CN1786021A - 人b细胞特异性膜分子cd20的12氨基酸模拟表位及其用该模拟表位构建的多肽表位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人B细胞特异性表达膜分子CD20的12个氨基酸的模拟表位及其用该模拟表位构建的多肽表位疫苗，利用已由美国FDA批准上市的用于B淋巴细胞型白血病及淋巴瘤治疗的人鼠嵌合单克隆抗体Rituximab作为配体在噬菌体12随机呈现肽库中筛选出CD20分子的模拟表位，Gln－Asp－Lys－Leu－Th－Gln－Try－Pro－Lys－Try－Leu－Glu，该表位能够特异性的被美罗华单抗所识别，化学合成该12氨基酸的模拟表位并与匙孔嗜血蓝蛋白(KLH)进行化学偶连，得到构建成功的疫苗。由它构建的蛋白疫苗能够在小鼠体内诱导出针对天然CD20分子的抗血清，该抗血清具有相似与美罗华杀伤CD20+细胞的作用。进一步制备能够应用于人体的CD20分子的自体疫苗，从而以主动免疫方式来替代或补充单抗被动免疫治疗，克服单抗治疗缺陷打下基础。

Description

人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位 及其用该模拟表位构建的多肽表位疫苗

                              技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及噬菌体随机呈现肽库的筛选、被筛选噬菌体的亲和性检测和测序、多肽的合成与偶连、动物免疫实验、诱导抗血清的体外活性检测等技术。进一步涉及一种人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位及其用该模拟表位构建的在体内能够诱导出针对CD20分子的自身抗体的多肽表位疫苗。

                               背景技术

1.CD20分子及其单克隆抗体的相关研究

1.1CD20分子

CD20分子是一个表达于95％以上正常或恶化的B细胞表面的标志性分子，是治疗B细胞淋巴瘤时的理想靶抗原。编码CD20的基因位于11号染色体的t(11；14)(q13；q32)区域，它是由297个氨基酸组成的分子量约为33kD的非糖基化磷蛋白，起始表达于pre-B细胞阶段，直至浆细胞期消失。单核细胞、静息以及活化的T细胞及非淋巴细胞均不表达CD20分子。CD20分子是一个四次穿膜蛋白，氨基端和羧基端都位于质膜内侧，位于第三和第四跨膜区之间的由43个氨基酸残基组成的环区，构成了其主要的抗原表位，也是各种单抗分子作用的靶位。CD20分子与其抗体结合后内化作用不明显，也没有明显的CD20分子脱落现象，在人体血清中无游离的CD20存在。

目前，有关CD20分子的生物学功能还不完全清楚，多数认为它是以多聚体的形式行使钙离子通道的功能，是调节B细胞增殖、分化信号途径的组分。CD20位于细胞膜的脂筏(lipid rafts)上，脂筏是胞膜上的一个富含磷脂的区域，被认为是一个信号传导的平台。CD20与脂筏上的Src家族的激酶成员(Lyn、Fyn和Lck)以及PAG(p75/85)相连，PAG将Csk募集至脂筏，从而使Lyn、Fyn和Lck保持失活状态。CD20分子在抗体的作用下相互靠近，发生交联甚至超交联时形成的多聚体发挥钙离子通道的功能，使细胞外钙离子流入细胞内；另外，Src家族的酪氨酸蛋白激酶由于靠近而相互激活，启动信号途径，动员内源性钙离子的释放。这两者导致细胞内钙离子浓度的升高，从而对细胞周期的运行产生影响，调节细胞增殖与分化，甚至导致细胞的凋亡。

1.2CD20分子的单克隆抗体的发展现状

过去的大约30年中，由Khler和Milstein提出的单克隆抗体技术已经为一系列疾病的的体外诊断提供了契机。然而，单克隆抗体的特异性识别抗原的特性在人类疾病的免疫治疗只是在近10年中才崭露头角。目前，单克隆抗体(mAbs)在临床中被用于癌症的诊断和治疗，控制自体免疫性疾病、移植物抗宿主反应和同种异体移植排斥，以及治疗细菌感染引发的脑(脊)髓炎、心肌损伤和可逆的药物中毒等。

CD20分子在人类恶性B细胞的高表达以及抗体结合后不内化等的多种特性使其成为抗体治疗恶性B淋巴细胞肿瘤的重要靶标。Rituximab(Rituxan^，IDEC-C2B8)，商品名美罗华，1997年由FDA批准用于非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)的治疗。它是一个人鼠的嵌合抗体，包含鼠源抗CD20单抗2B8(Ibritumomab)的可变区和人源IgG1重链及κ链的恒定区。美罗华与其亲本抗体具有相似的亲和力和人组织反应活性。相对于2B8单抗其优点在于：1)人源性区域可以介导正常的宿主效应功能；2)其半衰期长于单纯鼠抗体；3)降低宿主抗嵌合体单抗(HACA)的产生。Rituximab可以通过抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和补体介导的溶胞作用(CDC)两种途径杀伤CD20⁺B淋巴细胞。Demiden等人的体外实验证实了Rituximab可诱导CD20⁺B淋巴瘤细胞凋亡。目前，认为Ritaximab清除恶性B细胞的机制还在于激活宿主的免疫活性细胞，使化疗耐受性淋巴细胞重新敏感化等。

Rituximab的副作用包括寒战、发热、恶心、疲乏无力、头痛、瘙痒、舌和喉部肿大(血管水肿)等。其他症状有呕吐、支气管痉挛、哮喘、中度低血压、鼻炎、皮疹、荨麻疹、颜面潮红、肿瘤相关性疼痛以及使已经存在的心律失常或心绞痛症状加重等。Rituximab用药量375mg/m²，每周1次静脉滴注共4次为1疗程，平均1疗程费用为12万人民币左右。最少治疗为4疗程，完全缓解律为27％。同时也有研究发现rituximab的使用导致B细胞表面CD20分子的消失，也许这也是rituximab使用效率底的原因之一。Rituximab作为第一个被FDA批准用于肿瘤治疗的单克隆抗体制剂，它的出现为非霍奇金淋巴瘤的治疗提供了新的方向。

近年来，FDA又批准了两种CD20分子相关的单抗药物(2002年2月和2003年6月)，放射性免疫治疗单抗-Zevalin和Bexxar(Tositumoma和¹³¹I Tositumoma)。Zevalin是同位素⁹⁰Y标记的鼠源单抗2B8(Ibritumomab)。Bexxar是放射性同位素¹³¹I标记的表位识别更依赖于CD20多聚体的存在的鼠源单克隆抗体-抗B1单克隆抗体(Tositumomab，IgG2a-λ)。这两种放免药物通过抗体介导放射性同位素到肿瘤部位，发挥放射性细胞毒直接杀伤肿瘤细胞，克服了放疗不能全身给药的缺点；与单纯免疫治疗相比，表现出更强杀伤邻近肿瘤细胞的能力。

目前，上市的这三种抗体单独使用都获得了很好的疗效。联合化疗药物使用均有良好的协同疗效。但是也存在患者细胞表面CD20抗原在治疗后发生丢失的现象，从而影响单抗的疗效。另外抗CD20抗体治疗费用高，部分患者还发生了HAMA和HACA的反应，如何找到更为完善的治疗方法还需要进一步探索。

