CN104391114A - Elisa方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗cd20单克隆抗体浓度 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体浓度。具体而言，本发明提供测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，所述方法使用抗CD20单克隆抗体的F(ab′)2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用IgG-F(ab′)2抗体作为检测抗体。本发明的方法具有良好的特异性、反复冻融稳定性、长期冻存稳定性等优点。

Description

ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体浓度
技术领域
本发明涉及定量测定血清中单克隆抗体药物浓度的方法。本发明的方法采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法对血清中抗CD20单克隆抗体浓度进行分析，具有良好的灵敏度和特异性等优点。
背景技术
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是最常见的淋巴组织恶性肿瘤，其死亡率在我国居恶性肿瘤中的第十位。NHL的传统治疗方案是以化疗为主，局部放疗、手术治疗为辅的综合治疗。迄今为止，传统细胞毒化疗药物进一步提高恶性淋巴瘤临床疗效的空间十分有限，单克隆抗体已经成为对经过选择的NHL患者较为成功的一种治疗方法。治疗B细胞性NHL最常用的抗体靶目标包括CD20、CD22等。
CD20抗原位于前B和成熟B淋巴细胞的表面，而造血干细胞、正常浆细胞或其它正常组织不表达CD20。95％以上的B细胞型非霍奇金淋巴瘤瘤细胞表达CD20。重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体与B细胞表面的CD20抗原特异性结合后，启动介导B细胞溶解的免疫反应，作用机制包括补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、生长抑制作用等[1-2]。因此，CD20抗原是靶向治疗非霍奇金淋巴瘤的有效靶点。国外同类品种利妥昔单抗注射液(英文名称：Rituximab Injection；商品名称：利妥昔单抗(商品名：美罗华))由IDEC/Genentech公司开发，于1997年11月获美国FDA批准用于NHL治疗，1998年欧盟也批准该药上市。利妥昔单抗注射液于2000年3月在我国获得进口许可。利妥昔单抗注射液上市规格为500mg/50ml、100mg/10ml，临床治疗NHL使用推荐剂量为375mg/m2BSA(体表面积)。
神州细胞工程有限公司研制的重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体SCT400是一种人鼠嵌合IgG1型抗CD20单克隆抗体，能特异性地与跨膜抗原CD20结合，临床上拟单用或与化药联合治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)。SCT400抗原结合位点和抗体可变区氨基酸序列与利妥昔单抗完全相同，恒定区与利妥昔单抗在重链CH1区域仅有一个氨基酸差异(V219A)已经开展了针对SCT400和利妥昔单抗在质量、临床前药效、安全性评价等方面的比较研究工作。研究结果证明二者的理化特性、生物活性、体内外药效和药代动力学特征基本一致；临床前安全性评价结果也证实二者具有高度相似和可比性。基于以上临床前数据和临床研究，在中国医学科学院肿瘤医院和307医院展开了多中心、开放I期临床药代动力学试验。
目前目前已经由多篇文献报道应用ELISA的方法检测人血清中利妥昔单抗的浓度[Maloney et al，1994；Berinstein et al，1998；Tobinai et al，1998；Iacona et al，2000，Buem et al，2004；Cragg et al，2004；Hampson et al，2010]。但文献报道的多克隆抗体，如纯化的多克隆羊抗IDEC C2B8抗体血清、羊抗人IgG结合辣根过氧化氢酶、商品化的兔抗鼠IgG或者是过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG被用于一系列利妥昔单抗的临床研究中，但是在这些临床研究中样本检测前需要稀释1/20000倍以上因为缺少特异性，且与正常人IgG有交叉反应。因为这个原因，Cragg提出了使用特异的mAb MB2A4直接检测利妥昔单抗的浓度，这种分析方法呈现出高的特异性，但是需要进行高通量筛选、费用昂贵因此很难被广泛运用。并且这种抗独特性抗体只能检测游离的利妥昔单抗的浓度不能检测循环的CD20-利妥昔单抗的混合浓度。
参考文献
Anderson KC，Bates MP，Slaughenhoupt BL，Pinkus GS，Schlossman SF，Nadler LM.1984.Expression of human B cell associated antigens onleukemias and lymphomas：A model of human B cell differentiation.Blood；63：1424-33.
Berinstein，N.L.，Grillo-Lopez，A.J.，White，C.A.，Bence-Bruckler，I.，Maloney，D.，Czuczman，M.，Green，D.，Rosenberg，J.，McLaughlin，P.，Shen，D.，1998.
