CN101041907B - Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗癌药物Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物，获得所述复合物的方法，以及所述复合物的三维晶体结构及其应用。本发明提供的复合物的三维晶体结构的分析结果不仅揭示了Rituximab和抗原表位肽相互作用的关键残基，并且，为设计和改造Rituximab以得到更高亲和力和更高特异性的抗体提供了理论基础，可用于基于所述复合物的结构的药物的虚拟改造。另外，本发明提供复合物中，CD20抗原表位肽段呈现独特的环状结构，可用于筛选针对该表位的新的抗体。
Description
技术领域
本发明属于抗体药物技术领域，具体地说，是关于一种抗癌药物Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物，获得所述复合物的方法，以及所述复合物的三维晶体结构及其应用。
背景技术
人CD20是一类表达于B细胞表面的标记分子(Stashenko，P.，L.M.Nadler，et al.(1980).J.Immunol.125(4)：1678-85)。它是一个四次跨膜的蛋白，被预测有一个大的胞外环区(从142位赖氨酸到182位的酪氨酸)，并且可以在B细胞表面寡聚化(Bubien，J.K.，L.J.Zhou，et al.(1993).J.Cell Biol.121(5)：1121-32；Teeling，J.L.，W.J.Mackus，et al.(2006).J.Immunol.177(1)：362-71.)。尽管CD20的确切功能并不是很清楚，但是很多实验证据显示CD20的功能很可能是形成或者调节电压门控性钙离子通道(Bubien，J.K.，L.J.Zhou，et al.(1993).J.Cell Biol.121(5)：1121-32)。由于CD20分子具有以下一些性质：CD20分子在80％以上的B细胞淋巴瘤中有表达，但是在干细胞，原B细胞以及一般的浆细胞和其它组织中没有表达，而且被抗体交联以后并不引起细胞的内吞作用(Anderson，K.C.，M.P.Bates，et al.(1984).Blood 63(6)：1424-33；Press，O.W.，J.Howell-Clark，et al.(1994).Blood 83(5)：1390-7)，使其成为一个非常好的B细胞淋巴瘤的药物靶标分子。
Rituximab(美罗华)是罗氏公司生产的一种广泛应用于某些淋巴瘤以及自身免疫性疾病的单克隆抗体类药。它的抗原表位在2006年被定位于人B细胞表面抗原CD20的胞外区的从163位天冬酰胺到187位谷氨酰胺的区域(Polyak，M.J.and J.P.Deans(2002).Blood 99(9)：3256-62；Teeling，J.L.，W.J.Mackus，et al.(2006).J Immunol 177(1)：362-71)。尽管Rituximab最初被应用于低度的非霍奇金性淋巴瘤，但后来的临床数据显示Rituximab在其它种类的淋巴瘤以及自身免疫疾病的治疗中都有一定的疗效(Leget，G.A.and M.S.Czuczman(1998).Curr Opin Oncol 10(6)：548-51；Boye，J.，T.Elter，et al.(2003).Ann Oncol 14(4)：520-35；Check，E.(2004).Nature 428(6985)：786；Edwards，J.C.，L.Szczepanski，et al.(2004).N Engl J Med 350(25)：2572-81)。多重的机制被证明在Rituximab的治疗过程中发挥作用，包括补体依赖性的细胞杀伤作用以及抗体依赖性的细胞杀伤作用，并且能够诱导细胞凋亡(Smith，M.R.(2003).Oncogene 22(47)：7359-68)。值得注意的是B细胞表面的CD20表达在不同的患者之间有着显著的差异。因此，基于Rituximab获得高亲和性和高特异性的抗体对于CD20表达水平低的患者的治疗有着重要的意义(Keating，M.and S.O′Brien(2000).Semin Oncol 27(6 Suppl 12)：86-90；McLaughlin，P.，F.B.Hagemeister，et al.(2000).Semin Oncol 27(6 Suppl 12)：37-41)。