2.治疗性疫苗

2.1研究进展

近年来，针对人类自身蛋白的单克隆抗体在治疗急、慢性疾病的过程中显示出了良好的效果。但是，造价的昂贵和使用上的不便限制了单克隆抗体的广泛应用，因此，由被动地接受这种抗体蛋白转向寻求针对人类自身蛋白的主动免疫疫苗，既用主动免疫的治疗方式替代被动免疫，成为蛋白药物的发展方向。目前，治疗性疫苗的研究已成为一个热点，涉及很多疾病，如：慢性病毒感染、过敏、肿瘤、阿尔海默茨病、糖尿病、高血压、肥胖症以及风湿性关节炎等。

治疗性疫苗使人的免疫系统发生有利于患者的反应。大部分的疫苗可以分为两大类：一类是诱导机体发生体液免疫反应，产生抗体；另一类是诱导机体发生细胞免疫反应，产生细胞毒性T细胞(CTLs)。后一类治疗性疫苗主要用于肿瘤和病毒感染性疾病的治疗。

绝大多数的预防性疫苗都是通过诱导抗体的产生来保护机体的，这就证明通过诱导抗体来治疗感染性疾病是一种有效的治疗方法。与预防性疫苗相比，治疗性疫苗的发展就要缓慢的多，直到近几年治疗性疫苗才看到成功的希望。同时，单克隆抗体在治疗疾病方面所取得的巨大成功预示着能够在体内诱导抗体产生的治疗性疫苗有着广阔的发展前景。实际上，已经有动物试验表明诱导出一定水平的内源性特异性抗体来治疗疾病是可能的，如：阻断TNF-α以治疗炎症性疾病。

人源化的抗TNF-α单克隆抗体已经被证明在治疗类风湿性关节炎和Crohn’s病(节断性回肠炎)方面十分有效。目前已经有几种TNF-α的阻断剂上市，包括两种单克隆抗体(infliximab，adalimumab)和一种受体阻断剂(etanercept)，它们正在帮助成千上万的病人减轻痛苦，而且年收入达到20亿美元。所以阻断过量表达的TNF-α能够达到治疗疾病的效果。在动物试验中已经证实通过主动免疫可以特异性诱导出TNF-α的中和性抗体，而且诱导的抗体滴度足以治疗动物关节炎模型。

其他的动物试验表明可以通过诱导体内产生高滴度抗体来治疗以下疾病：针对血管紧张素的疫苗可以治疗高血压；针对IL-9的疫苗可以治疗病原体引起的嗜酸性细胞增多症；针对IL-5的疫苗可以治疗哮喘；针对N-methyl-D-aspartate receptor-1(NMDAR1)的疫苗可以治疗中风。另外，针对一些性激素如人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotro-pin HCG)的免疫可以降低妇女体内的激素水平而达到避孕效果；针对促性腺素释放激素(GnRH)的疫苗可以用于治疗晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用治疗性疫苗诱导出针对胃泌素(gastrin)的抗体可以延长病人的生命。

那么，治疗性疫苗的研究中存在哪些问题呢？最近在针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗的研制过程所发生的情况似乎对这个问题做了回答。阿尔海默茨病是一种看起来非常适合用治疗性疫苗进行治疗的疾病，这种病的发病过程长达数年甚至数十年。如果能用治疗性疫苗诱导出持续时间较长的抗体的话，那么无疑是一种理想的治疗方法，尤其是这种病人经常忘记吃药。

阿尔海默茨病的特征是大脑中斑块的沉积，这种斑块中含有Aβ-肽，这种Aβ-肽是从淀粉样蛋白的前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)衍生来的。在编码APP的基因发生突变导致Aβ-肽的生成增加的人群中，阿尔海默茨病在早年就开始发生了。表达这种突变的APP的转基因小鼠大脑内有大量的斑块沉积，这种斑块与阿尔海默茨病病人脑中发现的斑块相似。用Aβ-肽加上强免疫佐剂来免疫这种转基因小鼠会使小鼠脑中的斑块减少，小鼠的精神表现明显好转。随后，一种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗开始了临床试验，在临床I期试验证明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的临床II期紧跟着开始了，但是没有想到的是6％的试验对象由于产生无菌性脑炎而被迫停止试验。随后研究证实，这种副作用与抗体的滴度没有关系，实际上，一名没有产生抗体反应的受试病人也得了无菌性脑炎。另外，在一名病人的大脑中发现有大量的淋巴细胞浸润。这些研究结果与一种假说相一致，那就是在病人中发现的副作用是由于Aβ-肽特异性的T淋巴细胞引起的，而不是由于抗体引起的。这就要求能够研制出不引起T淋巴细胞介导的自身免疫的第二代疫苗。那么，这种针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗的效果如何呢？在前面提到的临床II期试验中，在诱导出抗Aβ-肽抗体的病人中有一部分认知力的减弱确实推迟了，有一些病人甚至在接受治疗的这一年中意识状态有了好转。如果在疫苗设计时能够解决其安全性问题，那么在不久的将来，针对阿尔海默茨病的治疗性疫苗就会出现。

另一类稍有不同的疫苗对安全性的要求更低一些，那就是针对上瘾药物的疫苗。在动物试验中针对可卡因和尼古丁的疫苗降低了这些药物在大脑中的水平，消除了它们的成瘾症状，试验动物在接受了免疫后对药物不再依赖。在临床I期试验中，可卡因疫苗被证明有良好的耐受性，并且可以诱导出良好的抗体反应，现在，人们正在翘首以待它的有效性结果。

2.2诱导自身抗体的理论研究

针对自身蛋白的治疗性疫苗是如何诱导自身免疫系统产生针对自身蛋白的抗体呢？要产生足够高的滴度的特异性抗体以治疗相关疾病，治疗性疫苗必须克服三个障碍：T细胞耐受、B细胞耐受、在没有佐剂和抗原长效制剂的情况下诱导出抗体。众所周知，人体免疫系统主要是对外来入侵者发动攻击的，而对机体本身是不攻击的，这可能是由于机体具有能够识别“非我”与“自我”的能力。免疫系统的这种特性通常被称为耐受或无反应性。耐受发生在B细胞和T细胞水平。一般来说，T细胞耐受更严格一些。对许多抗原来说，在发生T细胞耐受的同时，正常的B细胞株却在体内存在。实际上，有三种机制导致了免疫耐受：细胞株剔除，即特异性的淋巴细胞从淋巴细胞群中被彻底剔除；免疫无能，即特异性的淋巴细胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即具有免疫功能的淋巴细胞存在，但是由于没有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不能被激活。对T细胞来说，诱导耐受和无能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但诱导耐受也可以在外周进行。B细胞耐受主要在骨髓中诱导，但也可在外周诱导。通常，对于普遍表达的丰富抗原的免疫耐受更容易阐明。

在针对外来抗原的免疫反应中，T细胞和B细胞互相配合才能有效地产生抗体：当受到外来抗原免疫时，特异性的B细胞结合抗原，产生起始的激活信号。另外，B细胞内吞抗原，在其表面呈现抗原肽和MHCII类分子的复合物。通常，B细胞不能激活TH细胞。要激活TH细胞，树突状细胞是必不可少的，树突状细胞摄取抗原，并在其细胞表面呈递抗原肽和MHCII类分子的复合物，激活TH细胞。激活后的TH细胞识别B细胞表面呈现的抗原肽和MHCII类分子的复合物，引起B细胞增殖、抗体的产生以及抗体类别的转换。如果因为免疫耐受而缺乏TH细胞的协同作用，那么就不会产生抗体。在针对自身蛋白的疫苗的设计过程中，如果将自身抗原与外源蛋白或多肽载体融合或偶联在一起，就有可能绕过TH细胞耐受：自身抗原特异性的B细胞就能够摄取该自身抗原以及与其相连的载体蛋白，并在其表面呈现载体肽与MHCII类分子的复合物，由于TH细胞对载体蛋白没有免疫耐受，所以能够被激活，从而协同自抗原特异性的B细胞产生针对自身抗原的特异性抗体。

