TWI788564B

TWI788564B - 包含抗ｐｃｓｋ９抗體的製劑及其用途

Info

Publication number: TWI788564B
Application number: TW108116232A
Authority: TW
Inventors: 汪音爵; 劉曉林; 謝瑞霞
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-05-10
Publication date: 2023-01-01
Also published as: JP7419262B2; AU2019265409B2; JP2021524839A; EP3791895A1; EP3791895A4; EP3791895B1; US20220062416A1; CA3099074A1; TW201946659A; WO2019214707A1; CN110464842A; CN110464842B; AU2019265409A1

Abstract

本發明涉及包含抗PCSK9抗體的製劑及其用途，尤其涉及包含特異性結合前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型9(PCSK9)的抗體和/或抗體片段、緩衝劑、減黏劑和表面活性劑的藥物製劑。本發明還涉及抗PCSK9抗體。此外，本發明涉及這些製劑或抗體的治療和診斷用途。

Description

包含抗PCSK9抗體的製劑及其用途

本發明涉及抗體製劑領域，尤其涉及包含特異性結合前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9)(PCSK9)的抗體(下稱抗PCSK9抗體)和/或其抗體片段的藥物製劑。此外，本發明涉及這些製劑的治療和診斷用途。

血清膽固醇水平升高是導致心血管事件的重要危險因子，目前已有多種作用機制的降低膽固醇的藥物上市或在研，其中抗PCSK-9的單株抗體因具備良好的安全性和療效，受到廣泛的關注(趙水平等，中國成人血脂異常防治指南(2016年修訂版).中國循環雜誌31(10)：937-953,2016)。

單株抗體藥物因作用特異性強，不良反應小等優勢已成為許多疾病領域藥物的發展主流，藉由減少LDLR內吞來降低LDL-C的抗PCSK-9單株抗體藥物是目前的研究熱點。抗PCSK-9單抗具有顯著的降低LDL-C的效果，且安全性良好、用藥方便，是降脂治療領域的重大突破性藥物。

現在仍然存在替代PCSK9抗體的需求。具體而言，存在與PCSK9具有高親和力、細胞株來源可靠，穩定性好並能以高效能降低LDL-C的替代PCSK9抗體的需求。還更具體的是，存在以高效能降低LDL-C並提供持久的起效持續時間(例如，持久的LDL-C水平的抑制)的替代PCSK9抗體的需求。此類抗體將還較佳具有利於開發、製造或配製的良好的物理化學特性。

目前大多數上市的單株抗體藥物為靜脈注射，但是，對於一些慢性疾病，病人希望可以在家中自行用藥，因此皮下注射便成為了首選的注射方式。由於皮下注射體積一般限制在1.0~1.5ml，因此需要抗體製劑達到高濃度(

100mg/ml)以滿足臨床用藥劑量要求。但是，黏度高也是高濃度抗體製劑的一大挑戰。因為，高黏度製劑會給下游工藝和藥物藉由注射器皮下給藥帶來很大困難。蛋白在高濃度下往往穩定性較差，容易產生聚集體和顆粒，且蛋白構象的不穩定也會引起化學穩定性，如電荷異質性的顯著變化。

另外，單株抗體為生物大分子，其結構非常複雜。在生產過程中，表達的抗體分子會發生各種翻譯後修飾和降解反應，如N末端環化，糖基化，脫醯胺，異構化，氧化，片段化，二硫鍵錯配等等。這些質量屬性可能會對最終產品安全性和有效性產生影響，因此，控制產品質量的正確性和一致性也非常重要。

本領域中有提供低黏度、穩定、高濃度的抗PCSK-9抗體液體製劑的需要。

PCSK9呈現為重要和有利的治療靶標。本發明還提供了包含抗PCSK9抗體或其片段(例如本文所定義的抗PCSK9抗體)的液體抗體製劑。本發明還提供了針對PCSK9的抗體。

一、本發明的抗體製劑

一方面，本發明提供一種液體抗體製劑，其包含(i)抗PCSK-9抗體或其片段(例如抗原結合片段)；(ii)緩衝劑；(iii)減黏劑；和(iv)表面活性劑。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約50至約200mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約100mg/mL至約200mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約100mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約125mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約150mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約175mg/mL。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其片段的濃度為約200mg/mL。

在一個實施方案中，所述抗PCSK9抗體為任何結合PCSK9蛋白(例如人PCSK9)的抗體，例如多株抗體、單株抗體或者兩者的組合。較佳地，在一個實施方案中，所述抗PCSK9抗體為單株抗體。在一個實施方案中，所述抗PCSK9抗體或其片段為本文中定義的抗PCSK9抗體或其片段。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.01-50mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.1-50mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.2-10mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約0.5-2.5mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約1.0-2.0mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約1.5mg/ml。

在一個實施方案中，所述緩衝劑選自組胺酸、麩胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷。在一個實施方案中，所述緩衝劑為組胺酸。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的減黏劑的濃度為約10mmol/L-1000mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的減黏劑的濃度為約20mmol/L-500mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的減黏劑的濃度為約50mmol/L-300mmol/L。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的減黏劑的濃度為約50mmol/L-200mmol/L。

在一個實施方案中，所述減黏劑選自：糖醇(例如山梨醇)、精胺酸、精胺酸鹽酸鹽、硫氰酸鈉、硫氰酸銨、硫酸銨、氯化銨、氯化鈣、氯化鋅、乙酸鈉和其組合。在一個實施方案中，所述減黏劑是山梨醇。在一個實施方案中，所述減黏劑是山梨醇，其濃度為約1%-6%(w/v)。在一個實施方案中，所述減黏劑是山梨醇，其濃度為約1%-6%(w/v)，並且所述液體製劑不包含其它減黏劑。在一個實施方案中，所述減黏劑是山梨醇與精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合。在一個實施方案中，所述減黏劑是山梨醇與精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合，其中山梨醇的濃度為約1%-6%(w/v)，較佳約2%-4%(w/v)，更佳約3%(w/v)，其中精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)的濃度為約50mmol/L~180mmol/L，較佳約70mmol/L~150mmol/L，更佳約90mmol/L。在一個實施方案中，所述減黏劑是山梨醇與精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合，其中山梨醇的濃度為約1%-6%(w/v)，較佳約2%-4%(w/v)，更佳約3%(w/v)，其中精胺酸或精胺酸鹽的濃度為約50mmol/L~180mmol/L，較佳約70mmol/L~150mmol/L，更佳約90mmol/L，並且所述液體製劑不包含其它減黏劑。

在一個實施方案中，所述表面活性劑的濃度為約0.01-5mg/ml。在一個實施方案中，所述表面活性劑的濃度為約0.05-1mg/ml。在一個實施方案中，所述表面活性劑的濃度為約0.1-0.5mg/ml。在一個實施方案中，所述表面活性劑的濃度為約0.3mg/ml。

在一個實施方案中，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。在一個實施方案中，所述表面活性劑例如是普洛尼克(pluronics)、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、或聚山梨醇酯-20等。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑包含溶媒，較佳地所述溶媒選自注射用水、注射用有機溶劑包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

在一個實施方案中，所述液體製劑的pH值為約5.0~6.0。在一個實施方案中，所述液體製劑的pH值為約5.2-5.8。在一個實施方案中，所述液體製劑的pH值為約5.4-5.6。在一個實施方案中，所述液體製劑的pH值為約5.5。

在一個實施方案中，所述液體製劑在25℃的黏度為約1.0厘泊-20厘泊。在一個實施方案中，所述液體製劑在25℃的黏度為約1.0厘泊-10厘泊。在一個實施方案中，所述液體製劑在25℃的黏度為約1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0厘泊。在一個實施方案中，所述液體製劑在25℃的黏度為約5.0厘泊-7.0厘泊。在一個實施方案中，所述液體製劑在25℃的黏度為約5.2厘泊。在一個實施方案中，所述液體製劑在25℃的黏度為約6.0厘泊。

在一個實施方案中，所述液體製劑為藥物製劑，較佳為注射劑，更佳為皮下注射劑。

在一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含(i)約100mg/mL至約200mg/mL的抗PCSK-9抗體或其片段；(ii)約0.2-10mg/ml組胺酸；(iii)約1%-6%(w/v)山梨醇；和(iv)約0.05-1mg/ml聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20；其中所述液體製劑的pH為約5.0~6.0。

在一個更佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑還包含注射用水。

在一個較佳實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含(i)約100mg/mL至約200mg/mL的抗PCSK-9抗體或其片段；(ii)約0.2-10mg/ml組胺酸；(iii)約1%-6%山梨醇和約50mmol/L~180mmol/L精胺酸或精胺酸鹽；和 (iv)約0.05-1mg/ml聚山梨醇酯-80或聚山梨醇酯-20；其中所述液體製劑的pH為約5.0~6.0。

在一個實施方案中，本發明的包含抗PCSK9抗體的液體製劑在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約42℃或約45℃的條件下儲存至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間後，用SEC-HPLC法檢測，抗PCSK-9抗體或其片段的純度下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。

在一個實施方案中，本發明的包含抗PCSK9抗體的液體製劑在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約42℃或約45℃的條件下儲存至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間後，用非還原型CE-SDS法檢測，抗PCSK-9抗體或其片段的純度下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。

在一個實施方案中，本發明的包含抗PCSK9抗體的液體製劑在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5 ℃、約25℃、約35℃、約37℃、約42℃或約45℃的條件下儲存至少14天、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間後，用CEX-HPLC法檢測，抗PCSK-9抗體或其片段的電荷異質性變化不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%。

本發明的製劑具有高的抗體濃度，同時其具有適合給藥尤其皮下給藥的低黏度，具有高的物理和化學穩定性，存放時不易產生聚集體和顆粒並且較不易發生電荷異質性變化。這些優點對於生產完全、有效、高一致性的臨床藥品是十分有益的。

