KR102256552B1 - 암 치료 및 진단의 타겟으로서 ly75 - Google Patents

암 치료 및 진단의 타겟으로서 ly75 Download PDF

Info

Publication number
KR102256552B1
KR102256552B1 KR1020157011701A KR20157011701A KR102256552B1 KR 102256552 B1 KR102256552 B1 KR 102256552B1 KR 1020157011701 A KR1020157011701 A KR 1020157011701A KR 20157011701 A KR20157011701 A KR 20157011701A KR 102256552 B1 KR102256552 B1 KR 102256552B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
antibody
lymphoma
present
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020157011701A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150082278A (ko
Inventor
제임스 에드워드 애크로이드
Original Assignee
옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47429281&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR102256552(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드 filed Critical 옥스포드 바이오테라퓨틱스 리미티드
Publication of KR20150082278A publication Critical patent/KR20150082278A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102256552B1 publication Critical patent/KR102256552B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

본 발명은, 암, 예로 림프종, 골수종, 백혈병, 갑상선암, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 두경부암 및 피부암을 치료, 스크리닝, 진단 및 예후 예측하고, 암, 예로 림프종, 골수종, 백혈병, 갑상선암, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 두경부암 및 피부암의 치료 효능을 모니터링하고, 약물을 개발하기 위한, 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

암 치료 및 진단의 타겟으로서 LY75 {LY75 AS CANCER THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC TARGET}
본 발명은 암을 치료하기 위한 치료학적 타겟으로서 또는 암의 마커로서 유용성을 가진, 림프종, 골수종, 백혈병, 갑상선암, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 두경부암 및 피부암과 관련된 막 단백질의 동정에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 상기 단백질은 치료 항체 또는 그외 약제학적 제제 등의 친화성 반응물을 만들어낼 수 있는 생물학적 타겟을 의미한다. 또한, 본 발명은 암의 치료 및/또는 진단에 있어서의 상기한 친화성 반응물의 용도에 관한 것이다.
림프종, 골수종, 백혈병, 갑상선암, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 두경부암 및 피부암 등의 암을 치료하는데 있어 주된 시도는 초기 검출율을 향상시키고, 질환 진행을 추적하여 재발을 동정하는데 사용할 수 있는 새로운 비-침습성 마커를 탐색하며, 개선된 저독성의 치료제, 특히 5년 생존율이 여전히 좋지 않은 더욱 진행된 질환에 대한 치료제를 찾는 것이다. 면역치료제 및 타겟 독소와 같은 새로운 방식을 제공함으로써 암 세포에 보다 특이적인 타겟, 예컨대 공격할 수 있도록 종양 세포의 표면에 발현되는 타겟을 동정하는 것이 상당히 요구되고 있다.
림프구 항원 75는 세포외 공간으로부터 특수 항원-가공 구획으로 직접 항원을 포획하는 세포내흡입 (세포내흡입) 수용체로서 작용하며, B 림프구의 증식 저하를 유발하는 것으로 여겨진다. 전술한 암 세포 상에 림프구 항원 75의 제시는, 예를 들어 항체-기반의 암 치료법의 세포-표면 타겟으로서 유용하다는 입증이 요구되지만, 아직까지 개시된 바 없다.
본 발명은, 다양한 질환, 이하 "본 발명의 질환"으로 지칭되는 예컨대 림프종, 골수종, 백혈병, 갑상선암, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 두경부암 및 피부암 조직의 막 추출물에서, 이하 LY75로 지칭되는 림프구 항원 75를 검출하는 것을 기술한다.
다양한 암들에서 LY75의 차별적인 발현은 이들 암에 대해 친화성 반응물-, 예를 들어 항체-기반의 치료법을 이용하여 이 단백질을 타겟화할 수 있게 해준다. 즉, LY75는, LY75의 에피토프에 특이적으로 결합하는, 항체 등의 친화성 반응물을 생성시키는데 이용할 수 있으며, 치료의 원리로서 상기한 친화성 반응물로 타겟팅할 수 있다. 암 세포의 세포 표면에 존재하는 단백질을 타겟팅하는 항체 등의 친화성 반응물은, (i) 이러한 친화성 반응물에 접합된 약물 또는 독소(들)에 의한 세포용혈, 또는 (ii) 예를 들어 신호전달 경로를 통해 암 세포의 증식을 추진할 수 있는, 상기한 단백질의 생리 기능을 저해하는 등의, 다양한 기전을 통해 암 치료에 활용할 수 있다. 이러한 친화성 물질-기반의 치료에서 중요한 측면은, 단백질 타겟의 조직 분포 및 발현 수준 측면에서 정상적인 발현 프로파일이, 정상 조직 상의 단백질 타겟을 항체로 타겟팅하였을 때 정상 조직과 결합하여 유해한 부작용을 일으키지 않도록 하는 프로파일이라는 점이다.
본 발명은 LY75에 결합하는 친화성 반응물을 치료학적 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, LY75가 발현되는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
암은 바람직하게는 본 발명의 질환들 중 하나이다.
또한, 본 발명은, 바람직하게는 암이 본 발명의 질환들 중 하나인, 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 LY75에 결합하는 친화성 반응물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 암이 본 발명의 질환들 중 하나인, 암의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서의 LY75에 결합하는 친화성 반응물의 용도를 제공한다.
본 발명에 사용되는 친화성 반응물은 바람직하게는 LY75에 특이적으로 결합한다.
친화성 반응물은 항체일 수 있으며, 예를 들어 항체 전체 또는 이의 기능성 단편 또는 항체 모방체일 수 있다. 바람직한 친화성 반응물에는 항체, 예를 들어 단일클론 항체가 포함된다.
친화성 반응물은 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 탈푸코시화된 항체 (defucosylated antibody) 또는 2 특이성 항체일 수 있다.
항체의 기능성 단편은 유니바디 (UniBody), 도메인 항체 또는 나노바디 (Nanobody)를 포함한다.
항체 모방체는 어피바디(Affibody), DARPin, 안티칼린 (Anticalin), 아비머 (Avimer), 버사바디 (Versabody) 또는 두오칼린 (Duocalin)을 포함한다.
본 발명에 사용되는 친화성 반응물은, 세포독성 모이어티 또는 방사성 동위원소와 같은 치료학적 모이어티를 포함하거나 또는 이것이 접합될 수 있다. 친화성 반응물은 항체 약물 접합체 또는 면역접합체일 수 있다.
친화성 반응물은 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 일으키거나 또는 보체 의존적인 세포독성 (CDC)를 일으킬 수 있다. 친화성 반응물은 암 세포의 자살을 유도하거나, 암 줄기 세포를 사멸시키거나 수를 감소시키거나, 및/또는 순환성 암 세포를 사멸시키거나 그 수를 감소시킬 수 있다. 친화성 반응물은 LY75의 생리 기능을 조절하거나, LY75에 대한 리간드 결합을 저해하거나 및/또는 LY75에 의해 매개되는 신호 전달 경로를 저해할 수 있다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 또한 LY75를 코딩하는 핵산에 혼성할 수 있는 혼성화 물질 (hybridizing agent)을 치료학적 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, LY75를 발현하는 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암, 바람직하게는 본 발명의 질환들 중 하나인 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, LY75를 코딩하는 핵산에 혼성할 수 있는 혼성화 물질을 제공한다.
또한, 본 발명은 암, 바람직하게는 본 발명의 질환들 중 하나인 암의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서의, LY75를 코딩하는 핵산에 혼성할 수 있는 혼성화 물질의 용도를 제공한다.
본 발명에 사용되는 혼성화 물질은 바람직하게는 LY75의 하나 이상의 세포외 도메인을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 사용하기 적합한 혼성화 물질로는 저해성 RNA, 짧은 간섭형 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 마이크로RNA (miRNA), 안티센스 핵산, 상보적인 DNA (cDNA), 올리고뉴클레오티드 및 리보자임을 포함한다.
또한, 본 발명은, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재 또는 수준, 또는 LY75 코딩 핵산의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하거나, 또는 개체에서 이들의 수준 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서, LY75가 발현되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 LY75가 발현되는 암에서 약물 또는 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.
상기한 방법은, (a) 건강한 개체에서의 수준과 비교하여, 개체에서 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 수준 증가 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 수준 증가의 존재, (b) 건강한 개체에서 검출불가한 수준과 비교하여, 개체에서 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 검출가능한 수준의 존재 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 검출가능한 수준의 존재가, 상기 개체에서 LY75가 발현되는 암임을 나타내는 것인, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재 또는 그 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서, LY75가 발현되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하거나 또는 진행을 모니터링하는 방법, 또는 LY75가 발현되는 암의 약물 또는 치료법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법들에서, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재, 또는 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재 또는 수준은, 개체로부터 수득한 생물 샘플을 분석함으로써 검출할 수 있다.
LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재는 LY75에 결합하는 친화성 반응물을 이용하여 검출할 수 있다. 친화성 반응물은 본원에 언급된 모든 적합한 친화성 반응물일 수 있다. 친화성 반응물은 검출가능한 표지물질을 포함하거나 이와 접합될 수 있다.
본원에 언급되는 본 발명의 모든 측면들에서, 개체는 인간일 수 있다.
또한, 본 발명은, (a) LY75 또는 이의 하나 이상의 단편을 후보 물질과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 물질이 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편에 결합하는지를 확인하는 단계를 포함하는, 개체에서 LY75가 발현되는 암을 치료 또는 예방하는 물질의 동정 방법을 제공한다. 이 방법은, 또한, 상기 암에서 LY75가 발현되는 암을 저해하기 위해 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편에 결합하는 물질의 능력을 검사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 물질은, 특히 LY75의 활성을 조절하거나, LY75에 대한 리간드 결합을 낮추거나 또는 LY75의 이량체화를 낮출 수 있다.
본원에 기술된 본 발명에 대한 다양한 구현예들에서, 언급될 수 있는 구체적인 암 타입은 본 발명의 질환들 중 하나이다.
일 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, B 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 소포 림프종, 멘틀 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 (MALT)의 림프종, T 세포/조직구-풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프구형질세포성 림프종, 소형 림프성 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종 및/또는 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 바람직하게는 비-호지킨 림프종이다. 본 발명의 일부 구현예들에서, 림프종은 호지킨 림프종이 아니다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 갑상선암이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 방광암이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 유방암, 바람직하게는 3중 음성 (Triple Negative) 유방암이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 위암이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 식도암이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 두경부암이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 피부암, 예컨대 흑색종이다.
다른 구현예에서 검출, 예방 또는 치료할 암은 다발성 골수종이다.
본 발명의 다른 측면들은 본원의 청구항과 아래에 기술된다.
도 1은 LY75 발현 세포에 대한 항체의 특이적인 결합성을 나타내는, 항-LY75 단일클론 항체의 유세포 측정 분석을 도시한 것이다.
도 2a는 MabZAP 분석을 이용하여 NAMALWA 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2b는 MabZAP 분석을 이용하여 RAJI 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2c는 MabZAP 분석을 이용하여 HCC1143 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2d는 MabZAP 분석을 이용하여 HCC1806 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2e는 MabZAP 분석을 이용하여 MDA-MB-468 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2f는 MabZAP 분석을 이용하여 SW780 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2g는 MabZAP 분석을 이용하여 Kato III 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2h는 MabZAP 분석을 이용하여 SCC-9 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2i는 MabZAP 분석을 이용하여 AML-193 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2j는 MabZAP 분석을 이용하여 THP-1 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2k는 MabZAP 분석을 이용하여 RPMI 8226 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
도 2l은 MabZAP 분석을 이용하여 OE-19 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화를 도시한 것이다.
아래에 상세하게 기술된 본 발명은 암을, 예를 들어 본 발명의 질환을 치료 또는 예방하기 위해 개체, 예컨대 포유류 개체에게 치료 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은, 포유류 개체에서 암, 예컨대 본 발명의 질환의 임상적인 스크리닝, 진단 및 예후 예측을 위한, 특정 치료학적 처치에 반응할 가능성이 높은 환자를 동정하기 위한, 암, 예컨대 본 발명의 질환에 대한 치료 결과를 모니터링하기 위한, 약물 스크리닝 및 약물 개발을 위한, 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 특정 암에서 LY75 단백질이 발현된다는 사실을 토대로 한다. 특히, 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 갑상선암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 세포성 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소 세포성 폐암 및 림프종의 세포막에서 LY75 단백질의 발현을 보여주는 입증 데이타가 본원에 기술된다. 또한, 면역-조직화학적 분석을 통해 췌장암, 난소암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 피부암, 갑상선암 및 폐암 뿐 아니라 다발성 골수종과 림프종, 호지킨 타입 및 비-호지킨 타입의 림프종에서 종양 세포의 특이적인 염색을 보여준다. 따라서, LY75에 대한 항체는 이들 암과 LY75를 발현하는 그외 타입의 암에서 치료제 및 진단제로서의 유용성을 가질 수 있다.
본원에서, 용어 "개체"는, 동물, 바람직하게는 포유류를 지칭한다. 포유류 개체는 인간을 제외한 포유류일 수 있지만, 일반적으로는 성인과 같은 인간이다.
개체는 일반적으로 살아있는 개체일 것이다. 하지만, 본 발명의 이용, 방법 및 조성물이 살아있는 개체를 스크리닝, 진단 및 예후 예측하는데 특히 적합하다 하더라도, 예를 들어 동일 질환의 발병 위험성을 가진 패밀리 구성원을 동정하기 위해 개체에서 부검 진단하는데에도 사용할 수 있다.
본원에서, 용어 "환자"는 본 발명의 질환들 중 하나 이상을 가지고 있거나 가진 것으로 의심되는 개체를 지칭한다.
본원에서, 용어 "본 발명의 단백질"은 LY75로 본원에 지칭되는 림프구 항원 75 (GeneID: 4065)를 의미한다. 이 단백질은 다양한 암들에서 차별적으로 발현되는 것으로 발견된 바, 이들 암에 대한 친화성-기반의 치료에 새로운 타겟이 된다. LY75 단백질의 인간 서열은 서열번호 1에 제시된다. 용어 LY75 (단백질)는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하는 아미노산 서열을 가진 단백질, 또는 이의 유도체 또는 변형체, 특히, 이의 천연 인간 유도체 또는 이의 변형체를 망라한다.
이 단백질은 실시예 1에 기술된 방법 및 장치를 통해 (예, 막 단백질 추출물에 대한 액체 크로마토그래피-질랑 분광측정에 의해) 암 환자의 암 조직 샘플의 막 단백질 추출물에서 동정되었다. 펩타이드 서열은 SWISS PROT 및 TrEMBL 데이타베이스 (Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) 및 the European Bioinformatics Institute (EBI), www.expasy.org)에서 비교하였으며, entry O60449, 림프구 항원 75 - LY75를 동정하였다. 이 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 등재 번호 NM_002349로 확인되었으며, 서열번호 2로 제시한다.
SWISS-PROT에 따르면, 림프구 항원 75는 비장, 흉선, 결장 및 말초혈 림프구에서 발현된다. 이것은 골수 및 B 림프구성 세포주들에서 검출된다. 이소형인 OGTA076b와 OGTA076c는 호지킨 및 리드-스텐버그 (HRS) 세포로 지칭되는 악성 호지킨 림프종 세포에서 발현된다. LY75는 세포내흡입 수용체로 작용하여, 세포외 공간으로부터 특수 항원-가공 구획으로 포획한 항원을 이동시킨다. 이는 B 림프구의 증식 저하를 유발한다. 본 발명자는 LY75가 호지킨 림프종과 비-호지킨 림프종 둘다에서 발현된다는 것으로 확인하였는데, 이는 이들 암과 그외 타입의 암을 가진 환자 등의 환자에서 LY75에 대한 친화성-기반의 치료가 치료학적 효능을 가질 것이라는 것을 시사해준다.
면역조직화학적 실험 (실시예 2)은, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 피부암, 갑상선암 및 폐암 (비-소 세포) 뿐만 아니라 다발성 골수종과 미만성 거대 B 세포 림프종, B 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 소포 림프종, 멘틀 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 (MALT)의 림프종, T 세포/조직구-풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프구형질세포성 림프종, 소형 림프성 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 등의 림프종에서 종양 세포가 특이적으로 염색됨을 입증해주었다. 이들 암은 본 발명의 바람직한 질환이다.
LY75는 단백질의 단편으로, 특히 에피토프 함유 단편, 예컨대 이의 항원성 또는 면역원성 단편 및 이의 유도체, 특히 세포외 도메인 (예, 세포외 테일 또는 루프)을 포함하는 단편으로 이용가능하다. 항원성 단편 또는 면역원성 단편 등의 에피토프 함유 단편은, 전형적으로 아미노산 12개 이상의 길이, 예컨대 아미노산 20개 이상의 길이, 예컨대 아미노산 50 또는 100개 이상의 길이일 것이다. 단편은 전장 단백질 길이의 95% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대, 전단 단백질 길이의 75% 또는 50% 또는 25% 또는 10% 또는 그 이상일 수 있다.