与T细胞耐受相比，B细胞耐受要宽松得多。实际上，在许多情况下，自身特异性B细胞在体内以正常的频率出现，如果受到抗原和TH细胞的共同作用就会被激活。所以对许多可溶性自身蛋白来讲，体内存在其特异性B细胞株，尤其当这种蛋白不是非常富余表达的时候更是这样。对于这类蛋白或多肽，将其与载体蛋白相连，绕过T细胞耐受，就有可能产生有效的疫苗。实际上，利用这种策略，针对多种自身激素的抗体反应已经被诱导出来了。

2.3噬菌体表面随机呈现肽库技术的研究进展

1985年，Smith报道了外源多肽在单链噬菌体表面呈现的结果，由此发展起来的噬菌体表面呈现技术近几年来得到迅速发展，成为生物学研究和应用领域中有效而重要的工具。该技术是将编码外源多肽或蛋白的基因片断插入噬菌体衣壳蛋白的基因中，从而将外源多肽或蛋白呈现于噬菌体表面。由于构成外源基因片段的脱氧核苷酸可以随机的排列组合，所以可以构建呈现不同外源多肽或蛋白的噬菌体表面呈现多肽或蛋白库，进而应用于酶底物的筛选，抗体的筛选，配体的筛选，蛋白间相互作用的研究，疾病的诊断等方面。

2.3.1噬菌体呈现系统

2.3.1.1丝状噬菌体呈现系统

丝状噬菌体是一类具有丝杆状形态的噬菌体，在分类中属于丝杆噬菌体科(Inoviride)，丝状噬菌体属(Inovirus)。用于表面呈现的噬菌体为一类特异性感染大肠杆菌的噬菌体，包括M13、fd、f1、If1和Ike等。它们具有相似的结构。以M13噬菌体为例，它的核心为6000bp的环状单链DNA，含10个基因，分别编码10种不同的蛋白。其中基因VIII编码主要衣壳蛋白pVIII，基因III，VI，VII，IX分别编码次要衣壳蛋白pIII、pVI、pVII、pIX。M13噬菌体以其次要衣壳蛋白pIII仅感染具F纤毛的大肠杆菌。

丝状噬菌体自身有许多适于构建多肽库的特点。如它能够接受在衣壳蛋白中插入外源多肽，并将外源蛋白表达后呈现于病毒颗粒表面，便于被相应的受体或抗体识别。即使外源序列干扰病毒的生活周期，也能通过基因或噬菌粒系统将多肽表达于表面，产生携带野生型和重组衣壳蛋白的嵌合噬菌体。易于扩增，重组后的噬菌体能够通过感染大肠杆菌得到扩增。对于筛选到的能够特异性结合某一靶分子的多肽噬菌体也能够再感染大肠杆菌，扩增后测序分析其核苷酸序列。噬菌体在各种洗脱条件(如低pH)下仍然很稳定，可以感染形成很高的滴度(一般达到10¹²)，这样高的滴度足以代表库中所有的克隆。

最初常用于噬菌体表面呈现的是衣壳蛋白pIII或pVIII。pIII是衣壳蛋白中最大的蛋白，位于噬菌体的最尾端，其C末端锚定在内膜上，N末端游离在外。它识别并结合大肠杆菌的F纤毛，其最大的特点是对外源蛋白或多肽的大小无严格限制，大至50kD的蛋白已被成功呈现。由于pIII的拷倍数只有3-5个，可筛选高亲和力的抗原决定簇，故常为呈现的首选蛋白，但在免疫学和生物疫苗的研究中受到限制。用pVIII呈现的外源分子在无任何佐剂的情况下就能刺激生物体产生较强的免疫学反应，且其拷贝数多达2700个左右，因此可用于筛选亲和力较低的抗体，但小分子量的pVIII不能容纳多于6个氨基酸的外源多肽，这一点限制了外源多肽与pVIII的融合。高拷贝pVIII在疫苗开发中具有潜在的应用价值。

2.3.1.2其它噬菌体呈现系统

除丝状噬菌体外，人们还发展了一些其它的噬菌体呈现系统，如T4噬菌体和λ噬菌体。外源蛋白被呈现时，可与T4噬菌体小外壳蛋白的C末端融合，也可通过与λ噬菌体衣壳上的D蛋白的N末端融合或与λ噬菌体主要尾部蛋白pV的C末端融合。与丝状噬菌体呈现系统相比，这两种呈现系统均以烈性噬菌体的形式释放子代病毒粒子，所以被呈现的蛋白可以较大，甚至也可以是对宿主有毒性的蛋白。

2.3.1.3噬菌粒呈现系统

用pIII或pVIII呈现外源蛋白时，外源蛋白可能会影响到噬菌体的一些性能。特别是对于pIII而言，其在感染大肠杆菌时是必需的，如果其功能受到影响，则噬菌体无法很好的侵染大肠杆菌，为了解决这一问题，人们构建了噬菌粒呈现系统。在该系统中，外源蛋白由噬菌粒编码，在辅助型噬菌体的帮助下，新产生的噬菌体的表面既含有少量来自噬菌粒的融合蛋白，又含大量来自辅助型噬菌体的野生型蛋白，这样即使外源蛋白对噬菌体有负面影响，也被大量的野生型蛋白“稀释“了。噬菌粒呈现系统的出现，还使得一些新的呈现方式成为可能。如利用该系统，Jespers等证明在pVI蛋白C末端可呈现外源蛋白，Gao等证明在pVII，pIX蛋白N末端可呈现抗体片段，Fuh等证明在pVIII的C末端也可呈现外源蛋白。这样，M13的所有衣壳蛋白都可借助噬菌粒呈现系统用于外源蛋白或多肽的呈现。

2.3.2噬菌体肽库技术的应用

噬菌体显示技术的出现和发展为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。同时随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为：(1)含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。

2.3.2.1蛋白质之间相互作用的氨基酸残基分析

噬菌体表面呈现肽库技术已广泛用于蛋白质之间的相互作用位点的研究。例如：整合素(integtins)通讯的膜表面受体，为细胞生长、分化、迁移所必需。Koivunen等分别用五肽、六肽、七肽、九肽的随机噬菌体肽库筛选与整合素结合的小肽，从四个肽库中均筛选到包括RGD序列的小肽，反之，用含RGD序列的纤维粘连素片断从随机肽库中筛选到与之结合的小肽，都具有CWDDG/LWLC的序列。此序列类似于Hong等筛选到的与腺病毒penton RGD位点结合小肽MTSDDL的序列。两组均证实KDDLW序列存在于整合素亚基中，且参与RGD的交联作用。通过噬菌体表面呈现及筛选技术，确定整合素的与RGD序列蛋白之间相互作用的重要残基，为设计整合素特异性抑制剂提供有价值的信息。