本發明人驚奇地發現山梨醇可作為抗PCSK9抗體的液體製劑的減黏劑，在無需加入其它減黏劑的情況下，即可獲得低黏度、高濃度抗PCSK-9抗體或其片段液體製劑，並且所述液體製劑具有高的穩定性。另外，本發明人驚奇地發現山梨醇和精胺酸的組合作為減黏劑能夠更好地降低抗PCSK9抗體的液體製劑的黏度，並且使得能夠使高濃度抗PCSK-9抗體或其片段液體製劑具有更低的便於皮下注射的黏度，並且所述PCSK-9抗體液體製劑具有提高的穩定性(見實施例10-12)。

因此，另一方面，本發明提供了糖醇用作包含抗PCSK9抗體的液體製劑的減黏劑的用途。

在一個實施方案中，所述糖醇在抗PCSK9抗體的液體製劑中的濃度為約1%-6%(w/v)，較佳約2%-4%(w/v)，更佳約3%(w/v)。在一個實施方案中，所述糖醇較佳為山梨醇。

另一方面，本發明提供了糖醇作為減黏劑在製備包含抗PCSK9抗體的液體製劑中的用途。

在一個實施方案中，本發明提供了糖醇作為僅有的減黏劑在製備包含抗PCSK9抗體的液體製劑中的用途。

另一方面，本發明提供了糖醇和精胺酸(或精胺酸鹽，較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合用作包含抗PCSK9抗體的液體製劑的減黏劑的用途。

在一個實施方案中，所述糖醇在抗PCSK9抗體的液體製劑中的濃度為約1%-6%(w/v)，較佳約2%-4%(w/v)，更佳約3%(w/v)，精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)的濃度為約50mmol/L~180mmol/L，較佳約70mmol/L~150mmol/L，更佳約90mmol/L。在一個實施方案中，所述糖醇較佳為山梨醇。

另一方面，本發明提供了糖醇和精胺酸(或精胺酸鹽，較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合作為減黏劑在製備包含抗PCSK9抗體的液體製劑中的用途。

在一個實施方案中，本發明提供了糖醇和精胺酸(或精胺酸鹽，較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合作為僅有的減黏劑在製備包含抗PCSK9抗體的液體製劑中的用途。

另一方面，本發明提供了由上面所述液體製劑凍幹而獲得的固體製劑。可在使用前，將該固體製劑重構於適當的溶媒中，形成本發明的液體製劑。

另一方面，本發明提供根據本發明的液體製劑的製備方法，其包括以下步驟：a.提供抗PCSK-9抗體或其片段；b.加入緩衝劑和減黏劑；c.加入表面活性劑；d.視需要地無菌過濾，得到本發明的液體製劑。

在一個實施方案中，步驟a.中的抗PCSK-9抗體或其片段是經過分離純化的抗PCSK9抗體。

在一個實施方案中，步驟a.中的抗PCSK-9抗體或其片段以溶液較佳水溶液形式提供。

在一個實施方案中，在步驟b.之前使用超濾離心管(截流分子量例如為約30KD)離心濃縮抗PCSK-9抗體或其片段。

在一個實施方案中，步驟b.的緩衝劑和減黏劑以溶液較佳水溶液形式提供。

在一個實施方案中，在步驟b.後，超濾離心濃縮並再用緩衝劑和減黏劑溶液較佳水溶液稀釋，如此反復，直到置換完全。

在一個實施方案中，在步驟c.前，調整PCSK-9抗體或其片段的濃度。

所述抗PCSK-9抗體或其片段、緩衝劑、減黏劑和表面活性劑如文中所述，其用量和/或濃度如對本發明液體製劑所述或可由其適當地確定。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑的製備方法包括以下步驟：i.提供分離純化的抗PCSK9抗體，並視需要地將其加入到截流分子量為約30KD的超濾離心管中，離心濃縮；ii.加入緩衝劑和減黏劑溶液較佳水溶液(較佳地，緩衝劑和減黏劑的種類、濃度和溶液的pH如上面和定義部分對本發明的液體製劑所定義，更佳地緩衝劑為組胺酸，減黏劑為精胺酸和/或山梨醇)稀釋後繼續濃縮，如此反復，直至置換完全；iii.調整置換後的蛋白質的濃度到對本發明的液體製劑所定義的濃度；iv.加入表面活性劑或其溶液較佳水溶液，使表面活性劑的終濃度至對本發明的液體製劑中所定義的濃度；v.視需要地步驟iv的溶液無菌過濾；和vi.視需要地分裝至西林瓶中，加蓋橡膠塞和鋁塑蓋，獲得成品。

在實施方案中，抗PCSK9抗體是本文所定義的抗PCSK9抗體。

二、本發明的抗PCSK9抗體

在一些實施方案中，提供結合PCSK9或其片段(較佳人PCSK9蛋白質)的抗PCSK9抗體或抗體片段(較佳抗原結合片段)。

在本發明的一個方面中，本文提供抗PCSK9抗體，以及其片段(例如抗原結合片段)。在一些實施方案中，抗PCSK9抗體抑制或阻斷PCSK9活性。在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體具有以下一個或多個特性：(1)結合PCSK9(較佳地人PCSK9蛋白質)，較佳地，具有的平衡解離常數(K_D)

大約1μM，

大約100nM，

大約10nM，

大約1nM，

大約0.1nM，

大約0.01nM，或

大約0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)；(2)阻斷PCSK9(例如人PCSK9)與LDLR(例如人LDLR)結合；(3)增加LDLR的恢復能力，和/或抑制PCSK9誘導的LDL-C攝入降低，從而使得細胞(例如肝細胞)增加對LDL-C的攝取，較佳地，抗體濃度在大約10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nM以上，例如大約在10-100nM之間、15-70nM之間等，較佳地所述抗體增加細胞對LDLC攝取的能力比對照抗體高至少2倍，較佳地，對照抗體是IgG或本領域已知的抗體，例如阿利羅庫單抗(Alirocumab)、依伏羅庫單抗(Evolocumab)或羅德希珠單抗(Lodelcizumab)；(4)有效阻止了細胞的LDLR內化；(5)(劑量依賴地)降低血清中LDL-C水平和/或總膽固醇(TC)水平；(6)在較長時間內顯著降低血清中LDL-C水平，例如有效天數在15、16、17、18、19、20或21天以上。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，其中所述VH包含 (i)表II所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(CDR)，或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(VL)，其中所述VL包含：(i)SEQ ID NO：24所示的VL中所含的三個互補決定區域(CDR)；或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中(a)所述VH包含(i)表II所列任一抗體的VH中所含的三個互補決定區域(CDR)，或(ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列；和/或(b)所述VL包含：(i)SEQ ID NO：24所示的VL中所含的三個互補決定區域(CDR)；或 (ii)相對於(i)的序列，在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。

在較佳的實施方案中，VH包含選自SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。

在較佳的實施方案中，VL包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。

在較佳的實施方案中，本發明抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含(a)如SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，和/或(b)如SEQ ID NO：24所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。

在較佳的實施方案中，本發明抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含(a)如SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31、32或33所示的重鏈可變區的3個互補決定區HCDR，和(b)如SEQ ID NO：24所示的輕鏈可變區的3個互補決定區LCDR。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中(i)所述VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含選自SEQ ID NO：1、7、8、9、10、11、12、13和20的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR1包含與選自SEQ ID NO：1、7、8、9、10、11、12、13和20的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR2包含選自SEQ ID NO：2、14、15、16、17和21的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR2包含與選自SEQ ID NO：2、14、15、16、17和21的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；HCDR3包含選自SEQ ID NO：3、18、19和22的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者HCDR3包含與選自SEQ ID NO：3、18、19和22的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；和/或(ii)其中所述VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR1包含與SEQ ID NO：4的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR2包含與SEQ ID NO：5的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列；LCDR3包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，或者LCDR3包含與SEQ ID NO：6的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗PCSK9抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中(a)所述VH包含(i)表I所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的組合；或 (ii)(i)的HCDR組合的變體，所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)；和/或(ii)所述VL包含(i)分別包含如SEQ ID NO：4、5和6所示的胺基酸序列或分別由所述胺基酸序列組成的LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合；或者(ii)(i)的LCDR組合的變體，所述變體在所述三個CDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗PCSK9抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和/或輕鏈可變區(VL)，其中所述VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合如下表(表I)所示：

在較佳的實施方案中，本發明提供抗PCSK9抗體或其抗原結合片段，其包含如表I所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組合。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和/或輕鏈可變區VL，其中，(a)重鏈可變區VH(i)包含與選自SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與選自SEQ ID NO：23、25、26、27、28、29、30、31、32和33的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中；和/或(b)輕鏈可變區VL(i)包含與SEQ ID NO：24的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；(ii)包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與SEQ ID NO：24的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在CDR區中。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗PCSK9抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的組合如下表(表II)所示：

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈和/或輕鏈，其中(a)重鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；(ii)包含選自SEQ ID NO：34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與選自SEQ ID NO：34、36、37、38、39、40、41、42、43和44的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在重鏈的CDR區中，更佳地，所述胺基酸改變不發生在重鏈可變區中；和/或(b)輕鏈(i)包含與SEQ ID NO：35的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由其組成；(ii)包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列或由其組成；或者(iii)包含與SEQ ID NO：35的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列，較佳地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈的CDR區中，更佳地，所述胺基酸改變不發生在輕鏈可變區中。

在較佳的實施方案中，本發明提供抗PCSK9抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈和輕鏈，其中所述抗體或其抗原結合片段所包含的重鏈和輕鏈的組合如下表(表III)所示：

在一些實施方案中，本發明的抗體還涵蓋抗PCSK9抗體的胺基酸序列的變體，以及與上文所述的任何抗體結合相同表位的抗體。

在某些實施方案中，提供結合PCSK9或其片段的抗體或抗體片段(較佳的抗原結合片段)，其中所述抗體結合PCSK9的片段內的表位。在某些實施方案中，提供結合PCSK9或其片段的抗體或抗體片段，其中所述抗體結合包含人PCSK9胺基酸序列SEQ ID NO：53的胺基酸片段內的表位。

