CN104755496A - 作为癌症治疗和诊断靶标的ly75 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于癌症(如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌)治疗、筛选、诊断和预后的方法和组合物，用于监测癌症(如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌)治疗的有效性并用于药物开发。

Description

作为癌症治疗和诊断靶标的LY75
发明概述
本发明涉及癌症(如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和/或皮肤癌)相关膜蛋白的鉴定，该蛋白可用作癌症治疗的治疗性靶标或作为癌症的标记物。具体而言，该蛋白代表生物靶标，可针对其制备亲和试剂，包括治疗性抗体，或其他药剂。本发明还涉及这类亲和试剂在癌症的治疗和/或诊断中的应用。
技术背景
癌症(如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌)治疗中的主要挑战是改善早期检测率，发现新的可用于追踪疾病进展和鉴定复发的非侵入性标记物，以及发现改进和低毒性治疗方法，尤其是对于5年存活仍较差的较晚期疾病。非常需要鉴定针对癌细胞更有特异性的靶标，例如在肿瘤细胞表面表达从而可通过实施新方法(如免疫治疗和靶向的毒素)进行攻击的靶标。
淋巴细胞抗原75作为内吞受体将捕获的抗原从胞外空间导向特定的抗原加工隔室并被认为导致B淋巴细胞增殖的减少。例如，之前尚未公开前述癌细胞上淋巴细胞抗原75的存在是显示其作为例如基于抗体的癌症治疗的细胞表面靶标的应用所必需的。
发明内容
本发明公开了在多种疾病组织(例如淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌，后文中称作“本发明疾病”)的膜提取物中检测淋巴细胞抗原75(后文中称作LY75)。
各种癌症中LY75的差异表达允许使用针对这类癌症的基于亲和试剂(如基于抗体)的治疗来靶向蛋白。因此，LY75可用于产生特异性结合LY75中表位的亲和试剂(包括抗体)，并可被这类亲和试剂靶向作为治疗基础。靶向癌细胞细胞表面上蛋白的亲和试剂(包括抗体)可通过多种机制用于癌症的治疗，包括(i)通过补体介导或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)裂解；(ii)通过与这类亲和试剂偶联的药物或毒素降解；或者(iii)抑制这类蛋白的生理功能，其可例如通过信号途径驱动癌细胞的生长。这类基于亲和试剂的治疗的一个重要方面是，就组织分布和表达水平而言，蛋白靶标的正常表达概况能够使抗体对正常组织上蛋白靶标的任意靶向都不会通过与正常组织结合产生不良副作用。
本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，其中LY75在所述癌症中表达，该方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的结合LY75的亲和试剂。
该癌症优选是本发明疾病之一。
本发明还提供了一种用于治疗或预防癌症的结合LY75的亲和试剂，该癌症优选是本发明疾病之一。
本发明还提供了结合LY75的亲和试剂在生产用于治疗或预防癌症的药物中的应用，该癌症优选是本发明疾病之一。
本发明中使用的亲和试剂优选特异性结合LY75。
该亲和试剂可以是抗体，例如全抗体，或其功能片段或抗体模拟物。优选的亲和试剂包括抗体，例如单克隆抗体。
该亲和试剂可以是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、去岩藻糖基(defucosylated)抗体或双特异性抗体。
功能性抗体片段包括单一抗体(Unibody)、域抗体(domain antibody)或纳米抗体(Nanobody)。
抗体模拟物包括亲和体(Affibody)、DARP素(DARPin)、抗运载蛋白(Anticalin)、高亲合性多聚体(Avimer)、反体(Versabody)或双运载蛋白(Duocalin)。
本发明中使用的亲和试剂可含有或偶联于治疗性部分，如细胞毒性部分或放射性同位素。该亲和试剂可以是抗体药物偶联物或免疫偶联物。
该亲和试剂可引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或可引发补体依赖性细胞毒性(CDC)。该亲和试剂可诱导癌细胞的凋亡，杀死或减少癌干细胞的数目和/或杀死或减少循环的癌细胞数目。亲和试剂可调节LY75的生理功能、抑制配体与LY75的结合和/或抑制LY75介导的信号转导途径。
在替代性实施方式中，本发明还提供了一种治疗或预防癌症的方法，其中LY75在所述癌症中表达，该方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的杂交剂，该杂交剂能够与编码LY75的核酸杂交。
本发明还提供了一种用于治疗或预防癌症的杂交剂，其能够与编码LY75的核酸杂交，该癌症优选是本发明疾病之一。
本发明还提供了杂交剂在生产用于治疗或预防癌症的药物中的应用，该杂交剂能够与编码LY75的核酸杂交，该癌症优选是本发明疾病之一。
本发明中使用的杂交剂优选特异性结合编码LY75的一种或多种胞外结构域的核酸。
本发明中使用的合适的杂交剂包括抑制性RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、小RNA(miRNA)、反义核酸、互补DNA(cDNA)、寡核苷酸和核酶。
本发明还提供了一种检测、诊断和/或筛选或监测对象中癌症进展的方法(其中LY75在所述癌症中表达)或者提供了一种监测对象中癌症药物或治疗作用的方法(其中LY75在所述癌症中表达)，该方法包括检测是否存在LY75或其一种或多种片段或其水平、是否存在编码LY75的核酸或其水平，或者该方法包括检测所述对象中其水平的变化。
这类方法可包括检测是否存在LY75或其一种或多种片段或其水平，或者是否存在编码LY75的核酸，其中(a)与健康对象中的水平相比，对象中LY75或所述其一种或多种片段水平的升高或者编码LY75的核酸水平的升高，或者(b)与健康对象中的相应的不可检测水平相比，对象中存在可检测水平的LY75或所述其一种或多种片段或者可检测水平的编码LY75的核酸表明所述对象中存在癌症，其中LY75在所述癌症中表达。
本发明还提供了一种检测、诊断和/或筛选或监测癌症进展的方法(其中LY75在所述癌症中表达)或者提供了一种监测对象中癌症药物或治疗作用的方法(其中LY75在所述癌症中表达)，该方法包括检测是否存在能够免疫特异性结合LY75的抗体或其一种或多种片段或其水平。
在本发明的方法中，可通过分析获自对象的生物样品来检测是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸，或者是否存在能够免疫特异性结合LY75的抗体或其一种或多种片段或其水平。
可使用结合LY75的亲和试剂检测是否存在LY75或其一种或多种片段。该亲和试剂可以是本文所述的任意合适的亲和试剂。该亲和试剂可含有或偶联至可检测标记。
在本发明的任一方面，该对象可以是人。
本发明还提供了用于鉴定用于癌症治疗或预测的试剂的方法，其中LY75在所述癌症中表达，该方法包括(a)使LY75或其一种或多种片段接触候选试剂；以及(b)测定该试剂是否结合LY75或其一种或多种片段。该方法还包括测试结合LY75或其一种或多种片段的试剂抑制癌症的能力，其中LY75在所述癌症中表达。该试剂可以但不限于调节LY75活性、减少与LY75结合的配体或降低LY75二聚化。
在本发明的多个实施方式中，提及的特定癌症类型是本发明疾病之一。
在一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(未另加说明)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤(未另加说明)、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和/或血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，优选非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，该淋巴瘤不是霍奇金淋巴瘤。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是甲状腺癌。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是膀胱癌。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是乳腺癌，优选三重阴性乳腺癌。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是胃癌。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是食道癌。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是头颈癌。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是皮肤癌，例如黑素瘤。
在另一个实施方式中，待检测、预防或治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
本发明的其他方面列于下文和本文的权利要求中。
附图简要说明
图1显示抗LY75单克隆抗体的流式细胞术分析，显示那些抗体对表达LY75的细胞的特异性结合。
图2a使用MabZAP试验显示NAMALWA细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2b使用MabZAP试验显示RAJI细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2c使用MabZAP试验显示HCC1143细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2d使用MabZAP试验显示HCC1806细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2e使用MabZAP试验显示MDA-MB-468细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2f使用MabZAP试验显示SW780细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2g使用MabZAP试验显示Kato III细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2h使用MabZAP试验显示SCC-9细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2i使用MabZAP试验显示AML-193细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2j使用MabZAP试验显示THP-1细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2k使用MabZAP试验显示RPMI 8226细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
图2l使用MabZAP试验显示OE-19细胞对抗LY75单克隆抗体的内化。
发明详述
下文详细描述的本发明包括向对象(如哺乳动物对象)给予治疗性组合物以治疗或预防癌症(如本发明疾病)。本发明还提供了用于哺乳动物对象中癌症(如本发明疾病)的临床筛选、诊断和预后的方法和组合物，用于鉴定最有可能响应特定治疗性治疗的对象，用于监测癌症(如本发明疾病)的结果，用于药物筛选和药物开发。
本发明是基于以下发现，即LY75蛋白在某些癌症中表达。具体而言，本文公开了支持性数据，其显示LY75蛋白在膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病、结直肠癌、食道癌、淋巴瘤、甲状腺癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌和淋巴瘤的质膜中表达。免疫组化分析也显示胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌和肺癌以及多发性骨髓瘤和淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金类型)中肿瘤细胞的特异性染色。因此，针对LY75的抗体可在这些癌症和其他显示LY75表达的癌症类型中用作治疗剂和诊断剂。
本文所用术语“对象”指动物，优选是哺乳动物。该哺乳动物对象可以是非人哺乳动物，但通常是人，如成年人。
该对象通常是活体对象。然而，当本发明的应用、方法和组合物特别适用于活体对象的筛选、诊断和预后时，其也可用于对象的死后诊断，从而例如鉴定具有发生相同疾病风险的家庭成员。
本文所用术语“患者”指患有或疑似患有一种或多种本发明疾病的对象。
本文所用术语“本发明的蛋白”指淋巴细胞抗原75(基因ID：4065)，其在本文中称作LY75。已发现该蛋白在多种癌症中差异性表达，因此为这些癌症的基于亲和性的治疗提供了新的靶标。LY75蛋白的人序列示于SEQ ID NO:1。术语LY75(用于指代蛋白时)包括具有特定氨基酸序列的蛋白，该氨基酸序列包含或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其衍生物或变体，特别是其天然产生的人衍生物或变体。
已通过实施例1所述方法和设备在来自癌症患者的癌组织样品的膜蛋白提取物中鉴定到该蛋白(例如，通过膜蛋白提取物的液相色谱-质谱)。将肽序列与SWISS PROT和TrEMBL数据库(属于瑞士生物信息学研究所(SIB)和欧洲生物信息学研究所(EBI)，参见www.expasy.org)比较，并鉴定到输入条目060449，淋巴细胞抗原75–LY75。编码该蛋白的核苷酸序列发现于登录号NM002349，如SEQ ID NO:2所示。
根据SWISS-PROT，淋巴细胞抗原75表达于脾、胸腺、结肠和外周血淋巴细胞。已在骨髓和B淋巴细胞系中检测到该蛋白。
同种型OGTA076b和OGTA076c表达于称作霍奇金和里-施(HRS)细胞的恶性霍奇金淋巴瘤细胞中。LY75作为内吞受体将捕获的抗原从胞外空间导向特定的抗原加工隔室。其导致B淋巴细胞增殖的减少。发明人证明，LY75表达于霍奇金和非霍奇金淋巴瘤类型，表明在患者(包括患有这些或其他癌症类型的那些患者)中针对LY75的基于亲和性的治疗会具有治疗性作用。
免疫组化实验(参见实施例2)显示了以下癌症中肿瘤细胞的特异性染色：胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌和肺(非小细胞)癌以及多发性骨髓瘤和淋巴瘤，包括弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(未另加说明)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤(未另加说明)、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。后面的癌症是优选的本发明疾病。
LY75可以片段的形式使用，特别是含有表位的片段，例如其抗原性或免疫原性片段及其衍生物，特别是包含该蛋白的胞外结构域(例如胞外尾或环)的片段。含有表位的片段(包括抗原性或免疫原性片段)的长度通常为12个氨基酸或更多，例如20个氨基酸或更多，例如50或100个氨基酸或更多。片段可以是全长蛋白长度的95％或更多，例如90％或更多，例如全长蛋白长度的75％或50％或25％或10％或更多。
或者，本文所用或所称蛋白/多肽可限于本说明书中特别列出/描述的那些蛋白/多肽或与其具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％氨基酸序列相同性或相似性的变体或衍生物。可使用适当的默认参数通过任何合适的算法(如BLAST、CLUSTAL)测定氨基酸序列相同性/相似性百分比。
因此，用于指代蛋白或多肽时，术语“LY75”指其氨基酸序列包含或由以下氨基酸序列组成的蛋白：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其衍生物或变体，该衍生物或变体与SEQ ID NO:1具有至少90％或95％的序列相同性并且与LY75具有基本相同的组织分布。
用于指代核酸时，术语“LY75”指其核苷酸序列编码的蛋白包含以下氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其衍生物或变体，该衍生物或变体与SEQ ID NO:1具有至少90％或95％的序列相同性并且与LY75蛋白具有基本相同的组织分布。
用于指代核酸时，术语“LY75”还指其核苷酸序列包含以下序列的核酸：SEQ ID NO:2所示序列或其衍生物或变体，该衍生物或变体与SEQ ID NO:2具有至少90％或95％的序列相同性并且编码与LY75蛋白具有基本相同的组织分布的蛋白。
LY75的含有表位的片段(包括抗原性或免疫原性片段)能够在患者中引发相关免疫应答。编码LY75的DNA也可用作其片段，例如编码LY75片段(如其免疫原性片段)的DNA。编码LY75的核酸(如DNA)片段可以是全编码区长度的95％或更多，例如90％或更多，例如全编码区长度的75％或50％或25％或10％或更多。核酸(如DNA)片段的长度可以是36个核苷酸或更多，例如60个核苷酸或更多，例如150或300个核苷酸或更多。
LY75的衍生物包括序列上的变体，其中可具有一个或多个(例如1-20(如15)个氨基酸，或基于全长蛋白氨基酸数目计算的最多20％(如最多10％或5％或1％))缺失、插入或取代。取代通常是保守性取代。衍生物通常与其来源的蛋白具有基本相同的生物功能。衍生物通常与其来源的蛋白具有可比的抗原性或免疫原性。衍生物通常具有其来源的蛋白的配体结合活性或活性受体-复合物形成能力或上述两者。衍生物和变体通常具有与LY75相同的组织分布。
蛋白的衍生物还包括化学处理的蛋白(如羧甲基化、羧酰胺化、乙酰化的蛋白)，例如在纯化期间处理。
在一个方面，本发明提供了LY75或包含LY75的组合物。该蛋白可以是分离的或纯化的形式。本发明还提供了编码LY75的核酸和包含编码LY75的核酸的组合物。
在其他方面，提供了能够在对象中引发免疫应答的组合物，该组合物包含LY75多肽和/或其一种或多种抗原性或免疫原性片段，以及一种或多种合适的运载体、赋形剂、稀释剂或佐剂(合适的佐剂如下文所述)。
能够引发免疫应答的组合物可以例如疫苗形式提供，该疫苗包含：LY75多肽或其衍生物或变体和/或其一种或多种抗原性或免疫原性片段，可选连同一种或多种合适的运载体、赋形剂、稀释剂或佐剂。
在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防例如一种或多种本发明疾病的LY75多肽或其一种或多种片段或衍生物或变体。
在另一方面，本发明提供了LY75多肽或其一种或多种片段或衍生物或变体在治疗或预防例如一种或多种本发明疾病中的应用。
本发明还提供了LY75多肽或其一种或多种片段或衍生物或变体在生产用于治疗或预防例如一种或多种本发明疾病的药物中的应用。
在一个方面，提供了一种治疗方法，包括给予治疗有效量的用于治疗或预防例如一种或多种本发明疾病的LY75多肽或其一种或多种片段或衍生物或变体。
本发明还提供了一种用于治疗或预防对象中本发明疾病的方法，或对对象进行疫苗接种以抵御例如一种或多种本发明疾病的方法，该方法包括给予对象有效量的LY75多肽和/或其一种或多种抗原性或免疫原性片段或衍生物或变体(例如作为疫苗)的步骤。
在另一个方面，本发明提供了治疗例如本发明疾病的方法，包括给予患者治疗有效量的化合物，该化合物可调节(如上调或下调)或互补患有例如本发明疾病的患者中LY75的表达或生物活性(或两者)，从而(a)预防例如本发明疾病的发生或发展；(b)预防例如本发明疾病的进展；或(c)缓解例如本发明疾病的症状。
在其他实施方式中，本发明提供了一种药物，其单独或共同地包含：
(a)LY75，以及
(b)抗癌剂，
用于在癌症治疗，优选在本发明疾病之一的治疗过程中进行同时、连续或单独的给药。
LY75可用于例如本发明疾病的检测、预后、诊断或监测或用于药物开发。
根据本发明的另一方面，我们提供了一种检测、诊断和/或筛选或监测对象中例如本发明疾病进展或者监测对象中例如针对本发明疾病的抗癌药物或疗法效果的方法，该方法包括检测所述对象中是否存在LY75或其一种或多种片段或其水平，或者是否存在编码LY75的核酸或其水平或者是否存在LY75的活性或其水平，或者该方法包括检测所述对象中其水平的变化。
根据本发明的另一方面，我们提供了一种在候选对象中检测、诊断和/或筛选例如本发明疾病的方法，该方法包括检测所述候选对象中是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸或者是否存在LY75的活性，其中，(a)与健康对象中的水平相比，候选对象中LY75或所述其一个或多个片段水平的升高或者编码LY75的核酸水平的升高，或者(b)与健康对象中的相应的不可检测水平相比，候选对象中存在可检测水平的LY75或所述其一个或多个片段或者可检测水平的编码LY75的核酸表明所述对象中存在例如本发明疾病。
根据本发明的另一方面，我们提供了一种监测对象中例如本发明疾病的进展或者监测例如针对本发明疾病的抗癌药物或疗法效果的方法，该方法包括在第一时间点和后续时间点检测所述候选对象中是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸或者是否存在LY75的活性，与所述第一时间点处对象中的水平相比，后续时间点处对象中LY75或所述其一个或多个片段水平的升高或降低或者编码LY75的核酸水平的升高或降低或者LY75的活性水平的升高或降低显示所述对象中例如本发明疾病的进展或衰退或者显示所述对象中例如针对本发明疾病的抗癌药物或疗法有效果或没有效果。
对于LY75，相对于分析来自未患有例如本发明疾病的对象的组织后所获得的检测水平，分析来自患有例如本发明疾病的对象的组织样品后所获得的检测水平取决于所使用的具体分析方法和检测技术。因此，本发明考虑到，各实验室会根据使用的分析方法和检测技术在未患有例如本发明疾病的对象中建立参考范围，这在诊断领域是常规的。优选地，在各批次分析的测试样品中都包含至少一个来自已知患有例如本发明疾病的对象的对照阳性组织样品或至少一个来自已知未患有例如本发明疾病的对象的对照阴性组织样品(且更优选同时包括阳性和阴性对照样品)。
在本发明的一个方面，使用液相色谱-质谱分析或其他适当方法来分析来自对象(优选活体对象)的本发明疾病组织样品，从而测量LY75的表达以用于例如本发明疾病的筛选或诊断、确定本发明疾病患者的进展、监测本发明疾病疗法的有效性或用于药物开发。
在任意上述方法中，可在患有癌症(如本发明疾病)的候选对象中检测的水平优选比健康对象中的水平高2倍或更多倍。