除了Rituximab和Zevalin(Rituximab的原型鼠源抗体用放射性90Y标记)，另一个针对人CD20的抗体B1也在2003年通过FDA的认证被用于非霍奇金性淋巴瘤的治疗(Garber，K.(2003).J Natl Cancer Inst 95(3)：189)。这几种以及其它的一些针对CD20的抗体，例如1F5，AT80和2H7，被认为识别CD20上相似的区域(从165位酪氨酸到182位酪氨酸)(Polyak，M.J.and J.P.Deans(2002).Blood 99(9)：3256-62；Teeling，J.L.，W.J.Mackus，et al.(2006).J Immunol 177(1)：362-71)。然而这些抗体在功能上还是有差异。比如大部分的抗体结合会使CD20积聚到去垢剂不溶的脂筏中，但是B1却没有这样的作用。这个性质可能与其介导补体依赖性的细胞杀伤作用相关，但与其引起细胞凋亡的能力无关(Deans，J.P.，S.M.Robbins，et al.(1998).J Biol Chem 273(1)：344-8；Chan，H.T.，D.Hughes，et al.(2003).Cancer Res 63(17)：5480-9；Cragg，M.S.，S.M.Morgan.et al.(2003).Blood 101(3)：1045-52)。
为了解CD20抗体的功能多样性以及其潜在的机制，鉴定Rituximab以及其它识别CD20的单克隆抗体的抗原表位在近几年引起广泛的兴趣。人和鼠的CD20分子的序列对比显示尽管两者有73％的序列一致性，但是在胞外环区的43个氨基酸中只有16个相同(Polyak，M.J.and J.P.Deans(2002).Blood 99(9)：3256-62)。突变实验显示出人CD20上的170位的丙氨酸和172位的脯氨酸是决定CD20上Rituximab所识别的抗原表位的关键(Polyak，M.J.and J.P.Deans(2002).Blood 99(9)：3256-62)。七聚的环肽以及七聚和十三聚的线性肽噬菌体展示文库实验显示CD20上171NPS173三个氨基酸是CD20被Rituximab识别所必需的，170位的丙氨酸可以被替换为丝氨酸(Perosa，F.，E.Favoino，et al.(2006).Blood 107(3)：1070-7)。类似的实验显示CD20上170ANPS173和182YCYSI185被167位和183位的两个半胱氨酸连起来的二硫键连接起来构成Rituximab识别的区域(Binder，M.，F.Otto，et al.(2006).Blood 108(6)：1975-8.)。然而Rituximab识别CD20的具体的机制还是不清楚。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种抗癌药物Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物。
本发明的另一个目的在于，提供一种Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽的复合物的制备方法。
本发明的又一个目的在于，提供一种Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽形成的复合物的三维晶体结构。
本发明的还有一个目的在于，提供一种Rituximab的Fab片段与CD20抗原表位多肽形成的复合物的三维晶体结构的用途。
为实现上述目的，发明人设计并合成了CD20从163位天冬酰胺到187位谷氨酰胺的肽段，并且，在肽链中、对应于人CD20胞外区的167位和183位的这2个半胱氨酸之间人工合成引入了一个链内的二硫键，以模拟CD20自然的状态。
随后，发明人将纯化的Rituximab的Fab和抗原表位肽混合并进行共结晶，获得Rituximab的Fab和抗原表位肽的复合物。
发明人还测定了所述Rituximab的Fab片段与抗原表位肽的共结晶复合物的三维晶体结构，并对所述的复合物的结构进行了分析。
所述的复合物的结构的分析结果显示了Rituximab和抗原表位肽相互作用的关键残基。同时，分析结果还很好的解释了以往文献(Polyak，M.J.and J.P.Deans(2002).Blood99(9)：3256-62)中提及的生化数据，即人CD20上的170位的丙氨酸和172位的脯氨酸是决定CD20上Rituximab所识别的抗原表位的关键；并且，为设计和改造Rituximab以得到具有更高亲和力和更高特异性的抗体提供了理论基础。根据本发明，在所述的复合物中，CD20抗原表位肽段呈现独特的环状结构，可用于筛选针对该表位的新的抗体。
附图说明
图1显示了电泳和动态光散射检测Rituximab Fab的纯度和均一性的结果。其中，图1A为电泳结果，图1B为动态光散射结果。
图2显示了抗原表位肽的分析型反相色谱层析结果。
图3显示了抗原表位肽的质谱分析结果。
图4是Rituximab的Fab片段与其抗原表位肽复合物结构中抗原表位肽的电子密度的立体图。
图5是Rituximab的Fab片段与抗原表位肽的复合物的结构的立体图。
具体实施方式
以下结合附图，以具体实施例对本发明作进一步详细说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等中所述的条件进行。
实施例1、抗体的制备
以木瓜蛋白酶酶切Rituximab(罗氏公司)，酶切条件为：10mg/ml的Rituximab中加入木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich)至终浓度为0.1mg/ml；然后于37℃，酶切18小时，缓冲液为：0.1M Tris-HCl+2mM EDTA+1mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol)，pH8.0。