在一些實施方案中，本發明抗PCSK9抗體或其片段的重鏈和/或輕鏈還包含信號肽序列，例如METDTLLLWVLLLWVPGSTG。

在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。

在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。

在一些實施方案中，置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置換，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表IV所示：

在某些實施方案中，置換發生在抗體的CDR區。通常，獲得的變體相對於親本抗體在某些生物學特性方面(例如，增加的親和力)具有修飾(例如，改善)和/或將基本上保留親本抗體的的某些生物學特性。示例性置換變體是親和力成熟抗體。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體經糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾可以是有用的，例如除去岩藻糖模塊以提高抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield等(2002)JBC277：26733)。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。

在某些實施方案中，可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體，以便增強例如抗體治療疾病的有效性。Fc區變體可包括在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如置換)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。關於Fc變體的實例參見美國專利號7,332,581，美國專利號6,737,056，美國專利號6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)，美國專利號6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)，美國專利號7,371,826，Duncan&Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利號5,648,260；美國專利號5,624,821；和WO 94/29351。

在某些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。可以如，例如美國專利號7,521,541中所述地生成半胱胺酸改造的抗體。

在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段具有以下一個或多個特性：(i)顯示與表C所列的任一抗體對PCSK9(例如人PCSK9，較佳具有如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列)相同或相似的結合親和力和/或特異性；(ii)抑制(例如，競爭性抑制)表C所列的任一抗體與PCSK9(例如人PCSK9，較佳具有如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列)的結合；(iii)與表C所示的任一抗體結合相同或重疊的表位；(iv)與表C所示的任一抗體競爭結合PCSK9(例如人PCSK9，較佳具有如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列)；(v)具有表C所列的任一抗體分子的一個或多個生物學特性。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體是IgG1形式的抗體或IgG2形式的抗體或IgG4形式的抗體。

在一些實施方案中，本文所述的抗PCSK9抗體是單株抗體。在一些實施方案中，本文所述的抗PCSK9抗體是人源化的。在一些實施方案中，本文所述的抗PCSK9抗體是人抗體。在一些實施方案中，至少部分的本文所述的抗PCSK9抗體的框架序列是人共有框架序列。在一個實施方案中，本文所述的抗PCSK9抗體還涵蓋其抗體片段。抗體片段的實例包括但不限於Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH，F(ab’)₂、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，各自具有單一抗原結合位點，和殘留的“Fc”片段，其名稱反映了它易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生F(ab’)₂片段，其具有兩個抗原結合位點並且仍然能夠交聯抗原。

在一些實施方案中，本發明的抗PCSK9抗體是人源化抗體。用於使抗體人源化的不同方法是技術人員已知的，如由Almagro&Fransson綜述的，其內容藉由提述完整併入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13：1619-1633)。Almagro&Fransson區分理性辦法和經驗辦法。理性辦法的特徵在於生成少數工程化抗體變體並評估其結合或任何其它感興趣的特性。如果設計的變體不產生預期的結果，那麼啟動新一輪的設計和結合評估。理性辦法包括CDR嫁接、表面重建(Resurfacing)、超人源化(Superhumanization)和人字符串內容優化(Human StringContent Optimization)。相比之下，經驗辦法基於生成大的人源化變體庫並使用富集技術或高通量篩選選出最佳純株。因而，經驗辦法依賴於能夠對大量抗體變體進行搜索的可靠的選擇和/或篩選系統。體外展示技術，如噬菌體展示和核糖體展示滿足這些要求並且是技術人員公知的。經驗辦法包括FR庫、導向選擇(Guided selection)、框架改組(Framework-shuffling)和Humaneering。

在一些實施方案中，本文所述的抗PCSK9抗體是人抗體。可使用本領域中已知的各種技術來製備人抗體。人抗體一般描述於van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol 5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。

在一些實施方案中，本文所述的抗PCSK9抗體是嵌合抗體。

可藉由在組合文庫中篩選具有所需活性的抗體來分離本發明抗體。舉例來說，本領域中已知多種用於產生噬菌體展示文庫並且在這些文庫中篩選具有所需結合特徵的抗體的方法。這些方法於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien 等人編，人Press，Totowa，NJ，2001)中評述，並且進一步於例如McCafferty等人，Nature348：552-554；Clackso等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo編，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)中描述。

在一些實施方案中，本發明還涵蓋與其它物質，如可檢測標記(如螢光染料、酶、受質、生物發光物質、放射性物質和化學發光部分)、細胞毒性劑或免疫抑制劑綴合的抗PCSK9單株抗體(“綴合物或免疫綴合物”)。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。適合於形成免疫綴合物的細胞毒性劑(例如化療劑)的例子是本領域中已知的，參見例如WO05/103081。

在一些實施方案中，本發明的抗體可以是單特異性的、雙特異性或多特異性的。多特異性單抗可以對一種靶多肽的不同表位是特異性的或可以含有對超過一種靶多肽特異性的抗原結合域。參見例如，Tutt等(1991)J.Immunol.147：60-69。抗PCSK9單抗可以與另一種功能性分子(例如另一種肽或蛋白質)連接或共表達。例如抗體或其片段可以功能性與一或多種其它分子，如另一種抗體或抗體片段連接(例如藉由化學偶聯、遺傳融合、非共價聯合或以其它方式)以產生具有第二或更多結合特異性的雙特異性或多特異性抗體。

在一些實施方案中，本發明的抗體結合人PCSK9蛋白，例如如SEQ ID NO：53所示的人PCSK9蛋白。

三、本發明抗體或其製劑的治療方法和用途

另一方面，本發明涉及在對象中抑制PCSK9與LDL-受體(LDLR)結合的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。本發明還涉及本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體製備用於在對象中抑制PCSK9與LDL-受體(LDLR)結合的藥物的用途。

在另一方面中，本發明涉及降低對象的膽固醇水平的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。在一個實施方案中，膽固醇是LDL-膽固醇，較佳地血清膽固醇。在另一方面中，本發明涉及降低對象的LDL-膽固醇水平的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。在一些實施方案中，本發明涉及降低對象的血清LDL-膽固醇水平的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。在另一方面，本發明還涉及本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體製備用於在對象中降低對象的膽固醇水平(在一個實施方案中是LDL-膽固醇水平或血清LDL-膽固醇水平)的藥物的用途。

在另一方面中，本發明涉及預防或治療對象的與升高的LDL-膽固醇水平相關的病症的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。本發明還涉及本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體製備用於在對象中治療對象的與升高的LDL-膽固醇水平相關的病症的藥物的用途。

在一方面中，本發明涉及預防或治療膽固醇相關疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。本發明還涉及本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體製備用於治療膽固醇相關疾病的藥物中的用途。膽固醇相關疾病的示例性和非限制性實例提供在後文中。在一些實施方案中，膽固醇相關疾病是高膽固醇血症(hypercholesterolemia)或高脂血症。在一些實施方案中，本發明涉及治療高膽固醇血症和/或高脂血症的方法，所述方法包括向所述對象施用有效量的本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體。在一些實施方案中，本發明還涉及本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體製備用於治療高膽固醇血症和/或高脂血症的藥物的用途。

在一方面中，本發明涉及預防或治療可以藉由消除、抑制或降低PCSK9活性而被改善、減緩、抑制或預防的任何疾病或病症的方法。在一些實施方案中，可以藉由使用他汀類物質(statins)治療或預防的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗PCSK9製劑或本發明的抗PCSK9抗體來治療或預防。在一些實施方案中，可以受益於防止膽固醇合成或提高LDLR表達的疾病或病症也可以使用本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體來治療。

在一些實施方案中，本文所述的方法還包括向所述對象聯合施用有效量的另外的治療劑。在一個實施方案中，本發明還涉及包含本文所述的抗體製劑或抗體以及另外的治療劑的組合產品。在一個實施方案中，另外的治療劑提升LDLR蛋白的水平。在另一個實施方案中，另外的治療劑降低LDL-膽固醇的水平。在另一個實施方案中，另外的治療劑包含他汀類物質。在另一個實施方案中，另外的治療劑為他汀類物質。在一些實施方案中，他汀類物質選自：阿托伐他汀(atorvastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，美伐他汀(mevastatin)，匹伐他汀(pitavastatin)，普伐他汀(pravastatin)，羅舒伐他汀(rosuvastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，及其任意組合。在某些實施方案中，所述另外的治療劑用於預防和/或治療動脈粥樣硬化和/或心血管疾病。在某些實施方案中，所述另外的治療劑用於降低復發的心血管事件的風險的方法。在某些實施方案中，所述另外的治療劑用於提高對象的HDL-膽固醇水平。在一些實施方案中，對象或個體是哺乳動物，較佳地人。

上述組合療法包括組合給藥(其中兩種以上治療劑被包含在相同或分開的製劑中)和分別給藥，其中，任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體的給藥可以發生在另外的治療劑和/或佐劑的給藥前、同時和/或之後。

為了預防或治療疾病，本發明的製劑或抗體的合適劑量(當單獨或與一種或多種其他另外的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重性和進程、所述抗體是以預防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對所述製劑或抗體的應答，和主治醫師的判斷力。所述抗體以一次治療或經過一系列治療合適地施用於患者。所述抗體的示例性的劑量範圍包括3-30mg/kg。

在其他方面，本發明提供任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體在生產或製備藥物中的用途，所述藥物用於治療上文提及的相關疾病或病症。

在某些實施方案中，本發明的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體可防治性地施用以預防或緩和高膽固醇血症、高脂血症、心血管疾病和/或任何膽固醇相關疾病的發作。在某些實施方案中，可施用本發明的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體以治療現有高膽固醇血症和/或高脂血症和/或心血管疾病和/或任何膽固醇相關疾病。在一些實施方案中，本發明的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗PCSK9抗體會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。

四、其它

在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗PCSK9抗體或其片段的核酸。在一個實施方案中，提供包含所述核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體。在一個實施方案中，提供包含所述載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。