在本发明的一个实施方式中，通过用于检测LY75的液相色谱-质谱分析来自对象(如怀疑患有本发明疾病的对象)的组织样品。相对于来自未患有本发明疾病的对象(例如对照样品)或先前确定的参考范围，来自对象的组织中LY75丰度的升高表明存在本发明疾病。
对于LY75片段、含有表位的片段、免疫原性片段或抗原性片段：
对于相关癌症应用，在本发明的一个方面，这些片段包括实施例1中鉴定为胰蛋白酶序列的序列。
如本文所用，当LY75存在于基本不含污染蛋白的制备物中，即制备物中存在的总蛋白中少于10％(例如少于5％，如少于1％)是污染蛋白时，该LY75是“分离的”。污染蛋白是氨基酸序列与分离的LY75显著不同的蛋白，这是通过质谱分析测定的。如本文所用，“显著不同的”序列指允许通过质谱分析从LY75中解析出污染蛋白，该质谱分析根据实施例1中所述实验方案进行。
在本发明的诊断和预后方法中，LY75可通过本领域技术人员已知的任意方法测量，包括但不限于本文所述的优选技术、激酶试验、酶试验、结合试验和其他功能性试验、免疫试验和western印迹。
或者，可在免疫试验中检测LY75。在一个实施方式中，免疫试验的方法为：在如果LY75存在即可出现结合(如免疫特异性结合)的条件下使来自待测试对象的样品接触抗LY75抗体(或其他亲和试剂)，并通过试剂检测或测量任意结合(如免疫特异性结合)的量。LY75结合剂可通过本文教导的方法和技术生产。在一个具体的实施方式中，使用免疫组化分析LY75。
可通过检测LY75片段(如含有表位的(如免疫原性或抗原性)片段)来检测LY75。片段的长度可以是至少10、更通常至少20个氨基酸，例如至少50或100个氨基酸；例如至少150或200个氨基酸；例如至少300或500个氨基酸；例如至少700或900个氨基酸。
在一个实施方式中，组织切片中亲和试剂(如抗体)的结合可用于检测异常的LY75定位或LY75的异常水平。在特定实施方式中，针对LY75的抗体(或其他亲和试剂)可用于测试患者组织(例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织)中LY75的水平，其中LY75的异常水平表示存在本发明疾病。如本文所用，“异常水平”指与未患有本发明疾病的对象中水平或参考水平相比升高的水平。
可使用任何合适的免疫试验，包括但不限于，使用如下技术的竞争和非竞争试验系统，如western印迹、放射性免疫试验、ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心”免疫试验、免疫沉淀试验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体固定试验、免疫放射测定试验、荧光免疫试验和蛋白A免疫试验。
例如，可通过两步法夹心试验在流体样品(如血液、尿液或唾液)中检测LY75。在第一步中，使用捕获试剂(例如抗LY75抗体或其他亲和试剂)捕获LY75。该捕获试剂可选地固定在固相上。在第二步中，使用直接或间接标记的检测试剂检测捕获的LY75。在一个实施方式中，该检测试剂是凝集素。任何凝集素都可用于该目的，其优先结合LY75而非结合具有与LY75相同核心蛋白的其他同种型或结合共有抗体所识别的抗原决定簇的其他蛋白。在优选的实施方式中，与所述具有与LY75相同核心蛋白的其他同种型或所述共有抗体所识别的抗原决定簇的其他蛋白相比，经选择的凝集素以至少高2倍的亲和性结合LY75，更优选是至少高5倍的亲和性，更优选是至少高10倍的亲和性。基于本说明书，可以通过本领域熟知的方法容易地鉴定适用于检测LY75的凝集素，例如测试Gabius H-J和Gabius S(编)，1993，Lectins and Glycobiology(《凝集素和糖生物学》)，第158-174页中Sumar等，Lectins as Indicators ofDisease-Associated Glycoforms(《作为疾病相关糖形指示剂的凝集素》)的第158-159页上表I中记录的一种或多种凝集素(上述文献通过引用全文纳入本文)。在一个替代性实施方式中，该检测试剂是抗体(或其他亲和试剂)，例如特异性(如免疫特异性)检测其他翻译后修饰的抗体，如免疫特异性结合磷酸化氨基酸的抗体。这类抗体的示例包括结合磷酸酪氨酸的那些抗体(BD转导实验室公司(BD Transduction Laboratories)，目录号：P11230-050/P11230-150；P11120；P38820；P39020)、结合磷酸丝氨酸的那些抗体(加利福尼亚州南旧金山的泽美实验室公司(Zymed Laboratories Inc.)，目录号：61-8100)和结合磷酸苏氨酸的那些抗体(加利福尼亚州南旧金山的泽美实验室公司，目录号：71-8200、13-9200)。
如果需要，编码LY75的基因、相关基因，或相关核酸序列或子序列(包括互补序列)也可用于杂交试验。编码LY75的核苷酸，或其包含至少8个核苷酸(优选至少12个核苷酸且最优选至少15个核苷酸)的子序列可用作杂交探针。杂交试验可用于编码LY75的基因的异常表达相关的病症、紊乱或疾病状态的检测、预后、诊断或监测，或用于具有例如本发明疾病的迹象或症状的对象的差异性诊断。具体而言，这类杂交试验可通过以下方法进行：在可以发生杂交的条件下使含有核酸的对象样品接触能够与编码LY75的DNA或RNA杂交的核酸探针，并检测或测量任何所得杂交。
因此，例如，可以使用能够与编码LY75的核酸杂交的杂交剂(特别是寡核苷酸探针)检测编码LY75的核酸(如DNA或更合适的RNA)。
一种这类示例性方法包括：
使一种或多种包含10个或更多个与编码LY75的核苷酸序列互补的连续核苷酸的寡核苷酸探针接触获自来自对象的生物样品的RNA或复制自该RNA的cDNA，其中，所述接触在允许探针与核苷酸序列(如果存在)杂交的条件下发生；
检测探针和核苷酸序列之间的杂交(如果有)；并
比较步骤(b)中检测到的杂交(如果有)与对照样品中检测到的杂交或先前确定的参考范围。
本发明还提供了诊断试剂盒，其包含抗LY75抗体(或其他亲和试剂)。此外，这类试剂盒还可任选地包含下列的一种或多种：
(1)用于使用抗LY75亲和试剂进行诊断、预后、治疗性监测或这些应用的任意组合的说明书；
(2)标记的亲和试剂结合伙伴；
(3)其上固定抗LY75亲和试剂的固相(如试剂条)；以及
(4)显示诊断、预后或治疗应用或其任意组合得到批准的标签或插入页。如果没有提供标记的亲和试剂结合伙伴，则可使用可检测标记物(如化学放光、酶、荧光或放射性部分)标记抗LY75亲和试剂本身。
本发明还提供了一种试剂盒，其包含能够与编码LY75的核酸(合适地是RNA)杂交的核酸探针。在具体实施方式中，试剂盒包含一个或多个容器，其中含有引物对(例如各引物的大小范围为6-30个核苷酸、更优选10-30个核苷酸且更优选10-20个核苷酸)，其在适当反应条件下可扩增至少一部分编码LY75的核酸，例如通过聚合酶链式反应(参见例如Innis等，1990，PCR Protocols(《PCR实验方案》)，加利福尼亚州圣迭戈的学术出版社公司(Academic Press,Inc.))、使用Qβ复制酶的连接酶链式反应(参见EP 320,308)、环探针反应(cyclicprobe reaction)或本领域已知的其他方法。
试剂盒还可任选地包含预定量的LY75或编码LY75的核酸，例如用作标准品或对照。
本文所用术语“样品”包括来自具有患有一种或多种本发明疾病风险的对象的体液(如血液、尿液或唾液)和组织活检样品(该活检样品是例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤活检样品)或其匀浆。
例如，使用的生物样品可以来自任何来源，如血清样品或组织样品，例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织。例如，在寻找转移性本发明疾病的证据时，可关注本发明疾病转移的主要位点，例如对于淋巴瘤而言的淋巴结、脾、肝、胃、骨、大脑、肺、睾丸和皮肤；对甲状腺癌而言的肺和骨；对于膀胱癌而言的骨、肺、皮肤和肝；对于乳腺癌而言的骨、肝和肺；对于食道癌而言的肝、肺和骨；对于胃癌而言的肝、肺、大脑、骨、肾和胰腺；对于头颈癌而言的肺、骨、肝和皮肤或者对于皮肤癌而言的肺、大脑和骨。
或者，可通过原位分析检测是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸或者LY75的活性。
在某些实施方式中，本文所述诊断方法可以在体外或离体至少部分地或完整地进行。
合适地，定量检测是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸或者LY75的活性。
例如，定量检测可包括：
使生物样品接触特异性针对LY75的亲和试剂，所述亲和试剂可选地与可检测标记偶联；并
检测亲和试剂和样品中至少一种物质之间是否发生结合，所述检测可直接或间接地进行。
或者，通过涉及使用成像技术的方法定量检测是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸或者LY75的活性。
在另一个实施方式中，本发明的方法涉及使用对例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织切片进行免疫组化以确定是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸或者LY75的活性，从而定位例如本发明疾病细胞。
在一个实施方式中，例如，使用能够特异性结合LY75或其一种或多种片段的亲和试剂(如抗体)检测是否存在LY75或其一种或多种含表位片段。
在另一个实施方式中，检测LY75的活性。
临床研究中的应用
本发明的诊断方法和组合物可辅助监测临床研究，以例如评估用于治疗本发明疾病的药物。在一个实施方式中，测试候选分子将患有例如本发明疾病的对象中LY75水平恢复至未患有本发明疾病的对象中发现的水平的能力，或者在治疗的对象中将LY75水平保持在非淋巴瘤、非甲状腺癌、非膀胱癌、非胃癌、非食道癌、非头颈癌和非皮肤癌数值处或附近的能力。
在另一个实施方式中，本发明的方法和组合物用于筛选临床研究的候选者以鉴定患有例如本发明疾病的个体；这类个体随后可排除在研究外或可置于单独的治疗或分析组中。
本发明蛋白和相应核酸的生产
在一个方面，本发明提供了一种治疗或预防例如本发明疾病的方法，包括给予有这类治疗或预防需要的对象治疗有效量的编码LY75或其一种或多种片段或衍生物的核酸，例如以疫苗的形式给予。
在另一方面，提供了一种治疗或预防例如本发明疾病的方法，包括给予有这类治疗或预防需要的对象治疗有效量的核酸，所述核酸抑制LY75的功能或表达。
本发明的方法(和/或本文所述其他DNA方面)可例如包括所述核酸是LY75反义核酸或核酶。
因此，本发明包括编码LY75或其一种或多种片段或衍生物的核酸在生产用于治疗或预防例如本发明疾病的药物中的应用。
还提供了抑制LY75的功能或表达的核酸在生产用于治疗或预防例如一种或多种本发明疾病的药物中的应用。
本发明使用的DNA可通过分离为来自cDNA文库的cDNA片段的形式获得，其中使用起始材料市售mRNA并测定和鉴定其核苷酸序列。即，具体而言，从cDNA文库中随机分离克隆，该cDNA文库是根据Ohara等的方法制备的(DNA Research(《DNA研究》)第4卷，53-59(1997))。然后，通过杂交，除去复制的克隆(其重复出现)，随后进行体外转录和翻译。测定克隆两个末端的核苷酸序列，从中确认50kDa或更大的产物。
此外，使用由此获得的末端核苷酸序列作为查询序列检索已知基因的数据库中的同源物。
除上述筛选方法外，cDNA的5'和3'末端序列还涉及人基因座序列。随后在序列之间的区域中确认未知的长链基因并分析cDNA的全长。这样，可以系统性克隆无法通过依赖于已知基因的常规克隆方法获得的未知基因。
此外，还可使用PCR方法(如RACE)制备含有本发明DNA的人来源基因的全部区域，同时尽力避免在短片段或获得的序列中出现人为误差。如上文所述，可获得具有本发明DNA的克隆。
在用于克隆本发明DNA的另一方法中，生成了合成的DNA引物，其具有部分本发明多肽的适当核苷酸序列，随后使用适当文库通过PCR方法进行扩增。或者，可通过使本发明的DNA与整合至适当载体并标记有DNA片段或编码本发明多肽的一些或全部区域的合成DNA杂交来进行选择。可以通过例如Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(FrederickM.Ausubel等编，1987)中所述方法进行杂交。本发明的DNA可以是任何DNA，前提是其含有编码上文所述本发明多肽的核苷酸序列。这类DNA可以是鉴定或分离自cDNA文库等的cDNA，其来源于淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织。这类DNA还可以是合成的DNA等。用于文库构建的载体可以是噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等中的任一种。此外，通过使用上述细胞和/或组织中制备的总RNA组分或mRNA组分，可通过与聚合酶链式反应偶联的直接逆转录(后文中简称为“RT-PCR方法”)进行扩增。
可通过本领域技术人员已知的例如定点诱变方法、基因同源重组方法、引物延伸方法和PCR方法的适当组合容易地生成编码由与LY75的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列组成的上述多肽的DNA，或者编码由通过组成部分氨基酸序列的一个或多个氨基酸的缺失、取代或插入的方式衍生自LY75的氨基酸序列的氨基酸序列组成的上述多肽的DNA。此外，此时，用于使多肽具有基本相当生物活性的可能的方法是组成多肽的氨基酸中的同源氨基酸的取代(例如极性和非极性氨基酸、疏水性和亲水性氨基酸、正电荷和负电荷氨基酸以及芳族氨基酸)。此外，为维持基本相当的生物活性，本发明的多肽中功能性结构域内的氨基酸优选是保守的。
此外，本发明的DNA的示例包括：包含编码LY75的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA和在严谨条件下与该DNA杂交并编码生物活性(功能)与由LY75的氨基酸序列组成的多肽的功能相当的多肽(蛋白)的DNA。在这类条件下，能够与包含编码LY75的氨基酸序列的DNA杂交的这类DNA的示例是包含特定核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列与该DNA的全部核苷酸序列具有一定程度的总体平均同源性，如约80％或更高，优选约90％或更高，且更优选约95％或更高。可根据本领域已知方法进行杂交，如Current Protocols inMolecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(Frederick M.Ausubel等编，1987)中所述方法或根据其的方法。这里，“严谨条件”是例如约“1*SSC、0.1％SDS和37℃，或约“0.5*SSC、0.1％SDS和42℃的更严谨条件，或约“0.2*SSC、0.1％SDS和65℃的甚至更严谨条件。使用更严谨的杂交条件可以预期分离与探针序列具有高同源性的DNA。给出上述SSC、SDS和温度条件的组合是用于说明目的。
可使用用于确定杂交严谨性的适当上述因素或其他因素(例如探针浓度、探针长度和杂交反应时间)的组合由本领域技术人员实现与上文类似的严谨性。
根据目的，本发明的克隆的DNA可直接使用或需要时在使用限制性酶消化或添加接头后使用。该DNA可在5'末端侧具有作为翻译起始密码子的ATG并在3'末端侧具有作为翻译终止密码子的TAA、TGA或TAG。也可使用适当合成的DNA衔接子添加这些翻译起始和翻译终止密码子。
在本发明的方法/应用中，LY75可以例如纯化的形式提供，如将LY75多肽纯化至至少一定程度。LY75多肽可以基本纯的形式提供，即基本不含其他蛋白。LY75多肽还可使用重组方法生产，合成生产或通过这些方法的组合生产。可通过本领域技术人员已知的任意方法容易地制备LY75，其涉及生产含有适当本发明DNA的表达载体或含有本发明DNA的基因，培养使用该表达载体转化的转化子，生成和积累本发明相关多肽或含有该多肽的重组蛋白，随后收集所得产物。
重组LY75多肽可通过本领域熟知的方法从包含表达系统的遗传改造的宿主细胞中制备。因此，本发明还涉及包含LY75多肽或核酸的表达系统、使用这类表达系统遗传改造的宿主细胞和通过重组技术进行的LY75多肽生产。对于重组LY75多肽生产，可对宿主细胞进行遗传改造以对核酸整合表达系统或其部分。这类整合可使用本发明熟知的方法进行，例如磷酸钙转染、DEAD-葡聚糖介导的转染、转染、微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、射弹导入(ballistic introduction)或感染(参见例如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(《分子生物学基本方法》)，1986和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
对于宿主细胞，可使用例如埃希氏菌属、链球菌属、葡萄球菌属、链霉菌属的细菌、杆菌属的细菌、酵母、曲霉属细胞、昆虫细胞、昆虫和动物细胞。可用于本发明的埃希氏菌属细菌的特定示例包括大肠杆菌(Escherichia coli)K12和DH1(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第60卷,160(1968))、JM103(NucleicAcids Research,第9卷,309(1981))、JA221(Journal of Molecular Biology,第120卷,517(1978))和HB101(Journal of Molecular Biology,第41卷,459(1969))。对于杆菌属的细菌，可使用例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI114(Gene,第24卷,255(1983))和207-21(Journal of Biochemistry,第95卷,87(1984))。对于酵母，可使用例如酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D和20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromycespombe)NCYC1913和NCYC2036以及毕赤酵母(Pichia pastoris)。对于昆虫细胞，可使用例如果蝇S2和秋粘虫Sf9细胞。对于动物细胞，可使用例如COS-7和Vero猴细胞、CHO中华仓鼠细胞(后文中简称为CHO细胞)、dhfr基因缺陷型CHO细胞、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3细胞、人FL细胞、COS、HeLa、C127、3T3、HEK 293、BHK和Bowes黑色素瘤细胞。
无细胞翻译系统也可用于生产重组多肽(例如兔网状细胞裂解物、小麦胚芽裂解物、来自英国刘易斯的罗氏诊断公司(Roche Diagnostics Ltd.)的SP6/T7体外T&T和RTS 100大肠杆菌HY转录和翻译试剂盒和来自英国南安普顿的普洛麦格英国公司(Promega UK)的TNT Quick偶联的转录/翻译系统)。
表达载体可根据本领域已知方法生成。例如，可通过以下方法生成载体：(1)切下含有本发明DNA的DNA片段或含有本发明DNA的基因，以及(2)在适当的表达载体中将DNA片段连接于启动子下游。可使用多种表达系统，例如但不限于染色体、附加体和病毒来源的系统，例如来源于大肠杆菌的质粒(如pBR322、pBR325、pUC18和pUC118)、来源于枯草杆菌(如pUB110、pTP5和pC194)的质粒、来自噬菌体、来自转座子、来自酵母附加体(如pSH19和pSH15)、来自插入元件、来自酵母染色体元件、来自病毒(如杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和逆转录病毒)以及来源于其组合的载体(如来源于质粒和噬菌体(如[λ]噬菌体)遗传元件(如粘粒和噬菌粒)的那些载体)。该表达系统可含有调节和产生表达的控制区。
本发明中使用的启动子可以是任意启动子，前提是其适合用于进行基因表达的宿主。例如，当宿主是大肠杆菌时，优选trp启动子、lac启动子、recA启动子、pL启动子、lpp启动子等。当宿主是枯草杆菌时，优选SPO1启动子、SPO2启动子、penP启动子等。当宿主是酵母时，优选PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。当使用动物细胞作为宿主时，用于这类情况的启动子的示例包括SRa启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子和HSV-TK启动子。通常，可以使用能够维持、增殖或表达核酸以在宿主中生成多肽的任何系统或载体。
可通过多种熟知且常规的技术中的任意一种将合适的核酸序列插入表达系统中，例如Sambrook等，同上中所述的那些。可将适当的分泌信号整合至LY75多肽中以允许翻译的蛋白分泌至内质网的内腔、周质空间或胞外环境中。这些信号对于LY75多肽可以是内源性的或者其可以是外源性信号。可根据本领域已知方法进行宿主细胞的转化。例如，可参考以下文件：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第69卷,2110(1972)；Gene,第17卷,107(1982)；Molecular&General Genetics,第168卷,111(1979)；Methods in Enzymology,Vol.194,182-187(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,第75卷,1929(1978)；CellTechnology,独立第8卷,New Cell Technology,Experimental Protocol.263-267(1995)(由Shujunsha发布)；以及Virology,第52卷,456(1973)。可根据本领域已知方法培养因此获得的用含有本发明DNA的表达载体或含有本发明DNA的基因转化的转化子。例如，当宿主是埃希氏菌属的细菌时，通常将细菌在约15℃-43℃下培养约3-24小时。需要时，还可进行通气或搅拌。当宿主是杆菌属的细菌时，通常将细菌在约30℃-40℃下培养约6-24小时。需要时，还可进行通气或搅拌。在培养宿主是酵母的转化子时，通常使用将pH调节至约5-8的培养基在约20℃-35℃下培养约24-72小时。需要时，还可进行通气或搅拌。在培养宿主是动物细胞的转化子时，通常使用将pH调节至约6-8的培养基将细胞在约30℃-40℃下培养约15-60小时。需要时，还可进行通气或搅拌。
如果需要表达LY75多肽以用于基于细胞的筛选试验，优选在细胞表面生成多肽。在这种情况下，可在筛选试验中使用前收获细胞。如果LY75多肽分泌至培养基，可回收培养基以分离所述多肽。如果在细胞内生产，必需首先裂解细胞之后回收LY75多肽。
可通过熟知的方法从重组细胞培养物或其他生物源中回收LY75多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、分子筛色谱、离心方法、电泳方法和凝集素色谱。在一个实施方式中，使用了这些方法的组合。在另一个实施方式中，使用了高效液相色谱。在其他实施方式中，特异性结合LY75多肽的抗体可用于消耗包含所述多肽的LY75多肽的样品或纯化所述多肽。