酶切产物先采用SP-Sepharose FF(GE Healthcare)进行阳离子交换层析，再采用Phenyl-Sepharose HP(GE Healthcare)进行疏水相互作用层析；通过上述步骤，获得Rituximab的Fab片段。
采用SDS-PAGE和动态光散射实验对Fab片段的纯度和均一性进行验证，结果如图1所示；如图1结果所示，纯化得到的Rituximab的Fab片段，其纯度大于95％，并且均一性良好。
将纯化的Fab片段浓缩至8mg/ml，同时将缓冲液置换为：100mM的NaCl+10mMTris-HCl，pH8.0。
实施例2、CD20抗原表位肽的制备
对应于人CD20胞外区163位到187位残基的肽段，设计并合成了一段含有25个氨基酸的抗原表位肽片段，该片段序列如下：
NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ。
同时，在该片段中对应于人CD20胞外区的167位和183位残基的2个半胱氨酸(序列中已用下划线标识出所述的半胱氨酸)之间引入了一个链内二硫键，以模拟CD20自然的状态。
参考操作手册所述方法，通过分析型反相色谱层析(图2)和质谱分析(图3)，确定所制备的氨基酸片段的纯度大于95％。
实施例3-5、抗体与抗原表位肽的共结晶
分别按照1∶1、1∶5和1∶10的摩尔比，将纯化好的Rituximab Fab和CD20抗原表位肽，在4℃混合12小时，获得蛋白-肽的混合溶液。
采用悬滴扩散法，将混合所获得的蛋白-肽的混合溶液与结晶池液(0.2 M乙酸钙，0.1M二甲砷酸钠，pH6.5，18％聚乙二醇8000)各1微升混合形成悬滴后，置于含有500微升结晶池液的结晶槽中进行晶体生长。
在4℃下生长两周左右，即收获方形的共结晶复合物晶体。
将晶体冷冻保存在Paratone-N(Hampton Research)中，然后迅速降温至-170℃。
在NW12射线源(日本光子工厂)上，进行共结晶复合物的衍射实验，并收集共结晶复合物的2.6埃分辨率的衍射数据，数据用软件HKL2000(光子工厂提供)来处理，数据的统计总结在表1中。
由表1的结果可知，Rituximab Fab和在CD20上被它识别的表位肽的复合物晶体衍射数据，有较高的质量和完整度，这套数据可以很好的反映出复合物的结构。从结构的修正统计来看，整体结构模型的误差低于一般公认的可接受的结构模型误差标准(R因子低于25％，Free R因子低于30％)，可以有效地反映出Rituximab Fab与其在CD20上的表位肽的复合物的真实结构。
表1、衍射数据和结构修正统计表
| 衍射数据统计表 | |
衍射光源波长( |
1.0000 |
| 空间群 | P212121 |
| 晶胞参数 | |
a轴( |
96.4 |
b轴( |
98.8 |
| c轴() | 107.2 |
衍射分辨率( |
50.0-2.60(2.69-2.60) |
| 观察到的衍射点 | 119,890 |
| 实际独立的衍射点(信噪比＞0) | 29,570 |
| 平均冗余度 | 4.1(3.7) |
| 平均信噪比 | 17.8(2.0) |
| 完整度(％) | 90.6(91.5) |
| Rmerge值(％)b | 7.6(43.4) |
| 结构修正模型的数据统计 | |
| 衍射点数量(Fo＞0σ(Fo)) | |
| 修正组 | 29,131 |
| 检测组 | 1,460 |
| R因子(％)c | 23.9(35.6) |
| FreeR因子(％) | 29.6(42.8) |
| 氨基酸残基数 | 913 |
| 水分子的数目 | 212 |
所有原子的平均B因子( |
49.0 |
| 键长的均方差() | 0.008 |
| 键角的均方差(°) | 1.6 |
| Ramachandran点分布(％) | |
| 最可几区 | 87.4 |
| 可几区 | 11.6 |
| 基本上可几区 | 0.8 |
| 不可几区 | 0.3 |
a括号中的数据代表最高衍射层的统计数据。
bRmerge＝∑hkl∑i|Ii(hkl)i-<I(hkl)>|/∑hk1∑iIi(hkl)。
cR因子＝||Fo|-|Fc||/|Fo|。
实施例6、共结晶复合物的结构测定，优化和分析
Rituximab Fab与其在CD20上的表位肽的共结晶复合物的结构在软件Phaser(http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/phaser/)中用分子置换的方法进行解析：以人类单克隆抗体A5B7的Fab片段的结构(Banfield，M.J.，D.J.King，et al.(1997).Proteins 29(2)：161-71)作为分子置换的模型；结构的修正在CNS(http://cns.csb.yale.edu/v1.1/)中用标准的流程进行，包括以下步骤：共轭梯度能量最小化，分子动态模拟退火，B因子的修正(Brunger，A.T.，P.D.Adams，et al.(1998).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54(Pt 5)：905-21)。Free R值用5％随机选择的数据来计算。