在一個實施方案中，本發明提供製備抗PCSK9抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)的方法，其中所述方法包含在適於表達編碼所述抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)的核酸的條件下培養所述宿主細胞，以及視需要地分離所述抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。在某個實施方案中，所述方法還包括從宿主細胞回收抗PCSK9抗體或其片段(較佳地抗原結合片段)。

在一方面中，本發明涉及檢測樣品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括(a)將樣品與本文所述的任何抗PCSK9抗體製劑或本發明的抗體接觸；和(b)檢測抗PCSK9抗體或其片段和PCSK9蛋白間的複合物的形成。在一個實施方案中，抗PCSK9抗體是被可檢測地標記的。

本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有制劑或抗PCSK9抗體或其片段、方法和用途。

第1圖顯示了不同濃度的各個抗PCSK9抗體阻斷PCSK9與LDLR結合的能力。

第2圖顯示了不同濃度的各個抗PCSK9抗體增加HepG2細胞恢復LDLR的能力。

第3圖顯示了不同濃度的各個抗PCSK9抗體降低細胞LDLR內化的能力。

第4A圖顯示了本發明示例性抗體的重鏈的FR和CDR的序列信息，第4B圖顯示了本發明示例性抗體的輕鏈的FR和CDR的序列信息。

第5A圖顯示了顯示了本發明示例性抗體的重鏈可變區的序列信息，第5B圖顯示了本發明示例性抗體的輕鏈可變區的序列信息。

第6圖顯示了大鼠皮下或靜脈給予抗PCSK-9抗體或依伏羅庫單抗(Evolocumab)後血清中LDL-C相對於給藥前水平(D1給藥前，基線)的%變化率(平均)vs時間作圖的圖譜。

第7圖顯示了大鼠皮下或靜脈給予抗PCSK-9抗體或依伏羅庫單抗(Evolocumab)後血清中%HDL-C相對於給藥前水平(D1給藥前，基線)的%變化率(平均)vs時間作圖的圖譜。

第8圖顯示了給予食蟹猴抗PCSK-9抗體或依伏羅庫單抗(Evolocumab)後血清LDL-C相對於給藥前水平(D1給藥前，基線)的%變化率(平均)vs時間作圖的圖譜。

第9圖顯示了給予食蟹猴抗PCSK-9抗體或依伏羅庫單抗(Evolocumab)後血清HDL-C相對於給藥前水平(D1給藥前，基線)的%變化率(平均)vs時間作圖的圖譜。

第10圖顯示了給予食蟹猴抗PCSK-9抗體或依伏羅庫單抗(Evolocumab)後血清TC相對於給藥前水平(D1給藥前，基線)的%變化率(平均)vs時間作圖的圖譜。

定義

本發明中所使用的術語具有如下所列定義。如果在文中沒有給出定義，則本發明中所使用的術語具有本領域所通常理解的含義。

為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。

如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或更多項。

如本文所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組合的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

除非另外說明，術語“前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin型9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)(PCSK9)”、“PCSK9”或“NARC-1”當用於本文中時是指任何天然PCSK9，較佳地來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PCSK9。該術語涵蓋“全長”未加工的PCSK9以及由細胞內加工產生的任何形式的PCSK9或其任何片段。該術語還包括天然存在的PCSK9的變體，例如，剪接變體或等位變體。

術語“PCSK9活性”或PCSK9的“生物學活性”當用於本文中時包括PCSK9的任何生物學作用。在一些實施方案中，PCSK9活性包括PCSK9與受質或受體相互作用或結合的能力。在一些實施方案中，PCSK9的生物學活性是PCSK9與LDL-受體(LDLR)結合的能力。在一些實施方案中，PCSK9結合並催化涉及LDLR的反應。在一些實施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低或減少LDLR的利用度的能力。在一些實施方案中，PCSK9的生物學活性包括PCSK9提高對象的LDL的量的能力。在一些實施方案中，PCSK9的生物學活性包括PCSK9降低對象的可以用於與LDL結合的LDLR的量的能力。在一些實施方案中，PCSK9的生物學活性包括PCSK9降低可以用於與LDL結合的LDLR的量的能力。在一些實施方案中，PCSK9的生物學活性包括由PCSK9信號傳導所致的任何生物學活性。

術語“抗PCSK9抗體”、“抗PCSK9”、“PCSK9抗體”或“結合PCSK9的抗體”是指這樣的抗體，所述抗體能夠以足夠的親合力結合PCSK9蛋白或其片段以致所述抗體可以用作靶向PCSK9中的診斷劑和/或治療劑。在一個實施方案中，抗PCSK9抗體與不相關的、非PCSK9蛋白結合的程度低於所述抗體與PCSK9結合的約10%，如例如藉由放射性免疫測定(RIA)測量的。在一些實施方案中，抗PCSK9的抗體的平衡解離常數(K_D)

1μM，

100nM，

10nM，

1nM，

0.1nM，

0.01nM，或

0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

“抗體片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)；單結構域抗體；雙價或雙特異性抗體或其片段；駱駝科抗體；和由抗體片段形成的雙特異性抗體或多特異性抗體。

如本文所用，術語“表位”指抗原(例如，PCSK9)中與抗體分子特異性相互作用的部分。

與參照抗體“結合相同或重疊表位的抗體”是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%以上的所述參照抗體與其抗原的結合，反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%以上的該抗體與其抗原的結合。

與參照抗體競爭結合其抗原的抗體是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗體是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。

抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的所述參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的。

與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。

“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，所述指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

然而，應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是 CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat,Chothia,AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如本領域技術人員明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

“功能性Fc區”擁有天然序列Fc區的“效應器功能”。例示性的“效應器功能”包括C1q結合；CDC；Fc受體結合；ADCC；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合，而且可以使用多種測定法來評估，例如本文所公開的那些。

術語“Fc區”在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，所述區域包含至少一部分的恒定區。該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在某些實施方案中，人IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羰基端。然而，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外說明，Fc區或恒定區中的胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，其也被稱為EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

適用於本發明的“抗體及其抗原結合片段”包括但不限於多株、單株、單價、雙特異性、異綴合物、多特異性、重組、異源、異源雜合、嵌合、人源化(特別是嫁接有CDR的)、去免疫的、或人的抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、由Fab表達庫產生的片段、Fd、Fv、二硫化物連接的Fv(dsFv)、單鏈抗體(例如scFv)、雙抗體或四抗體(Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14),6444-6448)、納米抗體(nanobody)(也稱為單域抗體)、抗獨特型(抗Id)抗體(包括例如針對本發明抗體的抗Id抗體)和上述任一種的表位結合片段。

“人共有框架”是指這樣的框架，即在選擇人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出現的胺基酸殘基。一般而言，對人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇是從可變結構域序列的亞型中選擇。

“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恒定區所屬於的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恒定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恒定區不同。例如，IgG1形式的抗體是指其重鏈恒定區Ig結構域為IgG1的Ig結構域。

本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療膽固醇相關疾病中有效的任何物質，包括細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑等等。

“人抗體”指具有這樣的胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列對應於下述抗體的胺基酸序列，所述抗體由人或人細胞生成或來源於非人來源，其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。

“人源化”抗體是指包含來自非人CDR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR對應於非人抗體的那些，並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的那些。人源化抗體視需要可以包含至少一部分的來源於人抗體的抗體恒定區。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”是指已經進行了人源化的抗體。

“個體”或“對象”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或對象是人。

“分離的”抗體是這樣的抗體，其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。對於用於評估抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

相對於參比多肽序列的“百分比(%)胺基酸序列同一性”定義為在將所述序列進行比對(並在必要時導人空位)以獲取最大百分比序列同一性，且不將任何保守置換視為序列同一性的部分之後，候選序列中的胺基酸殘基與參比多肽序列中的相同胺基酸殘基的百分比。可使用本領域各種方法進行序列比對以便測定百分比胺基酸序列同一性，例如，使用公眾可得到的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以決定測量比對的適宜參數，包括對所比較的序列全長獲得最大比對所需的任何算法。

額外地或備選地，可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索，以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。

術語“組合產品”是指一種劑量單位形式的固定組合或非固定組合或用於組合施用的部分的試劑盒，其中兩種或更多種治療劑可以獨立地在同一時間或在時間間隔內分開施用，尤其是在這些時間間隔允許組合伴侶展示協作，例如，協同效應時。術語“固定組合”是指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑，例如他汀類藥物)以單一實體或劑量的形式同時施用於患者。術語“非固定組合”意指本發明抗體和組合伴侶(例如其他治療劑，例如他汀類藥物)作為分開的實體同時、並行或依次施用於患者，沒有特定的時間限制，其中這樣的施用提供了患者體內兩種化合物的治療有效水平。後者也適用於雞尾酒療法，例如施用三種或更多種治療劑。在一個較佳的實施方案中，藥物組合是非固定組合。

術語“組合療法”是指施用兩種或更多種治療劑以治療如本公開所述的膽固醇相關疾病。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。

用於本文時，“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。

用於本文時，“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有家族病史的對象是預防性方案的候選。通常，術語“預防”是指在病徵或症狀發生前，特別是在具有風險的對象中發生前的藥物施用。