另外，研究最为深入的是从噬菌体表面随机端肽库中筛选到的能模拟EPO功能的小肽。EPO(促红细胞生成素)是由165个氨基酸组成的糖蛋白，在临床应用于病理性贫血。但由于EPO的糖链占其分子量的一半左右，不仅限制了原核表达系统的应用，且糖链的结构也决定了只能皮下或静脉给药。Wringhton等从cpVIII呈现的多肽库中筛选到与EPO受体结合的8个氨基酸环行肽，但与EPO受体亲和力较低。为获得高亲和力的受体，在此基础上构建了包括以8个氨基酸为核心、两侧为随机序列的肽库，通过cpIII呈现，从中筛选到与EPO受体高亲和力的环肽，并且其序列与天然EPO无相似之处。经体内、体外一系列活性检测证明，这些环肽确实能够模拟EPO功能，诱导受体二聚体形成，进行信号转导，刺激细胞生长、分化。EPO模拟肽的发现是噬菌体表面呈现技术应用的重大突破，为设计蛋白质小分子模拟物提供信息，从而开辟一条新的药物设计和治疗途径。

以固相化单抗做为筛选分子，从噬菌体随机肽库中获得与单抗有结合活性的小肽，其保守性序列与天然抗原序列相同或类似，即模拟了天然蛋白质连续表位。若完全不同于天然抗原序列，称这些肽为模拟表位(mimotopes)，它模拟天然蛋白一级结构上不连续的氨基酸经过空间折叠而形成的表位结构。

等应用HER2/neu受体细胞外结构域的单抗mAbMGr2，从噬菌体肽库中筛选到一系列噬菌体表型。序列分析表明，噬菌体肽的保守性序列与neu多肽链的氨基酸序列同源性很低，但筛选到的每个噬菌体表型免疫动物，均能产生针对HER2/neu抗体。实验证实从随机肽库中筛选到的小肽能够很好模拟天然HER2/neu细胞外结构域中由不连续氨基酸形成的空间表位。

2.3.2.2确定疾病特异性抗原模拟物

从随机肽库中筛选与目的筛选物相结合的小肽，已有多篇文献成功报道，筛选的成功与否有赖于高质量肽库及高纯度的筛选物。有文献报道，将筛选方法稍做修饰，即可用复合物如全血清或其他体液从肽库中筛选与目的物结合的小肽。

已有多个研究小组证实，利用多克隆血清从随机肽库中筛选出疾病专一的模拟抗原决定簇是可能的。这种方法在预先不知道抗原任何信息的情况下，从一个大的肽库中筛选出呈现特异性模拟抗原决定簇的噬菌体，这种特异性噬菌体只能与病人血清反应而不与正常血清反应。并且模拟抗原决定簇的序列是否与原始分子相似都不会影响它应用于疫苗，因而在新发现的疾病方面更有意义。Cortese实验小组进行一系列实验，成功地筛选到能够与某些疾病患者血清中抗体结合，而并不与正常对照结合地小肽。Prezzi等用感染了人丙肝病毒(HCV)的人血清做为筛选物，获得的噬菌体小肽能够与病人血清反应，而与对照血清无反应。以此类肽为抗原免疫兔获得的抗体可识别HCV蛋白。现已商品化的人乙肝病毒疫苗，包括纯化的基因工程重组人乙肝疫苗都是通过此方法而制备的。

2.3.2.3筛选细胞特异性、器官特异性的肽

随着噬菌体表面呈现技术不断发展、完善，已发展出了利用非纯化分子作为筛选配体的筛选方法。Barry等报道用整个细胞作为亲和筛选配体，从肽库中筛选出与细胞表面受体结合的肽。此方法优点在于细胞表面受体在经过细胞翻译、加工、修饰过程后呈现于细胞表面，出于完全天然构象状态。而且细胞作为配体既不需对受体分子进行纯化，也不需对受体结构进行分析。另外，肿瘤细胞向特定组织部位的亲润及特定组织定位，提示在这些组织表面可能存在特异受体。可以利用活体组织直接从噬菌体表面呈现多肽库中筛选组织细胞表面特异性受体，找到癌症治疗有关的重要小肽，用于疾病诊断或药物靶向治疗。

总之，噬菌体短肽库技术具有重要的理论意义和应用价值。在研究蛋白间的相互识别，蛋白折叠及空间构象的预测，肽与有机物间的相互作用以及酶与底物的结合，抗体与抗原的相互作用，激素与受体的结合等方面显示出巨大的应用潜力。在诸如疫苗的设计、基因定位、小分子药物的开发等领域的应用前景广阔。

                              发明内容

本发明的目的在于，筛选出人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位，从而构建一种能够在体内诱导出针对CD20分子的特异性抗体的治疗性疫苗，为恶性B细胞相关肿瘤提供一种新的治疗药物。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：利用已由美国FDA批准上市的用于B淋巴细胞型白血病及淋巴瘤治疗的人鼠嵌合单克隆抗体Rituximab作为配体在噬菌体12随机呈现肽库中筛选出CD20分子的模拟表位，化学合成该12氨基酸的模拟表位并与匙孔嗜血蓝蛋白(KLH)进行化学偶连，得到构建成功的疫苗。联合弗氏佐剂免疫健康成年BALB/c小鼠，诱导出针对人CD20分子的抗血清，并且该抗血清能够发挥与Rituximab一致的补体杀伤(CDC)功能。

具体内容是：

1)以人鼠嵌合单克隆抗体Rituximab作为配体，在噬菌体随机呈现12肽库中筛选得到与人鼠嵌合单克隆抗体Rituximab高亲和力的三种CD20分子的模拟表位，其氨基酸序列分别为：Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu；

          His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His；

          Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys。

上述的三种CD20分子的模拟表位与CD20分子的蛋白序列及基因序列无任何同源性，与CD20分子单克隆抗体美罗华具有特异的亲和性。

实现上述人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位的筛选方法，其特征在于，按以下步骤完成：

a)噬菌体随机呈现12肽库的筛选

以0.1mol/L的NaHCO3，pH8.6，100μg/mL配制的Rituximab溶液包被ELISA板孔，过夜后，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；然后用1％牛血清白蛋白的TBS，50mM Tris-HCl，pH 7.5，4℃孵育，封闭2h，再采用0.1％Tween 20的TBST洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；

加入200μl用TBST稀释的含2×10¹¹pfu的库噬菌体溶液，室温孵育1h；倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用TBS+0.1％Tween20洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；用100μL洗脱液洗脱结合的噬菌体，其洗脱液配方为：0.2mol/L Glycine-HCl，pH2.2，10g/L BSA，并迅速加入配方为1mol/L Tris-HCl，pH9.1的中和液中和；取1μL测滴度，剩余液体加入20mL处于对数生长早期的ER2738培养物(大肠杆菌ER2738；20mg/L四环素的5mL LB培养基：胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl 10g/L)中，于37℃剧烈振荡培养4.5h，得到扩增的噬菌体；

将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4℃，10000rpm离心10min；上清转入新的离心管，再离心，取80％的离心上清转入新的离心管，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，其配方为：PEG-8000 200mg/mL，NaCl2.5M，4℃静置过夜；次日，4℃，10000rpm离心15min，倾去离心上清；再同法快速离心一下，吸尽残留上清；1mLTBS重悬沉淀，于4℃10000rpm离心5min，将残留的细胞沉淀下来；上清加入1/6体积的PEG/NaCl，冰浴1h，4℃，10000rpm离心15min，倾去上清，用200μL含0.01％NaN₃的TBS重悬沉淀，10000rpm离心1min；上清即为扩增好的洗脱液，1μL用于测滴度，余下的液体于4℃存放；