为从培养产物中分离并纯化本发明的多肽或蛋白，例如，在培养后，通过已知方法收集微生物体或细胞，其悬浮于适当缓冲液中，通过例如超声波、溶菌酶和/或冻融破坏微生物体或细胞，随后对所得物进行离心或过滤，并且随后可获得粗的蛋白提取物。该缓冲液还可含有蛋白变性剂(如脲或盐酸胍)或表面活性剂(如曲通X-100(TM))。当蛋白分泌至培养溶液中时，反应完成后可通过已知方法分离微生物体或细胞与上清液，随后收集上清液。可通过已知的分离和纯化方法的适当组合纯化因此获得的培养物上清液或提取物中的蛋白。可通过已知方法或根据其的方法将因此获得的本发明的多肽(蛋白)转化为盐。相反地，当本发明的多肽(蛋白)是以盐的形式获得时，可通过已知方法或根据其的方法将其转化为游离蛋白或肽或另一种盐。此外，在纯化前后使适当的蛋白修饰酶(如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)作用于通过重组生成的蛋白，从而可任意添加修饰或部分除去多肽。可通过各种结合试验、使用特异性抗体的酶免疫试验等来测量是否存在本发明的多肽(蛋白)或其盐。
当多肽在分离和或纯化期间变性时，可使用本领域熟知的技术进行重折叠以再生天然或活性构型构型的LY75多肽。在本发明中，LY75多肽可获自任何来源的生物样品，例如但不限于血液样品或组织样品，例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织样品。
LY75多肽可以是“成熟蛋白”的形式或者可以是较大蛋白(如融合蛋白)的一部分。通常优选包括额外的氨基酸序列，其含有分泌或前导序列、前蛋白、原蛋白或前原蛋白序列或帮助纯化的序列(如亲和标签，例如但不限于多重组氨酸残基、FLAG标签、HA标签或myc标签)。
LY75可以例如与异源融合伙伴融合，例如来自乙型流感嗜血杆菌称作蛋白D的表面蛋白、来自流感病毒的非结构蛋白(如NS 1)、来自乙型肝炎的S抗原或者称作LYTA的蛋白(如其C末端)。
还可使用可在重组生产期间提供稳定性的额外序列。可通过整合可切割序列作为额外序列或其部分来按需要任选地除去这类序列。因此，LY75多肽可与其他部分融合，包括其他多肽或蛋白(例如谷胱甘肽-S-转移酶和蛋白A)。可使用适当蛋白酶切割这类融合蛋白，随后分离为各蛋白。这类额外序列和亲和标签是本领域熟知的。除上述以外，需要时还可向表达载体添加本领域已知的特征，如增强子、剪接信号、聚A添加信号、选择标记物和SV40复制起始。
在一个方面，本发明提供了用于治疗、筛选、检测和/或诊断疾病(如癌症，且特别是本发明疾病)的能够特异性结合LY75或其片段的试剂，或者能够与编码LY75的核酸杂交的杂交剂，或者能够检测LY75的活性的试剂。
针对LY75的亲和试剂的生产
在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合LY75或其片段的亲和或免疫亲和试剂，例如含有或偶联于可检测标签或者含有或偶联于治疗性部分(如细胞毒性部分)的亲和试剂。例如，该亲和剂可以是抗体。
在一个实施方式中，本发明中使用的亲和试剂可结合LY75上的表位，例如SEQ ID NO:1的一个或多个部分。在优选实施方式中，本发明中使用的亲和试剂可结合LY75胞外结构域上的表位，例如SEQ ID NO:53的一个或多个部分。
根据本领域中的那些，存在三种主要的免疫亲和试剂类型：单克隆抗体、噬菌体展示抗体和较小的抗体衍生的分子(如亲和体、域抗体(dAb)、纳米抗体、单一抗体、DARP素、抗运载蛋白、双运载蛋白、高亲合性多聚体或反体)。通常，在其中说明使用抗体的本发明的应用中，可使用其他亲和试剂(如亲和体、域抗体、纳米抗体、单一抗体、DARP素、抗运载蛋白、双运载蛋白、高亲合性多聚体或反体)。这类物质被认为能够免疫特异性结合LY75。适当情况下，术语“亲和剂”应解释为包括能够特异性结合LY75的免疫亲和试剂和其他物质，包括但不限于配体、凝集素、链霉亲和素、抗体模拟物和合成的结合剂。
针对LY75的抗体的生产
根据本发明，LY75、LY75类似物、LY75相关蛋白或前述任一物质的片段或衍生物可用作免疫原以生成免疫特异性结合这类免疫原的抗体。这类免疫原可通过任何便利的方法分离，包括上文所述方法。本文所用术语“抗体”指肽或多肽，其衍生自、模仿能够特异性结合抗原或表位的免疫球蛋白基因或其片段或者由其编码。参见例如Fundamental Immunology(《基础免疫学》)，第3版，W.E.Paul编，雷文出版社(Raven Press)，纽约(1993)；Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即保留结合抗原能力的“抗原结合位点”(例如片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也包括于术语“抗体”中。本发明的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、双特异性、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab')2片段、通过Fab表达文库生产的片段、抗独特型(抗Id)抗体和上述任一种物质的表位结合片段。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA，如IgG)或亚类的免疫球蛋白分子。
术语“特异性结合”或“特异性地结合”(“或免疫特异性结合”)不旨在表示抗体排他性地结合其预期靶标。而是，如果通常抗体与其预期靶标的亲和性是与非靶标分子亲和性的约5倍以上，则认为抗体“特异性结合”。合适地，不存在与不希望的物质(特别是健康人或动物的天然产生的蛋白或组织)之间的显著交叉反应或交叉结合。优选地，该抗体与靶分子之间的亲和性是其与非靶分子之间亲和性的至少约5倍，优选10倍，更优选25倍，甚至更优选50倍，且最优选100倍或更高。在一些实施方式中，抗体或其他结合剂与抗原之间的特异性结合指结合亲和性为至少106M-1。抗体可以例如以至少约107M-1且优选约108M-1至约109M-1、约109M-1至约1010M-1或约1011M-1的亲和性进行结合。
亲和性可根据以下公式计算：Kd＝koff/kon，其中koff是解离速率常数，kon是结合速率常数且Kd是平衡常数。可通过在多个浓度(c)下测量标记的配体的结合组分(r)来测定平衡时的亲和性。使用斯卡查德(Scatchard)方程对数据进行作图：r/c＝K(n-r)：
其中
r＝平衡时结合的配体的摩尔数/受体的摩尔数；
c＝平衡时游离配体浓度；
K＝平衡结合常数；以及
n＝每个受体分子的配体结合位点数目
通过作图分析，用Y轴上的r/c对X轴上的r进行作图以生成斯卡查德图。亲和性是直线的负斜率，可通过结合的标记的配体与未标记的过量配体进行竞争来测定koff(参见例如美国专利号6,316,409)。靶向剂与其靶分子的亲和性是例如至少约1x10-6摩尔/升，如至少约1x10-7摩尔/升，如至少约1x10-8摩尔/升，特别是至少约1x10-9摩尔/升，且尤其是至少约1x10-10摩尔/升。通过斯卡查德分析进行的抗体亲和性测量是本领域熟知的，参见例如van Erp等，J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson和Griswold,Comput.Methods ProgramsBiomed.27:65-8,1988。
在一个实施方式中，可使用任意可从公共渠道获得的识别编码LY75的基因的基因产物的抗体。在另一个实施方式中，使用本领域技术人员已知的方法生产识别LY75、LY75类似物、LY75相关多肽或前述任一物质的片段或衍生物的抗体。本领域技术人员应理解，许多方法可用于生产抗体，例如参见Antibodies,A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)，Harlow和David Lane编，冷泉港实验室(1988)，冷泉港，纽约。本领域技术人员还应理解，模拟抗体的结合片段或Fab片段也可通过多种方法由遗传信息制备(AntibodyEngineering:A Practical Approach(《抗体工程：实践方法》)(Borrebaeck,C编)，1995，牛津大学出版社(Oxford University Press)，牛津；J.Immunol.149,3914-3920(1992))。
在本发明的一个实施方式中，生成了针对LY75的特定结构域的抗体。在特定实施方式中，LY75的亲水性片段被用作用于抗体生产的免疫原。
在抗体生产过程中，可通过本领域已知的技术(例如ELISA(酶连免疫吸附试验))实现对所需抗体的筛选。例如，为选择识别LY75的特定结构域的抗体，可测试制备的杂交瘤中针对结合含有这类结构域的LY75片段的产物。对于选择特异性结合第一LY75同源物但不特异性结合(或较弱地结合)第二LY75同源物的抗体，可基于对第一LY75同源物的阳性结合和缺少对第二LY75同源物的结合(或结合降低)进行选择。类似地，对于选择特异性结合LY75但不特异性结合(或较弱地结合)同一蛋白的不同同种型(如具有与LY75相同的核心肽的不同糖形)的抗体，可基于对LY75的阳性结合和缺少对不同同种型(例如不同糖形)的结合(或结合降低)进行选择。因此本发明提供了一种抗体(如单克隆抗体)，与LY75的同种型(例如糖形)相比，其能够以较高的亲和性结合LY75(例如高至少2倍，如至少5倍，特别是至少10倍的亲合性)。
可用于本发明方法的多克隆抗体是来源于经免疫动物血清的抗体分子的异质群体。还可使用未分级的免疫血清。本领域中已知的多种方法可用于生产针对LY75、LY75片段、LY75相关多肽或LY75相关多肽片段的多克隆抗体。例如，一种方式是纯化感兴趣的多肽或合成感兴趣的多肽(例如使用本领域熟知的固相肽合成方法)。参见，例如，Guide to Protein Purification(《蛋白质纯化指南》)，Murray P.Deutcher编，Meth.Enzymol.，第182卷(1990)；SolidPeptide Synthesis(《固相肽合成》)，Greg B.Fields编，Meth.Enzymol.，第289卷(1997)；Kiso等，Chem.Pharm.Bull.，38：1192-99(1990)；Mostafavi等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1：255-60，1995；Fujiwara等，Chem.Pharm.Bull.(东京)44：1326-31，1996。选择的多肽随后可用于通过注射多种宿主动物(包括但不限于兔、小鼠、大鼠等)进行免疫以生成多克隆或单克隆抗体。如果通过凝胶电泳纯化LY75，可在从聚丙烯酰胺凝胶中提取或不提取后使用LY75进行免疫。可根据宿主的种类采用各种佐剂(即免疫刺激剂)来增强免疫应答，这些佐剂包括但不限于：完全或不完全的弗氏佐剂、矿物质凝胶(如氢氧化铝)，表面活性物质(如溶血卵磷脂)、普流罗尼多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚和佐剂(如BCG(卡介苗)或短小棒状杆菌(corynebacterium parvum))。其他佐剂也是本领域熟知的。
为了制备针对LY75、LY75片段、LY75相关多肽或LY75相关多肽的片段的单克隆抗体(mAb)，可以使用通过培养物中连续细胞系生产抗体分子的任何技术。例如，最初由Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)开发的杂交瘤技术，以及三源杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983,Immunology Today 4:72)，和生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，ARL公司(Alan R.Liss,Inc.)，第77-96页)。这类抗体可属于任何免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。生产本发明的mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。在本发明的其他实施方式中，可使用已知技术在无菌动物中生产单克隆抗体(PCT US90/02545，通过引用纳入本文)。
该单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体和嵌合单克隆抗体(如人-小鼠嵌合体)。嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的抗体，例如具有人免疫球蛋白恒定区和来源于鼠mAb的可变区的那些抗体(参见例如Cabilly等，美国专利号4,816,567；和Boss等，美国专利号4,816,397，其通过引用全文纳入本文)。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(参见例如Queen，美国专利号5,585,089，其通过引用全文纳入本文)。
嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术生产，例如使用下述方法：PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请184,187；欧洲专利申请171,496；欧洲专利申请173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请125,023；Better等，1988,Science 240:1041-1043；Liu等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等，1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等，1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等，1987,Cane.Res.47:999-1005；Wood等，1985,Nature 314:446-449；和Shaw等，1988,J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science229:1202-1207；Oi等，1986,BioTechniques 4:214；美国专利5,225,539；Jones等，1986,Nature 321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239:1534；以及Beidler等，1988,J.Immunol.141:4053-4060。
人对象治疗应用中特别需要完全人抗体。这类抗体可使用无法表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因但可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来生产。以正常方式用所选抗原(例如LY75的全部或一部分)来免疫转基因小鼠。针对该抗原的单克隆抗体可使用常规杂交瘤技术获得。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后发生类型转换和体细胞突变。因此，可能利用这种技术产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于这种产生人抗体的技术概述，参见Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13:65-93)。对于用于生产人抗体和人单克隆抗体的这项技术和用于生产这类抗体的实验方案的详细讨论，参见例如美国专利5,625,126；美国专利5,633,425；美国专利5,569,825；美国专利5,661,016；以及美国专利5,545,806。此外，诸如阿布吉尼公司(Abgenix,Inc.)(加利福尼亚州福利孟德)、基法公司(Genpharm)(加利福尼亚州圣何塞)的公司能够利用类似于上述技术的技术提供针对所选抗原的人抗体。
可以利用称作“指导选择”的技术产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，使用所选的非人单克隆抗体(如小鼠抗体)指导选择识别相同表位的完全人抗体。(Jespers等(1994)BioTechnology 12:899-903)。
本发明的抗体还可通过使用噬菌体展示技术来制备，该技术用于生成和筛选用于与选择的靶标结合的多肽文库。参见例如Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等，Science 249,404-6,1990，Scott和Smith,Science 249,386-88,1990；以及Ladner等，美国专利号5,571,698。噬菌体展示技术的基本概念是建立待筛选的编码多肽的DNA与多肽之间的物理关联。该物理关联是由噬菌体颗粒提供的，其展示作为衣壳一部分的多肽，该衣壳包封编码多肽的噬菌体基因组。在多肽与其遗传物质之间建立这种物理关联可同时大规模筛选携带不同多肽的极大量噬菌体。展示对靶标具有亲和性的多肽的噬菌体与该靶标结合，通过对靶标的亲和性筛选来富集这些噬菌体。通过这些噬菌体各自的基因组可鉴定它们所展示的多肽特性。然后使用这些方法，可常规大量合成经鉴定对所需靶标具有结合亲和性的多肽。参见例如美国专利号6,057,098，其全文纳入本文，包括所有表格、附图和权利要求。具体而言，这类噬菌体可用于展示抗体库或组合抗体文库(例如人或鼠的)表达的抗原结合域。可以使用抗原，例如使用标记的抗原或者结合或捕获在固体表面或珠上的抗原来选择或鉴定表达能够结合感兴趣的抗原的抗原结合域的噬菌体。这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13结合结构域，其表达自具有与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的Fab、Fv或二硫稳定化的Fv抗体结构域的噬菌体。可用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法包括Brinkman等，J.Immunol.Methods 182:41-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods184:177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24:952-958(1994)；Persic等，Gene 1879-18(1997)；Burton等，Advances in Immunology 57:191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；上述文献各自通过引用全文纳入本文。
如上述参考文献所述，噬菌体选择后，可分离噬菌体的抗体编码区，并用于生成完整抗体(包括人抗体或任何其它所需的抗原结合片段)，并在任何所需宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中表达，如下文详述。例如，重组生产Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可采用通过本领域已知方法来进行，例如PCT公开WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques12(6)：864-869(1992)；和Sawai等，1995，AJRI 34:26-34；以及Better等，Science240:1041-1043(1988)中公开的那些(所述文献通过引用全文纳入本文)。
可用于生产单链Fv和抗体的技术的示例包括以下文献中公开的那些：美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu等，PNAS 90:7995-7999(1993)；以及Skerra等，Science240:1038-1040(1988)。
本发明还提供了双特异性抗体的应用，其可通过本领域已知方法制备。全长双特异性抗体的传统生产方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，1983,Nature,305:537-539)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤纯化正确的分子，亲和层析颇为烦琐，且产率较低。公开于1993年5月13日的WO 93/08829和Traunecker等，1991，EMBO J.,10:3655-3659公开了类似方法。
根据不同且更优选的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选与含有至少部分绞链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有结合轻链所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物，如果需要还有免疫球蛋白轻链的DNA，插入单独的表达载体中，共同转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的不同比例的三种多肽链提供最优产率的实施方式中，这为调节三个多肽片段的共有部分提供了极大的灵活性。然而，当表达比例相同的至少两种多肽链导致高产率或该比例没有显著性差异时，可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在该方法的一个优选实施方式中，双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。已发现，此种不对称结构有助于分离所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链的组合，因为免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供了一种容易的分离方式。这种方法参见1994年3月3日公开的WO 94/04690。产生双特异性抗体的进一步详情参见例如，Suresh等，Methodsin Enzymology,1986,121:210。
在本发明的一些实施方式中，亲和试剂(例如抗体、或其抗原结合部分或抗体模拟物)不是双特异性的。在本发明的一些具体实施方式中，亲和试剂(例如抗体、或其抗原结合部分或抗体模拟物)不是用于治疗一种或多种癌症的双特异性抗体，所述癌症选自淋巴瘤、膀胱癌/恶性肿瘤、乳腺癌、胃/结肠癌、食道癌和皮肤癌/黑色素瘤。
本发明提供了抗LY75免疫球蛋白分子的功能活性片段、抗原结合部分、衍生物或类似物。功能活性指该片段、衍生物或类似物能够引发抗抗独特型抗体(即三级抗体)，其识别与该片段、衍生物或类似物来源处的抗体所识别抗原相同的抗原。具体而言，在优选实施方式中，可通过删除特异性识别抗原的CDR序列C端侧的CDR序列和框架序列来增强免疫球蛋白分子的独特型的抗原性。为确定结合抗原的CDR序列，含有CDR序列的合成肽可用于结合试验，通过本领域已知的任何结合试验方法与抗原结合。