術語“膽固醇相關疾病”包括以下中的任一種或多種：高膽固醇血症、高脂血症、心臟病、代謝綜合征(metabolic syndrome)、糖尿病、冠狀動脈心臟病(coronary heart disease)、卒中(stroke)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、阿爾茨海默病(Alzheimers disease)和一般性的異常脂血症(dyslipidemia)(其顯示為例如提高的總血清膽固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的VLDL和/或低的HDL)。可以使用抗PCSK9抗體(單獨地或與一種或多種其他藥物組合地)治療的原發性和繼發性異常脂血症的一些非限制性實例包括代謝綜合征、糖尿病(diabetes mellitus)、家族性混合性高脂血症(familial combined hyperlipidemia)、家族性高甘油三酯血症(familial hypertriglyceridemia)、家族性高膽固醇血症(familial hypercholesterolemias)，包括雜合性高膽固醇血症(heterozygous hypercholesterolemia)、純合性高膽固醇血症(homozygous hypercholesterolemia)、家族性缺陷性載脂蛋白(familial defective apoplipoprotein)B-100；多基因性高膽固醇血症(polygenic hypercholesterolemia)；殘粒移去障礙病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺失(hepatic lipase deficiency)；繼發於以下任何的異常脂血症：飲食不慎(dietary in discretion)、甲狀腺機能障礙(hypothyroidism)、藥物(包括雌激素和孕酮療法、β阻斷劑和噻嗪類利尿劑(thiazide diuretics))；腎病綜合征(nephrotic syndrome)、慢性腎衰竭(chronic renal failure)、庫欣綜合征(Cushing′s syndrome)、原發性膽汁性肝硬變(primary biliary cirrhosis)、糖原沉積病(glycogen storage diseases)、肝細胞瘤(hepatoma)、膽汁淤積(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰島素瘤(insulinoma)、單純性生長素缺乏症(isolated growth hormone deficiency)和酒精所致高甘油三酯血症(alcohol-induced hypertriglyceridemia)。

術語“高膽固醇血症”當用於本文中時是指其中膽固醇水平升高到一定水平以上的病症。在一些實施方案中，LDL-膽固醇水平升高到一定水平以上。在一些實施方案中，血清LDL-膽固醇水平升高到一定水平以上。

術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其可操作相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為“表達載體”。

“對象/患者樣品”指從患者或對象得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自對象的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。

術語“有效量”指本發明的製劑、抗體或片段這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在治療的患者中產生預期效果。有效量可以由作為本領域技術人員的主治醫師藉由考慮以下多種因素來容易地確定：諸如哺乳動物的物種；它的大小、年齡和一般健康；涉及的具體疾病；疾病的程度或嚴重性；個體患者的應答；施用的具體抗體；施用模式；施用製劑的生物利用率特徵；選擇的給藥方案；和任何伴隨療法的使用。

“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。本發明的製劑、抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的治療有效量可以根據多種因子如疾病狀態、個體的年齡、性別和重量和抗體或抗體部分在個體中激發所需反應的能力而變動。治療有效量也是這樣的一個量，其中製劑、抗體或抗體片段或其綴合物或組合物的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。

“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。

術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉形體”和“轉形的細胞”，其包括初級轉形的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親代細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉形的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。

如文中所用，術語“製劑”意指適合於向動物較佳哺乳動物(包括人)施用的包含至少一種活性成分和至少一種非活性成分的組合物。“液體製劑”是指液體形式的製劑。本發明的液體製劑包含(i)抗PCSK-9抗體或其片段；(ii)緩衝劑；(iii)減黏劑；(iv)表面活性劑；和(v)溶媒。本發明的製劑的組成可如上面液體製劑實施方案中所示。本發明的液體製劑較佳為注射劑，更佳為皮下注射劑。

如文中所用，“緩衝劑”是指pH緩衝劑。較佳地，所述緩衝劑能夠使本發明的液體製劑的pH保持在約5.0~6.0，較佳約5.2-5.8，更佳約5.4-5.6，最佳約5.5。緩衝劑在液體製劑中的濃度為例如約0.01-50mg/m、約0.1-50mg/ml、約0.2-10mg/ml、約0.5-2.5mg/ml、約1.0-2.0mg/ml或約1.5mg/ml。較佳地，緩衝劑選自組胺酸、麩胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷。

如文中所用，“減黏劑”是指能夠降低抗PCSK-9抗體液體製劑的黏度的物質。減黏劑在液體製劑中的濃度為例如約10mmol/L-1000mmol/L、約20mmol/L-500mmol/L、約50mmol/L-300mmol/L或約50mmol/L-200mmol/L。較佳地，減黏劑選自：糖醇、精胺酸、精胺酸鹽酸鹽、硫氰酸鈉、硫氰酸銨、硫酸銨、氯化銨、氯化鈣、氯化鋅、乙酸鈉和其組合。更佳地，減黏劑是山梨醇，或者減黏劑是山梨醇與精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)的組合。較佳地，山梨醇在液體製劑中的濃度為約1%-6%(w/v)；精胺酸或精胺酸鹽(較佳精胺酸鹽酸鹽)在液體製劑中的濃度為約50mmol/L~180mmol/L，較佳約70mmol/L~150mmol/L，更佳約90mmol/L。

如文中所述，“表面活性劑”是指加入少量後，能使溶液體系的界面狀態發生明顯變化的物質。表面活性劑在液體製劑中的濃度為例如約0.01-5mg/ml，約0.05-1mg/ml或約0.1-0.5mg/ml，更佳為約0.3mg/ml。較佳地，表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如普洛尼克(pluronics)、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40或聚山梨醇酯-20等。

如文中所用，術語“溶媒”是指用於溶解或懸浮活性成分和非活性成分以形成液體製劑的液體。可用於本發明的溶媒包括但不限於注射用水、注射用有機溶劑包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

如文中所用，術語“糖醇”糖醇是單糖經催化氫化等還原反應而得到的相應多元醇。糖醇包括但不限於山梨糖醇、甘露糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇等。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小10%的下限和比指定數字數值大10%的上限的範圍內的數字數值。

如文中所用，“w/v”是指“重量/體積”，例如“1%w/v”即為1g/100ml=0.01g/ml=10mg/ml。

[實施例]以下結合實施例進一步說明本發明，下列實施例不應被理解為對本發明的限制。

縮寫的含義：

SEC-HPLC：體積排阻高效液相色譜

CE-SDS：十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳

CZE：毛細管區帶電泳

實施例1. 抗PCSK9的抗體篩選確定母抗體

抗原生物素標記

按照廠商的說明，採用Pierce公司的琥珀醯亞胺基磺酸基生物素標記工具包對PCSK9抗原(SEQ ID NO.53)進行生物素標記。FITC標記山羊抗人免疫球蛋白F(ab’)kappa鏈抗體(LC-FITC)購自(Southern Biotech)、聚乙烯抗生物素蛋白(SA-PE)購自(Sigma)、鏈黴親和素-633(SA-633)購自(Molec ular Probes)。鏈黴微珠和細胞免疫磁珠分離柱購自Miltenyi LS。

初步篩選

8個合成基於酵母的抗體展示(yeast-based antibody presentation)文庫(來自Adimab)按照現有的方法(Xu等人，2013；WO2009036379；WO 2010105256；W02012009568)進行擴增，每個庫多樣性達到1×10⁹。簡言之，前兩輪的篩選使用Miltenyi公司的MACS系統進行磁性激活細胞分選進行。首先，將每個文庫的酵母細胞(~1×10¹⁰細胞/文庫)分別在FACS洗滌緩衝液中(磷酸鹽緩衝液，含有0.1%牛血清蛋白)室溫孵化15分鐘，緩衝液中含有如上所述製備的100nM生物素標記的PCSK9抗原。使用50ml預冷的FACS洗滌緩衝液洗一次，再用40ml相同洗滌緩衝液重懸細胞，並加入500μl鏈黴素微珠於4℃孵化15分鐘。1000rpm離心5min棄去上清後用5ml FACS洗滌緩衝液重懸細胞，將細胞溶液加到Miltenyi LS柱中。加樣完成後，FACS洗滌緩衝液洗柱3次，每次3ml。從磁性區域取下Miltenyi LS柱，用5ml生長培養基洗脫，收集洗脫的酵母細胞並在37℃過夜生長。

使用流式細胞儀進行下一輪的分選：將經過MACS系統篩選獲得的大約1×10⁸的酵母細胞用FACS緩衝液洗三次，於含有低濃度生物素(100-1nM)標記的PCSK9抗原或者PCSK9-Fc融合抗原中室溫下培養。棄去培養液，細胞用FACS洗滌緩衝液洗兩次之後，將細胞與LC-FITC(1：100稀釋)混合並與SA-633(1：500稀釋)或EA-PE(1：50稀釋)試劑混合，4℃下培養15分鐘。用預冷的FACS洗滌緩衝液洗脫兩次，並重懸於0.4ml緩衝液中，將細胞轉移到帶濾器的分離管中。使用FACS ARIA(BD Biosciences)分選細胞。

接下來再藉由幾輪篩選以獲得競爭性配體並清除非特異性結合物(例如CHO細胞的膜蛋白)。經過最後幾輪的分選之後，將收集的酵母細胞塗平板，在37℃培養過夜，挑選出靶標單純株。利用sanger法對所獲得抗體的可變區進行測序。共獲得大約310個可變區序列獨特的抗體並逐一進行鑒定。

藉由酵母表達並使用Protein A親和層析的方法純化獲得了這些抗PCSK9抗體蛋白。

抗體生產純化

將藉由篩選獲得的表達抗PCSK9抗體的酵母細胞在30℃下震盪誘導48小時以表達抗PCSK9的抗體。誘導結束之後，1300rpm離心10min去除酵母細胞，收穫上清液。使用Protein A對上清液中的抗PCSK9抗體進行純化，pH2.0醋酸溶液洗脫，收獲抗PCSK9抗體。使用木瓜蛋白酶消化並用KappaSelect(GE生命醫療集團)進行純化獲得相應的Fab片段。

根據本領域常規方法，從上述表達抗PCSK9抗體的酵母細胞獲得編碼抗PCSK9抗體的基因DNA，並根據常規方法將該基因DNA選殖到新的表達載體(pCDNA3.1)。

將含有目標抗體基因的上述表達載體與轉染試劑Lipofectamine TM2000(購自Invitrogen)按照生產產商提供的方案瞬時轉染培養的人腎胚細胞293細胞，棄去培養基並用新鮮的培養基把細胞稀釋到4X10⁶/ml。在37℃，5%CO₂的條件下培養細胞7天，每48小時流加新鮮培養基。7天後，13000rpm離心20min。取上清液，用Protein A純化上清液，使抗體的純度>95%。

ForteBio KD測定(生物膜層干涉法)