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McLaughlin P，Grillo-López A J，Link BK，Levy R，Czuczman MS，Williams ME，Heyman MR，Bence-Bruckler I，White CA，Cabanillas F，Jain V，Ho AD，Lister J，Wey K，Shen D，Dallaire BK.1998.Rituximab ChimericAnti-CD20Monoclonal Antibody Therapy for Relapsed Indolent Lymphoma：Half of Patients Respond to a Four-Dose Treatment Program；J Clin Oncol.16：2825-33.
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Manches，O.，Lui，G.，Chaperot，L.，Gressin，R.，Molens，J.P.，.Jacob MC，Sotto JJ，Leroux D，Bensa JC，Plumas J.2003.In vitro mechanisms of action ofrituximab on primary non-Hodgkin lymphomas.Blood，101：949-954.
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发明内容
为了准确的检测血清药物浓度的变化，更好的分析抗CD20抗体的药代动力学特征，本文提供了新的定量测定血清中抗CD20单克隆抗体(尤其是SCT400)浓度的ELISA方法。
在一些实施方案中，令人吃惊地发现所述方法不需要高倍稀释，检测抗CD20单克隆抗体具备高特异性。在一些实施方案中，所述方法不与正常人IgG产生交叉反应。在一些实施方案中，所述方法避免了使用单克隆抗体如mAb MB2A4检测所必需的高通量筛选、费用昂贵和难以广泛运用等缺陷。
因此，本申请提供了测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法，所述测定法使用抗CD20单克隆抗体的F(ab′)2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用IgG-F(ab′)2抗体作为检测抗体。
在一些实施方案中，所述多克隆抗体如下获得：使用胃蛋白酶消化抗CD20单克隆抗体，去除Fc片段(例如可通过亲和层析柱去除混合液中的Fc片段)，收集F(ab′)2片段，优选对所述F(ab′)2片段进行纯化(例如可通过超滤和采用层析柱进行纯化)，然后用于免疫动物。
在一些实施方案中，所述免疫动物为兔。
在一些实施方案中，在检测前对血清样品进行稀释的步骤。在一些实施方案中，所述方法不需要高倍稀释，检测抗CD20单克隆抗体具备高特异性，例如，对样品的稀释可低于20000倍，例如18000倍以下，17000倍以下，16000倍以下，15000倍以下，14000倍以下，13000倍以下，12000倍以下，11000倍以下，10000倍以下，9000倍以下，8000倍以下，7000倍以下，6000倍以下，5000倍以下，4000倍以下，3000倍以下，2000倍以下，1800倍以下，1700倍以下，1600倍以下，1500倍以下，1400倍以下，1300倍以下，1250倍以下，1200倍以下，1180倍以下，1150倍以下，1120倍以下，1100倍以下，1080倍以下，1050倍以下，1020倍以下，或1000倍以下；所述稀释倍数可以在200倍以上，300倍以上，400倍以上，500倍以上，600倍以上，700倍以上，800倍以上，850倍以上，900倍以上，950倍以上，980倍以上，或1000倍以上。在一些实施方案中，血清样品的稀释范围可在上述范围内任意选择。
在一些实施方案中，所述血清包括人血清。
在一些实施方案中，所述抗CD20单克隆抗体包括SCT400和利妥昔单抗，优选单克隆抗体SCT400。
在一些实施方案中，所述IgG-F(ab′)2抗体包括兔抗鼠IgG-F(ab′)2抗体。在一些实施方案中，IgG-F(ab′)2抗体可以进行标记，优选所述IgG-F(ab′)2抗体是HRP标记的抗体。
在一些实施方案中，所述测定法为定量测定法。
在一些实施方案中，所述测定法的灵敏度可达0.78ng/mL。
在一些实施方案中，所述测定法的线性范围在1.56ng/ml～50ng/ml范围内。
在一些实施方案中，在0.1％空白血清检测时，非相关人、鼠、嵌合IgG对检测结果无影响。