다른 예로, 본원에 채택 또는 언급되는 단백질/폴리펩타이드는 본 명세서에 구체적으로 인용/기술된 단백질/폴리펩타이드, 또는 이와 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 아미노산 서열 동일성/유사성을 가진 변형체 또는 유도체로 한정될 것이다. 아미노산 서열 동일성/유사성 %는 임의의 적정 알고리즘, 예를 들어 BLAST, CLUSTAL에서 적절한 디폴트 파라미터를 사용하여 결정할 수 있다.
그래서, 용어 "LY75"는 단백질 또는 폴리펩타이드 측면에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 아미노산 서열을 가진 단백질, 또는 서열번호 1과 적어도 95% 또는 95%의 서열 동일성을 가지며 기본적으로 LY75와 동일한 조직 분포를 가지는, 상기 단백질의 유도체 또는 변형체를 지칭한다.
핵산 측면에서는, 용어 "LY75"는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산, 또는 서열번호 1과 적어도 90% 또는 95% 서열 동일성을 가지며 기본적으로 LY75 단백질과 동일한 조직 분포를 가지는 상기 핵산의 유도체 또는 변형체를 의미한다.
용어 "LY75"는 핵산 측면에서 또한 서열번호 2에 제시된 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산, 또는 서열번호 2와 적어도 90% 또는 95% 서열 동일성을 가지며 기본적으로 LY75 단백질과 동일한 조직 분포를 가지는 상기 핵산의 유도체 또는 변형체를 의미한다.
항원성 단편 또는 면역원성 단편을 비롯한 LY75의 에피토프-함유 단편은 환자에서 적절한 면역 반응을 발생시킬 수 있을 것이다. 또한, LY75를 코딩하는 DNA는 이의 단편으로서, 예를 들어 면역원성 단편과 같은 LY75의 단편을 코딩하는 DNA로서 사용가능하다. LY75를 코딩하는 핵산 (예, DNA) 단편은 전장 코딩 영역 길이의 95% 이상일 수 있으며, 예를 들어, 전체 코딩 영역 길이의 예컨대 90% 이상, 예컨대 75% 또는 50% 또는 25% 또는 10% 또는 그 이상일 수 있다. 핵산 (예, DNA)의 단편은 뉴클레오티드 36개 이상의 길이, 예컨대 뉴클레오티드 60개 이상, 예컨대 뉴클레오티드 150 또는 300개 이상의 길이일 수 있다.
LY75의 유도체는, 결손, 삽입 또는 치환 중 하나 이상 (예, 아미노산 1-20개, 예로, 15개, 또는 단백질 전장에 해당되는 아미노산 수에 대한 최대 20%, 예로 최대 10% 또는 5% 또는 1%)이 이행된 서열 변형체를 포함한다. 치환은 전형적으로 보존적인 치환일 수 있다. 유도체는 전형적으로 이것이 유래된 단백질과 동일한 생물학적 기능을 기본적으로 가질 것이다. 유도체는 전형적으로 이것이 유래된 단백질과 비슷한 수준으로 항원성 또는 면역원성을 나타낼 것이다. 유도체는 전형적으로 이것이 유래된 단백질의 리간드-결합 활성 또는 활성 수용체-복합체 형성력 중 어느 하나 또는 바람직하게는 둘다를 가질 것이다. 유도체 및 변형체는 LY75와 동일한 조직 분포를 일반적으로 가질 것이다.
또한, 단백질의 유도체는 카르복시메틸화된 단백질, 카르복시아미드화된 단백질, 아세틸화된 단백질과 같이 화학적으로 처리된 단백질, 예를 들어 정제하는 동안 처리된 단백질을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 LY75 또는 LY75를 포함하는 조성물을 제공한다. 단백질은 분리되거나 정제된 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 LY75를 코딩하는 핵산 및 LY75를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, LY75 폴리펩타이드 및/또는 이의 하나 이상의 항원성 또는 면역원성 단편, 및 한가지 이상의 적정 담체, 부형제, 희석제 또는 보강제 (적절한 보강제는 아래에 기술됨)를 포함하는, 개체에서 면역 반응을 도출할 수 있는 조성물을 제공한다.
면역 반응을 도출할 수 있는 조성물은, 예를 들어, LY75 폴리펩타이드 또는 이의 유도체나 변형체, 및/또는 이의 하나 이상의 항원성 또는 면역원성 단편을, 선택적으로 하나 이상의 적절한 담체, 부형제, 희석제 또는 보강제와 함께 포함하는 백신으로서 제공될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 본 발명의 질환들 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위한, LY75 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 이의 단편, 유도체 또는 변형체를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 본 발명의 질환들 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위한 LY75 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 이의 단편, 유도체 또는 변형체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 본 발명의 질환들 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어, LY75 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 이의 단편, 유도체 또는 변형체의 용도를 제공한다.
일 측면에서, 예를 들어, 본 발명의 질환들 중 하나 이상을 치료 또는 예방하기 위해 LY75 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 이의 단편, 유도체 또는 변형체를 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은, LY75 폴리펩타이드 및/또는 하나 이상의 이의 항원성 단편, 면역원성 단편, 유도체 또는 변형체를, 예컨대 백신으로서 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 예를 들어 본 발명의 질환을 예방 또는 치료하는 방법, 또는 예를 들어 본 발명의 질환들 중 하나 이상에 대해 개체를 백신접종하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 예를 들어 본 발명의 질환의 발병 또는 발생을 예방하기 위해; (b) 예를 들어 본 발명의 질환의 진행을 방지하기 위해; 또는 (c) 예를 들어 본 발명의 질환의 증상을 완화하기 위해, 예를 들어 본 발명의 질환을 가진 환자에서, LY75의 발현 또는 생물 활성 (또는 둘다)을 조절 (예, 상향 조절 또는 하향 조절)하거나 또는 보완하는 화합물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어 본 발명의 질환의 치료 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 암 치료에, 바람직하게는 본 발명의 질환들 중 하나를 치료하는데 있어 동시, 순차적 또는 분할 투여하기 위한, 아래 성분을 별도로 또는 함께 포함하는 약제를 제공한다:
(a) LY75, 및
(b) 항암제.
LY75는 예를 들어 본 발명의 질환을 검출, 예후 예측, 진단 또는 모니터링하거나 또는 약물을 개발하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재 또는 수준, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 수준, 또는 LY75 활성의 존재 또는 수준을 검출하는 단계를 포함하거나, 또는 개체에서 상기한 수준의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 예를 들어 본 발명의 질환을 검출, 예후 예측, 진단 및/또는 스크리닝하거나 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 본 발명의 질환에 대한 항암제 또는 치료의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은, (a) 건강한 개체에서의 수준과 비교하여, 후보 개체에서의, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 수준 증가의 존재 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 수준 증가의 존재, 또는 LY75 활성의 수준 증가의 존재, 또는 (b) 건강한 개체에서 대응되는 검출불가한 수준과 비교하여, 후보 개체에서의, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 검출가능한 수준의 존재, LY75를 코딩하는 핵산의 검출가능한 수준의 존재, 또는는 LY75 활성의 검출가능한 수준의 존재가, 개체에서 예를 들어 본 발명의 질환이 존재함을 의미하는 것인, 후보 개체에서 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 LY75 활성의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 후보 개체에서 예를 들어 본 발명의 질환을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 본 발명의 질환의 진행 또는 퇴행을 의미하거나 또는 개체에서 본 발명의 질환에 대한 예를 들어 항암제 또는 치료의 유효성 또는 무용성 (non-effect)을 의미하는, 1차 시간대와 나중 시간대에 후보 개체에서 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재, 또는 LY75 활성의 존재, 또는 1차 시간대에서 개체의 수준의 수준과 비교하여 나중 시간대의 개체에서의 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 수준 증가 또는 감소의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 수준 증가 또는 감소의 존재, 또는 LY75 활성의 수준 증가 또는 감소의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 본 발명의 질환에 대한, 예컨대 항암제 또는 치료의 효능을 모니터링하거나 또는 개체에서 예를 들어 본 발명의 질환의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다.