ForteBio親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：p.270-8)進行。簡言之，傳感器在分析緩衝液中線下平衡30分鐘，然後線上檢測60秒建立基線，在線加載如上所述獲得的經純化的抗體至AHQ傳感器上。再將傳感器放入100nM的PCSK9抗原中作用5分鐘，之後將傳感器轉移至分析緩衝液解離5分鐘。使用1：1結合模型進行動力學的分析。

MSD-SET動力學檢測

平衡親和力的檢測如前所述(Estep等人2013)。在含有0.1%的無IgG BSA的磷酸鹽緩衝鹽水(PBSF)中，加入終濃度為10-100pM的如前所述獲得的生物素標記的PCSK9抗原(b-PCSK9)，對如上獲得的抗PCSK9 Fab或mAb經過3到5倍連續稀釋，獲得濃度為5-100nM的Fab或mAb溶液。將抗體(稀釋於20nM磷酸鹽緩衝鹽水中)4℃過夜或室溫30分鐘包被在MSD-ECL板上。加入3% BSA，700rpm室溫封閉30分鐘，之後用清洗緩衝液(PBSF+0.05%吐溫20)洗3遍。將樣品加入板中置於搖床中700rpm室溫孵育150秒後清洗1遍。加入250ng/ml sulfotag標記的鏈黴抗生物素(稀釋於PBSF中)，室溫孵育3分鐘。緩衝液清洗3遍後使用MSD Sector Imager 2400設備讀取來確定結合在板上的抗原。未結合的抗原百分比藉由滴定抗體方法得到，結果發現抗PCSK9 Fab或mAb與抗原的結合符合代謝動力學的二次方程。

Octet Red384結合表位鑒定

結合表位鑒定使用了標準的三明治式的交互阻斷分析法。將靶點特異性對照IgG固定於AHQ傳感器上，並且用不相干的人IgG1抗體封閉傳感器上空Fc結合位點。將傳感器放於100nM的目標抗原PCSK9溶液中120s，再放入到第二種如上所製備的100nM抗PCSK9的抗體或配體溶液中。讀取數據，並將數據藉由ForteBio數據分析軟件7.0(來自ForteBio)處理。抗原結合抗體後還能被第二種抗體或配體結合暗示有一個未結合表位(非競爭性的)，沒有結合則表示表位阻斷(競爭性的或配體阻斷)。

藉由以上的篩選和鑒定工作，我們獲得了一些能夠阻斷PCSK9和LDLR結合且和人鼠PCSK9都結合的抗體。為了獲得更高親和力的抗PCSK9抗體，我們藉由以下方法對抗體ADI-02396進行了優化。

實施例2 抗PCSK9抗體的親和力優化

VHmut篩選

該方法是藉由常規的錯配PCR的方法向抗體重鏈區域引入突變。PCR過程中，藉由使用1uM高突變的鹼基類似物dPTP和8-oxo-dGTP，從而將鹼基錯配概率提高至約0.01bp。

獲得的錯配PCR的產物藉由同源重組的方法構建入含有重鏈恒定區的載體中。藉由這種方法，在包括PCSK9抗原滴度、未標記抗原競爭以及使用母抗體競爭的篩選壓力下，我們獲得了庫容量為1x10⁷的次級庫。藉由FACS方法進行了3輪成功篩選。

CDRH1/CDRH2篩選

把VHmut方法獲得的子代抗體的CDRH3基因構建入1x10⁸多樣性的CDRH1/CDRH2基因庫中，並對其進行了3輪篩選。第一輪使用MACS方法，而第二、三輪使用FACS方法，對抗體抗原結合物進行親和力加壓，篩選出最高親和力的抗體。

第一輪優化：第一步工作是使這個具有人鼠交叉活性、配體競爭性抗PCSK9抗體ADI-02396(命名為“母”抗體)的親和力提高。簡而言之，就是向母抗體中引入突變(利用“錯配PCR”的方法)，建立次級基於酵母的抗體展示(yeast-based antibody presentation)庫。最終生成了大約1×10⁷大小的次級庫用於後面更高親和力抗體的富集。篩選壓力包括PCSK9抗原滴度、未標記抗原競爭以及使用母抗體競爭。FACS技術也用於篩選目標群體(具體操作方法參見Chao等人Nature Protocols,2006)。經過2-3輪的富集，將獲得的酵母塗平板從而可以獲得單純株。經過這一工作後，總共得到了3個親和力改進的後代，ADI-09111、ADI-09112和ADI-09113。藉由ForteBio Octet測定，這三個抗體的K_D範圍是1-10nM。兩個子代抗體ADI-09112和ADI-09113被用於第二輪的親和力優化。

第二輪的親和力優化：第二步工作是提高兩個人鼠交叉活性、配體競爭性的抗PCSK9單抗ADI-09112和ADI-09113(命名為“母”抗體)的親和力。簡而言之，就是為每一個母抗體再建立次級基於酵母的抗體展示(yeast-based antibody presentation)庫。將母抗體的CDR-H3和輕鏈(LC)與現有酵母文庫中的基因的CDR-H1和CDR-H2相結合(命名為：“H1/H2”優化)。這最終生成了大約1×10⁸大小的5個庫用於後面更高親和力抗體的富集。篩選方法同第一輪篩選。經過2-3輪的富集，將酵母菌塗在平板上獲得單純株。經過這一工作後，得到了親和改進的後代抗體，其中ADI-10085、ADI-10086和ADI-10087是ADI-09112的CDR-H1及CDR-H2區域的變異體，ADI-10088、ADI-10089和ADI-10090是ADI-09113的VH區域變異體。所述抗體的相關序列信息參見表A-C。這些抗體對人PCSK9的親和力提高了10倍，藉由ForteBio法和MSD-SET測定表明其K_D範圍在4-17pM~200pM之間(表1，表2)。有部分抗體的親和力比對照抗體高10倍左右。其他抗體功能鑒定可以進一步縮小抗體數量，以便於臨床前的開發。

本申請涉及的各個抗PCSK-9抗體的序列信息及編號如下表A-C所示：

實施例3. 抗PCSK-9抗體抑制PCSK-9與LDLR結合實驗

用PBS溶液(磷酸鹽緩衝溶液)稀釋如實施例1所述的PCSK9蛋白(生物素標記的PCSK9蛋白)至400nmol/L作為工作液。分別用PBS溶液稀釋如實施例2所獲得的抗PCSK9抗體(ADI-10085、ADI-10086、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089和ADI-10090)至濃度依次為1000nmol/L、100nmol/L、10nmol/L、1nmol/L、0.1nmol/L，按照同樣的方法製備對照抗體(阿利羅庫單抗、依伏羅庫單抗、波可希珠單抗和羅德希珠單抗)各個濃度的溶液。將PCSK9工作液與梯度稀釋的各個抗PCSK9抗體樣品或者對照樣品等體積混合。用PBS溶液重懸過表達人LDLR的CHO細胞(CHO-LDLR)並計數，將其細胞濃度用PBS溶液調整至4×10⁶個/ml，接種於96孔U型細胞培養板中每孔加入50μl的細胞培養液，加入50μl PCSK9與抗PCSK9抗體的混合液，每孔中細胞數為2.0×10⁵個，200g室溫離心5分鐘，棄上清。用PBS溶液按1：200比例稀釋抗-His-FITC(R&DSystems)終濃度至2.5μg/ml，加入96孔板中，100μl每孔，冰浴30分鐘。200g室溫離心5分鐘，輕輕棄上清液，每孔中加入150μl PBS溶液，200g室溫離心5分鐘，輕輕棄上清液，重複3次。在每個實驗孔中加入80μl/孔的PBS溶液，移液器吹打數下重懸細胞。用流式細胞儀檢測細胞螢光信號值。

實驗所檢測到的螢光信號，請參見下述表3。

將表3原始數據用GraphPad Prism6軟件進行分析作圖得到第1圖。

實驗結果表明，抗PCSK9抗體與對照抗體相比具有相當的阻斷PCSK9與LDLR結合的能力。

實施例4 細胞LDL-c攝取分析實驗

從液氮保存罐中取出HepG2細胞凍存管，37℃快速水浴融化，將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml室溫生長培養基(90%DMEM+10%FBS，其中DMEM和FBS均購自Gibco公司)，1000r/分鐘，室溫離心5分鐘後，用新鮮生長培養基重懸沉澱細胞，轉入培養瓶中在37℃，5%CO₂條件下培養。取對數生長期的HepG2細胞，PBS溶液清洗兩次後，加入1ml的0.25%的胰蛋白酶(購自Gibco)消化3分鐘，加入6ml的生長培養基重懸細胞終止反應。用生長培養基將HepG2細胞調整至0.8×10⁶個/ml，接種於黑色底部透明的聚-D-賴胺酸塗層96孔細胞培養板(購自Nunc)中，每孔100μL，37℃，5%CO₂培養箱中孵育6~7小時。棄生長培養基，替換為分析培養基(DMEM+5%FBS)，100μl/孔，37℃，5%CO₂培養箱中培養過夜。分別將抗體樣品(ADI-10085、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089)用分析培養基稀釋至66.7nmol/L。再以66.7nmol/L的樣品為起始濃度，進行4倍梯度稀釋，陽性對照抗體(阿利羅庫單抗、依伏羅庫單抗和羅德希珠單抗)和陰性對照(LDL、PCSK9+LDL和IgG)進行相同操作。將獲得的各濃度梯度樣品分別各取60μl與60μl的66.7nmol/L的PCSK9進行等體積混合，從而獲得各個混合液。空白對照為120μl的分析培養基。吸棄96孔板內液體，每孔加入50μl上述混合液和空白對照樣品，置於37℃，5%CO₂培養箱中孵育1小時。取出培養板，每孔加入50μl，用分析培養基稀釋的6μg/ml的BODIPY標記的LDL溶液(購自life technologies)，將培養板置於37℃，5%CO₂條件下培養4小時。棄去培養基，每孔加入100μl PBS溶液洗滌培養板後棄去。洗滌兩次，每孔再加入100μl PBS溶液。用Spectra Max I3酶標儀，讀取螢光值。