在软件O(http://www.imsb.au.dk/～mok/o/o_man/manual.html)中经过模型构建之后，电子密度图(图4)中可以清晰地发现对应于肽的电子密度。结构的立体化学分析采用了软件Procheck(http://www.biochem.ucl.ac.uk/～roman/procheck/procheck.html)，该结构修正的统计结果见表1。CD20表位肽与Rituximab的Fab片段的复合物的结构被修正到R值23.9％和free R值到29.6％。
Fab的虹角用Stanfield等人表述的方法来计算(Stanfield，R.L.，A.Zemla，et al.(2006).J.Mol Biol 357(5)：1566-74)，结果为139度。
复合物的整体结构利用用软件Pymol(http://pymol.sourceforge.net/)制作，结果见图5。如图5所示，晶体结构的一个不对称单元中包含两个抗原抗体复合物分子，这两者的构象非常相似。其中，抗体的结构是经典的由四个β桶形结构域所组成的规范的免疫球蛋白折叠：轻链折叠为VL和CL结构域，重链折叠为VH和CH结构域，每个结构域中包含一个链内二硫键稳定其结构，重链和轻链的碳末端通过一个链间二硫键连接起来。抗体的六个互补决定区中，轻链L1和L2没有参与与抗原的相互作用，轻链L3和重链H1、H2、H3四个互补决定区形成一个口袋与抗原发生相互作用。如图4和图5显示，复合物的结构中的肽段形成一个特殊的环状构象。肽段的N端的环尽管没有二级结构但是其结构却由于与Fab的相互作用而得到稳定，中间的一小段310螺旋和环通过丰富的氢键与肽上其它部分相互作用形成稳定的结构。C末端是一小段疏水的α螺旋，预测其为CD20跨膜区的延伸。
Fab与抗原表位肽之间有440平方埃的面积被包埋在相互作用的界面内，并且具有高的形状互补值(0.83)，远高于一般的抗原抗体之间0.64-0.68的形状互补值(Lawrence，M.C.and P.M.Colman(1993).J Mol Biol 234(4)：946-50)。
Rituximab的Fab的互补决定区L3，H1，H2和H3参与了与肽段的相互作用，并且形成一个深的口袋将肽段中的几个关键氨基酸170ANP172包埋在口袋的内部。它们之间有一些氢键的相互作用，特别是171位的天冬酰胺与Fab上重链99位的丝氨酸和106位的色氨酸形成两个氢键，而肽段上173位的丝氨酸则通过其侧链的羟基和主链的羰基与Fab上重链的33位的天冬酰胺的侧链的酰胺基形成两个氢键。除去氢键以外肽段和Fab之间还有丰富的范德华力接触，尤其是在关键的170ANPS173与Fab之间有79个范德华力接触，而整体的肽段与Fab之间一共有97个范德华力接触。
根据以上对复合物的结构的分析，可将所获得的信息用于基于所述复合物的结构的药物的虚拟改造；还可用于筛选针对CD20抗原表位肽段呈现独特的环状结构的新的抗体。
Claims (5)
1.一种抗体与抗原的复合物，其特征在于，所述抗体为Rituximab的Fab片段，所述抗原为CD20抗原表位肽，所述的CD20抗原表位肽的氨基酸序列为：
NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ，所述的CD20抗原表位肽的2个半胱氨酸之间有一个链内二硫键；
且所述复合物为共结晶复合物，通过以下步骤制备：
A、Rituximab的Fab和CD20抗原表位肽按1∶1～1∶10的摩尔比在4℃混合12小时，获得蛋白-肽的混合溶液；
B、将混合所获得的蛋白-肽的混合溶液与结晶池液混合形成悬滴后，置于含有结晶池液的结晶槽中进行晶体生长，在4℃下生长两周，得到复合物晶体；
其中，所述结晶池液包含0.2M乙酸钙，0.1M二甲砷酸钠，pH 6.5，18％聚乙二醇8000；
得到的所述复合物晶体的衍射数据为：
空间群：P212121；
晶胞参数a轴
96.4；b轴
98.8；c轴
107.2。
2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述Fab和CD20抗原表位肽按1∶5的摩尔比混合。
3.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，含有蛋白-肽的混合悬滴与结晶池液的体积比为1∶1。
4.如权利要求1所述的复合物的应用，其特征在于，用于基于所述复合物的结构的药物的虚拟改造。
5.如权利要求1所述的复合物的应用，其特征在于，用于筛选针对CD20抗原表位肽段的抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20101208 Termination date: 20160316 |