因此，在一些实施方案中，本申请提供的测定法检测抗CD20单克隆抗体具备高特异性。在一些实施方案中，本申请提供的测定法不与正常人IgG产生交叉反应。在一些实施方案中，本申请提供的测定法避免了使用单克隆抗体如mAb MB2A4检测所必需的高通量筛选、费用昂贵和难以广泛运用等缺陷。
附图说明
图1：血清中SCT400药物浓度测定典型标准曲线(0.39～50ng/ml)。
图2：1-01受试者(250mg/m2)给药后时间血清中SCT400随时间变化的药物浓度-时间曲线。
具体实施方式
为了更加清楚的对本发明进行说明，以下通过具体实施实例对本发明的具体实施方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所属技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。
1.抗体筛选：
1.1兔抗SCT400-F(ab′)2多抗的生产与纯化：将500μg胃蛋白酶(sigma-aldrich，USA)用20mM醋酸钠缓冲液稀释好后，加入到50mgSCT400中，37℃孵育过夜，加入2M Tris-HCl缓冲液进行终止。使用蛋白G亲和层析柱去除混合液中的Fc片段，收集含有F(ab′)2片段的溶液，进行超滤(30KDa孔径，Miilipore，USA)。之后采用SEC-葡聚糖凝胶200层析柱将SCT400F(ab′)2片段进一步纯化。
纯化后的SCT400F(ab′)2片段皮下注射入新西兰大白兔进行免疫，从而产生抗-SCT400F(ab′)2抗体。收集兔血清，用蛋白G亲和层析柱进行纯化后，进行抗原亲和层析。为了减少兔抗体与人免疫球蛋白的交叉反应，采用正常人血清来源的人免疫球蛋白偶联的亲和层析柱进行纯化。经SDS-PAGE检测兔抗体纯度后，OD280测定蛋白质含量。
1.2HRP标记的兔抗鼠IgG-F(ab′)2片段：HRP标记的兔抗鼠IgG-F(ab′)2片段购自Jackson Immuno Research，该试剂与人IgG抗体交叉反应较低。
1.3流式细胞术：采用流式细胞术检测SCT400及利妥昔单抗与细胞表面的CD20抗原结合是否具有差异。制备3管Daudi细胞，每管含有1×106个细胞，一管加入1μg SCT400，一管加入1μg利妥昔单抗，剩余一管加入PBS作为阴性对照。4℃孵育20分钟，用1mL含有0.5％BSA的PBS洗涤细胞，800rpm离心5分钟。之后采用FITC标记的鼠抗人IgG Fc二抗(义翘神州生物技术有限公司提供)在4℃孵育20分钟。洗涤三次后，加入500μL 0.5％BSA-PBS重悬细胞，采用BD FACS Calibur流式细胞仪进行分析。
2.方法验证与结果
2.1.药品与试剂：标准品：SCT400，由神州细胞工程有限公司提供。规格：50mg(5ml)/瓶，批号：20120301。包被液(pH 9.6碳酸盐缓冲液)；磷酸盐缓冲液(pH7.4)；洗涤液(磷酸盐缓冲液-0.05％Tween 20，pH7.4)；封闭液(含2％牛血清白蛋白的洗涤液)；二抗稀释液(0.5％牛血清白蛋白-PBS-Tween 20，pH7.4)；样品稀释液(0.1％牛血清白蛋白-PBS-Tween20，pH 7.4)；0.1％人混合血清稀释液；显色液；终止液(2M硫酸)；包被抗体：即兔抗SCT400-F(ab′)2多抗(0.14mg/m2，批号：PH05SE0501)；检测抗体：即辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG-F(ab′)2(0.5mg/ml，批号：96850)。
2.2设备与耗材：酶标仪：型号Multiskan GO，Thermo公司产品；涡旋混匀器：型号QL-901，海门其林贝尔仪器制造有限公司产品；Eppendorf单道、12道移液器；高吸附96孔酶标板：Nunc公司产品等。
2.3ELISA测定操作步骤：用包被液稀释兔抗SCT400-F(ab′)2多抗至750ng/ml，以100μl/孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜。洗涤液300ul/孔，洗板3次。用含保护剂的封闭液以300μl/孔加至板内，室温放置1小时。干燥及真空包装：室温4小时后，于吸水纸上拍干酶标板，之后将酶标板正向置于通风橱中干燥1小时。取出后用铝箔袋真空包装(每袋一板，加一袋干燥剂)。置4℃保存。将预包板从4℃取出后，300ul/孔，洗板3次。将空白对照、标准品、质控样品及稀释好的待检样品均以100μl/孔加至板内，室温放置2小时。洗板5次，每次都需要在滤纸上拍干。再用二抗稀释液将HRP标记的兔抗鼠IgG-F(ab′)2抗体稀释4000倍，以100μl/孔加至板内，室温放置1小时。洗板5次，每次都需要在滤纸上拍干。以100μl/孔加入临时配制的显色液，室温放置20min。以50μl/孔加入终止液终止反应。混匀后立即将酶标板放入酶标仪中，选择450nm为测定波长测定吸光度。