所獲得的螢光值原始數據在下表4中列出，並用GraphPad Prism6軟件對表4中所公開的數據進行分析作圖，從而得到第2圖。從實驗結果可知，與未加抗PCSK9抗體的螢光值相比，抗PCSK9抗體(ADI-10085、ADI-10087、ADI-10088、ADI-10089)作用HepG2細胞的情況下螢光值增強約兩倍。這些數據證明本申請所公開的各個抗PCSK9抗體在HepG2細胞中可以增加LDLR的恢復能力，抑制了PCSK9誘導的LDL-c攝入降低，從而使得HepG2細胞增加對LDL-c的攝取，並且在16.8nM和66.7nM的梯度，其效果均優於陽性對照抗體。

實施例5. 細胞LDLR內化分析實驗

PCSK9能與LDLR直接結合促使LDLR內化，進入肝細胞後運至溶酶體降解，從而減少細胞表面表達的LDLR，增加血清中LDL-c的水平。抗PCSK9抗體阻斷PCSK9與LDLR的結合，從而降低PCSK9消耗LDLR的能力，本實驗藉由使CHO-LDLR細胞與抗PCSK9抗體及PCSK9蛋白溶液共同孵育，採用上述流式細胞儀檢測LDLR的螢光值，比較抗PCSK9抗體與陽性對照抗體(依伏羅庫單抗)螢光值，來判斷抗PCSK9抗體對細胞LDLR內化的生物活性。

使用RPMI 1640細胞培養基(Gibco)將實施例1所述PCSK9蛋白配置為濃度50μg/ml，將60μl，1000nm的抗PCSK9抗體(ADI-10085和ADI-10087)與PCSK9(50μg/ml)溶液混合，均勻後孵育30分鐘，對陽性抗體對照進行相同處理。取CHO細胞和CHO-LDLR細胞分別離心，500g室溫離心3分鐘，用PBS溶液重懸細胞並調整細胞密度至2×10⁶個/ml，加入96孔U型板中，100μl/孔，將上述混合的樣品100μl/孔加入至培養板中，一式四份，吹打均勻，4℃孵育4小時。之後用200μl的PBS溶液洗3次，500g室溫離心3分鐘。取5μl抗-LDLR-PE(北京義翹公司，貨號20131-R301-P)加入100μl PBS溶液中稀釋，然後每孔100μl加入96孔U型板中，避光孵育30分鐘。再用200μl的PBS溶液洗3次，500g離心3分鐘，用細胞培養基重懸所得到的細胞，並採用流式細胞儀檢測CHO-LDLR細胞表面標記PE螢光的LDLR蛋白的螢光信號，實驗結果請參見表5。將表5原始數據用GraphPad Prism6軟件進行分析作圖獲得第3圖。

根據表5的結果可見，本申請獲得的抗體有效阻止了細胞的LDLR內化。

實施例6 抗PCSK9抗體對健康SD大鼠的降血脂作用

將受試抗體(抗PCSK9抗體ADI-10087)按照本領域常規方法施用給SPF級SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，其中雌性大鼠體重約254~294g，約9~12週齡；雄性大鼠體重約369~420g，約9~12週齡。各組均為單次給藥，給藥方案詳見表6。

各組動物按以下時間點根據常規方法頸靜脈采血：給藥前0h(D1)，給藥後72h(D4)、168h(D8)、336h(D15)、504h(D22)、672h(D29)、840h(D36)。收集至無抗凝劑的試管中，冰上放置凝結後2~8℃，5000rpm/min離心10分鐘，收集血清，用Hitachi-7060型自動生化分析儀進行LDL-C和HDL-C的測定。根據血脂分析數據，計算各時間點LDL-C和HDL-C相對給藥前(基線)變化率(%LDL-C和%HDL-C)。根據實驗結果發現，大鼠單次皮下給予3~30mg/kg本申請的抗PCSK9抗體後，能夠劑量依賴地降低血清LDL-C和HDL-C水平(第6圖和第7圖)。例如分別在給藥後3天、7天、14天、21天較基線水平有顯著降低。此外，申請人同時發現當大鼠單次皮下給予10mg/kg依伏羅庫單抗後，血清LDL-C和HDL-C水平並無顯著降低。

對於本發明的其它抗體，也可以應用同樣的方法進行上述測定。

實施例7 抗PCSK9抗體對健康食蟹猴的降血脂作用

將受試抗體(抗PCSK9抗體ADI-10087)按照本領域常規方法施用給食蟹猴(廣東春盛生物科技發展有限公司)，其中雌性動物體重約2-4kg，年齡約3-5歲，雄性動物體重約3-5kg，年齡約3-5歲。給藥方案請參見表7，其中組1~5為單次給藥，組6為每週1次給藥，共4次給藥。

針對組1~5，在以下時間點按照常規方法從動物的給藥肢體的對側前肢或後肢皮下靜脈或腹股溝股動脈/腹股溝靜脈採血：給藥前0h及給藥後24h(D2)、72h(D4)、120h(D6)、168h(D8)、336h(D15)、504h(D22)、672h(D29)、840h(D36)、1008h(D43)、1176h(D50)及1344h(D57)。關於組6，在以下時間點按照上述方法采血：首次給藥前0h及給藥後24h(D2)、72h(D4)、120h(D6)、168h(D8，第2次給藥前)、336h(D15，第3次給藥前)取血。末次給藥於給藥前0h，給藥開始後24h(D2)、72h(D4)、120h(D6)、168h(D8)、336h(D15)、504h(D22)、672h(D29)、840h(D36)、1008h(D43)、1176h(D50)及1344h(D57)採血。

收集全血至含促凝劑和分離膠的試管中，冰上放置凝結後2~8℃離心，5000rpm/min，離心10min，收集血清。全部血樣採集完成後，進行總膽固醇(TC)、LDL-C、HDL-C的測定。根據血脂分析數據，計算各時間點LDL-C和HDL-C相對於給藥前(基線)變化率(%LDL-C和%HDL-C)。根據實驗結果發現：食蟹猴單次皮下給予3、10、30mg/kg本申請的抗PCSK9抗體(ADI-10087)後，血清LDL-C(第8圖)和TC(第10圖)水平均顯著降低，並呈現出較為明顯的量效關係，在給藥後3~28天較基線水平有顯著降低。表明，本申請公開的抗體可以有效用於降低與LDL-C和TC相關的狀況和/或病症，例如用於降低血脂。

抗PCSK9抗體給藥後對食蟹猴血清HDL-C水平總體上無明顯影響(第9圖)。

然而本申請人驚奇地發現，食蟹猴單次皮下分別給予10mg/kg本申請的抗PCSK9抗體和依伏羅庫單抗後，發現依伏羅庫單抗給藥後LDL-C呈現較基線水平顯著降低的時間段僅為14天，短於同劑量本申請抗體給藥後的21天，即本申請的抗PCSK9抗體顯著降低LDL-C的時間長於依伏羅庫單抗。

實施例8：本發明的抗PCSK9抗體液體製劑(製劑A)的製備

根據處方A配製濃度為150mg/ml的抗PCSK9液體製劑

處方A

將從實施例2獲得的抗PCSK9抗體(ADI-10087)加入到超濾離心管中(截流分子量30KD)，離心濃縮後加入無聚山梨酯80和抗PCSK9抗體的處方A水溶液(1.5g/L組胺酸，90mmol/L精胺酸，3%山梨醇，pH 5.5)稀釋後繼續濃縮，如此反復，直至置換完全。將置換後的蛋白調整到150mg/ml後加入1/100體積的聚山梨酯80水溶液(30g/L)，使聚山梨酯80的終濃度為0.3g/L。將此半成品無菌過濾後分裝至西林瓶中，加蓋橡膠塞和鋁塑蓋，獲得成品。

實施例9：本發明的抗PCSK9抗體液體製劑的對比例(製劑B)的製備

對比例：根據處方B配製濃度為150mg/ml的抗PCSK9液體製劑

處方B

將從實施例2獲得的抗PCSK9抗體(ADI-10087)加入到超濾離心管中(截流分子量30KD)，離心濃縮後加入無聚山梨酯80和抗PCSK9抗體的處方B水溶液(1.5g/L組胺酸，180mmol/L精胺酸，pH 5.5)稀釋後繼續濃縮，如此重複，直至置換完全。將置換後的蛋白調整到150mg/ml後加入1/100體積的聚山梨酯80水溶液(30g/L)，使聚山梨酯80的終濃度為0.3g/L。將此半成品無菌過濾後分裝至西林瓶中，加蓋橡膠塞和鋁塑蓋，獲得成品。

實施例10：抗PCSK9抗體液體製劑的黏度測定

採用錐板黏度計(Brookfield，CAP1000+/2000+，詳情見http：//www.sinoinstrument.com/product_details-4-83-401-60.html)在室溫20~25℃下進行黏度測定。選擇轉子和速度(轉子：cp-40；轉速： 25rpm)。將轉子連接到連接螺母上，調節位置，加入樣品。按下Run按鍵，進行樣品黏度測定。根據上面實驗測得製劑A的黏度為5.2厘泊，製劑B的黏度為6.0厘泊。令人驚奇的是，製劑A的黏度明顯小於製劑B的黏度，表明精胺酸和山梨醇的組合更有利於降低高濃度抗體製劑的黏度。

實施例11：抗PCSK9抗體液體製劑的蛋白純度變化

為了考查製劑A和製劑B的穩定性，進行了加速穩定性實驗。將分裝至西林瓶中並加塞軋蓋後的製劑A和製劑B成品置於在40℃±2℃/60%RH±5%RH條件下進行加速穩定性考察，考察時間持續2個月。期間藉由下述的SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法測定蛋白純度的變化。

SEC-HPLC法：

將樣品濃度稀釋至2mg/ml，用親水矽膠體積排阻色譜柱TSKG 3000 SWx1，蛋白進樣量100μg，流動相為20mmol/L Na₂HPO₄‧12 H₂O、150mmol/L NaCl、200mmol/L精胺酸，pH 6.8，流速0.5ml/分鐘，檢測波長280nm，柱溫25℃，用面積歸一化法計算。