本发明提供了抗体片段，例如但不限于F(ab')2片段和Fab片段。可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。F(ab')2片段由可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域组成，并且通过抗体分子的胃蛋白酶消化生成。Fab片段通过还原F(ab')2片段的二硫桥键生成。本发明还提供了本发明抗体的重链和轻链二聚体，或其任意最小片段(如Fv或单链抗体(SCA))(例如参见美国专利4,946,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；以及Ward等，1989,Nature 334:544-54)，或具有与本发明抗体相同特异性的任意其他分子。单链抗体的形成方式是：经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，形成单链多肽。可以使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等，1988,Science 242:1038-1041)。
在其他实施方式中，本发明提供了本发明的免疫球蛋白(或其功能活性片段或其抗原结合部分)的融合蛋白，例如其中免疫球蛋白经由共价键(如肽键)在N端或C端处与非免疫球蛋白的另一蛋白的氨基酸序列(或其部分，优选该蛋白的至少10、20或50个氨基酸部分)融合。优选地，免疫球蛋白或其片段在恒定结构域的N端处与其他蛋白共价连接。如上文所述，这类融合蛋白可促进纯化、增加体内半衰期并增强抗原跨上皮屏障至免疫系统的递送。
本发明的免疫球蛋白包括修饰的类似物和衍生物，即通过共价连接任意类型的分子，前提是这类共价连接不妨碍免疫特异性结合。例如，但不限于，免疫球蛋白的衍生物和类似物包括通过例如糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化、用已知保护/封端基团衍生化、蛋白酶水解切割、与细胞配体或其它蛋白连接等进一步修饰的那些蛋白。通过已知技术可进行任意多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，类似物或衍生物还可包含一种或多种非经典氨基酸。
前述抗体可用于涉及LY75定位和活性的本领域已知方法中，例如用于对该蛋白进行成像、测量其在适当生理样品中的水平、用于诊断方法等。
针对LY75的亲和体的生产
亲合体分子代表一类新的基于58个氨基酸残基蛋白结构域的亲和蛋白，其来源于葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一。该三螺旋束结构域已被用作构建组合噬菌粒文库的骨架，可从中使用噬菌体展示技术选择靶向所需分子的亲和体变体(Nord K,Gunneriusson E,Ringdahl J,Stahl S,Uhlen M,Nygren PA,Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterialreceptor domain(从α螺旋细菌受体结构域的组合文库中选择的结合蛋白),NatBiotechnol 1997；15:772-7；Ronmark J,Gronlund H,Uhlen M,Nygren PA,Humanimmunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering ofprotein A(来自蛋白A组合改造的人免疫球蛋白A(IgA)特异性配体),Eur JBiochem 2002；269:2647-55)。该简单、稳健的亲和体分子结构以及其低分子量(6kDa)使其适用于多种应用，例如作为检测试剂(Ronmark J,Hansson M,Nguyen T,等，Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras producedin Escherichia coli(大肠杆菌中生产的亲和体-Fc亲和体的构建和表征),JImmunol Methods 2002；261:199-211)和抑制受体相互作用(Sandstorm K,Xu Z,Forsberg G,Nygren PA,Inhibition of the CD28-CD80co-stimulation signal by aCD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering(组合蛋白改造开发的CD28结合亲和体配体对CD28-CD80共刺激信号的抑制),Protein Eng 2003；16:691-7)。亲和体及其生产方法的其他细节可通过参考美国专利号5831012获得，其通过引用全文纳入本文。
标记的亲和体也可用于成像应用以测定同种型的丰度。
针对LY75的域抗体的生产
本文所述抗体包括域抗体。域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元，对应于人抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。域抗体的分子量为约13kDa。多玛提斯公司(Domantis)已开发了一系列大且高度功能性的全人VH和VL dAb文库(各文库中存在超过100亿种不同序列)并使用这些文库选择对治疗靶标有特异性的dAb。与许多常规抗体不同，域抗体良好地表达于细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中。域抗体及其生产方法的其他细节可参见美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684和0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609，上述文献各自通过引用全文纳入本文。
针对LY75的纳米抗体的生产
纳米抗体是抗体衍生的治疗性蛋白，其含有独特的天然产生的重链抗体的结构和功能特性。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆和分离的VHH结构域是非常稳定的多肽，具有原始重链抗体的全部抗原结合能力。纳米抗体与人抗体的VH结构域具有高度同源性并可进一步人源化而不损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性潜能，这已在使用纳米抗体先导化合物的灵长类动物研究中确定。
纳米抗体结合了常规抗体的优势与小分子药物的重要特征。与常规抗体类似，纳米抗体显示高度的靶标特异性、与其靶标之间的高度亲和性以及低固有毒性。然而，与小分子药物类似，其可抑制酶并容易地进入受体裂缝。此外，纳米抗体非常稳定，可以通过除注射以外的方式给予(参见例如WO 04/041867，其其通过引用全文纳入本文)且易于制造。纳米抗体的其他优势包括因其小尺寸识别不常见或隐藏的表位，因其独特的三维、以高亲和性和选择性结合蛋白靶标的空腔或活性位点，药物格式灵活性(drug format flexibility)、调节药物发现的半衰期和容易程度和速度。
纳米抗体由单个基因编码并在几乎所有原核和真核宿主中高效产生(例如大肠杆菌(参见例如US 6,765,087，其通过引用全文纳入本文)、霉菌(例如曲霉属(Aspergillus)或木霉属(Trichoderma))和酵母(例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉森酵母属(Hansenula)或毕赤酵母属(Pichia))(参见US 6,838,254，其通过引用全文纳入本文))。该生产过程是可放大的且已生产了数千克量的纳米抗体。由于与常规抗体相比，纳米抗体具有优良的稳定性，其可配制为长储藏期限、即用型溶液。
纳米克隆方法(参见例如WO 06/079372，其通过引用全文纳入本文)是用于制备针对所需靶标的纳米抗体的专有方法，其基于B细胞的自动化高通量选择。
针对LY75的单一抗体的生产
单一抗体是另一种抗体片段技术；但这种技术是基于除去IgG4抗体的铰链区。删除铰链区生成了特定分子，其大小为传统IgG4抗体的基本一半且具有IgG4抗体的一价结合区而非二价结合区。还熟知的是，IgG4抗体是惰性的且因此不与免疫系统相互作用，这有利于不需要免疫应答的疾病治疗，且该优势传递至单一抗体。例如，单一抗体可用于抑制或沉默(但不杀死)其结合的细胞。此外，单一抗体与癌细胞的结合不会刺激其增殖。另外，因为单一抗体的大小为传统IgG4抗体的约一半，其还在较大的实体瘤上显示较好的分布，并具有潜在有利的功效。单一抗体以与全IgG4抗体类似的速率从体内清除并且能够以与全抗体类似的亲和性结合其抗原。单一抗体的其他细节可参见专利WO2007/059782，其通过引用全文纳入本文。
针对LY75的DARP素的生产
DARP素(设计的锚蛋白重复蛋白)是抗体模拟物DRP(设计的重复蛋白)技术的一个示例，其已被开发以利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白(如锚蛋白或富亮氨酸重复蛋白)是普遍存在的结合分子，其与抗体不同，存在于细胞内外。其独特的模块结构是重复结构单元(重复)，其堆叠在一起以形成延长的重复结构域，显示可变和模块的靶标结合表面。基于该模块，可产生具有高度多样化结合特异性的多肽组合文库。该策略包括一致设计显示可变表面残基的自相容性重复并将其随机组装为重复结构域。
DARP素可以非常高的产率在细菌表达系统中生产且其属于已知最稳定的蛋白。已选择针对多种靶蛋白(包括人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白)的高特异性、高亲和性DARP素。可获得具有个位数纳摩尔至皮摩尔范围亲和性的DARP素。
DARP素已用于多种应用，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组化(IHC)、芯片应用、亲和纯化或Western印迹。还证明DARP素在胞内隔室中具有高度活性，例如作为与绿色荧光蛋白(GFP)融合的胞内标记物蛋白。DARP素还用于抑制病毒进入，其具有pM范围的IC50。DARP素不仅可理想地用于封闭蛋白-蛋白相互作用，还可抑制酶。已成功地抑制蛋白酶、激酶和转运蛋白，通常是变构抑制模式。非常迅速且特异性地富集在肿瘤上以及非常有利的肿瘤与血液比例使DARP素非常适用于体内诊断或治疗方法。
关于DARP素和其他DRP技术的其他信息可参见美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利申请公开号WO02/20565，上述两篇文献都通过引用全文纳入本文。
针对LY75的抗运载蛋白的生产
抗运载蛋白是另一种抗体模拟技术，但在这种情况下结合特异性来源于脂质运载蛋白，这是一种低分子量蛋白家族，其天然且大量地表达于人组织和体液。脂质运载蛋白经进化以具有多种与化学敏感性或不可溶化合物生理转运和储存相关的体内功能。脂质运载蛋白具有稳健的固有结构，包含高度保守的β-筒，其支持位于蛋白某一末端的四个环。这些环形成结合口袋的入口并且该分子这一部分的构象差异导致单个脂质运载蛋白之间的结合特异性差异。
虽然保守的β-折叠框架支持的高变环的总体结构令人联想到免疫球蛋白，但脂质运载蛋白与抗体在大小上显著不同，其由160-180个氨基酸的单条多肽链组成，显著大于单个免疫球蛋白结构域。
克隆了脂质运载蛋白并对其环进行工程改造以生成抗运载蛋白。生成了结构多样的抗运载蛋白的文库且抗运载蛋白显示允许对结合功能进行选择和筛选，随后对可溶蛋白进行表达和生产以进一步在原核或真核系统中分析。研究成功地表明，可开发特异性针对几乎任何人靶蛋白的抗运载蛋白；其可分离并可获得纳摩尔或更高范围的结合亲和性。
抗运载蛋白也可配置为双重靶向蛋白，称为双运载蛋白。双运载蛋白结合一个单体蛋白中两个单独的治疗靶标，该单体蛋白可使用标准生产方法容易地生产，同时无论其两个结合结构域的结构取向如何都保留靶标特异性和亲和性。
通过单个分子对多重靶标的调节在已知涉及一种以上单个诱发因素的疾病中特别有利。此外，二价或多价结合格式(如双运载蛋白)在以下方面具有显著潜能：靶向疾病中细胞表面分子、介导信号转导途径上的拮抗作用或经由细胞表面受体的结合和聚类诱导增强的内含作用。此外，双运载蛋白的高固有稳定性与单体抗运载蛋白相当，提供了针对双运载蛋白的递送潜能和灵活配制。
关于双运载蛋白的其他信息可参见美国专利号7,250,297和国际专利申请公开号WO 99/16873，上述两篇文献都通过引用全文纳入本文。
针对LY75的高亲合性多聚体的生产
高亲合性多聚体通过体外外显子改组和噬菌体展示进化自人胞外受体结构域的大家族，生成具有结合和抑制特性的多结构域蛋白。已证明连接多个独立结合结构域建立了亲合性并导致与常规的单表位结合蛋白相比亲和性和特异性提高。其他潜在的优势包括简单和高效地在大肠杆菌中生产多靶标特异性分子，改善热稳定性和对蛋白酶的耐受性。已获得了针对多种靶标的具有亚纳摩尔级亲和性的高亲合性多聚体。
关于高亲合性多聚体的其他信息可参见美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756，上述全部文献都通过引用全文纳入本文。
针对LY75的反体的生产
反体是具有大于15％半胱氨酸的3-5kDa小蛋白，其形成高二硫化密度骨架，代替典型蛋白具有的疏水性核心。使用少量的二硫化物替换大量疏水性氨基酸(包括疏水性核心)导致形成较小、较亲水性(聚集和非特异性结合较少)、较耐受蛋白酶和热且具有较低密度的T细胞表位的蛋白，因为对MHC呈递贡献最多的残基是疏水性的。全部四种这些特性都已知影响免疫原性，且预期其共同导致免疫原性的大幅降低。
反体的启示来自水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛和海葵生成的天然可注射生物药物，其已知具有出乎意料的低免疫原性。由选择的天然蛋白家族开始，通过设计并通过筛选将大小、疏水性、蛋白水解的抗原加工和表位密度最小化至远低于天然可注射蛋白平均值的水平。
考虑到反体的结构，这些抗体模拟物提供了多功能形式，其包括多价、多特异性、多种半衰期机制、组织靶向模块和不存在抗体Fc区。此外，以高产率在大肠杆菌中制造反体，并且由于其亲水性和小尺寸，反体是高度可溶的且可配制为高浓度。反体的热稳定性极佳(可将其煮沸)并提供了延长的储藏期限。
关于反体的其他信息可参见美国专利申请公开号2007/0191272，其通过引用全文纳入本文。
亲和试剂的表达
抗体的表达
本发明的抗体可通过本领域已知的任何用于抗体合成的方法来生产，具体而言是通过化学合成或通过重组表达，且优选通过重组表达技术生产。
抗体或其片段、衍生物或类似物的重组表达需要构建编码抗体的核酸。如果抗体的核苷酸序列已知，则可由化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的核酸(如Kutmeier等，1994，BioTechniques 17:242所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体的序列的某部分的重叠寡核苷酸，使这些寡核苷酸退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，可通过克隆抗体获得编码抗体的核酸。如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列已知，则可使用可与该序列3'和5'端杂交的合成引物通过PCR扩增或者使用特异性针对特定基因序列的寡核苷酸探针通过克隆从合适来源(如抗体cDNA文库，或由表达该抗体的任何组织或细胞生成的cDNA文库)获得编码抗体的核酸。
如果无法获得特异性识别特定抗原的抗体分子(或者用于克隆编码这类抗体的核酸的cDNA文库的来源)，可通过本领域任何已知方法生成特异性针对特定抗原的抗体，例如通过免疫动物(如兔)以生成多克隆抗体或者(例如)通过生成单克隆抗体。或者，可通过筛选针对结合特定抗原的Fab片段的克隆的Fab表达文库(例如Huse等，1989,Science 246:1275-1281中所述)或者通过筛选抗体文库(参见例如Clackson等，1991,Nature 352:624；Hane等，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)来获得编码至少抗体的Fab部分的克隆。
一旦获得编码至少抗体分子的可变结构域的核酸，就可将其导入含有编码抗体分子恒定区的核苷酸序列的载体中(参见例如PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)。还可获得含有完整轻链或重链的载体，其用于与核酸共表达以允许表达完整的抗体分子。随后，编码抗体的核酸可用于导入所需的核苷酸取代或缺失以取代(或删除)一个或多个参与同不含巯基的氨基酸残基形成链间二硫键的可变区半胱氨酸残基。这类修饰可通过本领域已知的用于在核苷酸序列中导入特定突变或缺失的任意方法进行，例如但不限于化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson等，1978,J.Biol.Chem.253:6551)、基于PCR的方法等。
此外，可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:851-855；Neuberger等，1984,Nature 312:604-608；Takeda等，1985,Nature 314:452-454)，该方法是剪接来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物活性的人抗体分子的基因。如上文所述，嵌合抗体是不同部分来源于不同动物物种的分子，例如具有来源于鼠mAb的可变区和人抗体恒定区的那些抗体，例如人源化抗体。
一旦获得编码本发明抗体分子的核酸，就可使用本领域已知技术通过重组DNA技术生产用于生成抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体分子序列的核酸来制备LY75的方法。可利用本领域技术人员熟知的方法构建含有抗体分子编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。参见例如以下文献中所述技术：Sambrook等(1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(《分子克隆，实验室手册》)，第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)和Ausubel等(编，1998，Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons)，纽约)。
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养该转染细胞以生成本发明的抗体。
用于表达本发明重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌)或优选地是真核细胞，特别是对于全重组抗体分子的表达。具体而言，与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中间体早期基因启动子元件)联用的哺乳动物细胞(如中华仓鼠卵巢细胞(CHO))是有效的抗体表达系统(Foecking等，1986，Gene 45:101；Cockett等，1990，BioTechnology 8:2)。
可利用各种宿主-表达载体系统来表达本发明的抗体分子。这类宿主表达系统代表可产生并随后纯化感兴趣编码序列的载体，但也代表用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可原位表达本发明抗体分子的细胞。它们包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如毕赤酵母(SaccharomycesPichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BHK、293和3T3细胞)，其携带含有衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。
在细菌系统中，可根据所表达抗体分子的指定应用对许多表达载体进行有利地选择。例如，要生成大量这类蛋白质时，为生成包含抗体分子的药物组合物，可能需要能够指导易于纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。这类载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983，EMBO，12:1791))，其中抗体编码序列可单独连接到载体内，与lacZ编码区位于同一读框内，以产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13:3101-3109；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.，24:5503-5509)；等。也可采用pGEX载体将外来多肽表达成含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这类融合蛋白可溶，并可通过吸附和结合于基质谷胱甘肽琼脂糖珠然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解细胞中纯化。pGEX载体设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而能从GST部分释放克隆的靶基因产物。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多面体病病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗体编码序列单独克隆到病毒的非必需区(如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(如多角体蛋白启动子)的控制下。在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统(例如腺病毒表达系统)。
如上文所述，可选择调节插入序列表达、或以所需的特定方式修饰和加工该基因产物的宿主细胞系。对蛋白质产物的这类修饰(如糖基化)和加工(如切割)可能对于蛋白质功能是重要的。
为了长期、高产率地生产重组抗体，优选稳定的表达。例如，通过使用包含抗体的核苷酸序列与选择性标记(例如新霉素或潮霉素)的核苷酸序列的表达载体转染细胞并选择选择性标记的表达，可生成稳定表达感兴趣抗体的细胞系。这类工程改造细胞系在筛选和评价与抗体分子直接或间接相互作用的化合物时特别有用。