LY75의 경우, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체의 조직 분석시 수득되는 검출 수준에 비해, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 개체의 조직 샘플의 분석시 수득되는 검출 수준은, 사용되는 특정 분석 프로토콜 및 검출 기법으로 결정될 것이다. 즉, 본 발명은, 각 실험실에서는, 진단 분야에서 통상적인 바와 같이, 사용되는 분석 프로토콜 및 검출 기법에 따라, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체에서 기준 범위를 확립할 것으로 본다. 바람직하게는, 예를 들어 본 발명의 질환을 걸린 것으로 공지된 개체로부터 수득한 하나 이상의 대조군 양성 조직 샘플, 또는 예를 들어 본 발명의 질환이 없는 것으로 공지된 개체로부터 수득한 하나 이상의 대조군 음성 조직 샘플 (및 바람직하는 양성 대조군 샘플 및 음성 대조군 샘플)이 분석할 테스트 샘플의 각 배치에 포함된다.
본 발명의 일 측면에서, 예를 들어 본 발명의 질환의 스크리닝 또는 진단을 위해 LY75의 발현을 측정하거나, 환자에서 본 발명의 질환의 예후를 확인하거나, 치료법에 대한 본 발명의 질환의 효능을 모니터링하거나, 또는 약물을 개발하기 위해, 액체 크로마토그래피-질량 분광측정 분석 또는 그외 적정 방법을 이용하여, 개체에서, 바람직하게는 살아있는 개체에서 수득한 조직 샘플에서 본 발명의 질환을 분석한다.
전술한 방법들 중 임의의 방법에서, 암, 예컨대 본 발명의 질환을 가진 후보 개체에서 검출될 수 있는 수준은, 바람직하게는 건강한 개체에서의 수준 보다 2배 이상 높다.
본 발명의 일 구현예에서, 개체 (예, 본 발명의 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체) 유래 조직은 LY75를 검출하기 위해 액체 크로마토그래피-질량 분광측정에 의해 분석한다. 개체 또는 본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체 (예, 대조군 샘플) 유래 조직 또는 기존에 결정된 기준 범위에 비해, 개체 유래 조직내 LT75의 수준의 증가는, 본 발명의 질환이 존재한다는 것을 의미한다.
단편, LY75의 에피토프 함유 단편, 면역원성 단편 또는 항원성 단편과 관련하여: 관련 암 용도의 경우, 본 발명은, 일 측면에서, 실시예 1에서 트립신 서열로서 동정된 서열을 포함한다.
본원에서, LY75는, 오염 단백질이 실질적으로 없는 조제물, 즉 존재하는 총 단백질의 10% 미만 (예, 5% 미만, 예를 들어 1% 미만)이 오염 단백질(들)인 조제물로 존재한다면, "분리된" 것이다. 오염 단백질은 질량 분광측정 분석에 의해 결정되는 바와 같이 분리된 LY75의 서열과 현저하게 다른 아미노산 서열을 가진 단백질이다. 본원에서, "현저하게 다른" 서열은 실시예 1에서 본원에 기술된 프로토콜에 따라 수행된 질량 분광측정 분석에 의해 오염 단백질을 LY75로부터 해리시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 진단 및 예후 예측 방법에서, LY75는, 비제한적인 예로, 본원에 기술된 바람직한 기법, 키나제 분석, 효소 분석, 결합 분석 및 그외 기능성 분석, 면역분석 및 웨스턴 블롯팅 등의, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의 방법에 의해 분석할 수 있다.
다른 예로, LY75는 면역분석으로 검출할 수 있다. 일 구현예에서, 면역분석은, LY75가 존재한다면 결합 (예, 면역특이적인 결합)이 이루어질 수 있는 조건 하에 테스트할 개체의 샘플을 항-LY75 항체 (또는 그외 친화성 반응물)와 접촉시킨 다음, 제제에 의해 임의의 결합 (예, 면역특이 결합)의 양을 측정함으로써, 수행한다. LY75 결합제는 본원에 교시된 방법 및 기법으로 제조할 수 있다. 특정 구현예에서, LY75는 면역조직화학법으로 분석한다.
LY75는 이의 단편, 예컨대 에피토프 함유 (예, 면역원성 또는 항원성) 단편을 검출을 통해 검출할 수 있다. 단편은 적어도 10개, 보다 전형적으로는 적어도 20개의 아미노산, 예컨대 적어도 50 또는 100개의 아미노산, 예컨대 적어도 150 또는 200개의 아미노산; 예컨대 적어도 300 또는 500개의 아미노산; 예컨대 적어도 700 또는 900개의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
일 구현예에서, 조직 섹션에서의 친화성 반응물 (예, 항체)의 결합을 이용하여, 비정상적인 LY75 위치화 또는 LY75의 비정상적인 수준을 검출할 수 있다. 특정 구현예에서, LY75에 대한 항체 (또는 기타 친화성 반응물)를 사용하여, LY75의 비정상적인 수준이 본 발명의 질환을 의미하는 LY75의 수준에 대해 환자 조직 (예, 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직)을 분석할 수 있다. 본원에서, "비정상적인 수준"은 본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체에서의 수준 또는 기준 수준과 비교해 증가된 수준을 의미한다.
임의의 적합한 면역분석, 비제한적인 예로, 웨스턴 블롯, 방사성면역분석, ELISA (효소 연계된 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 프레시피틴 반응, 겔 확산 프레시피틴 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역방사측정 분석, 형광 면역분석 및 단백질 A 분석과 같은 기법을 이용한, 경쟁적인 및 비-경쟁적인 분석 시스템 등이 사용될 수 있다.
예를 들어, LY75는 2단계 샌드위치 분석을 이용하여 유체 샘플 (예, 혈액, 뇨 또는 타액)에서 검출할 수 있다. 제1 단계에서, 포획 반응물 (예, 항-LY75 항체 또는 그외 친화성 반응물)을 이용하여 LY75를 포획한다. 포획 시약은 선택적으로 고상에 고정될 수 있다. 제2 단계에서, 직접 또는 간접 표지된 검출 시약을 사용하여 포획된 LY75를 검출한다. 일 구현예에서, 검출 시약은 렉틴이다. LY75와 동일한 코어 단백질을 가진 다른 이소형 또는 항체에 의해 인지되는 항원 결정부를 공유하는 다른 단백질에 비해 선호적으로 LY75에 결합하기 위해, 임의의 렉틴을 사용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 선택된 렉틴은 LY75와 동일한 코어 단백질을 가지는 상기한 다른 이소형 또는 친화성 반응물에 의해 인지되는 항원 결정부를 공유한 상기 다른 단백질과 비교해, 2배 이상 높은 친화성, 더 바람직하게는 5배 이상의 높은 친화성, 더 바람직하게는 10배 이상의 높은 친화성으로 LY75에 결합한다. 본 발명의 내용을 토대로, LY75를 검출하는데 적합한 렉틴은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로, 예를 들어 Sumar et al., Lectins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, In: Gabius H-J & Gabius S (eds.), 1993, Lectins and Glycobiology, at pp. 158-174 (이는 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)의 158-159 페이지의 표 1에 열거된 하나 이상의 렉틴 검사로 쉽게 동정할 수 있다. 다른 구현예에서, 검출 시약은 항체 (또는 그외 친화성 반응물), 예컨대 인산화된 아미노산에 면역특이적으로 결합하는 항체 등의 그외 번역 후 수정을 특이적으로 (예, 면역특이적으로) 검출하는 항체이다. 이러한 항체의 예로는, 포스포티로신에 결합한 것 (BD Transduction Laboratories, catalog nos.: P11230-050/P11230-150; P11120; P38820; P39020), 포스포세린에 결합한 것 (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, catalog no. 61-8100) 및 포스포트레오닌에 결합한 것 (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, catalogue nos. 71-8200, 13-9200)을 포함한다.
적절한 경우, LY75를 코딩하는 유전자, 관련 유전자 또는 관력 핵산 서열 또는 서브서열, 예컨대 상보적인 서열도 혼성화 분석에 사용할 수 있다. LY75를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 가장 바람직하게는 15개 이상을 포함하는 이의 서브서열을 혼성 프로브로서 사용할 수 있다. 혼성 분석은, LY75를 코딩하는 유전자의 비정상적인 발현과 관련된, 병태, 장애 또는 질환 상태를 검출, 예후 예측, 진단 또는 모니터링하거나, 또는 예를 들어 본 발명의 질환의 신호 또는 증상을 드러내는 개체의 차별적인 진단에 사용할 수 있다. 특히, 이러한 혼성화 분석은, 핵산을 함유한 개체의 샘플을 LY75를 코딩하는 DNA 또는 RNA에 혼성할 수 있는 핵산 프로브와, 혼성화가 이루어질 수 있는 조건 하에 접촉시키는 단계 및 모든 수득되는 혼성화 결과를 검출 또는 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행할 수 있다.