2.4方法学验证
参照FDA及CFDA生物样本检测指导原则，方法学验证包括方法的灵敏度、特异性、标准曲线与线性范围、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、基质效应、稀释效应、方法学质控等方面。
2.4.1标准曲线、线性范围、质控样品和定量下限
标准曲线是采用含0.1％空白人血清的样品稀释液稀释SCT400标准品，配制不同浓度的SCT400，使标准曲线各浓度点的终浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56ng/ml，LLOQ为1.56ng/ml，ULOQ为50ng/ml标准曲线外带一个0ng/ml的浓度点，用于标准曲线的本底扣除参比值。QC高、中、低浓度分别为：40、12.5和3.125ng/ml。
以0.1％血清中配置的SCT400的梯度浓度(取log)为横坐标，浓度对应的O.D值为纵坐标，采用四参数方法Y＝X0*((A1-A2)/(X-A2)-1)∧(1/P)进行回归计算，所得回归方程即为标准曲线。定量下限是标准曲线上的最低浓度点。标准曲线上的低浓度点误差值不得超过20％，中、高浓度点的误差值不超过15％，且至少75％的浓度点在合格范围内。
典型的标准曲线图如图1所示。
2.4.2分析方法的准确度和精密度
取0.1％空白人血清的样品稀释液稀释，制备高、中、低三个浓度点的QC样品40，12.5和3.125ng/ml，每个浓度平行五个样品测定，依法与标准曲线同批测定，以同批的标准曲线计算QC样品浓度。连续进行三批试验，根据QC样品的结果，求算批内及批间的精密度和准确度。结合三批试验数据进行方法准确度与精密度的计算。精密度要求高、中浓度点的批内和批间相对标准偏差(RSD％)不超过15％，低浓度点的批内和批间相对标准偏差(RSD％)不超过20％。高、中浓度点准确度(RE％)的均值应在理论值的±15％以内，低浓度点的均值在±20％以内。结果见表1。
表1、检测0.1％血清样品中SCT400分析方法准确度和精密度
2.4.3分析方法的定量下限
取含0.1％空白人血清的样品稀释液稀释制备浓度为1.56ng/ml定量下限的样品，平行五个样品测定，依法与标准曲线同批测定，以当批的标准曲线计算此样品的浓度。根据样品的结果，求算低定量下限的精密度和准确度。连续三批实验，结合三批实验数据进行定量下限的准确度与精密度的计算。精密度要求此浓度点的批内和批间相对标准偏差(RSD％)不得超过20％，准确度的均值在±20％以内。结果见表2。
表2、检测0.1％血清样品中SCT400分析方法LLOQ的准确度和精密度
结论：本法用于测定SCT400的分析方法准确性好精密度高，定量下限稳定，符合生物样品测定要求。
2.4.4稀释效应
考察SCT400浓度为：500ug/ml、50ug/ml、5ug/ml血清样品，分别稀释100000倍、10000倍、1000倍，再次测定浓度，将测定浓度与稀释后的理论浓度进行比较。考察稀释对测定结果是否有影响，并确定稀释因子的范围。结果见表3。
表3、检测0.1％血清样品中SCT400分析方法稀释因子测定
2.4.5稳定性
分别用血清制备浓度为40000、12500、3125ng/ml的血清样品，分别于-20℃放置11个月，在室温环境下放置12h，反复冻融二次和反复冻融五次后分别进行药物浓度测定，测定时分别用稀释液进行1000倍稀释得到终浓度分别为40、12.5和3.125ng/ml的0.1％血清样品。考察血清样品在不同储存条件下的稳定情况。结果见下表4。
表4、血清样品稳定性
2.4.6基质效应
考察10份健康人的空白血清，分别稀释1000倍数后，看其与混合血清所配置标曲的空白孔读数间的差异。结果见表5。
表5、10份健康人0.1％空白血清OD值
序号 OD-1 OD-2 OD-3 Mean
1 0.150 0.151 0.160 0.154
2 0.149 0.152 0.152 0.151
3 0.148 0.153 0.156 0.152
4 0.148 0.152 0.157 0.152
5 0.153 0.156 0.152 0.154
6 0.154 0.155 0.157 0.155
7 0.156 0.164 0.152 0.157
8 0.156 0.162 0.158 0.159
9 0.154 0.161 0.159 0.158
10 0.144 0.157 0.150 0.150
混合血清 0.152 0.159 0.157 0.156
3.药代动力学应用