CE-SDS法：

取樣品約100μg，加pH7.0樣品緩衝液使總體積為95ul，還原樣品加5μl β-巰基乙醇，非還原樣品加5μl 250mmol/L NEM，混合後70℃加熱10分鐘，進行檢測。

在SEC-HPLC法中，基於SEC主峰下降百分比，測得蛋白純度變化，製劑A的蛋白純度在1個月時下降2.6%，在2個月時下降3.7%。而製劑B的蛋白純度在1個月時下降4.1%，在2個月時下降7.0%。基於非還原CE-SDS下降百分比，測得蛋白純度變化，製劑A的蛋白純度在2周時下降0.4%，在1個月時下降2.0%。而製劑B的蛋白純度在2周時下降2.5%，在1個月時下降7.3%。可見，製劑A的純度變化速率顯著慢於製劑B。相對於製劑B，製劑A具有更高的穩定性。

實施例12：抗PCSK9抗體液體製劑的電荷異質性測定

在不同時間點，從實施例11中進行加速穩定性實驗的製劑A和製劑B取樣，進行電荷異質性檢測。採用Beckman Uncoated Capillary毛細管，Beckman PA800 plus毛細管電泳儀，取樣電壓為0.5psi，取樣時間10.0s，分離電壓30kV，分析時間30min。用面積歸一化法計算酸性組分、鹼性組分與主峰的峰面積占總峰面積的百分比。製劑A在2周時CZE主峰下降0%，在1個月時下降2.9%。而製劑B在2周時CZE主峰下降2.0%，在1個月時下降7.6%。

可以看到製劑A的電荷異質性變化速率顯著慢於製劑B，可見精胺酸和山梨醇的組合使得製劑更少發生電荷異質性變化。

以上描述了本發明的示例性實施方案，本領域技術人員應當理解的是，這些公開內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案。

<110> 信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)

<120> 包含抗PCSK9抗體的製劑及其用途

<160> 53

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區CDR1

<400> 4

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區CDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區CDR3

<400> 6

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR1

<400> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR1

<400> 8

<210> 9

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<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR1

<400> 9

<210> 10

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<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR1

<400> 11

<210> 12

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR1

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<210> 13

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR1

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<210> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR2

<400> 14

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR2

<400> 15

<210> 16

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR2

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR2

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<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 重鏈可變區CDR3

<400> 18

<210> 19

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR3

<400> 19

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR1

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> X1選自V和I

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> X2選自S、V、R、G、W

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> X3選自S或A

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> X4選自S或A

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> X5選自G、A、S或T

<400> 20

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR2

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> X1選自I或A

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> X2選自Y和N

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> X3選自S、K和R

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> X4選自S和F

<400> 21

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區CDR3

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> X1選自G和N

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> X2選自D和G

<400> 22

<210> 23

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-02396的重鏈可變區

<400> 23

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區

<400> 24

<210> 25

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-09111的重鏈可變區

<400> 25

<210> 26

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-09112的重鏈可變區

<400> 26

<210> 27

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-09113的重鏈可變區

<400> 27

<210> 28

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10085的重鏈可變區

<400> 28

<210> 29

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10086的重鏈可變區

<400> 29

<210> 30

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10087的重鏈可變區

<400> 30

<210> 31

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10088的重鏈可變區

<400> 31

<210> 32

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10089的重鏈可變區

<400> 32

<210> 33

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10090的重鏈可變區

<400> 33

<210> 34

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-02396的重鏈

<400> 34

<210> 35

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈

<400> 35

<210> 36

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-09111重鏈

<400> 36

<210> 37

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-09112重鏈

<400> 37

<210> 38

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-09113重鏈

<400> 38

<210> 39

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10085重鏈

<400> 39

<210> 40

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10086重鏈

<400> 40

<210> 41

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10087重鏈

<400> 41

<210> 42

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10088重鏈

<400> 42

<210> 43

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10089重鏈

<400> 43

<210> 44

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ADI-10090重鏈

<400> 44

<210> 45

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區FR1

<400> 45

<210> 46

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區FR2

<400> 46

<210> 47

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區FR3

<400> 47

<210> 48

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈可變區FR4

<400> 48

<210> 49

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區FR1

<400> 49

<210> 50

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區FR2

<400> 50

<210> 51

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區FR3

<400> 51

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈可變區FR4

<400> 52

<210> 53

<211> 692

<212> PRT

<220>

<223> PCSK9抗原的胺基酸序列

<400> 53

Claims

一種液體抗體製劑，其包含(i)抗PCSK-9抗體或其抗原結合片段，其中該抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中，該VH包含互補決定區域(CDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含SEQ ID NO：8、的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，HCDR2包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且HCDR3包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或其中HCDR1包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，HCDR2包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且HCDR3包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或其中HCDR1包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，HCDR2包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且HCDR3包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或其中HCDR1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列或由所述胺基酸序列組成，HCDR2包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成，且HCDR3包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；該VL包含互補決定區域(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成； LCDR2包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；LCDR3包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；(ii)緩衝劑；(iii)減黏劑；和(iv)表面活性劑。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段的濃度為50至200mg/mL。
如申請專利範圍第2項所述的液體抗體製劑，其中本發明的液體抗體製劑中的抗PCSK9抗體或其抗原結合片段的濃度為100mg/mL至200mg/mL。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為0.01-50mg/ml。
如申請專利範圍第4項所述的液體抗體製劑，其中本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為0.1-50mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該緩衝劑選自組胺酸、麩胺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和三羥甲基胺基甲烷。
如申請專利範圍第6項所述的液體抗體製劑，其中該緩衝劑為組胺酸。
如申請專利範圍第4、6或7項中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑的濃度為10mmol/L-1000mmol/L。
如申請專利範圍第8項所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑的濃度為20mmol/L-500mmol/L。
如申請專利範圍第1項所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑選自糖醇、精胺酸、精胺酸鹽酸鹽、硫氰酸鈉、硫氰酸銨、硫酸銨、氯化銨、氯化鈣、氯化鋅、乙酸鈉和其組合。
如申請專利範圍第10項所述的液體抗體製劑，其中該糖醇為山梨醇。
如申請專利範圍第11項所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑為山梨醇。
如申請專利範圍第12所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑是濃度為1%-6%(w/v)的山梨醇。
如申請專利範圍第11項所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑是山梨醇與精胺酸或精胺酸鹽的組合。
如申請專利範圍第14項所述的液體抗體製劑，其中該減黏劑是山梨醇與精胺酸鹽酸鹽的組合。
如申請專利範圍第14項所述的液體抗體製劑，其中該山梨醇的濃度為1%-6%(w/v)；該精胺酸或精胺酸鹽的濃度為50mmol/L~180mmol/L。
如申請專利範圍第16項所述的液體抗體製劑，其中該山梨醇的濃度為2%-4%(w/v)；該精胺酸或精胺酸鹽的濃度為70mmol/L~150mmol/L。
如申請專利範圍第17項所述的液體抗體製劑，其中該山梨醇的濃度為3%(w/v)；該精胺酸或精胺酸鹽的濃度為90mmol/L。
如申請專利範圍第9至18項中任何一項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑的濃度為0.01-5mg/ml。
如申請專利範圍第19項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑的濃度為0.05-1mg/ml。
如申請專利範圍第19項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑是非離子型表面活性劑。
如申請專利範圍第21項所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑是普洛尼克、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-40、或聚山梨醇酯-20。
如申請專利範圍第1或22項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑的pH值為5.0~6.0。
如申請專利範圍第23項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑的pH值為5.2-5.8。
如申請專利範圍第24項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑在25℃的黏度為1.0匣泊-20匣泊。
如申請專利範圍第25項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑在25℃的黏度為1.0匣泊-10匣泊。
如申請專利範圍第26項所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑為藥物製劑。
如申請專利範圍第26項所述的液體抗體製劑，其中所述液體抗體製劑為注射劑。
如申請專利範圍第27項所述的液體抗體製劑，其中所述液體抗體製劑為皮下注射劑。
如申請專利範圍第1、20至22項中任一項所述的液體抗體製劑，其中該抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL，其中，(a)重鏈可變區VH包含選自SEQ ID NO：28、30、31和32的胺基酸序列或由其組成；和(b)輕鏈可變區VL包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列或由其組成。
如申請專利範圍第1、20至22項中任一項所述的液體抗體製劑，其中該抗PCSK9抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，其中(a)重鏈包含選自SEQ ID NO：39、41、42和43的胺基酸序列或由其組成；和(b)輕鏈包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列或由其組成。
如申請專利範圍第1、20至22項中任一項所述的液體抗體製劑，其中該抗PCSK9抗體為多株抗體、單株抗體或者兩者的組合。
如申請專利範圍第32項所述的液體抗體製劑，其中該抗PCSK9抗體為單株抗體。
如申請專利範圍第1至7和10至18項中任一項所述的液體抗體製劑，其中該抗PCSK9抗體具有以下一個或多個特性： (1)結合人PCSK9蛋白質，具有的平衡解離常數(K_D)為10^-9M至10^-13M；(2)阻斷人PCSK9與人LDLR結合；(3)增加LDLR的恢復能力或抑制PCSK9誘導的LDL-C攝入降低，該抗體增加細胞對LDLC攝取的能力比對照抗體高至少2倍；(4)有效阻止了細胞的LDLR內化；(5)劑量依賴地降低血清中LDL-C水平和/或總膽固醇水平；(6)15天以上顯著降低血清中LDL-C水平。
一種固體製劑，其由申請專利範圍第1至34項中任何一項所述的液體抗體製劑凍乾而獲得。
一種申請專利範圍第1至34項中任何一項所述的液體抗體製劑製備用於在對象中降低對象的膽固醇水平的藥物的用途。
一種申請專利範圍第1至34項中任何一項所述的液體抗體製劑製備用於治療膽固醇相關疾病的藥物中的用途。