그래서, LY75를 코딩하는 핵산 (예, DNA 또는 보다 적합하게는 RNA)은, 예를 들어 LY75를 코딩하는 핵산에 혼성할 수 있는 혼성 물질 (특히 올리고뉴클레오티드 프로프)를 이용하여 검출할 수 있다.
이러한 예시적인 한가지 방법은, LY75를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 연속되는 뉴클레오티드 10개 이상을 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브를, 개체 유래 생물 샘플에서 수득한 RNA 또는 상기 RNA의 cDNA 카피와 접촉시키는 단계로서, 접촉은 존재하는 경우 뉴클레오티드 서열에 프로브가 혼성화할 수 있는 조건 하에 이루어지는 것인 단계;
있다면 프로브와 뉴클레오티드 서열 간의 혼성화를 검출하는 단계; 및
있다면 단계 (b)에서 검출된 혼성화를, 대조군 샘플에서 검출된 혼성화 또는 기존에 결정된 기준 범위와 비교하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 항-LY75 항체 (또는 그외 친화성 반응물)를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 아울러, 이러한 키트는 선택적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 진단, 예후 예측, 치료학적 모니터링 또는 이들 용도의 조합을 이행하기 위한 항-LY75 친화성 반응물의 사용 설명서;
(2) 친화성 반응물에 대한 표지된 결합 파트너 (labelled binding partner);
(3) 항-LY75 친화성 반응물이 고정된 고상 (예, 반응물 스트립 (reagent strip); 및
(4) 진단, 예후 예측 또는 치료학적 이용 또는 이들의 임의 조합에 대한 규제 승인을 나타내는 표시 (label) 또는 인서트 (insert). 친화성 반응물에 대한 표지된 결합 파트너가 제공되지 않는다면, 항-LY75 친화성 반응물은 그 자체로 검출 마커, 예컨대 화학방광성, 효소적, 형광 또는 방사성 모이어티로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명은, LY75를 코딩하는 핵산, 적절하게는 RNA에 혼성할 수 있는 핵산 프로브를 포함하는 핵산을 포함하는 키트를 제공한다. 구체적인 구현예에서, 키트는, 하나 이상의 용기내, 적절한 반응 조건 하에, 중합효소 연쇄 반응 (예, Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), 리가제 연쇄 반응 (EP　320,308), Qβ 레플리카게 이용, 사이클릭 프로브 반응 또는 그외 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해서와 같이, LY75를 코딩하는 핵산의 적어도 일부의 증폭을 촉매할 수 있는, 한쌍의 프라이머 (예, 각각 뉴클레오티드 6-30개, 바람직하게는 10-30개, 더 바람직하게는 10-20개의 크기 범위임)를 포함한다.
키트는 선택적으로 예를 들어 표준물질 또는 대조군으로서 사용하기 위해 LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산을 미리 정해진 양으로 더 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "샘플"은 본 발명의 하나 이상의 질환의 발병 위험성이 있는 개체에서 수득한, 체액 (예, 혈액, 뇨 또는 타액) 및 조직 생검 (예, 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 생검 등의 생검) 또는 이의 호모게네이트 (homogenate)를 포함한다.
예를 들어, 사용되는 생물 샘플은 혈청 샘플 또는 조직 샘플, 예컨대 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직과 같은 임의 소스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 질환의 전이 증거를 찾을 경우, 본 발명의 질환의 주 부위들에서, 예컨대 림프종의 경우 림프절, 비장, 간, 위, 뼈, 뇌, 폐, 고환 및 피부; 갑상선암의 경우 폐와 뼈; 방광암의 경우 뼈, 폐, 피부 및 간; 유방암의 경우 뼈, 간 및 폐; 식도암의 경우 간, 폐 및 뼈; 위암의 경우 간, 폐, 뇌, 뼈, 신장 및 췌장; 두경부암의 경우 폐, 뼈, 간 및 피부; 또는 피부암의 경우 폐, 뇌 및 뼈에서 전이를 찾아보게 될 것이다.
다른 예로, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 LY75 활성의 존재는 인 시추 분석하여 검출할 수 있다.
특정 구현예들에서, 본원에 기술된 진단 방법은 적어도 일부가 또는 전체가 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
적합하게는, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 LY75 활성의 존재는 정량적으로 검출한다.
예를 들어, 정량적인 검출은 하기를 포함할 수 있다:
생물 샘플을, LY75에 특이적인 친화성 반응물과 접촉시키는 단계로서, 상기 친화성 반응물은 선택적으로 검출가능한 표지물질과 접합되어 있는 것인 단계; 및
친화성 반응물과 샘플내 하나 이상의 종 간에 결합이 이루어졌는지를 검출하는 단계로서, 검출은 직접 또는 간접적으로 수행되는 것인 단계.
다른 구현예에서, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 LY75 활성의 존재는 영상화 기법을 사용하는 수단에 의해 정량적으로 검출할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 LY75 활성의 존재를 확인하여, 예를 들어 본 발명의 질환 세포의 위치를 파악하기 위해, 예컨대 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직 섹션에 대해 면역조직화학법을 이용하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편의 존재는, 예를 들어, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 친화성 반응물, 예컨대 항체를 이용하여, 검출한다.
다른 구현예에서, LY75의 활성을 검출한다.
임상 연구에서의 용도
본 발명의 진단 방법 및 조성물은, 예컨대 본 발명의 질환의 치료용 약제를 평가하기 위해, 임상 연구를 모니터링하는데 일조할 수 있다. 일 구현예에서, 후보 분자는, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 개체에서 LY75 수준을 본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체 또는 치료받은 개체에서 확인되는 수준까지 회복시키는 회복력, 비-림프종, 비-갑상선암, 비-방광암, 비-위암, 비-식도암, 비-두경부암 및 비-피부암의 값 또는 거의 근사치로 LY75 수준을 유지하는 능력에 대해 테스트한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 개체를 동정하기 위한 임상 연구의 후보를 스크리닝하며; 이러한 개체는 연구에서 제외시키거나 또는 치료 또는 분석을 위한 별개 코호트로 배치할 수 있다.
본 발명의 단백질 및 해당 핵산의 제조
일 측면에서, 본 발명은 LY75를 코딩하는 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편 또는 유도체를, 예를 들어 백신 형태로, 치료학적인 유효량을, 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어 본 발명의 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, LY75의 기능 또는 발현을 저해하는 핵산을 치료학적인 유효량으로 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예를 들어 본 발명의 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법 (및/또는 본원에 기술된 그외 DNA 측면)은 예를 들어, 핵산이 LY75 안티센스 핵산 또는 리보자임인 경우를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은, 예를 들어 본 발명의 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어, LY75를 코딩하는 핵산 또는 이의 하나 이상의 단편 또는 유도체의 용도를 포함한다.
또한, 예를 들어 본 발명의 질환들 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 약제의 제조에 있어, LY75의 기능 또는 발현을 저해하는 핵산의 용도를 제공한다.
본 발명에 채택되는 DNA는, 출발 물질로서 시판 mRNA를 이용하여, 이의 뉴클레오티드 서열을 결정 및 동정하고, cDNA 라이브러리로부터 cDNA 단편으로서 분리함으로써 수득할 수 있다. 즉, 구체적으로, 클론은 Ohara et al.의 방법 (DNA Research Vol.4, 53-59 (1997))에 따라 제조된 cDNA 라이브러리로부터 랜덤으로 분리한다. 그런 후, 혼성화를 통해, (반복적으로 보이는) 복제된 클론을 취하여, 시험관내 전사 및 번역을 수행한다. 클론의 양 말단의 뉴클레오티드 서열들, 산물의 50 kDa 이상에 해당되는 뉴클레오티드 서열을 결정한다.
아울러, 공지 유전자들에 대한 데이타베이스에서 쿼리로서 이렇게 수득한 말단 뉴클레오티드 서열을 이용하여 상동성을 검색한다.
전술한 방법 외에도, cDNA의 5' 및 3' 말단 서열들을 인간 게놈 서열과 연관시킨다. 그런 후, 미공지의 장쇄 유전자를 서열들 간에 영역으로 확정하고, cDNA의 전장을 분석한다. 이런 방식으로, 공지 유전자에 의존하는 통례적인 클로닝 방법에 의해 수득할 수 없는 미공지 유전자를 체계적으로 클로닝할 수 있다.