200μL Rituximab溶液新包被一孔，用于下一轮筛选，为了提高筛选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，Rituximab的浓度分别降至50mg/L和20mg/L；重复以上筛选步骤，第二轮和第三轮的筛选中，加入的第一轮和第二轮筛出的噬菌体应根据滴度计算相当于2×10¹¹pfu噬菌体的液体体积；将TBST中Tween的浓度提高至0.5％；第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取1μL进行滴度测定，剩余存放于4℃；

从滴度测定中，菌斑数＜100的平板上随机挑取50个分隔良好噬菌斑进行扩增和纯化，既用无菌牙签蘸取的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的ER2738中，37℃剧烈振荡培养4.5h后，瞬间离心30s。新的离心管，同法再离心一次，取80％的上清，即得扩增的噬菌体液体；

b)特异性噬菌体筛选

以100mg/L的NaHCO₃pH8.6，包被96孔酶联板，同时对每个孔设立1％BSA对照孔，同型的IgG1对照孔，4℃孵育过夜；倾去包被液，加入5mg/L BSA，0.1mol/L NaHCO3，pH 8.6的封闭液，4℃封闭2h，以步骤1)中的TBST洗6次，每次均要除尽残余液体；将50个纯化的1×10⁹/孔噬菌体分别加入NaHCO₃pH8.6中，BSA和同型抗体IgG1包被孔中室温孵育2h。TBST洗6次，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb100μL，其比例1∶5000，室温孵育1h；TBST洗6次，2，2-连氮-双3-乙基苯并噻唑啉磺酸显色后测定A410nm处的吸光值；

c)噬菌体呈现肽的序列测定

根据ELISA结果，筛选出20个与rituximab有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆进行序列测定；噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清；常规提取噬菌体单链DNA，以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′，在ABI310DNA自动测序仪上进行自动测序，根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，比较不同克隆之间氨基酸序列的同源性，即可得到筛选的三种模拟表位。

2)上述的人B细胞特异性膜分子CD20的12个氨基酸模拟表位构建多肽表位疫苗的方法，其特征在于，将上述筛选得到的三种模拟表位Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try ProLys Try Leu Glu；His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His；Asn Met SerIle Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys进行多肽化学合成(由西安华辰生物技术公司完成)，采用戊二醛法将合成的多肽与蛋白载体KLH的化学偶连，将KLH配制成1mg/ml溶液，配方为0.1M PBS，pH7.5；5ml配制的KLH溶液，以40多肽：1蛋白的摩尔比的比例加入合成多肽，冷却至2～6℃，逐滴加入5ml 2％的戊二醛至多肽蛋白混合物，2～6℃不断搅拌1小时，pH为7.5的PBS或生理盐水透析，4℃过夜，得到约10ml多肽蛋白溶液，分装，-70℃冻存，其偶连物的浓度为0.5mg/ml；经DOT Blot确定偶连效果及其抗体鉴定，即为B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位构建的多肽表位疫苗。

3)本发明的模拟表位构建的模拟表位多肽疫苗可以在小鼠体内诱导出针对该表位的抗血清；该抗血清能够识别CD20+细胞天然表达的CD20分子；能够有效杀伤CD20+细胞。联合弗氏佐剂免疫健康成年BALB/c小鼠，诱导出针对人CD20分子的抗血清，并且该抗血清能够发挥与Rituximab一致的补体杀伤(CDC)功能。

本发明制备的模拟表位多肽疫苗使用筛选出的CD20分子的模拟表位结合载体蛋白KLH来突破自体免疫耐受，产生针对CD20分子的中和抗体，从而应用主动免疫的方法来替代Rituximab单抗这种被动免疫的治疗方式，进而减少单抗副作用，减轻病患负担。

                              附图说明

图1是筛选出20个与Rituximab有较高亲和力而与其他对照(其中(a)是同型IgG1对照，(b)是同BSA对照)亲和力低的噬菌体克隆的ELISA结果：1号框为阳性噬菌体与Rituximab的亲和结果；2号框为与Rituximab同型的无关抗体的亲和结果；3号黄色框为与封闭液牛血清白蛋白BSA的亲和结果。

经过Dot Blot证实构建的疫苗KLH-P1与Rituximab单抗具有良好的亲和性，而KLH-P2，KLH-P3均不能成功与Rituximab结合，既不能模拟CD20的表位。

图2是以ELISA检测KLH-P1免疫小鼠血清(1∶10000)滴度：1号框为GST-P1为检测抗原；2号框为GST对照。1～6号为免疫后的6只小鼠，7号为KLH免疫的对照小鼠血清。

图3是流式细胞仪检测抗血清与CD20⁺细胞表面天然表达的CD20分子结合的结果：A对照抗血清与CD20⁺细胞(Raji细胞)；B对照抗血清与CD20^-细胞(Jurkat细胞)；C免疫抗血清与CD20⁺细胞；D免疫抗血清与CD20^-细胞；E、F分别为C、D的荧光照片。

图4是MTT法检测抗血清对CD20⁺细胞杀伤的结果：浅色框为CD20⁺细胞(Raji细胞)；深色框为CD20^-细胞(Jurkat细胞)；1号Rituximab阳性对照；2号为抗血清；3号为对照抗血清；4号为单纯补体的对照。

                           具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

依照本发明的技术方案，制备人CD20分子治疗性自体疫苗首先应用亲和筛选的方法利用Rituximab为配体在噬菌体随机呈现12肽库(BioLabs^，New England)中筛选得到高亲和力的12多肽模拟表位Gln-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Try-Pro-Lys-Try-Leu-Glu(谷氨酰胺-天冬氨酸-赖氨酸-亮氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-色氨酸-脯氨酸-赖氨酸-色氨酸-亮氨酸-谷氨酸)，化学合成该表位以后，应用戊二醛法将其与KLH进行化学偶连，得到免疫用疫苗。

实现本发明的肽库筛选，疫苗构建，以及免疫动物，抗体检定工作，按以下步骤完成：

3.1.噬菌体随机呈现12肽库的筛选

噬菌体随机十二肽库(Ph.D.-12^TM Phage display peptide library)：购自美国New England Biolabs公司，其滴度为1.5×10¹³噬斑形成单位(pfu)/mL；多样性2.7×10⁹transformants。宿主菌为大肠杆菌E.coli ER2738，携带有可被噬菌体感染的F’因子，具有四环素抗性，可与呈现了12肽的噬菌体形成α互补。测序引物(-96gIIIsequencing primer)序列为：ccctcatagttagcgtaacg。

3.1.1噬菌体滴度的测定

(1)E.coli ER2738的培养以无菌操作技术从ER2738大肠杆菌的甘油冻存物中挑取一接种环，接种于四环素抗性的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂15g/L，NaCl10g/L)上，37℃培养24h，待平板上可见白色透亮的菌落形成后，将基本培养平板置于4℃保存。

(2)平板上挑取E.coli ER2738单菌落接种于含20mg/L四环素的5mL LB(胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl10g/L)培养液中，37℃振荡培养至对数生长中期(OD600约为0.5)。