可通过载体扩增提高抗体分子的表达水平(综述参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expression ofcloned genes in mammalian cells in DNA cloning(在DNA克隆中使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因)，第3卷(学术出版社(AcademicPress)，纽约，1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可扩增时，提高宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平会增加标记基因的拷贝数。由于扩增区域与抗体基因相连，所以也会提高抗体的产量(Crouse等，1983，Mol.Cell.Biol.3:257)。
可利用本发明的两个表达载体共同转染宿主细胞，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可含有相同的选择性标记物，使得能够等同地表达重链和轻链多肽。或者，可使用编码重链和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，轻链应位于重链之前，以避免产生过多有毒的游离重链(Proudfoot，1986，Nature 322:52；和Kohler，1980，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:2197)。重链与轻链的编码序列可包括cDNA或基因组DNA。
本发明抗体分子一旦重组表达后，可通过本领域已知的任何抗体分子纯化方法进行纯化，例如，通过色谱(如离子交换色谱，亲和色谱(如使用蛋白A或特定抗原)以及大小筛分柱色谱(sizing column chromatography))、离心、差异溶解度或任何其它用于蛋白质纯化的标准技术。
或者，任何融合蛋白都可通过使用特异性针对表达的融合蛋白的抗体来容易地纯化。例如，Janknecht等所述系统允许容易地纯化人细胞系中表达的非变性融合蛋白(Janknecht等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897)。在该系统中，感兴趣的基因被亚克隆至疫苗重组质粒中，使得该基因的开放阅读框通过翻译与由六个组氨酸残基组成的氨基末端标签融合。该标签用作融合蛋白的基质结合结构域。将使用重组疫苗病毒感染的细胞的提取物加载至Ni2+次氮基三乙酸-琼脂糖柱上和并使用含咪唑的缓冲液选择性洗脱带组氨酸标签的蛋白。
然后可选择这些方法产生的抗体，首先就与纯化的感兴趣多肽的亲和性和特异性进行筛选，如果需要，比较抗体与不需要结合的多肽的亲和性和特异性结果。筛选过程可涉及在微量滴定板的不同孔中固定纯化的多肽。随后将含有潜在抗体或抗体组的溶液置于相应微量滴定孔中并孵育约30分钟至2小时。随后清洗微量滴定孔并向孔中添加标记的二抗(例如，与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠抗体(如果产生的抗体是小鼠抗体))并孵育约30分钟，随后清洗。向各孔加入底物后，当存在固定多肽的抗体时，孔中显示颜色反应。
随后可在所选的试验设计中进一步分析鉴定到的抗体的亲和性和特异性。在开发靶蛋白的免疫试验中，将纯化的靶蛋白用作标准品，用所选抗体判断免疫试验的灵敏度和特异性。由于各种抗体的结合亲和性可能不同，某些抗体对(例如在夹心试验中)可能在空间上彼此干扰等，抗体的试验表现是比抗体的绝对亲和性和特异性更重要的测试。
本领域技术人员应认识到可采用许多方法制备抗体或结合片段，就对各种多肽的亲和性和特异性进行筛选和选择，但这些方法不改变本发明的范围。
对于治疗性应用，抗体(特别是单克隆抗体)可以适当地是人或人源化动物(如小鼠)抗体。可使用人蛋白(如LY75)作为免疫原在动物中产生动物抗体。人源化通常涉及将由此鉴定的CDR移植至人框架区。通常，需要一些后续的反突变(retromutation)以优化链的构象。这类过程是本领域技术人员已知的。
亲和体的表达
亲和体的构建已在他处描述(Ronnmark J,Gronlund H,Uhlen,M.,NygrenP.A,Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorialengineering of protein A(来自蛋白A组合改造的人免疫球蛋白A(IgA)特异性配体),2002,Eur.J.Biochem.269,2647-2655)，包括构建亲和体噬菌体展示文库(Nord,K.,Nilsson,J.,Nilsson,B.,Uhlen,M.和Nygren,P.A,A combinatoriallibrary of an a-helical bacterial receptor domain(一种α螺旋细菌受体结构域的组合文库),1995,Protein Eng.8,601-608.Nord,K.,Gunneriusson,E.,Ringdahl,J.,Stahl,S.,Uhlen,M.和Nygren,P.A,Binding proteins selected from combinatoriallibraries of an a-helical bacterial receptor domain(选自α螺旋细菌受体结构域的组合文库的结合蛋白),1997,Nat.Biotechnol.15,772-777)。
还在他处描述了使用生物传感器结合研究来研究优化的亲和体变体的生物传感器分析(Ronnmark J,Gronlund H,Uhlen,M.,Nygren P.A,Humanimmunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering ofprotein A(来自蛋白A组合改造的人免疫球蛋白A(IgA)特异性配体),2002,Eur.J.Biochem.269,2647-2655)、
亲和试剂修饰
在优选的实施方式中，抗LY75亲和试剂(如抗体或其片段)与诊断部分(如可检测标签)或治疗部分偶联。该抗体可用于诊断或测定给定治疗方案的有效性。可将抗体与可检测物质(标签)偶联以利于探测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层显像术)和非放射性顺磁金属离子。对于金属离子，通常参见美国专利号4,741,900，可根据本发明将其与抗体偶联用于诊断。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括链霉亲和素、亲和素和生物素；合适的荧光材料包括伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红蛋白；合适的发光材料包括鲁米诺；合适的生物发光材料包括荧光素酶、荧光素和发光蛋白；且合适的放射性核素包括125I、131I、111In和99TC。也可以使用68Ga。
如上文所述，亲和试剂(如用于本发明的抗体)可与治疗部分(如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)偶联。这类偶联物在本文中称作“免疫偶联物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫偶联物称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(如杀死细胞)的任何物质。示例包括紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂还包括，例如，抗代谢剂(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派(thioepa)苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(如道诺霉素和多柔比星)、抗生素(如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗-有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。
可与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选示例包括多卡米星、卡奇霉素、美登素和耳他汀及其衍生物。卡奇霉素抗体偶联物的一个示例是市售可得的(美国家用产品公司(American Home Products))。
可使用本领域已知的接头技术将细胞毒素与本发明的抗体偶联。已用于将细胞毒素与抗体偶联的接头类型的示例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含有肽的接头。可选择接头，其例如易于在溶酶体隔室内被低pH切割或者易于被蛋白酶(如优先表达于肿瘤组织的蛋白酶，如组织蛋白酶，如组织蛋白酶B、C、D)切割。
细胞毒素的示例参见例如美国专利号6,989,452、7,087,600和7,129,261，以及PCT申请号PCT/US2002/17210、PCT US2005/017804、PCT/US2006/37793、PCT/US2006/060050、PCT/US2006/060711、WO2006/110476，以及美国专利申请号60/891,028，上述文献都通过引用全文纳入本文。对于细胞毒素类型、接头和用于将治疗剂与抗体偶联的方法的进一步讨论，还可参见Saito,G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
亲和试剂也可与放射性同位素偶联以生成细胞毒性放射性药物，也称作放射性免疫偶联物。可与抗体偶联用于诊断或治疗应用的放射性同位素的示例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中已建立了用于制备放射性免疫偶联物的方法。放射性免疫偶联物的示例是市售可得的，包括(IDEC制药公司(IDEC Pharmaceuticals))和(科雷莎制药公司(Corixa Pharmaceuticals)),并且可使用类似方法制备使用本发明抗体的放射性免疫偶联物。
亲和试剂也可与酞菁染料偶联，这在后文中称作酞菁偶联物。可与抗体偶联用于诊断或治疗应用的酞菁染料的示例包括但不限于IR700。用于制备酞菁偶联物的方法参见例如Mitsunaga M,Ogawa M,Kosaka N,Rosenblum LT,Choyke PL和Kobayashi H(2011)Nat Med.2011Nov 6.doi:10.1038/nm.2554。
偶联物可用于修饰给定的生物学反应，药物部分不限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白可包括例如酶活性毒素或其活性片段(如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)；诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ的蛋白；或者生物反应修饰剂(例如淋巴因子、白介素-1("IL-1")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒细胞集落刺激因子("G-CSF")或其它生长因子)。Senter P.D.(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.13(3):235-244；Kovtun等(2010)Cancer Res.70(6):2528-2537。
用于将治疗部分与抗体偶联的技术是公知的，参见例如，Arnon等，“在癌症治疗中免疫靶向药物的单克隆抗体”(Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)，刊于《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)，Reisfeld等(编)，第243-56页(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.)1985)；Hellstrom等，“用于药物递送的抗体”(AntibodiesFor Drug Delivery)，刊于《控制的药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第2版)，Robinson等(编)，第623-53页(MD公司(Marcel Dekker，Inc).1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒剂的抗体载体：综述”(Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy:A Review)，刊于《单克隆抗体84：生物和临床应用》(Monoclonal Antibodies 84:Biological and Clinical Applications)，Pinchera等(编)，第475-506页(1985)；“放射性标记抗体在癌症治疗中的治疗应用的分析、结果和展望”(Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic UseOf Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy)，刊于《用于癌症检测和治疗的单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy)，Baldwin等(编)，第303-16页(学术出版社(Academic Press)1985)和Thorpe等，Immunol.Rev.62:119-58(1982)。
或者，抗体可与第二抗体以形成抗体异源偶联物，如Segal在美国专利号4,676,980中所述。
存在或不存在与其偶联的治疗部分的抗体可用作治疗剂，其单独或与细胞毒性因子和/或细胞因子联用进行给药。
在本发明的一些实施方式中，亲和试剂(例如抗体或其抗原结合部分或抗体模拟物)不含有或包含或不偶联于肿瘤抗原、变应原、自体抗原或病毒抗原。在一些具体实施方式中，亲和试剂(例如抗体或其抗原结合部分或抗体模拟物)不含有或包含或不偶联于肿瘤抗原。
本发明还提供了全人或人源化抗体，其诱导针对抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。全人抗体是蛋白序列由天然产生的人免疫球蛋白序列编码的抗体，其来自分离的生产抗体的人B淋巴细胞，或者来自小鼠的转基因鼠B淋巴细胞(其中鼠免疫球蛋白编码染色体区域被直向同源的人序列替换)。后一种类型的转基因抗体包括但不限于HuMab(加利福尼亚州的麦得莱克斯公司(Medarex,Inc.))和XenoMouse(加利福尼亚州的阿布吉尼公司(Abgenix,Inc.))人源化抗体是具有适当抗原特异性的非人抗体分子的恒定区被具有适当效应功能的人抗体(优选是IgG亚型)的恒定区替换的抗体(Morrison等，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等，1984,Nature 312:604-608；Takeda等，1985,Nature 314:452-454)。适当的效应功能包括ADCC，这是一种天然过程，当全人抗体或人源化抗体与癌细胞表面上的靶标结合时，其开启作为正常免疫系统一部分的淋巴细胞的细胞杀伤特性。这些称为天然杀伤(NK)细胞的活性淋巴细胞使用了细胞毒性过程以破坏抗体结合的活细胞。可在抗原特异性抗体和提取自免疫活性活体人对象的外周血单核细胞存在的情况下，从铕(Eu3+)标记的活细胞中测量Eu3+的释放以检测和定量ADCC活性。该ADCC过程详细地描述于Janeway Jr.CA.等，Immunobiology,第5版,2001,GarlandPublishing,ISBN 0-8153-3642-X；Pier G.B.等，Immunology,Infection,andImmunity,2004,p246-5；Albanell J.等，Advances in Experimental Medicine andBiology,2003,532:p2153-68以及Weng,W.-K.等，Journal of Clinical Oncology,2003,21:p 3940-3947。合适的ADCC检测和定量方法参见Blomberg等，Journalof Immunological Methods.1986,86:p225-9；Blomberg等，Journal ofImmunological Methods.1986,21；92:p117-23以及Patel和Boyd,Journal ofImmunological Methods.1995,184:p29-38。
ADCC通常涉及NK细胞的激活并依赖NK细胞表面上Fc受体对抗体包被细胞的识别。该Fc受体识别抗体(如IgG)的Fc(结晶)部分，其与靶细胞表面特异性结合。触发NK细胞激活的Fc受体称作CD16或FcγRIIIa。一旦FcγRIIIa受体与IgG Fc结合，则NK细胞释放细胞因子(如IFN-γ)以及进入靶细胞并通过触发凋亡促进细胞死亡的含有穿孔蛋白和粒酶的细胞毒性颗粒。
可通过改变抗体恒定区(Fc)与免疫系统细胞表面存在的各种受体之间的相互作用的修饰来增强抗体对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的诱导。这类修饰包括复合物寡糖链中α1,6-连接的岩藻糖部分的减少或缺失，该寡糖链通常在哺乳动物细胞中的天然或重组合成期间添加至抗体的Fc。在优选实施方式中，生产了非岩藻糖基化抗LY75亲和试剂(如抗体或其片段)以用于增强其诱导ADCC应答的能力的目的。
减少或融除Fc的寡糖链中α1,6-连接的岩藻糖部分的技术是业已成熟的。在一个示例中，在特定细胞系中合成重组抗体，所述细胞系中向N连接的双线(biantennary)复合物型Fc寡糖的最内部N-乙酰葡糖胺以α1,6连接的形式添加岩藻糖的能力受损。这类细胞系包括但不限于大鼠杂交瘤YB2/0，其表达的α1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8的水平降低。优选地，该抗体合成于由于缺失FUT8基因的全部两个拷贝而无法将α1,6-连接的岩藻糖部分添加至复合物寡糖链的细胞系中。这类细胞系包括但不限于FUT8-/-CHO/DG44细胞系。合成部分岩藻糖化或非岩藻糖化抗体和亲和试剂的技术描述于Shinkawa等，J.Biol.Chem.278:3466-34735(2003)；Yamane-Ohnuki等，Biotechnology and Bioengineering 87:614-22(2004)以及WO00/61739A1、WO02/31140A1和WO03/085107A1。在第二个示例中，通过在已进行遗传工程改造以过表达糖蛋白修饰糖基转移酶的细胞系中合成来降低或破坏重组抗体的岩藻糖化，所述过表达的水平是使携带截开型N-乙酰葡糖胺的复杂的N连接寡糖的生产最大化。例如，在表达酶N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT III)的中华仓鼠卵巢细胞系中合成抗体。稳定地转染有合适糖蛋白修饰糖基转移酶的细胞系以及使用这些细胞合成抗体的方法描述于WO99/54342。
非岩藻糖化抗体或亲和试剂可用作治疗剂，其单独或与细胞毒性因子和/或细胞因子联用进行给药。
在其他修饰中，以增强ADCC激活的方式改变抗体Fc的氨基酸序列，而不影响配体亲和性。这类修饰的示例描述于Lazar等，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 2006,103:p4005-4010；WO03/074679和WO2007/039818。在这些示例中，抗体Fc中的氨基酸取代(如天冬酰胺取代239位的丝氨酸和异亮氨酸取代332位的谷氨酰胺)改变了Fc受体抗体的结合亲和性，导致ADCC激活增加。
由于氨基酸取代而具有增强的ADCC激活的抗体试剂可用作治疗剂，其单独或与细胞毒性因子和/或细胞因子联用进行给药。
在本发明的一些实施方式中，亲和试剂(例如抗体、或其抗原结合部分或抗体模拟物)不是scFV。在本发明的一些特定实施方式中，亲和试剂(例如抗体、或其抗原结合部分或抗体模拟物)不是用于治疗皮肤癌或黑素瘤的scFV。
包括本发明疾病的癌症的诊断
根据本发明的另一方面，提供了一种检测、诊断和/或筛选或监测对象中癌症(例如本发明疾病)进展或者监测对象中例如针对本发明疾病的抗癌药物或疗法效果的方法，该方法包括检测所述对象中是否存在能够免疫特异性结合LY75或其一种或多种含表位片段的抗体或其水平，或者该方法包括检测所述对象中其水平的变化。
根据本发明的另一方面，还提供了一种检测、诊断和/或筛选对象中癌症(如本发明疾病)的方法，该方法包括检测所述对象中是否存在能够免疫特异性结合LY75或其一种或多种含表位片段的抗体，其中(a)与健康对象中的水平相比，所述对象中能够免疫特异性结合LY75或所述其一种或多种含表位片段的抗体的水平升高，或者(b)与健康对象中的相应的不可检测水平相比，所述对象中存在可检测水平的能够免疫特异性结合LY75或所述其一种或多种含表位片段的抗体表明所述对象中存在所述癌症。
一种检测、诊断和/或筛选癌症(如本发明疾病)的特定方法包括：
使待测试的生物样品接触LY75或其一种或多种含表位片段；以及
检测对象中是否存在能够免疫特异性结合LY75或所述其一种或多种含表位片段的抗体。
根据本发明的另一方面，提供了一种监测对象中癌症(如本发明疾病)进展或监测对象中例如针对本发明疾病的抗癌药物或疗法的作用的方法，该方法包括在第一时间点和后续时间点检测所述对象中是否存在能够免疫特异性结合LY75或其一种或多种含表位片段的抗体，与第一时间点时所述对象中的水平相比，后续时间点时所述对象中能够免疫特异性结合LY75或其一种或多种含表位片段的抗体水平升高或降低显示所述癌症的进展或衰退或者显示所述对象中所述抗癌药物或疗法有效果或没有效果。
通常通过分析获自所述对象的生物样品来检测是否存在能够免疫特异性结合LY75或其一种或多种含表位片段的抗体(示例性生物样品如上文所述，例如该样品是淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织的样品，或者血液或唾液样品)。该方法通常包括从所述对象中获得所述生物样品用于分析的步骤。可检测的抗体包括IgA、IgM和IgG抗体。
根据本发明，获自可能患有或已知患有本发明疾病的对象的例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈和皮肤组织、血清、血浆或尿液的测试样品可用于诊断或监测。在一个实施方式中，相对于对照样品(来自未患有本发明疾病的对象)或之前确定的参考范围，测试样品中LY75丰度的变化表明存在本发明疾病。在另一个实施方式中，与对照样品或之前确定的参考范围相比，测试样品中的LY75相对丰度显示本发明疾病(例如弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(未另加说明)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤(未另加说明)、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤；甲状腺未分化癌；移行细胞癌；炎性乳腺癌；鳞状细胞食道癌；胃腺癌；鳞状细胞头颈癌或鳞状细胞皮肤癌、黑素瘤)的亚型。在另一个实施方式中，相对于对照样品或之前确定的参考范围，测试样品中的LY75相对丰度显示本发明疾病的程度或严重性(例如转移的可能性)。在前述任一方法中，LY75的检测都可任选地与本发明疾病的一种或多种其他生物标记物的检测联用。本领域中任意合适的方法都可用于测量LY75的水平，包括但不限于本文所述的优选技术、激酶试验、检测和/或观察LY75的免疫试验(例如Western印迹、免疫沉淀之后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)。在其他实施方式中，相对于对照样品或之前确定的参考范围，测试样品中编码LY75的mRNA丰度的变化表明存在本发明疾病。任何合适的杂交试验都可用于通过检测和/或观察编码LY75的mRNA来检测LY75表达(例如Northern试验、点印迹、原位杂交等)。