아울러, 본 발명의 DNA를 함유한 인간 유래 유전자의 영역들 전체는, 짧은 단편 또는 수득된 서열에서 발생하는 인위적인 오차를 예방하기 위해 충분한 주의를 기울이면서, RACE 등의 PCR 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 DNA를 가진 클론을 수득할 수 있다.
본 발명의 DNA를 클로닝하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명의 폴리펩타이드의 일부에 대한 적정 뉴클레오티드 서열을 가진 합성 DNA 프라이머를 제조한 다음, 적절한 라이브러리를 이용하여 PCR 방법으로 증폭시킨다. 다른 구현예에서, 선별은, 본 발명의 DNA를, 적정 벡터에 병합되어 있으며 본 발명의 폴리펩타이드의 영역들 중 일부 또는 전체를 코딩하는, DNA 단편 또는 합성 DNA로 표지된 DNA와 혼성화함으로써, 수행할 수 있다. 혼성화는, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)에 기술된 방법에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 DNA는, 전술한 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 임의의 DNA일 수 있다. 이러한 DNA는 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직으로부터 유래되는, cDNA 라이브러리 등으로부터 동정 및 분리된 cDNA일 수 있다. 이러한 DNA는 또한 합성 DNA 등일 수 있다. 라이브러리 구축에 사용되는 벡터는, 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 중 임의의 것일 수 있다. 아울러, 전술한 세포 및/또는 조직으로부터 제조되는 전체 RNA 분획 또는 mRNA 분획을 사용함으로써, 중합효소 연쇄 반응 (이하, "RT-PCR 방법"으로 약칭됨)과 연계된 직접 역전사에 의해, 증폭을 수행할 수 있다.
LY75의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 전술한 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 또는 아미노산 서열의 일부를 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열의 결손, 치환 또는 부가에 의해, LY75의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열로 구성된 전술한 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA는, 예를 들어, 부위 특이적인 돌연변이 유발 방법, 유전자 상동적인 재조합 방법, 프라이머 연장 방법 및 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 PCR 방법을 적절하게 조합하여 사용함으로써, 쉽게 제조할 수 있다. 아울러, 이때, 폴리펩타이드가 실질적으로 등가의 생물 활성을 가지도록 유발할 수 있는 가능한 방법은, 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산들에서의 상동적인 아미노산 (예, 극성 및 비-극성 아미노산, 소수성 및 친수성 아미노산, 양으로 하전된 및 음으로 하전된 아미노산, 및 방향족 아미노산) 치환이다. 아울러, 실질적으로 등가의 생물 활성을 유지하기 위해, 본 발명의 폴리펩타이드에 포함된 기능성 도메인의 아미노산은 바람직하게는 보존된다.
아울러, 본 발명의 DNA의 예로는, LY75의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 및 엄격 조건 하에 DNA에 혼성하며 LY75의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드의 기능과 등가의 생물학적인 활성 (기능)을 가진 폴리펩타이드 (단백질)를 코딩하는 DNA를 포함한다. 이러한 조건에서, LY75의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 혼성할 수 있는 상기한 DNA의 예는, 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상 등의, DNA의 전체 뉴클레오티드 서열과 전체 평균 혼성화 수준을 가진, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA이다. 혼성화는 Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987)에 기술된 방법 및 그에 따른 방법과 같이 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 본원에서, "엄격 조건"은, 예를 들어, 대략 "1*SSC, 0.1% SDS 및 37℃의 조건, 대략 "0.5*SSC, 0.1% SDS 및 42℃의 보다 엄격한 조건, 또는 대략 "0.2*SSC, 0.1% SDS 및 65℃의 보다 더 엄격한 조건이다. 보다 엄격한 조건을 이용하는 경우, 프로브 서열과 상동성이 높은 DNA의 분리를 예상할 수 있다. 상기한 SSC, SDS 및 온도 조건들의 조합은 예시의 목적으로 제시된다. 상기와 유사한 엄격성은 혼성의 엄격성을 구하기 위해, 상기 인자 또는 그외 인자들 (예, 프로브 농도, 프로브 길이 및 혼성화 반응 시간)을 적절하게 조합하여 사용하여 당해 기술 분야의 당업자에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 클로닝된 DNA는, 직접 사용하거나, 또는 적절한 경우, 목적에 따라, 제한효소로 절단하거나 또는 링커를 부가한 후, 사용할 수 있다. DNA는 5' 말단측에 번역 개시 코돈으로서 ATG를, 3' 말단측에 번역 종결 코돈으로서 TAA, TGA 또는 TAG를 가질 수 있다. 이들 번역 개시 및 번역 종결 코돈들은 또한 적절한 합성 DNA 어댑터를 이용하여 부가할 수 있다.
본 발명의 방법/용도에서, LY75는 예를 들어 LY75 폴리펩타이드가 적어도 어느 수준까지 정제된 형태 등의 분리된 형태로 제공될 수 있다. LY75 폴리펩타이드는 실질적으로 순수한 형태, 즉, 다른 단백질이 상당한 수준으로 없는 형태로 제공될 수 있다. LY75 폴리펩타이드는 또한 재조합 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 이들 방법들을 조합하여 제조 또는 합성 제조된다. LY75는, 본 발명의 DNA를 함유한 유전자 또는 본 발명의 적정 DNA를 함유한 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 발현 벡터를 이용하여 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계, 본 발명의 적절한 폴리펩타이드 또는 이 폴리펩타이드를 함유한 재조합 단백질을 생산 및 축적하는 단계 및 이후 제조물을 수집하는 단계를 포함하는, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의 방법으로 쉽게 제조할 수 있다.
재조합 LY75 폴리펩타이드는 발현 시스템을 포함하는 유전자 조작된 숙주 세포로부터 당해 기술 분야에 널리 공지된 공정에 의해 제조할 수 있다. 이에, 본 발명은 또한 LY75 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함하는 발현 시스템, 이러한 발현 시스템으로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기법에 의한 LY75 폴리펩타이드의 제조에 관한 것이다. 재조합 LY75 폴리펩타이드를 생산하기 위해, 숙주 세포는 핵산에 발현 시스템 또는 이의 일부를 포함시키도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 포함은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAD-덱스트란 매개 형질감염, 트랜스벡션 (transvection), 미세주입, 양이온 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크레이프 로딩 (scrape loading), 발리스틱 도입 (ballistic introduction) 또는 감염과 같은 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예컨대 Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986 and Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989).
숙주 세포로서, 예를 들어, 에셰리키아 (Escherichia), 스트렙토코시 (Streptococci), 스타필로코시 (Staphylococci), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속의 박테리아, 바실러스 (Bacillus) 속의 박테리아, 효모, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 세포, 곤충 세포, 곤충 및 동물 세포가 이용된다. 본원에 사용되는 에셰리키아 속 박테리아의 구체적인 예로는, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) K12 및 DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 517 (1978)), 및 HB101 (Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 459 (1969))을 포함한다. 바실러스 속의 박테리아로서, 예를 들어, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) MI114 (Gene, Vol. 24, 255 (1983)) 및 207-21 (Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (1984))가 사용된다. 효모로서, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccaromyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 및 20B-12, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccaromyces pombe) NCYC1913 및 NCYC2036, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)가 사용된다. 곤충 세포로서, 예를 들어, 드로소필라 S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9 세포가 사용된다. 동물 세포로서, 예를 들어, COS-7 및 Vero 원숭이 세포, CHO 중국 햄스터 세포 (이하 CHO 세포로 약칭됨), dhfr-유전자-결핍성 CHO 세포, 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20 세포, 마우스 골수종 세포, 랫 GH3 세포, 인간 FL 세포, COS, HeLa, C127,3T3, HEK 293, BHK 및 Bowes 흑색종 세포가 사용된다.
무-세포성 번역 시스템 (cell-free translation system)도 재조합 폴리펩타이드를 제조하는데 이용할 수 있다 (예, 토끼 망상적혈구 세포용혈물, 밀 맥아 세포용혈물, SP6/T7 시험관내 T&T 및 RTS 100 E. Coli HY 전사 및 번역 키트, Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK 및 TNT 신속 커플링형 전사/번역 시스템, Promega UK, Southampton, UK).
