、ＮｅｔＢの存在下にて再刺激した。再増殖は刺激指数により表される。結果を図３に示す。

第２の有効性試験の結論：
得られた結果から、錯化されているか否かに関わらず、本発明の主題である二価塩を含む水中油型エマルションタイプのアジュバントは、ｉｎｏｖｏワクチン接種と適合し、サブユニット抗原によりもたらされる壊死性腸炎に対する保護を増大させることが示される。抗原性増強群の動物は、感染後に抗原性を増強していない抗原を用いてワクチン接種した動物に比べたより大きな体重増加及び腸病変の低減を示す。これらの動物は更に、抗原性を増強していない抗原を用いてワクチン接種した動物よりも高い抗原特異的な血清抗体力価及び抗原特異的なリンパ球再刺激指数を示す。この場合、抗原性を増強していないワクチンでは、Ｃ．パーフリンジェンス感染に対する保護を得ることはできない。

Claims

鳥類のｉｎｏｖｏワクチン接種のためのワクチン組成物中のアジュバントとしての使用が意図される、白色液体ワセリンと、エトキシル化糖エステルと、マンガン塩及びカルシウム塩から選ばれる二価無機塩とを含む組成物であって、水中油型エマルション又はマイクロエマルションであることを特徴とする、組成物。
前記組成物の重量１００％に対して、
５０％〜９７％の水と、
１％〜４５％の油性アジュバントと、
０．１％〜１０％の二価無機塩と、
０％〜１０％の錯化剤と、
を含む、請求項１に記載の組成物。
前記油性アジュバントが、該油性アジュバントの重量１００％に対して、
４０％〜９５％の前記白色液体ワセリンと、
５％〜６０％の前記エトキシル化糖エステルと、
を含むことを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
前記二価無機塩が、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、アスパラギン酸カルシウム及び塩化カルシウムから選ばれることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の組成物。
前記錯化剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム及びポリアクリル酸ナトリウムから選ばれることを特徴とする、請求項２ないし４のいずれか一項に記載の組成物。
少なくとも１つの抗原と請求項１ないし５のいずれか一項に記載の免疫アジュバント組成物とを含む、鳥類のｉｎｏｖｏワクチン接種が意図されるワクチン組成物。
前記抗原が少なくとも１つの組換えサブユニットタンパク質を含有することを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
前記サブユニットタンパク質が、鳥類コクシジウム症に対する保護を目的として、アイメリアであることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
前記サブユニットタンパク質が、壊死性腸炎に対する保護を目的として、クロストリジウム・パーフリンジェンス由来のタンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
前記抗原が、鳥類コクシジウム症及び鳥類壊死性腸炎に対する保護を目的として、クロストリジウム・パーフリンジェンス由来の少なくとも１つのタンパク質と、アイメリアとを含有することを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
コクシジウム症の少なくとも１つの抗寄生虫性の生きた抗原を含む、請求項１０に記載の組成物。
鳥類のワクチン接種に用いられる少なくとも１つの生きた抗原を含む、請求項１１に記載の組成物。