在本发明的另一实施方式中，特异性结合LY75的标记的抗体(或其他亲和试剂)、其衍生物和类似物可用于诊断目的以检测、诊断或监测本发明疾病。优选地，在动物中(更优选地在哺乳动物中检测且最优选地在人中)检测本发明疾病。
筛选试验
本发明提供了用于鉴定与LY75结合或对LY75的表达或活性具有刺激或抑制作用的试剂(例如候选化合物或测试化合物)的方法。本发明还提供了鉴定与LY75相关多肽或LY75融合蛋白结合或者对LY75相关多肽或LY75融合蛋白的表达或活性具有刺激或抑制作用的试剂、候选化合物或测试化合物的方法。试剂、候选化合物或测试化合物的示例包括但不限于核酸(如DNA和RNA)、碳水化合物、脂质、蛋白质、肽、肽模拟物、小分子和其他药物。可使用本领域已知的组合文库法的多种方法中任意一种获得试剂，包括：生物文库；空间可寻址的平行固相或溶液相文库；需要卷积的合成文库法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”文库法；以及使用亲和色谱选择的合成文库法。生物文库方法限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库(Lam,1997,Anticancer Drug Des.12:145；美国专利号5,738,996；和美国专利号5,807,683，上述各文献都通过引用全文纳入本文)。
用于分子文库合成的方法示例可在本领域中找到，例如：DeWitt等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909；Erb等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422；Zuckermann等，1994,J.Med.Chem.37:2678；Cho等，1993,Science261:1303；Carrell等，1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl 33:2059；Carell等，1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；以及Gallop等，1994,J.Med.Chem.37:1233，上述各文献都通过引用全文纳入本文。
化合物文库可存在于例如溶液(如，Houghten，1992，BioTechniques13:412-421)、或珠上(Lam,1991,Nature 354:82-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364:555-556)、细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利5,571,698；5,403,484；和5,223,409)、质粒(Cull等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865-1869)或噬菌体(Scott和Smith，1990，Science 249:386-390；Devlin,1990,Science 249:404-406；Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-6382；和Felici，1991，J.Mol.Biol.222:301-310)，上述文献各自通过引用全文纳入本文。
在一个实施方式中，在基于细胞的试验系统中鉴定与LY75、LY75片段(例如功能活性片段或抗原结合部分)、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用(即结合)的试剂。根据该实施方式，使表达LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白的细胞与候选化合物或对照化合物接触并测定候选化合物与LY75相互作用的能力。如果需要，该试验可用于筛选多个候选化合物(例如候选化合物的文库)。例如，该细胞可以是原核来源(如大肠杆菌)或真核来源(如酵母或哺乳动物)。此外，该细胞可内源性表达LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白，或者经遗传工程改造以表达LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白。在某些示例中，LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白或候选化合物是标记的，例如使用放射性标签(如32P、35S和125I)或荧光标签(如荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝素、邻苯二醛或荧胺)标记以检测LY75与候选化合物之间的相互作用。可通过本领域技术人员已知的方法测定候选化合物直接或间接地与LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用的能力。例如，候选化合物与LY75、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白之间的相互作用可通过流式细胞术、闪烁试验、免疫沉淀或western印迹分析来测定。
在另一个实施方式中，在无细胞试验系统中鉴定与LY75、LY75片段(例如功能活性片段或抗原结合部分)、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用(即结合)的试剂。根据该实施方式，使天然或重组的LY75或其片段、或天然或重组的LY75相关多肽或其片段、或LY75融合蛋白或其片段与候选化合物或对照化合物接触，并测定候选化合物与LY75或LY75相关多肽或LY75融合蛋白相互作用的能力。如果需要，该试验可用于筛选多个候选化合物(例如候选化合物的文库)。优选地，首先固定LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白，具体方法为例如使LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白的制剂与特异性识别或结合其的固定的抗体(或其他亲和试剂)接触，或者使纯化的LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白的制备物与经设计用于结合蛋白的表面接触。LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白可以是部分或完全纯化的，例如部分或完全地不含其他多肽，或者细胞裂解物的部分。此外，LY75、LY75片段、LY75相关多肽或LY75相关多肽的片段可以是融合蛋白，其包含LY75或其生物活性部分，或LY75相关多肽和诸如谷胱甘肽-S-转移酶的结构域。或者，可以使用本领域技术人员熟知的技术(例如生物素化试剂盒，伊利诺州洛克福德的皮尔斯化学品公司(Pierce Chemicals))对LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白进行生物素化。可通过本领域技术人员已知的方法测定候选化合物与LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用的能力。
在另一个实施方式中，使用基于细胞的试验系统鉴定结合或调节蛋白(如酶)或其生物活性部分的活性的试剂，其负责LY75的生产或降解或负责LY75的翻译后修饰。在初步筛选中，使多种化合物(例如化合物文库)接触天然或重组表达以下物质的细胞：(i)LY75、LY75的同种型、LY75同源物、LY75相关多肽、LY75融合蛋白或前述任一种物质的生物活性片段；以及(ii)负责加工LY75、LY75同种型、LY75同源物、LY75相关多肽、LY75融合蛋白或片段的蛋白以鉴定调节LY75、LY75同种型、LY75同源物、LY75相关多肽、LY75融合蛋白或片段的生产、降解或翻译后修饰的化合物。如果需要，随后可在次级筛选中针对天然或重组表达LY75的细胞测试初步筛选中鉴定的化合物。候选化合物调节LY75、同种型、同源物、LY75相关多肽或LY75融合蛋白的生产、降解或翻译后修饰的能力可以通过本领域技术人员已知的方法测定，包括但不限于流式细胞术、闪烁试验、免疫沉淀和western印迹分析。
在另一个实施方式中，在竞争性结合试验中鉴定与LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白竞争性相互作用(即结合)的试剂。根据该实施方式，使表达LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白的细胞接触候选化合物和已知与LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用的化合物，随后测定候选化合物优先与LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用的能力。或者，在无细胞试验系统中鉴定优先与LY75、LY75片段、LY75相关多肽或LY75相关多肽的片段相互作用(即结合)的试剂，具体方法为使LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白接触候选化合物或已知与LY75、LY75相关多肽或LY75融合蛋白相互作用的化合物。如上文所述，可通过本领域技术人员已知的方法测定候选化合物与LY75、LY75片段、LY75相关多肽、LY75相关多肽的片段或LY75融合蛋白相互作用的能力。这些试验(无论是基于细胞的或是无细胞的)可用于筛选多种候选化合物(例如候选化合物的文库)。
在另一个实施方式中，调节(即上调或下调)LY75或LY75相关多肽的表达或活性的试剂通过以下方法鉴定：使表达LY75或LY75相关多肽的细胞(例如原核来源或真核来源的细胞)接触候选化合物或对照化合物(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))并测定LY75、LY75相关多肽或LY75融合蛋白、编码LY75的mRNA或者编码LY75相关多肽的mRNA的表达。将候选化合物存在的情况下LY75、LY75相关多肽、编码LY75的mRNA或编码LY75相关多肽的mRNA的表达水平与候选化合物不存在(即存在对照化合物)的情况下LY75、LY75相关多肽、编码LY75的mRNA或编码LY75相关多肽的mRNA的表达水平比较。随后可基于该比较将候选化合物鉴定为LY75或LY75相关多肽表达的调节剂。例如，当存在候选化合物时LY75或mRNA的表达显著强于不存在候选化合物时的表达，则可将候选化合物鉴定为LY75或mRNA表达的刺激剂。或者，当存在候选化合物时LY75或mRNA的表达显著弱于不存在候选化合物时的表达，则可将候选化合物鉴定为LY75或mRNA表达的抑制剂。可通过本领域技术人员已知的方法测定LY75或编码其的mRNA的表达水平。例如，mRNA表达可通过Northern印迹分析或RT-PCR来评估，且蛋白水平可通过western印迹分析来评估。
在另一个实施方式中，调节LY75或LY75相关多肽活性的试剂通过以下方法鉴定：使含有LY75或LY75相关多肽的制备物或表达LY75或LY75相关多肽的细胞(例如原核或真核细胞)接触测试化合物或对照化合物并测定测试化合物调节(例如刺激或抑制)LY75或LY75相关多肽的能力。LY75或LY75相关多肽的活性可通过以下方式评价：检测LY75或LY75相关多肽的细胞信号转导途径的诱导(例如胞内Ca2+、二酰甘油、IP3等)，检测靶标对于合适底物的催化或酶活性，检测报告基因(例如对LY75或LY75相关多肽应答且与编码可检测标记物(如荧光素酶)的核酸可操作地连接的调控元件)的诱导，或者检测细胞应答，例如细胞分化，或细胞增殖。基于本说明书，本领域技术人员已知的技术可用于测量这些活性(参见例如美国专利号5,401,639，其通过引用纳入本文)。随后，通过将候选化合物的作用与对照化合物比较，可将候选化合物鉴定为LY75或LY75相关多肽活性的调节剂。合适的对照化合物包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)和生理盐水(NS)。
在另一实施方式中，在动物模型中鉴定调节(即上调或下调)LY75或LY75相关多肽的表达、活性或同时调节其表达和活性的试剂。合适的动物的示例包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猴、豚鼠、狗和猫。优选地，使用的动物代表本发明疾病的模型(例如，SCID小鼠中淋巴瘤细胞系DoHH2或WSU-FSCCL的异种移植物，Smith MR,Joshi I,Jin F,Obasaju C,BMC Cancer.2005年8月18日；5:103；甲状腺癌细胞系(如ARO)的异种移植物，Viaggi et al.,Thyroid 2003年6月；13(6):529-36；膀胱癌细胞系(如UCRU-BL-12、UCRU-BL-13和UCRU-BL-14)的异种移植物，Russell等Cancer Res.1986年4月；46(4Pt2):2035-40；裸小鼠或SCID小鼠中乳腺癌细胞系(如MCF-7(Ozzello L,SordatM.,Eur J Cancer.1980；16:553-559)和MCF10AT(Miller等，J Natl Cancer Inst.1993；85:1725-1732))的异种移植物；食道癌细胞系(如OE19)的异种移植物，Kelly等，Br J Cancer.2010年7月13日；103(2):232-8；裸小鼠中胃癌细胞系(如NCI-N87)的异种移植物；头颈癌细胞系(如FaDu和HNX-OE)的异种移植物或裸小鼠中皮肤癌细胞系(如MV3)的异种移植物，van Muijen等，Int J Cancer 1991年4月22日；48(1):85-91)。这些模型用于测试调节LY75水平的化合物，因为这些模型中的病变与例如本发明疾病中的病变类似。根据该实施方式，将测试化合物或对照化合物给予(例如口服、直肠或胃肠道外(如腹膜内或静脉内)给予)合适的动物并测定对于LY75或LY75相关多肽的表达、活性或表达和活性的作用。可通过上文所述方法评估LY75或LY75相关多肽表达的变化。
在另一实施方式中，LY75或LY75相关多肽被用作双杂交试验或三杂交试验中的“饵蛋白”以鉴定与LY75或LY75相关多肽结合或相互作用的其他蛋白(参见例如美国专利号5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)BioTechniques14:920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 8:1693-1696；以及PCT公开号WO94/10300)。本领域技术人员应理解，这类结合蛋白也可能作为例如涉及LY75的信号途径的上游或下游元件以参与LY75对信号的传导。
本发明还提供了通过上述筛选试验鉴定的新试剂及其用于本文所述治疗的应用。此外，本发明还提供了与LY75相互作用或调节其活性的试剂在生产用于治疗本发明疾病的药物中的应用。
LY75的治疗性应用
本发明提供了通过给予治疗性化合物来治疗或预防多种疾病或病症。这类化合物包括但不限于：LY75、LY75类似物、LY75相关多肽及其衍生物或变体(包括片段)；针对前述物质的抗体(或其他亲和试剂)；编码LY75、LY75类似物、LY75相关多肽及其片段的核酸；针对编码LY75或LY75相关多肽的基因的反义核酸；以及编码LY75或LY75相关多肽的基因的调节剂(例如激动剂和拮抗剂)。本发明的一个重要特征是鉴定癌症(如本发明疾病)中涉及的编码LY75的基因。例如，可通过给予治疗性化合物治疗(例如缓解症状或延缓发生或进展)或预防本发明疾病，所述治疗性化合物降低患有本发明疾病的对象的血清或组织中LY75的功能或表达。
在一个实施方式中，单独或与一种或多种其他治疗性化合物或治疗物联用以给予各自特异性结合LY75的一种或多种抗体(或其他亲和试剂)。
对于被给予的对象，生物产品(如抗体(或其他亲和试剂))是异体的。在一个实施方式中，向人对象给予人LY75或人LY75相关多肽、编码人LY75或人LY75相关多肽的核苷酸序列，或者针对人LY75或人LY75相关多肽的抗体(或其他亲和试剂)以用于治疗(例如缓解症状或延缓发生或进展)或预防。
不受理论的限制，可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)实现特异性结合LY75的抗体(或其他亲和试剂)的治疗活性(参见例如Janeway Jr.C.A.等，Immunobiology(《免疫学》)，第5版，2001，加兰出版公司(GarlandPublishing)，ISBN 0-8153-3642-X；Pier G.B.等，Immunology,Infection,andImmunity,2004,p246-5；Albanell J.等，Advances in Experimental Medicine andBiology,2003,532:p2153-68以及Weng,W-K.等，Journal of Clinical Oncology,2003,2l:p 3940-3947)。
本发明疾病的治疗与预防
例如，通过向可能患有或已知患有一种或多种本发明疾病或存在发生一种或多种本发明疾病风险的对象给予调节(即提高或降低)LY75的水平或活性(即功能)的化合物来治疗或预防本发明疾病，与未患有本发明疾病的对象的血清或组织相比，所述LY75的水平或活性差异性存在于患有一种或多种本发明疾病的对象的血清或组织中。在一个实施方式中，通过向可能患有或已知患有一种或多种本发明疾病或存在发生本发明疾病风险的对象给予上调(即降低)LY75的水平或活性(即功能)的化合物来治疗或预防本发明疾病，所述LY75的水平或活性在患有一种或多种本发明疾病的对象的血清或组织中增加。这类化合物的示例包括但不限于LY75反义寡核苷酸、核酶、针对LY75的抗体(或其他亲和试剂)和抑制LY75的酶活性的化合物。可使用体外试验鉴定其他有用的化合物，例如LY75拮抗剂和小分子LY75拮抗剂。
也可通过向可能患有或已知患有癌症(如本发明疾病)或存在发生这类癌症风险的对象给予下调LY75的水平或活性(即功能)的化合物来治疗或预防这类癌症，所述LY75的水平或活性在患有这类癌症的对象的血清或组织中增加。这类化合物的示例包括但不局限于：LY75、LY75片段和LY75相关多肽；编码LY75、LY75片段和LY75相关多肽的核酸(例如用于基因治疗)；以及对于具有酶活性的那些LY75或LY75相关多肽，已知调节酶活性的化合物或分子。可在体外试验中鉴定其他可以使用的化合物，例如LY75激动剂。
在另一个实施方式中，针对个体对象的需要调节治疗或预防。因此，在特定实施方式中，将促进LY75的水平或功能的化合物治疗性或预防性给予可能患有或已知患有癌症(例如本发明疾病)的对象，其中LY75的水平或功能缺失或相对于对照或正常参考范围降低。在其他实施方式中，将促进LY75的水平或功能的化合物治疗性或预防性给予可能患有或已知患有癌症(例如本发明疾病)的对象，其中LY75的水平或功能相对于对照或参考范围增加。在其他实施方式中，将降低LY75的水平或功能的化合物治疗性或预防性给予可能患有或已知患有癌症(例如本发明疾病)的对象，其中LY75的水平或功能相对于对照或参考范围增加。在其他实施方式中，将降低LY75的水平或功能的化合物治疗性或预防性给予可能患有或已知患有癌症(例如本发明疾病)的对象，其中LY75的水平或功能相对于对照或参考范围降低。可以容易地检测因给予这类化合物导致的LY75功能或水平的变化，例如通过获得样品(如血液或尿液)并体外测试LY75的水平或活性、或编码LY75的mRNA的水平，或前述的任意组合。这类试验可在给予本文所述化合物前后进行。
本发明的化合物包括但不限于将LY75概况恢复至正常的任何化合物，例如小有机分子、蛋白质、肽、抗体(或其他亲和试剂)、核酸等。本发明的化合物可与任意其他化疗药物联用。
疫苗治疗
本发明的另一个方面是免疫原性组合物，适当地是疫苗组合物，包含LY75或含有其片段的表位，或者编码LY75或其片段的核酸，以及任选的免疫刺激剂。
还提供了一种产生免疫应答的方法(包括给予对象这类组合物)以及一种治疗或预防癌症(如本发明疾病)的方法(包括给予有此需要的对象治疗有效量的这类组合物)以及用于预防或治疗本发明疾病的这类组合物。
因此，LY75可用作抗原性材料，并可用于疫苗生产，用于治疗或预防癌症(如本发明疾病)。这类材料可以是“抗原性”和/或“免疫原性”的。通常，“抗原性”指蛋白能够用于在对象或实验动物中产生抗体(或其他亲和试剂)或实际上能够诱导抗体应答。“免疫原性”指蛋白能够在对象或实验动物中引发免疫应答，如保护性免疫应答。因此，在后一种情况下，该蛋白不仅能够产生抗体应答，还可产生基于非抗体的免疫应答。“免疫源性”还包括蛋白是否在体外环境(如T细胞增殖试验)中引发免疫样应答。适当免疫应答的生成可能需要存在一种或多种佐剂和/或适当的抗原呈递。
本领域技术人员应理解，LY75的同源物或衍生物也可用作抗原性/免疫原性材料。因此，例如，本发明包括包含一个或多个插入、缺失、取代等的蛋白。此外，一种氨基酸可以被另一种类似“类型”取代，例如，一种疏水性氨基酸被另一种取代。可以使用诸如CLUSTAL的程序比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列并通过在各序列适当位置插入空格来实现最优比对。可以计算最优比对的氨基酸相同性或相似性(相同性加氨基酸类型的保守性)。诸如BLASTx的程序将比较类似序列的最长延伸体(stretch)并为该匹配赋值。因此可以获得其中发现若干类似区域的比较，其各自具有不同的评分。本发明包括全部两种分析类型。
对于同源物和衍生物的情况，与本文所述蛋白的相同性程度的重要性程度弱于同源物或衍生物应保留其抗原性和/或免疫原性。然而，合适地，提供了与本文所述蛋白或多肽具有至少60％类似性(如上文所述)的同源物或衍生物，例如提供了具有至少70％类似性(如至少80％类似性)的同源物或衍生物。特别地，提供了具有至少90％或甚至95％类似性的同源物或衍生物。合适地，同源物或衍生物与本文所述蛋白或多肽具有至少60％的序列相同性。优选地，同源物或衍生物具有至少70％相同性，更优选地至少80％相同性。最优选地，同源物或衍生物具有至少90％或甚至95％相同性。
在一个替代性方法中，该同源物或衍生物可以是融合蛋白，其整合了使纯化较容易的部分，例如通过有效地标记所需蛋白或多肽。可能需要除去该“标签”或者情况可能是融合蛋白本身保留了有用的足够的抗原性。