选择至少接受过一次标准抗肿瘤治疗的CD20阳性B细胞NHL患者，开展SCT400剂量递增、每周1次、连续给药4周方案。分别在首次给药于输注前、输注开始后第1h、第3h、第6h(如适用)、输注结束后即刻、输注结束后2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h；第2、3周期给药于输注前、静滴停止后即刻、输注结束后120h；第4周期给药于输注前、输注开始后第1h、第3h、第6h(如适用)、输注结束后即刻、输注结束后2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、14d、21d、28d、56d、84d、168d，于静脉采集全血，并分离血清，离心，保存于-20℃，备测。。单次给药和多次给药的药代动力学参数由软件WinNolin 6.3以非房室模型计算获得，图2显示了该受试者静脉滴注SCT400的药时曲线。
4、讨论
为了研究重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体在中国NHL患者中I期临床药代动力学特征，我们研发、验证和运用了一种新型的ELISA法检测血清中SCT400的浓度。该分析方法有很好的特异度，能准确的定量血清中SCT400的浓度。
在抗体选择方面，我们使用了抗SCT400独特性抗体捕获药物。它通过免疫兔子得到纯化的SCT400F(ab′)2不包含Fc段。该步骤确保了识别人血清中药物的特异性。然后我们使用了HRP标记的兔抗鼠IgG，F(ab)′2的抗体作为二抗在很大程度上减少了人血清中蛋白的干扰，保证了分析方法的特异性。同时我们检测了该中方法的特异性显示0.1％空白血清检测不同浓度非相关人、鼠、嵌合IgG对检测结果无影响。这些结果显示我们的方法比文献已经报道的方法拥有了更好的特异度(Maloney et al，1994；Berinstein et al，1998；Tobinai et al，1998；Iacona et al，2000)。
在样本稀释方面，该方法在样本检测前需要1/1000倍后进行检测，而以往的文献中报道的样本需要稀释1/20000倍以上。显示了我们的方法特异度要优于文献报道的方法。
根据利妥昔单抗受试者数据，375mg/m2剂量组第一周期给药后Cmax达205.6μg/mL(McLaughlin P et al，1998).因此我们确定了1.56-50ng/mL的线性范围，结果表明在该范围内线性较好。r2均大于0.995。
综述所述，SCT400在1.56ng/ml～50ng/ml范围内线性关系良好；日内、日间精密度(RSD)均小于10.0％。本研究方法的特异性、反复冻融稳定性、长期冻存稳定性和稀释效应均进行了验证，均符合生物样品的测定要求。该方法已经成功应用于一位给予SCT400患者的血药浓度检测。

Claims (10)

1.测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法，所述测定法使用抗CD20单克隆抗体的F(ab′)2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用IgG-F(ab′)2抗体作为检测抗体。
2.权利要求1所述的测定法，其中所述多克隆抗体如下获得：使用胃蛋白酶消化抗CD20单克隆抗体，去除Fc片段，收集F(ab′)2片段，优选对所述F(ab′)2片段进行纯化，然后用于免疫动物，优选兔。
3.权利要求1-2任一项所述的测定法，其中包括在检测前对血清样品进行稀释的步骤，优选稀释低于20000倍，例如稀释200至18000倍，300至15000倍，400至12000倍，500至10000倍，600至8000倍，700至6000倍，800至3000倍，900至2000倍，950至1500倍，980至1200倍等。
4.权利要求1-3任一项所述的测定法，其中所述血清包括人血清。
5.权利要求1-4任一项所述的测定法，其中所述抗CD20单克隆抗体包括SCT400和利妥昔单抗，优选SCT400。
6.权利要求1-5任一项所述的测定法，其中所述IgG-F(ab′)2抗体包括兔抗鼠IgG-F(ab′)2抗体，优选所述IgG-F(ab′)2抗体是HRP标记的抗体。
7.权利要求1-6任一项所述的测定法，其中所述测定法为定量测定法。
8.权利要求1-7任一项所述的测定法，其中所述测定法的灵敏度达0.78ng/mL。
9.权利要求1-8任一项所述的测定法，其中所述测定法的线性范围在1.56ng/ml～50ng/ml范围内。
10.权利要求1-9任一项所述的测定法，其中在0.1％空白血清检测时，非相关人、鼠、嵌合IgG对检测结果无影响。
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