발현 벡터는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 벡터는, (1) 본 발명의 DNA를 함유한 DNA 단편 또는 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 적출하여, (2) 적정 발현 벡터내 프로모터의 하류에 DNA를 연결함으로써, 제조할 수 있다. 매우 다양한 발현 시스템들, 예를 들어, 비제한적인 예로, 염색체, 에피좀 및 바이러스-유래 시스템, 예컨대 에셰리키아 콜라이 유래 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC18, 및 pUC118), 바실러스 섭틸리스 유래 플라스미드 (예, pUB110, pTP5 및 pC194), 박테리아파지 유래 플라스미드, 트랜스포존 유래 플라스미드, 효모 에피좀 유래 플라스미드 (예, pSH19 and pSH15)), 삽입 인자 유래 플라스미드, 효모 염색체 인자 유래 플라스미드, 바큘로바이러스, 파포바 바이러스, 예로 SV40, 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 계두 바이러스, 슈도광견병 바이러스 및 레트로 바이러스 등의 바이러스 유래 플라스미드, 및 이들의 조합으로 유래되는 벡터, 예를 들어, 플라스미드와 박테라오파지 (예, 람다 파지) 유전자 인자들로부터 유래된 벡터, 예로, 코스미드 및 파지미드가 사용될 수 있다. 발현 시스템은 발현을 조절할 뿐 아니라 야기하는 조절 영역을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 프로모터는 이것이 유전자 발현에 사용될 숙주에 적절한 한 임의의 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 숙주가 에셰리키아 콜라이인 경우, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, pL 프로모터, lpp 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 바실러스 섭틸리스인 경우, SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 효모인 경우, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 동물 세포가 숙주로 사용되는 경우, 이 경우에 사용되는 프로모터의 예로는 SRa 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터 및 HSV-TK 프로모터를 포함한다. 통상적으로, 핵산을 유지, 증폭 또는 발현하여 숙주내에서 폴리펩타이드를 제조할 수 있는 모든 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다.
적절한 핵산 서열은 상기 Sambrook et al.에 기술된 바와 같이 매우 다양한 널리 공지되고 일반적인 기법에 의해 발현 시스템에 삽입할 수 있다. 적절한 분비 신호를 LY75 폴리펩타이드에 삽입하여, 소포체의 내강, 주변세포질 공간 또는 세포외 환경으로 번역된 단백질을 분비시킬 수 있다. 이들 신호는 LY75 폴리펩타이드에 내인성이거나, 또는 이종 신호일 수 있다. 숙주 세포의 형질전환은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조할 수 있다: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 69, 2110 (1972); Gene, Vol. 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979); Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), Vol. 75, 1929 (1978); Cell Technology, separate volume 8, New Cell Technology, Experimental Protocol. 263-267 (1995) (issued by Shujunsha); Virology, Vol. 52, 456 (1973). 이렇게 수득한 본 발명의 DNA 또는 본 발명의 DNA를 함유한 유전자를 가진 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 배양할 수 있다. 예를 들어, 숙주가 에셰리키아 속의 박테리아인 경우, 이 박테리아는 일반적으로 약 15℃ - 43℃에서 약 3-24시간 배양한다. 필요에 따라서는 호기 또는 교반이 부가될 수 있다. 숙주가 바실러스 속의 박테리인 경우에는, 이 박테리아는 일반적으로 약 30℃ - 40℃에서 약 6-24시간 배양한다. 필요에 따라 호기 또는 교반이 부가될 수 있다. 숙주가 효모인 형질전환체를 배양하는 경우, 배양은 일반적으로 약 20℃ - 35℃에서 약 24-72시간 pH가 약 5-8로 조정된 배지를 이용하여 수행한다. 필요에 따라, 호기 또는 교반이 또한 부가될 수 있다. 숙주가 동물 세포인 형질전환체를 배양하는 경우, 세포는 일반적으로 약 30℃ - 40℃에서 약 15-60시간 동안 pH 약 6-8로 조정된 배지를 이용하여 배양한다. 필요에 따라, 호기 또는 교반이 부가될 수 있다.
LY75 폴리펩타이드를 세포성 스크리닝 분석에 이용하기 위해 발현시킨다면, 폴리펩타이드는 세포 표면에 생산되게 하는 것이 바람직하다. 이 경우, 세포는 스크리닝 분석에 사용하기 전에 회수할 수 있다. 만일 LY75 폴리펩타이드가 배지로 방출된다면 배지를 회수하여 폴리펩타이드를 분리할 수 있다. 만일 세포내에서 생산된다면, LY75 폴리펩타이드를 회수하기 전에 먼저 세포를 세포용혈시켜야 한다.
LY75 폴리펩타이드는 재조합 세포 배양물 또는 다른 생물학적 소스로부터, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 석출, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 친환성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파티트 크로마토그래피, 분자체질 크로마토크래피, 원심분리 방법, 전기영동 방법 및 렉틴 크로마토그래피 등의 널리 공지된 방법에 의해 회수 및 정제할 수 있다. 일 구현예에서, 이들 방법을 조합하여 사용한다. 다른 구현예에서, 고 성능 액체 크로마토그래피가 사용된다. 다른 구현예에서, LY75 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여, 상기 폴리펩타이드의 LY75 폴리펩타이드를 포함하는 샘플을 고갈시키거나 또는 상기 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질을 배양 산물로부터 분리 및 정제하기 위해, 예를 들어 배양 후, 미생물 균체 또는 세포를 공지 방법에 의해 수집하고, 이를 적정 완충제에 현탁한 다음, 미생물 균체 또는 세포를, 예를 들어, 초음파, 리소자임 및/또는 동결-해동에 의해 파괴하고, 수득되는 산물을 원심분리 또는 여과하여, 단배질의 조 추출물을 수득할 수 있다. 또한, 완충제는 우레아 등의 단백질 변성제, 또는 Triton X-100(TM) 등의 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 계면활성제를 포함할 수 있다. 단백질이 배양 용액으로 분비되는 경우에는, 미생물 균체 또는 세포 및 상층물을 배양 완료 후 공지 방법으로 분리한 다음 상층물을 수집한다. 이렇게 수득한 상층물 또는 추출물에 함유된 단백질은 공지 분리 및 정제 방법들을 적절하게 조합 사용함으로써 정제할 수 있다. 수득한 본 발명의 폴리펩타이드 (단백질)은 공지 방법에 의해 또는 이에 따른 방법에 의해 염으로 변환할 수 있다. 반대로, 본 발명의 폴리펩타이드(단백질)가 염의 형태로 수득된다면, 이는 공지 방법 또는 이에 따른 방법으로 유리형 단백질 또는 펩타이드 또는 다른 염 형태로 변환시킬 수 있다. 아울러, 트립신 또는 키모트립신 등의 적절한 단백질 변형 효소로, 정제하기 전 또는 정제한 후 재조합체에 의해 생산되는 단백질에 작용하게 야기함으로써, 변형을 임의의 부가하거나 또는 폴리펩타이드를 일부 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 (단백질) 또는 이의 염의 존재는 다양한 결합 분석, 특이 항체를 이용한 효소 면역분석 등에 의해 측정할 수 있다.
폴리펩타이드가 분리 및/또는 정제되는 동안 변이된 경우에는, LY75 폴리펩타이드의 천연 또는 활성형 구조를 재생하기 위한 리폴링을 위해, 당해 기술 분야에 공지된 기법을 사용할 수 있다. 본 발명에서, LY75 폴리펩타이드는 비제한적인 예로 혈액 샘플 또는 조직 샘플, 예를 들어 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직 샘플과 같은 임의의 소스로부터 유래된 생물 샘플로부터 수득할 수 있다.
LY75 폴리펩타이드는 "성숙 단백질" 형태이거나 또는 융합 단백질과 같이 보다 큰 단백질의 일부일 수 있다. 분비 또는 리더 서열, 프리-, 프로- 또는 프리프로-단백질 서열 또는 친화성 테그 등의 정제를 도와주는 서열, 예컨대 비제한적으로 멀티플 히스티딘 잔기, FLAG tag, HA tag 또는 myc tag를 포함하는 추가적인 아미노산 서열을 포함하는 것도 종종 유익하다.
LY75는, 예를 들어, 헤모필러스 인플루엔자 B의 단백질 D로 공지된 표면 단백질, 인플루엔자 바이러스 유래 비-구조 단백질, 예컨대 NS1, B형 간염 바이러스의 S 항원 또는 C 말달 등의 LYTA로 공지된 단백질과 같은 이종의 융합 파트너와 융합될 수 있다.