已知可以筛选抗原性蛋白或多肽以鉴定表位区域，即负责蛋白或多肽的抗原性或免疫原性的那些区域。本领域技术人员熟知的方法可用于测试片段和/或同源物和/或衍生物的抗原性。因此，本发明的片段应包含一种或多种这类表位区域或与这类区域足够类似以保留其抗原性/免疫原性特性。因此，对于本发明的片段而言，其相同性程度可能不相关，因为其可能与本文所述蛋白或多肽、同源物或衍生物的特定部分100％相同。再一次强调，关键点是该片段保留了其来源蛋白的抗原性/免疫原性特性。
对于同源物、衍生物和片段而言，重要的是其具有至少一定程度的其来源蛋白或多肽的抗原性/免疫原性。因此，在本发明的另一方面，提供了LY75或其同源物或衍生物的抗原性/或免疫原性片段。
LY75或其抗原性片段可以纯化或分离的制备物的形式单独提供。其可以混合物一部分的形式与一种或多种其他的本发明蛋白或其抗原性片段一起提供。因此，在其他方面，本发明提供了一种抗原组合物，其包含LY75和/或其一种或多种抗原性片段。这类组合物可用于癌症(如本发明疾病)的检测和/或诊断。
本发明所述的疫苗组合物可以是预防性或治疗性疫苗组合物。
本发明的疫苗组合物可包含一种或多种佐剂(免疫刺激剂)。本领域熟知的示例包括无机凝胶(如氢氧化铝)或油包水乳液(如不完全弗氏佐剂)。其他有用的佐剂是本领域技术人员熟知的。
用于治疗癌症的疫苗组合物的合适佐剂包括：3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(称作3D-MPL或简称MPL，参见WO92/116556)、皂苷(如QS21或QS7)和TLR4激动剂(如含CpG的分子，例如WO95/26204中所公开的那样)。使用的佐剂可以是各组分的组合，例如MPL和QS21或MPL、QS21和含CpG的部分。佐剂可配制为水包油乳液或脂质体制剂。这类制备物可包含其他载剂。
在另一个实施方式中，包含10个或更多个与编码LY75或LY75肽片段的核苷酸序列互补的连续核苷酸的寡核苷酸制备物被用作治疗癌症(如本发明疾病)的疫苗。这类制备物可包含佐剂或其他载剂。
抑制LY75以治疗本发明疾病
在本发明的一个实施方式中，通过给予拮抗(抑制)LY75的水平和/或功能的化合物来治疗或预防癌症(如本发明疾病)，与未患有这类癌症的对象的血清或组织相比，所述LY75的水平和/或功能在患有这类癌症的对象的血清或组织中升高。
用于该目的的化合物包括但不限于抗LY75抗体(或其他亲和试剂及其含有结合区域的片段和衍生物)、LY75反义或核酶核酸以及编码功能异常的LY75的核酸，其可用于通过同源重组“敲除”内源性LY75功能(参见例如Capecchi,1989,Science 244:1288-1292)。可通过使用已知的体外试验来鉴定抑制LY75功能的其他化合物，例如针对测试化合物抑制LY75与另一蛋白或结合伙伴结合或者抑制已知的LY75功能的能力的试验。
这类抑制可以例如在体外或细胞培养物中测试，也可使用遗传试验。优选的技术也可用于在化合物给药前后检测LY75的水平。使用合适的体外或体内试验来确定特定化合物的效果以及其给药是否显示治疗受影响组织，如下文中详述。
在特定实施方式中，将抑制LY75功能(活性)的化合物治疗性或预防性给予对象，在所述对象中通过与未根据本发明接受治疗的患有例如本发明疾病的对象的血清或组织相比来检测升高的LY75的血清或组织水平或功能性活性(例如超过正常水平或所需水平)，或者使该水平或活性恢复至未患有这类癌症的对象中的水平或活性或者预定的参考范围。本领域中标准的方法可用于测量LY75水平或功能的升高，如上文所述。合适的LY75抑制剂组合物可包括例如小分子，即1000道尔顿或更小的分子。这类小分子可通过本文所述筛选方法来鉴定。
用于治疗性或预防性化合物的试验
本发明还提供了用于药物发现的试验以鉴定或验证用于治疗或预防表达LY75的癌症(如本发明疾病)的化合物的功效。
因此，提供了一种筛选调节LY75活性的化合物的方法，该方法包括：(a)使LY75或其生物活性部分与候选化合物接触；以及(b)测定LY75的活性是否因此受到调节。这类方法可包括(a)使LY75或其生物活性部分在样品中与候选化合物接触；以及(b)将接触所述候选化合物后所述样品中LY75或其生物活性部分的活性与接触所述候选化合物前所述样品中LY75或其生物活性部分的活性进行比较，或者与参考活性水平进行比较。
该筛选方法可以是一种筛选抑制LY75活性的化合物的方法。
LY75或其生物活性部分可以例如在细胞上表达或由细胞表达。LY75或其生物活性部分可以例如分离自表达其的细胞。LY75或其生物活性部分可以例如固定在固相上。
因此，还提供了一种筛选调节LY75或编码LY75的核酸表达的化合物的方法，该方法包括：(a)使表达LY75或编码LY75的核酸的细胞与候选化合物接触；以及(b)测定LY75或编码LY75的核酸的表达是否因此受到调节。这类方法可包括(a)使表达LY75或编码LY75的核酸的细胞在样品中与候选化合物接触；以及(b)将接触所述候选化合物后所述样品中由细胞表达的LY75或编码LY75的核酸与接触所述候选化合物前所述样品中由细胞表达的LY75或编码LY75的核酸进行比较，或者与参考表达水平进行比较。
该方法可以是一种筛选抑制LY75或编码LY75的核酸表达的化合物的方法。
本发明的其他方面包括：可通过前述筛选方法获得的化合物，调节LY75或编码LY75的核酸的活性或表达的化合物，例如抑制LY75或编码LY75的核酸的活性或表达的化合物。
提供了这类化合物以用于治疗或预防癌症(如本发明疾病)。还提供了一种治疗或预防癌症(如本发明疾病)的方法，该方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的这类化合物。
可测定测试化合物将患有例如本发明疾病的对象中的LY75水平恢复至未患有这类癌症的对象中的水平或者在这类癌症的实验性动物模型中产生类似变化的能力。能够将患有例如本发明疾病的对象中的LY75水平恢复至未患有这类癌症的对象中的水平或者在这类癌症的实验性动物模型中产生类似变化的化合物可用作进一步药物发现的前导化合物，或者进行治疗性使用。可通过优选的技术、免疫试验、凝胶电泳之后进行观察、检测LY75活性或本文教导或本领域技术人员已知的任意其他方法来测定LY75的表达。这类测试可用于在临床监测或药物开发中筛选候选药物，其中LY75的丰度可用作临床疾病的替代标记物。
在各种特定实施方式中，可使用代表对象疾病中所涉及细胞类型的细胞进行体外试验以测定化合物是否对这类细胞类型具有所需效果。
可以在进行人体测试之前，在合适的动物模型系统中测试用于治疗的化合物，所述动物模型包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。对于体内测试，在向人给药前，可以使用本领域已知的任何动物模型系统。本发明疾病的动物模型的示例包括但不限于：SCID小鼠中淋巴瘤细胞系DoHH2或WSU-FSCCL的异种移植物，Smith MR,Joshi I,Jin F,Obasaju C,BMC Cancer.2005年8月18日；5:103；甲状腺癌细胞系(如ARO)的异种移植物，Viaggi etal.,Thyroid 2003年6月；13(6):529-36；膀胱癌细胞系(如UCRU-BL-12、UCRU-BL-13和UCRU-BL-14)的异种移植物，Russell等Cancer Res.1986年4月；46(4Pt 2):2035-40；裸小鼠或SCID小鼠中乳腺癌细胞系(如MCF-7(OzzelloL,Sordat M.,Eur J Cancer.1980；16:553-559)和MCF10AT(Miller等，J NatlCancer Inst.1993；85:1725-1732))的异种移植物；食道癌细胞系(如OE19)的异种移植物，Kelly等，Br J Cancer.2010年7月13日；103(2):232-8；裸小鼠中胃癌细胞系(如NCI-N87)的异种移植物；头颈癌细胞系(如FaDu和HNX-OE)的异种移植物或裸小鼠中皮肤癌细胞系(如MV3)的异种移植物，van Muijen等，Int J Cancer 1991年4月22日；48(1):85-91。这些模型可用于测试调节LY75水平的化合物，因为这些模型中的病变与例如本发明疾病中的病变类似。本领域技术人员还知晓，基于本发明，可生产具有编码LY75的基因的“敲除”突变的转基因动物。基因的“敲除”突变是导致突变的基因无法表达或以异常形式或低水平表达的突变，使得与基因产物相关的活性基本或完全缺失。优选地，该转基因动物是哺乳动物；更优选地，该转基因动物是小鼠。
在一个实施方式中，在非人动物(例如小鼠、大鼠、猴、兔和仓鼠)、优选表达LY75的本发明疾病的非人动物模型中鉴定调节LY75表达的测试化合物。根据该实施方式，将测试化合物或对照化合物给予动物，并测定测试化合物对于LY75表达的作用。可通过以下方法鉴定改变LY75表达的测试化合物：比较使用测试化合物治疗的动物或动物组中LY75(或编码其的mRNA)的水平与使用对照化合物治疗的动物或动物组中LY75或mRNA的水平。可使用本领域技术人员已知的技术测定mRNA和蛋白水平，例如原位杂交。可以处死或不处死动物以测定测试化合物的作用。
在另一个实施方式中，在非人动物(例如小鼠、大鼠、猴、兔和仓鼠)、优选表达LY75的本发明疾病的非人动物模型中鉴定调节LY75或其生物活性部分活性的测试化合物。根据该实施方式，将测试化合物或对照化合物给予动物，并测定测试化合物对于LY75活性的作用。可通过测试使用对照化合物治疗的动物与使用测试化合物治疗的动物来鉴定改变LY75活性的测试化合物。LY75的活性可通过以下方式评价：检测LY75的细胞第二信使(例如胞内Ca2+、二酰甘油、IP3等)的诱导，检测LY75或其结合伙伴的催化或酶活性，检测报告基因(例如对LY75应答且与编码可检测标记物(如荧光素酶或绿色荧光蛋白)的核酸可操作地连接的调控元件)的诱导，或者检测细胞应答(例如细胞分化或细胞增殖)。可使用本领域技术人员已知的技术来检测LY75活性的变化(参见例如美国专利号5,401,639，其通过引用纳入本文)。
在另一个实施方式中，在患有例如本发明疾病的人对象中鉴定调节LY75的水平或表达的测试化合物，优选在患有例如严重的本发明疾病的那些对象中鉴定。根据该实施方式，将测试化合物或对照化合物给予人对象，并通过分析生物样品(如血清、血浆或尿液)中LY75或编码其的mRNA的表达来测定测试化合物对LY75表达的作用。可通过以下方法鉴定改变LY75表达的测试化合物：比较使用对照化合物治疗的对象或对象组中LY75或编码其的mRNA的水平与使用测试化合物治疗的对象或对象组中的水平。或者，可通过以下方法鉴定LY75的表达变化：比较给予测试化合物前后对象或对象组中LY75或编码其的mRNA的水平。可使用本领域技术人员已知的技术获得生物样品并分析mRNA或蛋白表达。例如，可使用本文所述优选的技术评估LY75水平的变化。
在另一个实施方式中，在患有例如本发明疾病的人对象中鉴定调节LY75活性的测试化合物(优选在患有例如严重的本发明疾病的那些对象中鉴定)。在该实施方式中，将测试化合物或对照化合物给予人对象，并测定测试化合物对于LY75活性的作用。可通过以下方法鉴定改变LY75活性的测试化合物：比较来自对照化合物治疗的对象的生物样品与来自测试化合物治疗的对象的样品。或者，可通过以下方法鉴定LY75的活性变化：比较给予测试化合物前后对象或对象组中LY75的活性。LY75的活性可通过以下方式评价：检测生物样品(如血清、血浆或尿液)中LY75的细胞信号转导途径的诱导(例如胞内Ca2+、二酰甘油、IP3等)，LY75或其结合伙伴的催化或酶活性，或者细胞应答，例如细胞分化，或细胞增殖。可使用本领域技术人员已知的技术检测LY75的第二信使的诱导的变化或细胞应答的变化。例如，可使用RT-PCR检测细胞第二信使的诱导的变化。
在另一个实施方式中，选择使LY75的水平或表达向对照对象(例如未患有本发明疾病的人)中检测的水平变化的测试化合物以用于进一步的测试或治疗应用。在另一个实施方式中，选择使LY75的活性向对照对象(例如未患有本发明疾病的人)中发现的活性变化的测试化合物以用于进一步的测试或治疗应用。
在另一个实施方式中，在患有例如本发明疾病的人对象中鉴定降低例如本发明疾病相关一种或多种症状的严重程度的测试化合物，优选在患有例如严重的本发明疾病的对象中鉴定。根据该实施方式，将测试化合物或对照化合物给予对象，并测定测试化合物对于例如本发明疾病的一种或多种症状的作用。可通过以下方式鉴定减轻一种或多种症状的测试化合物：比较使用对照化合物治疗的对象与使用测试化合物治疗的对象。可使用熟悉例如本发明疾病的医生已知的技术来测定测试化合物是否减轻了一种或多种例如本发明疾病相关症状。例如，在患有例如本发明疾病的对象中减轻肿瘤负荷的测试化合物是对这类对象有益的。
在另一个实施方式中，选择降低一种或多种例如本发明疾病相关症状严重程度的测试化合物以用于进一步测试或治疗性应用。
治疗性和预防性组合物及其应用
本发明提供了治疗(和预防)方法，包括给予对象治疗有效量的本发明化合物(例如LY75蛋白、能够特异性结合LY75或其片段的亲和试剂，或编码LY75的核酸)。在一个具体方面，本发明是基本纯的(例如基本不含限制其作用或产生不需要的副作用的物质)。
当化合物包含核酸时可以使用的制剂和给药方法如上文所述；其他适当制剂和给药途径如下文所述。
已知可使用各种递送系统给予本发明组合物，例如：包裹在脂质体、微粒、微胶囊中，能表达该化合物的重组细胞，受体介导的胞吞(参见，例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.，262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸，等等。导入的方法可以是肠道或胃肠道外且包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可通过任何便捷途径，例如输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬里(如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收给予该化合物，并可与其它生物活性剂一起给药。给药可以是全身给药或局部给药。此外，可能需要将本发明的药物组合物通过任何合适的途径导入中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可由心室内导管促进，其例如与储器(如奥马耶储器)相连。也可采用经肺给药，例如利用吸入器或喷雾器，以及用雾化剂配制药物。
在本发明的一个方面，可将本发明中使用的核酸递送至真皮，例如使用颗粒介导的表皮递送。
在一个具体实施方式中，可能需要将本发明的药物组合物局部给予需要治疗的区域；这可通过(例如但不限于)以下方式来实现：手术期间的局部输注、局部施涂，例如通过注射、通过导管或通过植入物，所述植入物是多孔性、非多孔性或明胶状材料，包括膜，如唾液酸膜(sialastic membrane)，或者纤维。在一个实施方式中，可以通过直接注射至例如淋巴、甲状腺、膀胱、乳腺、胃、食道、头颈或皮肤组织或在恶性肿瘤或肿瘤或肿瘤前组织的位点(或前位点)处注射来进行给药。
在另一个实施方式中，可在囊泡(特别是脂质体)中递送化合物(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等，刊于Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer(《感染性疾病和癌症疗法中的脂质体》)，Lopez-Berestei和Fidler(编)，利斯出版社(Liss)，纽约，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；同上)。
在另一个实施方式中，该化合物可在控释系统中递送。在一个实施方式中，可使用泵(参见Langer,同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwald等，1980,Surgery 88:507；Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574)。在另一实施方式中，可使用多聚物质(参见Medical Applications of ControlledRelease(《控释的药物应用》),Langer和Wise(编),佛罗里达州波卡拉顿的CRC出版社(CRC Pres.)，佛罗里达州博卡拉顿(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance(《受控药物的生物利用度，药物产品设计和性能》)，Smolen和Ball(编)，纽约的威利出版公司(Wiley)(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；也参见Levy等,1985,Science 228:190；During等,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等,1989,J.Neurosurg.71:105)。在又一个实施方式中，可将控释系统放置于治疗靶点附近，例如，本发明疾病因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，Medical Applications of Controlled Release(《控释的医学应用》)，同上，第2卷，第115-138页(1984))。其他控释系统参见Langer(1990，Science249:1527-1533)的综述。
在特定实施方式中，当本发明的化合物是编码蛋白的核酸时，可在体内给予该核酸以促进其编码蛋白的表达，方法为通过将其构建为适当核酸表达载体的一部分并进行给药使其进入胞内，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；生物射弹，杜邦公司)，或使用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过将其与已知进入细胞核的同源框样肽连接来进行给药(参见例如Joliot等，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)，等。或者，可通过同源重组将核酸经细胞内导入并整合至宿主细胞DNA内以进行表达。
本发明还提供药物组合物。这类组合物包含治疗有效量的本发明化合物和药学上可接受的运载体。在一个具体实施方式中，术语“药学上可接受的”指适于被联邦或州政府管理机构批准，或美国药典或其它通常接受的药典所列的用于动物，更具体是用于人的。术语“运载体”表示与治疗剂一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这类药物运载体可以是无菌液体，如水和油，包括来自石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。静脉内给予该药物组合物时，水是优选的运载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体运载体，特别适用于注射液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、缓释制剂等形式。该组合物可与传统结合剂和运载体(如甘油三酯)一起配制为栓剂。口服制剂可含有标准运载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物运载体的示例参见E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)”。这类组合物含有治疗有效量的化合物，例如纯化形式的化合物，以及适量运载体，以提供适合给予对象的形式。该制剂应适合给药方式。
在一个实施方式中，例如当使用一种或多种抗体时，按照常规方法将该组合物配制成适合静脉内给予人类的药物组合物。静脉内给予的组合物通常是溶于无菌等渗水性缓冲液的溶液。如果需要，组合物也可含有增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)来减轻注射部位的疼痛。通常，各成分单独提供或混合在一起以单位剂型的形式提供，例如作为标明活性物质含量的密封容器(如安瓿或药囊)中的冻干粉末或无水浓缩物。通过输液给予该组合物时，可用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配该组合物。通过注射给予该组合物时，可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便在给药前与药物成分混合。
本发明的化合物可配制成中性形式或盐形式。
适当情况下，药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，例如衍生自氢氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
可以有效治疗癌症(如本发明疾病)的本发明化合物的量可以通过标准临床技术测定。此外，可任选地进行体外试验以辅助鉴别最优的剂量范围。制剂所用的准确剂量也取决于给药途径和疾病或病症的严重程度，应该按照实施人员的判断和各对象的情况决定。然而，用于静脉内给药的合适剂量范围通常是每千克体重约20-500毫克的活性化合物。用于鼻内给药的合适剂量范围通常是约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量可从体外或动物模型测试系统所得剂量反应曲线外推。
栓剂通常含有范围为0.5％-10％(以重量计)的活性成分，口服制剂优选含有10％-95％的活性成分。
本发明也提供包括一个或多个容器的药物包装或药盒，所述容器中装有本发明药物组合物的一种或多种成分。这类容器任选附有管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的告知书，该告知书反映(a)生产、使用或销售管理机构批准其用于人体，(b)使用指南，或上述两者。
因此，在一个方面，该药盒包含本发明使用的抗体，例如可将抗体冻干以在给药或使用前重建。当药盒用于疗法/治疗例如癌症时，可使用等渗水溶液重建抗体，其可选地提供于该药盒中。在一个方面，该药盒可包含本发明使用的多肽(如免疫原性多肽)，其可以例如被冻干。后一种药盒还可包含用于重建免疫原性多肽的佐剂。
本发明还延伸至本文所述组合物，例如用于在对象中诱导免疫应答的药物组合物和/或疫苗组合物。
在其他实施方式中，本发明提供了一种药物，其单独或共同地包含：
(a)结合LY75的亲和试剂，以及
(b)抗癌剂或其他活性剂，
用于在癌症治疗，优选在本发明疾病之一的治疗过程中进行同时、连续或单独的给药。
通过成像技术测定LY75的丰度
通过成像技术测定LY75丰度的一个优势是这类方法是非侵入性的(只是需要给予试剂)且无需从对象中提取样品。