(3)将噬菌体用LB进行10倍连续梯度稀释。对于扩增后的噬菌体培养上清，稀释10⁸-10¹¹倍；对于未扩增的筛选洗脱液，稀释10¹-10⁴倍。

(4)每份稀释的噬菌体样品各取10μl，分别加入步骤(2)培养好的细菌中(200μl)，快速混匀，室温孵育1-5min。

(5)各感染的细菌分别移入45℃预温、含有顶层琼脂3-5ml(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，MgCl₂·6H₂O1g/L，琼脂糖7g/L)的培养管中，加入40μl 20mg/mL的X-gal和16μl 50mg/mL的IPTG，充分混匀，然后迅速倒入预温的LB平板，倾斜使顶层琼脂均匀分布。

(6)将平板放置5min，使温度降低，然后反转平板，37℃孵育过夜。

观察平板，计数蓝色噬斑并乘以该平板中噬菌体样品的稀释倍数，得到每10μl噬菌体的滴度，以蓝色噬斑形成单位表示(plaque forming units，pfu)。

3.1.2.生物淘洗

(1)在96孔板中加入200μL用0.1mol/L的NaHCO3(pH8.6)稀释的Rituximab溶液(100μg/mL)。置于密闭潮湿的盒中轻轻摇动，4℃孵育过夜。

(2)预先接种ER2738于10mL(测滴度用)和20mL(扩增噬菌体用)的含四环素的LB中，37℃培养。

(3)将(1)中的96孔板取出，倾去液体，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(4)加入200μL封闭液1％牛血清白蛋白(BSA)的TBS(50mM Tris-HCl，pH7.5)，4℃孵育2h。

(5)TBST(TBS+0.1％Tween 20)洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(6)加入200μl用TBST稀释的含2×10¹¹pfu的库噬菌体溶液，室温孵育1h。

(7)倾去液体，去除未结合的噬菌体，TBST洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(8)用100μL洗脱液(0.2mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，10g/L BSA)洗脱结合的噬菌体，并迅速加入中和液(1mol/L Tris-HCl pH 9.1)中和；取1μL测滴度，剩余液体加入20mL处于对数生长早期的R2738培养物中，于37℃剧烈振荡培养4.5h，进行扩增。

(9)将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4℃，10000rpm离心10min。将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次，取80％的离心上清入新的离心管。

(10)在离心管中加入1/6体积的PEG8000/NaCl(PEG-8000 200mg/mL，NaCl2.5M)，于4℃静置过夜。

(11)次日取出PEG8000/NaCl沉淀好的液体，于4℃，10000rpm离心15min，小心的倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清。

(12)用1mLTBS重悬离心沉淀，将重悬液转入小离心管中，于4℃ 10000rpm离心5min以将残留的细胞沉淀下来。

(13)将离心上清移入新的小离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl冰浴1h。4℃，10000rpm离心15min，小心的倾去离心上清；再同法快速离心一下，用微量移液器吸尽残留上清。

(14)用200μL含0.01％NaN₃的TBS重悬沉淀，10000rpm离心1min以沉淀那些不能溶解的物质。将上清移入新的离心管，即为扩增好的洗脱液，1μL用于测滴度，余下的液体于4℃环境下存放。

(15)用200μL目的蛋白溶液新包被96孔板一孔，用于下一轮筛选，为了提高筛选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，目的蛋白的浓度分别降至50mg/L和20mg/L。

(16)观察步骤14中测滴度的结果，计数蓝斑的数量以确定噬菌体的滴度，该噬菌体用于第二轮的筛选。在第二轮的筛选中，加入的第一轮筛出的噬菌体应根据该滴度计算相当于2×10¹¹pfu噬菌体的液体体积。

(17)进行第二轮筛选，重复步骤2-15，并将TBST中Tween的浓度提高至0.5％。

(18)用200μL目的蛋白溶液新包被96孔板一孔，用于第三轮筛选。重复步骤2-8，TBST中Tween的浓度为0.5％，第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取1μL进行滴度测定，剩余存放于4℃。从滴度测定中，菌斑数＜100的平板上随机挑取50个分隔良好噬菌斑按下列方法进行扩增和纯化，此时应注意挑取的噬菌斑培养的时间不能超过18h。(这50个噬菌斑为挑选的阳性噬菌体斑)

经过三轮筛选，特异性噬菌体进一步被富集，得到的噬菌体滴度逐步升高。

	滴度
		第一轮	The average：5.6×109pfu
第二轮	The average：7.8×109pfu
		第三轮	The average：2.1×1010pfu

(19)阳性噬菌体的扩增，将ER2738的过夜培养物用LB进行1∶100稀释，1mL/管分装于50mL的培养管中。

(20)将用无菌牙签蘸取的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入上述培养管中，37℃剧烈振荡培养4.5h，进行扩增。

(21)将扩增好的噬菌体液体倒入离心管，瞬间离心30s。将离心上清转入新的离心管，同法再离心一次。取80％的上清，即为扩增的噬菌体液体。4℃下可存放几周，若要长时间保存，可加入终浓度为50％的无菌甘油存放于-20℃。

3.1.3.噬菌体特异性筛选(噬菌体ELISA)

在这挑选出的50个克隆中利用噬菌体ELISA进一步挑选与Rituximab高亲和力的克隆。

(1)以100mg/L Rituximab(NaHCO₃pH8.6)包被96孔酶联板，每孔200μL，同时对每个Rituximab孔设立1％BSA的包被孔对照，并对每个孔再包被一个同型的IgG1(来自第四军医大学细胞工程中心)为阴性对照，4℃孵育过夜。

(2)倾去包被液，加入封闭液(5mg/L BSA，0.1mol/L NaHCO3，pH 8.6)，4℃封闭2h。

(3)倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体。

(4)将50个纯化的噬菌体(1×10⁹/孔)分别加入Rituximab，BSA和同型抗体IgG1包被孔中室温孵育2h。

(5)TBST洗6次，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb(1∶5000)100μL，室温孵育1h。

(6)TBST洗6次，ABTS(2，2-连氮-双3-乙基苯并噻唑啉磺酸)显色后测定A410nm处的吸光值。

3.1.4.噬菌体呈现肽的序列测定

根据50个克隆的ELISA结果，筛选出20个与rituximab有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆(结果见图1)进行序列测定。

(1)噬菌体单链DNA的提取

噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清。用华舜公司生产的单链DNA提取试剂盒进行噬菌体单链DNA的提取，按操作说明书进行操作：在含有单个噬菌体克隆的LB培养液中加入沉淀液，高速离心后得到噬菌体颗粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌体外壳蛋白，经过树脂纯化，洗脱得到噬菌体单链DNA，紫外定量其浓度大于100ng/μL。

(2)Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列

以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，在ABI 310 DNA自动测序仪上进行自动测序。

(3)呈现随机肽氨基酸序列的推导及氨基酸同源性分析

根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，得出三种序列(P1，P2，P3)如下。比较不同克隆之间氨基酸序列的同源性。

P1：Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu

P2：His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His

P3：Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys

3.2.疫苗的构建

根据以上的测序结果，总结得到三种CD20分子的模拟表位为：Gln Asp Lys Leu ThrGln Try Pro Lys Try Leu Glu，His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His，Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys。