合适的成像技术包括正电子发射断层成像(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。使用这类技术观察LY75需要整合或结合合适的标签，例如放射性示踪剂(如18F、11C或123I)(对于这些技术的进一步细节，参见例如NeuroRx-The Journal of the American Society for ExperimentalNeuro Therapeutics(2005)2(2),348-360以及同上第361-371页)。放射性示踪剂或其他标签可通过给予合适标记的特定配体的对象(例如通过注射)来整合至LY75。或者，可将其整合至特异性针对LY75的结合亲和试剂(例如抗体)，其可给予至对象(例如通过注射)。对于使用亲和体进行成像的讨论，参见例如Orlova A,Magnusson M,Eriksson TL,Nilsson M,Larsson B,Hoiden-Guthenberg I,Widstrom C,Carlsson J,Tolmachev V,Stahl S,Nilsson FY,Tumor imaging using a picomolar affinity HER2binding Affibody molecule(使用皮摩尔级亲和性HER2结合亲和体分子进行的肿瘤成像),Cancer Res.2006年4月15日；66(8):4339-48。
使用免疫组化诊断和治疗包括本发明疾病的癌症
免疫组化是一种出色的检测技术并且因此对癌症(包括本发明疾病)的诊断和治疗非常有用。
免疫组化可用于检测、诊断或监测癌症(如上文所述的那些)，其使用特异性结合LY75的标记的抗体(或其他亲和试剂)、其衍生物和类似物作为特异性试剂，通过抗原-抗体相互作用来定位组织切片中的LY75抗原，该相互作用通过标记物(如荧光染料、酶、放射性元件或胶体金)来观察。
单克隆抗体技术的进步对于确保免疫组化在人肿瘤的现代精确显微诊断中的地位具有重要作用。通过免疫组化对于弥散性肿瘤转化细胞的鉴定更清晰地描绘了癌症侵入和转移以及朝向增加恶性的肿瘤细胞相关免疫表型的进化。未来的抗肿瘤治疗方法可包括多种个性化免疫治疗，特异性针对与各单个患者的肿瘤疾病相关的特定免疫表型模式。对于进一步讨论，参见例如Bodey B,Thesignificance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms(免疫组化在肿瘤诊断和治疗中的重要性),Expert Opin Biol Ther.2002年4月；2(4):371-93。
本发明各方面的优选特征可经修改作为各其他方面。本文所述现有技术文献以法律允许的最大程度纳入本文。
本发明由下文的非限制性实施例说明。
实施例1：使用液相色谱-质谱(LC/MS)鉴定膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、急性单核细胞白血病组织样品和多发性骨髓瘤细胞组织样品中表达的LY75
使用以下实验方案，消化提取自膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、急性单核细胞白血病组织样品和多发性骨髓瘤细胞和相应正常或正常相邻组织(NAT)样品的膜蛋白并通过串联质谱对所得肽进行测序。
1.1材料和方法
1.1.1质膜分级分离
对回收自膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、急性单核细胞白血病组织样品和多发性骨髓瘤细胞或正常或正常相邻组织的细胞进行均质化并在1000x g下离心。提取上清液并在49500x g下超速离心。对所得沉淀物重新均质化并通过不连续的蔗糖密度离心进行分离。在107000x g下进行超速离心后，回收并沉淀相边界处的组分。
1.1.2质膜溶解
将质膜组分重悬在SDS(十二烷基硫酸钠)中至0.5％的最终SDS浓度，离心并提取溶解的蛋白。
1.1.3胰蛋白酶裂解
对于溶液内消化，使用200mM碳酸氢铵将50μg蛋白溶液配制为100μl。向样品中添加10μl的还原剂DL-二硫苏糖醇(75mM)并在80℃下孵育15分钟。之后进行半胱氨酸封闭步骤，使用10μl 150mM碘乙酰胺并在室温下在黑暗中孵育30分钟。随后通过添加超纯水将SDS浓度稀释至0.05％。向混合物中添加足量体积的胰蛋白酶(普洛麦格公司(Promega)V5111)，使1μg胰蛋白酶与2.75μg蛋白反应并在37℃下孵育过夜。
或者，使用3μl 50mM TCEP还原105μg的蛋白溶液并在60℃下孵育1小时。随后根据生产商说明书在蛋白消化试剂盒(蛋白发现公司(ProteinDiscovery))的FASP过滤装置上加工样品，但使用三乙基碳酸氢铵代替碳酸氢铵。在75μl的终体积中进行胰蛋白酶裂解，使用1μg胰蛋白酶与50μg蛋白反应。
1.1.4肽分级分离
消化的蛋白样品在真空下干燥，重悬于0.1％甲酸水溶液中并添加三氟乙酸(TFA)以将溶液的pH降低至小于3。
在安捷伦(Agilent)LCI 200系列液相色谱系统上使用安捷伦Zorbax生物强阳离子交换系列II柱通过离子交换对肽进行分离。或者，根据供应商的实验方案使用安捷伦3100OFFGEL分馏器和OFFGEL试剂盒pH 3–10进行基于pI的分离。在IPG条的重水合后，向各孔中加载等体积的膜消化物。分离后，酸化所得组分。
1.1.5质谱
通过使用配备有nanoACQUITY UPLC BEH 130C18柱，75μmx250mm(186003545)和LTQ Orbitrap Velos(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))的沃特斯(Waters)nanoACQUITY UPLC系统通过液相色谱-质谱分析分级分离的样品。在120分钟内使用从3％增加至35％乙腈的300nl/分钟梯度对肽进行洗脱。在Orbitrap中以400-2000m/z质量范围之间的60000分辨率获得全扫描质谱。在各循环中，选择20个强度最高的肽用于使用该仪器上安装的纳米喷雾离子源在线性离子阱中进行CID MS/MS扫描。
1.1.6肽的氨基酸序列分析
通过Mascot软件(矩阵科学公司(Matrix Science))对由LTQ Orbitrap Velos生成的原始数据进行加工，该软件使用Mowse算法(Curr Biol.1993年6月1日；3(6):327-3)以通过对由Ensembl(http://www.ensembl.org/index.html)、IPI(www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html)和SwissProt(http://www.uniprot.org)组成的序列数据库以及污染蛋白序列进行检索来推断峰列表的氨基酸序列。肽鉴定的标准包括胰蛋白酶消化，最多2个缺失的切割位点和多个生物和化学修饰(氧化的甲硫氨酸、由MMTS或碘乙酰进行的半胱氨酸修饰和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化)。将具有0.05％或更低的期望值、28或更高的离子评分的秩为1的肽加载至我们的OGAP数据库中，在其中将其加工为蛋白组。
1.1.7膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、急性单核细胞白血病组织样品和多发性骨髓瘤细胞相关蛋白的区分
鉴定LY75的过程使用了通过对天然产生的人蛋白进行质谱(如上文所述)而经实验获得的肽序列，该质谱用于鉴定和组织公开的人基因组序列中的编码外显子。将这些表1所列经实验确定的序列与数据库比较，该数据库通过加工和整合肽质量、肽签名、EST和公共结构域基因座序列数据(如国际专利申请WO2009/087462所述)来编译。
表1.膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、急性单核细胞白血病组织样品和多发性骨髓瘤细胞的质膜中通过LC/MS鉴定的LY75特异性肽。
SEQ ID No 鉴定的肽
3 AANDPFTIVHGNTGK
4 CLGLDITK
5 CEHHSLYGAAR
6 KGGSEESLCDQPYHEIYTR
7 GGSEESLCDQPYHEIYTR
8 WGICLKPENGCEDNWEK
9 MDAESGLWQSFSCEAQLPYVCR
10 LHNEDIK
11 EEVWIGLK
12 TPNCVSYLGELGQWK
13 VQSCEEK
14 LNDASSDK
15 MCPPDEGWK
16 HGETCYK
17 FEQEYLNDLMK
18 YFWTGLR
19 DVDSCGEYNWATVGGR
20 MSGPLGPEEASPKPDDPCPEGWQSFPASLSCYK
21 SPDLQGSWQWSDR
22 TPVSTIIMPNEFQQDYDIR
23 EFIYLRPFACDTK
24 LEWVCQIPK
25 TPDWYNPDR
26 ISEWPIDDHFTYSR
27 FPVTFGEECLYMSAK
28 TWLIDLGKPTDCSTK
29 VQCSEQWIPFQNK
30 ELTYSNFHPLLVSGR
31 IPENFFEEESR
32 YHCALILNLQK
33 HFVSLCQK
34 YLNNLYK
35 TLTWHSAK
36 EVKPVDSVK
37 HMATTQDEVHTK
38 SHILSIR
39 SHILSIRDEK
40 SLMWFDK
41 TPLSYTHWR
42 FLAGLSTDGFWDIQTFK
43 GQTSPGNCVLLDPK
44 DGAICYKPTK
45 SDQALHSFSEAK
46 HDHSATIVSIK
47 HDHSATIVSIKDEDENK
48 HDHSATIVSIKDEDENKFVSR
49 KVECEHGFGR
50 VECEHGFGR
51 VPLGPDYTAIAIIVATLSILVLMGGLIWFLFQRHR
52 YAQGVNEDEIMLPSFHD
1.1.8蛋白指数
蛋白指数是对蛋白普遍性(protein prevalence)和肽丰度的测量。该算法考虑了其中已观察蛋白的样品的数目和各样品中观察的肽的数目对比可观察的肽的数目。随后通过相应正常样品对比癌症样品的成对比较对所得值进行分级。
1.2结果
如本文进一步描述的那样，这些实验鉴定到了LY75。在膀胱癌、乳腺癌、慢性淋巴性白血病(CLL)、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、小细胞肺癌和淋巴瘤(NHL)、急性单核细胞白血病(AML)组织样品和多发性骨髓瘤细胞(MM)的质膜中检测到了全长LY75。表2显示了通过蛋白指数测量的LY75的表达分布。
这些癌组织中LY75的表达显示LY75是这些癌症中有价值的治疗和诊断靶标。
表2.LY75蛋白指数(+++++＝非常高；++++＝高；+++＝中等；++＝低；+＝非常低；-＝未观察到)
组织 癌症 正常
膀胱 +++ +
乳腺 +++ -
结直肠 +++++ ++
胃 +++ ++
食道 ++++ -
头颈 ++ -
肾 + -
非小细胞肺 +++ -
卵巢 ++++ -
胰腺 +++ -
皮肤 ++ -
小细胞肺 + -
AML + -
CLL ++ -
NHL +++++ -
MM +++ -
实施例2：使用针对LY75的抗体的免疫组化
使用以下参考实验方案，使用针对LY75的小鼠单克隆抗体(徕卡公司(Leica))对FFPE肿瘤和正常组织进行免疫组化。
2.1材料和方法
2.1.1材料
来自英国TCS生物科学公司(TCS Biosciences)的Citroclear(HC5005)
来自英国西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的试剂醇(R8382)
来自英国大科公司(Dako)的靶标修复溶液，pH6(S2369)
来自英国大科公司的REAL过氧化物酶封闭溶液(S2023)
来自英国大科公司的抗体稀释液(S0809)
来自英国大科公司的EnVision+HRP偶联的聚合物，小鼠(K4000)
来自英国大科公司的液体DAB+底物(K3468)
来自英国大科公司的Mayer苏木精(X0909)
来自英国VWR公司的水基切削液(Aquatex)(1.08562.0050)
组织切片和阵列来自美国马里兰州的美国百麦克斯公司(US BiomaxInc.)。
2.1.2脱石蜡化和重水合
在Citroclear中对载玻片进行脱石蜡化(2x5分钟)，随后通过100％醇(2x5分钟)、50％醇(1x5分钟)和自来水(1x5分钟)进行重水合。
2.1.3抗原修复(高压锅)
在科普林氏缸内的50ml靶标修复溶液中对LY75抗原在压力下修复20分钟。随后使载玻片冷却至室温，再持续20分钟。使用疏水性阻隔笔在各组织切片/TMA周围画圈并使用PBS清洗载玻片两次，每次3分钟。
2.1.4组织染色
通过将组织与过氧化物酶封闭溶液在潮湿箱中室温孵育10分钟来封闭内源性过氧化物酶活性。随后将载玻片在PBS中清洗一次并在PBS-T(含有0.125％v/v吐温-20的PBS)中清洗一次，每次清洗3分钟。向各组织切片和/或阵列施加一抗(在抗体稀释液中1/160稀释)，并将载玻片在潮湿箱中室温孵育45分钟。随后将载玻片在PBS中清洗一次并在PBS-T中清洗一次，每次清洗3分钟。随后向组织施加EnVision+HRP偶联的聚合物并将载玻片在潮湿箱中室温孵育30分钟。随后将载玻片在PBS中清洗一次并在PBS-T中清洗一次，每次清洗3分钟。随后在潮湿箱中将组织在液态DAB+底物中室温孵育10分钟。随后将载玻片在PBS中清洗一次并在PBS-T中清洗一次，使用苏木精在潮湿箱中复染，室温下反应1分钟，并再次在PBS中清洗一次并在PBS-T中清洗一次，每次清洗3分钟。随后使用水基切削液(Aquatex)将盖玻片置于载玻片上。
2.2结果
免疫组化分析显示胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、皮肤癌、甲状腺癌和肺(非小细胞)癌以及多发性骨髓瘤和淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金类型)中肿瘤细胞的特异性染色。使用LY75抗体染色的霍奇金淋巴瘤亚型是：结节硬化性淋巴瘤、淋巴细胞优势型淋巴瘤、淋巴细胞消耗型淋巴瘤、混合细胞型淋巴瘤，和霍奇金淋巴瘤(未另加说明)。使用LY75抗体染色的非霍奇金淋巴瘤亚型是：弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤(未另加说明)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤(未另加说明)、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。因此，针对LY75的抗体可用作显示LY75表达的这些癌症和其他癌症类型的治疗剂和诊断剂。
实施例3：通过流式细胞分析测定针对LY75的单克隆抗体的特异性
通过在表达LY75的细胞系中进行流式细胞分析来测试针对LY75的单克隆抗体的特异性。
材料和方法
将抗LY75抗体与表达LY75的细胞孵育。将细胞在FACS缓冲液(DPBS，2％FBS)中清洗、离心并重悬于100μl稀释的LY75一抗(也稀释于FACS缓冲液中)。将该抗体-细胞复合物在冰上孵育60分钟，随后使用上文所述FACS缓冲液清洗两次。将抗体-细胞团块重悬于100μl稀释的LY75二抗(也稀释于FACS缓冲液中)并在冰上孵育60分钟。如前文所述清洗团块并将其重悬于200μl FACS缓冲液中。
将样品加载至BD FACScanto II流式细胞仪上并使用BD FACSdiva软件分析数据。
结果
流式细胞分析的结果显示抗LY75单克隆抗体有效地结合细胞表面人LY75。图1显示了抗LY75抗体在表达LY75的细胞上的结合特异性。该结果显示了针对LY75的那些抗体在表达LY75的细胞上的强力结合。
实施例4：表达LY75的细胞对抗LY75单克隆抗体的内化
已证明抗LY75单克隆抗体在结合表达LY75的细胞后被内化。MabZAP抗体结合一抗。随后，由细胞内化MabZAP复合物。皂草素(Saporin)进入细胞导致蛋白合成抑制和最终的细胞死亡。
如下所述进行MabZAP试验。以5x103个细胞/孔的密度接种各细胞。连续稀释抗LY75单克隆抗体或同种型对照人IgG，随后添加至细胞。随后以50μg/ml的浓度添加MabZAP并使平板孵育48和72小时。通过发光细胞活力试验试剂盒(普洛麦格公司，G7571)检测平板中的细胞活力并通过光度计(Luminomitor)(加利福尼亚州森尼韦尔的TB公司(Tuner BioSystems))在490nM处读取平板。通过Prism(Graphpad)分析数据。
细胞死亡与抗LY75单克隆抗体的浓度呈正比。结果显示，与抗人IgG同种型对照抗体相比，抗LY75抗体被以下细胞高效内化并与MabZAP复合物的浓度呈正比：Namalwa(图2a)、RAJI(图2b)、HCC1143(乳腺导管癌-ER阴性，PR阴性且Her阴性)(图2c)、HCC1806(乳腺棘层鳞状细胞癌-ER阴性，PR阴性且Her阴性)(图2d)、MDA-MB-468(图2e)、SW780(膀胱移行细胞癌)(图2f)、Kato III(胃腺癌)(图2g)、SCC-9(舌癌)(图2h)、AML-193(图2i)、THP-1(图2j)、RPMI 8226(多发性骨髓癌)(图2k)和OE-19(图2l)细胞。
序列

Claims (29)

1.一种治疗或预防非霍奇金淋巴瘤的方法，其中，LY75在所述淋巴瘤中表达，所述方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的结合LY75的亲和试剂。
2.一种治疗或预防癌症的方法，所述癌症选自淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌，其中，LY75在所述癌症中表达，所述方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的结合LY75的亲和试剂。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述亲和试剂特异性结合LY75。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述亲和试剂是抗体或其功能性片段或其抗原结合部分，或抗体模拟物。
5.如权利要求4所述的方法，所述亲和试剂是单克隆抗体。
6.如权利要求4或5所述的方法，所述亲和试剂是嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、单链抗体、去岩藻糖基抗体或双特异性抗体。
7.如权利要求4所述的方法，所述功能性抗体片段是单一抗体、域抗体或纳米抗体。
8.如权利要求4所述的方法，所述抗体模拟物是亲和体、DARP素、抗运载蛋白、高亲合性多聚体、反体或双运载蛋白。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述亲和试剂含有或偶联于治疗性部分。
10.如权利要求9所述的方法，所述治疗性部分是细胞毒性部分或放射性同位素。
11.如权利要求9或10所述的方法，所述亲和试剂是抗体药物偶联物。
12.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述亲和试剂引发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
13.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述亲和试剂引发补体依赖性细胞毒性(CDC)。
14.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述亲和试剂引发T细胞细胞毒性。
15.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述亲和试剂诱导癌细胞的凋亡、杀死或减少癌干细胞的数目和/或杀死或减少循环癌细胞的数目。
16.如权利要求1-8中任一项所述的方法，所述亲和试剂调节LY75的生理功能、抑制与LY75结合的配体和/或抑制LY75介导的信号转导途径。
17.一种检测、诊断和/或筛选或监测对象中癌症进展的方法，所述癌症选自淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌，其中，LY75在所述癌症中表达，或者监测对象中针对所述癌症的癌症药物或疗法作用的方法，所述方法包括检测所述对象中是否存在LY75或其一种或多种片段或其水平，或者是否存在编码LY75的核酸或其水平，或者所述方法包括检测所述对象中上述水平的变化。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法包括检测是否存在LY75或其一种或多种片段或其水平，或者是否存在编码LY75的核酸，其中(a)与健康对象中的水平相比，所述对象中LY75或所述其一种或多种片段水平的升高或者编码LY75的核酸水平的升高，或者(b)与健康对象中的相应的不可检测水平相比，所述对象中存在可检测水平的LY75或所述其一种或多种片段或者可检测水平的编码LY75的核酸表明所述对象中存在所述癌症。
19.一种检测、诊断和/或筛选或监测对象中癌症进展的方法，所述癌症选自淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌，其中，LY75在所述癌症中表达，或者监测对象中针对所述癌症的癌症药物或疗法作用的方法，所述方法包括检测是否存在能够免疫特异性结合LY75或其一种或多种片段的抗体或其水平。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，可通过分析获自所述对象的生物样品检测是否存在LY75或其一种或多种片段，或者是否存在编码LY75的核酸，或者是否存在能够免疫特异性结合LY75的抗体或其一种或多种片段或其水平。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中，使用结合LY75的亲和试剂检测是否存在LY75或其一种或多种片段。
22.如权利要求21所述的方法，所述亲和试剂如权利要求3-8中任一项所定义。
23.如权利要求21或22所述的方法，所述亲和试剂含有或偶联于可检测标签。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，所述对象是人。
25.一种鉴定用于治疗或预防癌症的试剂的方法，所述癌症选自淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈癌和皮肤癌，其中，LY75在所述癌症中表达，所述方法包括(a)使LY75或其一种或多种片段接触候选试剂；以及(b)测定所述试剂是否结合LY75或所述其一种或多种片段。
26.如权利要求25所述的方法，所述方法还包括测试结合LY75或其一种或多种片段的试剂抑制所述癌症的能力的步骤。
27.如权利要求25或26所述的方法，所述方法还包括测试结合LY75的试剂调节LY75的生理功能、抑制配体与LY75的结合和/或抑制LY75介导的信号转导途径的能力的步骤。
28.如权利要求2-27中任一项所述的方法，所述淋巴瘤选自弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴瘤(MALT)、富T细胞/组织细胞B细胞淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤。
29.如权利要求2-27中任一项所述的方法，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤或三重阴性乳腺癌。
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