3.2.1.表位的化学合成

采用固相合成法合成以上三种多肽，合成工作由西安华辰生物科技公司完成，纯度为98％以上。

3.2.2.多肽的化学偶连

采用戊二醛法进行多肽与蛋白载体KLH的化学偶连。

(1)将KLH(购自西安华辰)配制成1mg/ml(0.1M PBS，pH7.5)溶液。

(2)取5ml上述蛋白溶液，以40多肽：1蛋白的比例(摩尔比)加入合成多肽，冷却至2～6℃，中速搅动。

(3)逐滴加入5ml 2％的戊二醛至多肽蛋白混合物。

(4)2～6℃不断搅拌1小时。

(5)将上述溶液以PBS(pH7.5)或生理盐水透析，4℃过夜。

(6)透析完成后，得到约10ml多肽蛋白溶液，分装，-70℃冻存。

其偶连物得浓度应为0.5mg/ml。

3.2.3.构建疫苗的鉴定

以DOT Blot来确定偶连效果。

(1)将偶连的多肽KLH-Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu(KLH-P1)，KLH-His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His (KLH-P2)，KLH-Asn Met SerIle Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys (KLH-P3)，以及KLH以相同量(约3μg)仔细点在硝酸纤维素膜(NC膜)上。

(2)以2％ BSA TBS(pH7.5)封闭膜2小时以上。

(3)TBST(0.5％Tween20)洗涤膜3次，每次10分钟。

(4)加入TBST稀释的rituximab(4μg/ml)，室温轻摇孵育1小时。

(5)以同样方法洗去未结合的rituximab。

(6)加入TBST稀释的AP(碱性磷酸酶)标记的抗人二抗，室温孵育30分钟。

(7)TBST洗去二抗，再以TBS洗去tween 20，以碱性磷酸酶底物显色剂(sigma)避光显色。

3.3.动物免疫

3.3.1实验动物

BALB/c小鼠，4周龄，购自第四军医大学实验动物中心。随机分为4组，每组6只。

3.3.3实验材料

弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂均购自北京鼎国生物制品公司。上述制备的候选疫苗KLH-P1及对照蛋白KLH。

3.3.4免疫程序

(1)将小鼠随机分为2组，每组6只。

(2)分别将疫苗蛋白及载体蛋白对照与弗氏佐剂混匀，并使之完全乳化。

(3)每两周背部皮下多点注射免疫小鼠一次。每次每只免疫剂量为30～50μg蛋白。

(4)共免疫四次，首次为弗氏完全佐剂乳化，后两次为不完全佐剂的乳化，最后一次不加佐剂，进行腹腔注射。

(5)末次免疫后10日，眼球取血，并分离血清。

3.4.抗体鉴定

3.4.1.ELISA

3.4.1.1.材料与试剂

96孔酶联板(Costar)，NaHCO₃pH8.6，GST-P1(融合GST谷胱甘肽转移酶原核表达的模拟表位P1，由本科室自行构建表达)，GST(谷胱甘肽转移酶，本科室自行表达)，HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人，及抗小鼠二抗(武汉中山生物制品公司)。ABTS(sigma)。

3.4.1.2.实验方法

(1)GST-P1，GST 100mg/L(NaHCO₃，pH8.6)分别包被96孔板(100μl/孔)，并设置复孔。

(2)以TBS(pH7.5)1％BSA封闭。TBST(0.5％Tween 20)洗涤6次。

(3)分别加入每只小鼠的血清(1∶100，1∶1000，1∶10000，TBST稀释)，并以Rituximab为阳性对照，室温孵育1小时。

(4)TBST洗涤6次，每次3分钟。

(5)加入HRP标记的抗小鼠二抗，阳性对照加入抗人二抗，室温孵育30分钟。

(6)TBST洗涤6次，每次3分钟。

(7)加入ABTS显色剂，550型ELISA读数仪(美国Bio-Rad公司)410nm，读板。

3.4.2.流式细胞仪检测(FCM)

3.4.2.1.材料与试剂

(1)细胞与细胞培养

人恶性B白血病细胞Raji细胞(CD20+)，Jurkat细胞(CD20-)，均购自第四军医大学免疫学教研室。所有细胞均在RPMI1640培养基(GIBCO Co)中培养。培养基中含有10％小牛血清(杭州四季青生物制品厂)和100U*ml-1的青、链霉素。取对数生长期的细胞，计数，将单细胞悬液用RPMI1640培养基稀释至1×10⁷个细胞/ml备用。

(2)抗血清与抗体：

抗血清为动物免疫实验中收集的抗血清，KLH免疫为阴性对照抗血清；rituximab(0.01μg/μL)为阳性对照抗体；第二抗体分别为FITC标记的羊抗小鼠，抗人IgG1(武汉博士德)。灭活正常兔血清来自第四军医大学实验动物中心。

(3)试剂：

PBS(0.01M，pH7.2)；洗涤液(5％胎牛血清，4％NaN₃，PBS)；固定液(2％葡萄糖，1％甲醛，0.02％NaN₃，PBS)。

3.4.2.2.方法

(1)取40细胞悬液加入预先有抗血清(KLH-P1，KLH)，Rituximab(30μL)的塑料离心管，再加入50μL1∶20(PBS稀释)灭活的正常兔血清，4℃孵育30分钟。

(2)洗涤液洗涤3次，每次洗涤液加入1.5ml左右(1000rpm×5min)。

(3)弃上清，加入50μL工作浓度的二抗，充分摇匀，4℃避光孵育30min。

(4)洗涤液洗涤3次，每次洗涤液加入1.5ml左右(1000rpm×5min)。

(5)加入600μL固定液。

(6)上机(型号为FACS calibur，美国BECTON DICKINSON公司)检测。

3.4.3.抗体诱导的补体介导的细胞溶解作用(CDC)

3.4.3.1.材料与试剂

(1)细胞与细胞培养

同上。

(2)抗体与补体

抗血清同上；Rituximab(0.01μg/μL)为阳性对照；补体来源为豚鼠(第四军医大学实验动物中心)。

(3)试剂

5mg/ml MTT二苯基四氮唑嗅盐(sigma)；PBS(0.01M，pH 7.4)；二甲基亚砜DMSO(上海化学试剂厂)。

3.4.3.1.方法与步骤

(1)3只豚鼠心脏取血，分离血清，混合后做为补体来源。

(2)无血清RPMI1640培养基调整Raji，Jurkat细胞浓度为1×10⁶cells/ml，50μL每管分装，分别再加入抗血清(KLH-P1)，对照抗血清(KLH)，rituximab各30μL。

(3)各管分别加入100μL豚鼠血清，37℃，CO₂孵箱，孵育1小时左右。

(4)离心(1000rpm×5min)，弃上清。

(5)各管分别加入1％小牛血清的RPMI1640培养基200μL，MTT溶液20μL，37℃，CO₂孵箱继续孵育4小时左右。

(6)离心(1000rpm×5min)后，弃去培养上清，每管加入150μL的DMSO，震荡10min，移入酶联板。

(7)波长490nm，酶标仪(美国Bio-Rad公司)读板。

3.5本发明的效果：

经实验证实本发明的效果如下：

1)利用FDA批准上市的单克隆抗体美罗华(Rituximab)为配体在噬菌体随机12呈现肽库成功筛选了出了美罗华所识别的人B细胞表面CD20分子的模拟表位：Gln AspLys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe IleHis；Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys。经噬菌体ELISA检测与美罗华单抗具有特异的亲和性(见图1)。经序列比对，与CD20分子不具有任何同源性。

2)经过化学合成和化学偶连构建了由模拟表位和蛋白载体KLH构成的蛋白疫苗，经过Dot Blot证实KLH-Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu(KLH-P1)与美罗华单抗具有良好的亲和性(见图2)。该多肽成功的模拟了天然CD20分子一级结构上不连续的氨基酸经过空间折叠而形成的表位结构。

3)以KLH-Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu免疫BALB/c小鼠，获得抗血清，经ELISA检测可以与GST融合表达的多肽Gln Asp Lys Leu Thr Gln TryPro Lys Try Leu Glu特异性结合，滴度可达到1∶10000(见图3)。

4)流式细胞仪检测结果显示：获得的抗血清能够与Raji细胞上天然表达的CD20分子结合(见图4)。补体杀伤实验显示(见图5)，该抗血清也能够诱导产生补体依赖的细胞溶解作用，产生与单克隆抗体Rituximab相似的活性。

综上所述，该表位的得到与蛋白疫苗能够应用于人体的CD20分子的自体疫苗，从而以主动免疫方式来替代或补充单抗被动免疫治疗，克服单抗治疗缺陷打下基础。

Claims (6)

1.人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位，其特征在于，以人鼠嵌合单克隆抗体Rituximab作为配体，在噬菌体随机呈现12肽库中筛选得到与人鼠嵌合单克隆抗体Rituximab高亲和力的三种CD20分子的模拟表位，其氨基酸序列分别为：

Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu；

His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His；

Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys。

2.如权利要求1所述的人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位，其特征在于，所述的三种CD20分子的模拟表位与CD20分子的蛋白序列及基因序列无任何同源性，与CD20分子单克隆抗体美罗华具有特异的亲和性。

3.实现权利要求1所述的人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位的筛选方法，其特征在于，按以下步骤完成：

1)噬菌体随机呈现12肽库的筛选

以0.1mol/L的NaHCO3，pH8.6，100μg/mL稀释的Rituximab，包被ELISA板孔，过夜后，将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；然后用1％牛血清白蛋白的TBS，50mM Tris-HCl，pH7.5，4℃孵育，封闭2h，再采用0.1％Tween 20的TBST洗涤6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；

加入200μl用TBST稀释的含2×10¹¹pfu的库噬菌体溶液，室温孵育1h；倾去液体，去除未结合的噬菌体，再用TBS+0.1％Tween20洗涤10次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽残余液体；用100μL洗脱液洗脱结合的噬菌体，其洗脱液配方为：0.2mol/L Glycine-HCl，pH2.2，10g/L BSA，并迅速加入配方为1mol/L Tris-HCl，pH9.1的中和液中和；取1μL测滴度，剩余液体加入20mL处于对数生长早期的R2738培养物中，其中大肠杆菌ER2738；20mg/L四环素的5mL LB培养基：胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L NaCl10g/L，于37℃剧烈振荡培养4.5h，得到扩增的噬菌体；

将扩增好的噬菌体和大肠杆菌的混合液倒入离心管，于4℃，10000rpm离心10min；上清转入新的离心管，再离心，取80％的离心上清转入新的离心管，加入1/6体积的PEG8000/NaCl，其配方为：PEG-8000200mg/mL，NaCl2.5M，4℃静置过夜；次日，4℃，10000rpm离心15min，倾去离心上清；再同法快速离心一次，吸尽残留上清；1mLTBS重悬沉淀，于4℃10000rpm离心5min，将残留的细胞沉淀下来；上清加入1/6体积的PEG/NaCl，冰浴1h，4℃，10000rpm离心15min，倾去上清，用200μL含0.01％NaN₃的TBS重悬沉淀，10000rpm离心1min；上清即为扩增好的洗脱液，1μL用于测滴度，余下的液体于4℃存放；

200μL Rituximab溶液新一孔，用于下一轮筛选，为了提高筛选肽的严谨性，第二轮和第三轮筛选中，Rituximab浓度分别降至50mg/L和20mg/L；第二轮和第三轮的筛选中，加入的第一轮和第二轮筛出的噬菌体应根据滴度计算相当于2×10¹¹pfu噬菌体的液体体积；将TBST中Tween20的浓度提高至0.5％；第三轮的洗脱产物不需进行扩增，取1μL进行滴度测定，剩余存放于4℃环境；

从滴度测定中，菌斑数＜100的平板上随机挑取50个分隔良好噬菌斑进行扩增和纯化，既用无菌牙签蘸取的50个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入对数中期培养的ER2738中，37℃剧烈振荡培养4.5h后，瞬间离心30s。新的离心管，同法再离心一次，取80％的上清，即得扩增的噬菌体液体；

2)特异性噬菌体筛选

以100mg/L的NaHCO₃pH8.6，包被96孔酶联板，同时对每个孔设立1％BSA对照孔，同型的IgG1对照孔，4℃孵育过夜；倾去包被液，加入5mg/L BSA，0.1mol/LNaHCO3，pH8.6的封闭液，4℃封闭2h，以步骤1)中的TBST洗6次，每次均要除尽残余液体；将50个纯化的1×10⁹/孔噬菌体分别加入NaHCO₃pH8.6中，BSA和同型抗体IgG1包被孔中室温孵育2h。TBST洗6次，每孔加入HRP标记的小鼠抗M13噬菌体mAb100μL，其比例1∶5000，室温孵育1h；TBST洗6次，2，2-连氮-双3-乙基苯并噻唑啉磺酸显色后测定A410nm处的吸光值；

3)噬菌体呈现肽的序列测定

根据ELISA结果，筛选出20个与rituximab有较高亲和力而与其他对照亲和力低的克隆进行序列测定；噬菌体克隆的扩增同前，取噬菌体培养上清；常规提取噬菌体单链DNA，以单链DNA为模板，采用噬菌体随机肽库试剂盒中所提供的测序引物，引物序列为5′-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3′，在ABI310DNA自动测序仪上进行自动测序，根据DNA测序结果，推导出噬菌体所呈现随机肽的氨基酸序列，比较不同克隆之间氨基酸序列的同源性，即可得到筛选的三种模拟表位，其氨基酸序列分别为：

Gln Asp Lys Leu Thr Gln Try Pro Lys Try Leu Glu；

His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His；

Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys。

4.实现权利要求1所述的人B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位构建多肽表位疫苗的方法，其特征在于，将权利要求1的三种模拟表位：Gln Asp Lys Leu ThrGln Try Pro Lys Try Leu Glu；His Glu Glu Asn Asp Leu Arg Try Try Phe Ile His；Asn Met Ser Ile Gln Try His Arg Asp Phe Asn Lys，进行化学合成，采用戊二醛法进行合成多肽表位与蛋白载体KLH的化学偶连；将KLH以0.1M PBS，pH7.5配制成1mg/ml溶液，取5ml该溶液，以40合成多肽表位：1蛋白的摩尔比的比例加入合成多肽，冷却至2～6℃，逐滴加入5ml 2％的戊二醛至多肽蛋白混合物，2～6℃不断搅拌1小时，pH为7.5的PBS或生理盐水透析，4℃过夜，得到约10ml多肽蛋白溶液，分装，-70℃冻存，其偶连物的浓度为0.5mg/ml；经DOT Blot确定偶连效果及其抗体鉴定，即为B细胞特异性膜分子CD20的12氨基酸模拟表位构建的多肽表位疫苗。

5.如权利要求4所述的构建多肽表位疫苗的方法，其特征在于，所述的模拟表位构建的表位多肽疫苗能够在小鼠体内诱导出针对该表位的抗血清；该抗血清亦能够识别CD20⁺细胞天然表达的CD20分子；能够有效杀伤CD20⁺细胞。

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