또한, 재조합을 수행하는 동안 안정성을 제공할 수 있는 부가적인 서열도 사용할 수 있다. 이들 서열은 부가적인 서열 또는 이의 일부로서 절단성 서열의 투입을 필요로 하므로 선택적으로 제거할 수 있다. 따라서, LY75 폴리펩타이드는 기타 폴리펩타이드 또는 단백질 (예, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 및 단백질 A) 등의 다른 모이어티에 융합시킬 수 있다. 이러한 융합 단백질은 적절한 프로테아제를 이용하여 절단한 다음 각 단백질로 분리할 수 있다. 이러한 추가적인 서열 및 친화성 테그들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 전술한 사항 외에도, 인핸서, 스플라이싱 신호, 폴리A 부가 신호, 선별 마커 및 SV40 복제 오리진 등의 당해 기술 분야에 공지된 특징들을 필요에 따라 발현 벡터에 부가할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, LY75 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 또는 LY75를 코딩하는 핵산에 혼성화할 수 있는 혼성화제, 또는 암, 특히 본 발명의 질환을 치료, 스크리닝, 검출 및/또는 진단에 사용하기 위한 LY75 활성을 검출할 수 있는 물질을 제공한다.
LY75에 대한 친화성 반응물의 제조
일 측면에서, 본 발명은 LY75 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 친화성 또는 면역친화성 반응물, 예를 들어, 세포독성 모이어티 등의 치료 모이어티를 포함 또는 이에 접합되거나, 또는 검출 표지물질을 포함 또는 이에 접합된 친화성 반응물을 제공한다. 친화성 물질은, 예를 들어 항체일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 친화성 반응물은 LY75 상의 에피토프, 예컨대 서열번호 1의 하나 이상의 일부분에 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위한 친화성 반응물은 LY75 세포외 도메인 상의 에피토프, 예컨대 서열번호 53의 하나 이상의 일부분에 결합할 수 있다.
당해 기술 분야에 따르면, 면역친화성 반응물에는 주된 3가지 타입이 있다 - 단일클론 항체, 파지 디스플레이 항체 및 소형 항체-유래 분자, 예컨대 어피바디, 도메인 항체 (dAb), 나노바디, 유니바디, DARPin, Anticalin, Duocalin, Avimer 또는 Versabody. 항체 사용이 언급된 본 발명에 따른 용도에서, 일반적으로, 다른 친화성 반응물 (예, Affibodies, Domain 항체, Nanobodies, UniBodies, DARPins, Anticalins, Duocalins, Avimers 또는 Versabodies)이 사용될 수 있다. 이들 물질은 LY75에 면역특이적으로 결합할 수 있다고 할 수 있다. 적절한 경우, 용어 "친화성 물질"은 면역친화성 반응물과, 비제한적인 예로 리간드, 렉틴, 스트렙타미딘, 항체 모방체 및 합성 결합제 등의 LY75에 특이적으로 결합할 수 있는 그외 물질들을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
LY75에 대한 항체 제조
본 발명에 있어서, LY75, LY75 유사체, LY75-관련 단백질 또는 전술한 임의의 것의 단편 또는 유도체는, 면역원으로서 사용하여, 면역원에 면역특이적으로 결합시키는 항체를 제조할 수 있다. 이러한 면역원은 전술한 방법 등의 임의의 편리한 수단에 의해 분리할 수 있다. 용어 "항체"는, 본원에서, 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 코딩되거나, 유래되거나, 또는 이후 모델링화되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예컨대 Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97을 참조한다. 용어 항체는 항원에 결합하는 능력을 보유한 항원-결합 부분, 즉, "항원 결합부" (예, 단편, 서열, 상보성 결정부 (CDR))를 포함하며, 예로, (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')2, 힌지부에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 도메인과 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 싱글 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정부 (CDR)를 포함한다. 단쇄 항체는 또한 용어 "항체"에 포함된다. 본 발명의 항체는, 비제한적으로, 다클론, 단일클론, 2 특이, 인간화된 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편 및 F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 제조되는 단편, 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 및 전술한 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 임의의 클래스 (예, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA, 예컨대 IgG)의 것이거나 또는 면역글로불린 분자의 서브클래스일 수 있다.
용어 "특이적으로 결합한다" (또는 "면역특이적으로 결합한다")는, 항체가 이의 의도한 타겟에만 결합하다는 것을 나타내고자 하는 것은 아니다. 오히려, 이의 의도한 타겟에 대한 친화성이 전형적으로 비-타겟 분자에 의해 친화성과 비교해 약 5배 이상 높다면 항체는 "특이적으로 결합"하는 것이다. 적절하게는, 부적절한 물질, 특히 건강한 개체 또는 동물의 천연 단백질 또는 조직과 유의한 교차 반응 또는 교차 결합이 존재하지 않는다. 바람직하게는, 항체의 친화성은, 타겟 분자가 비-타겟 분자에 대한 친화성 보다 적어도 약 5배, 바람직하게는 10배, 더 바람직하게는 325배, 보다 더 바람직하게는 50배, 가장 바람직하게는 100배 높을 것이다. 일부 구현예들에서, 항체 또는 그외 결합제 및 항원 간의 특이적인 결합은, 결합 친화성 106 M-1 이상을 의미한다. 항체는, 예를 들어, 적어도 약 107 M-1, 바람직하게는 약 108 M-1 - 약 109 M-1, 약 109 M-1 - 약 1010 M-1, 또는 약 1010 M-1 - 약 1011 M-1의 친화성으로 결합한다.
친화성은 Kd =koff /kon로 계산한다 (koff는 해리 속도 상수이고, kon은 조합 속도 상수이고, Kd는 평형 상수임). 친화성은 다양한 농도 (c)에서 표지된 리간드의 결합 분율 (r)을 측정함으로써 평형에서 구할 수 있다. 데이타는 Scatchard 등식을 이용하여 그래프로 작성된다: r/c = K(n-r):
상기 식에서,
r = 평형시 결합 리간드 몰수/수용체 몰수
c = 평형시, 유리 리간드의 농도;
K = 평형 조합 상수; 및
n = 수용체 분자 당 리간드 결합부의 수
그래프 분석을 통해, r/c를 Y 축에 X 축의 r에 대해 작성하여, Scatchard 플롯을 그린다. 친화성은 선의 네거티브 기울기이다. koff는 결합된 표지된 리간드를 비표지된 과량의 리간드와 경쟁함으로써 구할 수 있다 (예, 미국 특허 6,316,409).　 이의 타겟 분자에 대한 타겟 물질의 친화성은, 예를 들어 적어도 약 1 x 10-6 moles/liter, 예로, 적어도 약 1 x 10-7 moles/liter, 예로 적어도 약 1 x 10-8 moles/liter, 특히 적어도 약 1 x 10-9 moles/liter, 구체적으로 적어도 약 1 x 10-10 moles/liter이다. Scatchard 분석에 의한 항체 친화성 측정은 당해 기술 분야, 예를 들어 van Erp et al., J. Immunoassay 12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988에 잘 알려져 있다.
일 구현예에서, LY75를 코딩하는 유전자의 유전자 산물을 인지하는 임의의 공공의 이용가능한 항체가 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, LY75, LY75 유사체, LY75-관련 폴리펩타이드 또는 이들의 임의의 단편 또는 유도체를 인지하는 항체를 제조한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 여러가지 공정들이, 예를 들어 Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y에 기술된 바와 같이, 항체의 제조에 이용가능하다는 것을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는 또한 결합 단편 또는 항체를 모방한 Fab 단편 역시 다양한 공정에 의해 유전자 정보로부터 제조할 수 있다는 것을 알 것이다 (Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C., ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)).
본 발명의 일 구현예에서, LY75의 특이 도메인에 대한 항체를 제조한다. 구체적인 구현예에서, LY75의 친수성 단편을 항체 생산을 위한 면역원으로서 사용한다.
항체 생산에 있어, 적합한 항체를 스크리닝하는 것은 당해 기술 분야에 공지된 기법, 예를 들어 ELISA (효소 연계된 면역흡착 분석)에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, LY75의 특이 도메인을 인지하는 항체를 선별하기 위해, 이러한 도메인을 함유한 LY75 단편에 결합하는 산물에 대해 구축된 하이브리도마를 분석할 수 있다. 1차 LY75 상동체에 특이적으로 결합하지만 2차 LY75 상동체에는 특이적으로 결합하지 않는 (또는 낮은 결합력으로 결합하는) 항체를 선별하기 위해, 1차 LY75 상동체에 대한 양성 결합성과 2차 LY75 상동체에 대한 결합 결여 (또는 결합성 감소)를 토대로 선별할 수 있다. 마찬가지로, LY75에 특이적으로 결합하지만 동일 단백질의 다른 이소형 (예, LY75와 동일한 코어 펩타이드를 가진 다른 글리코형)에는 특이적으로 결합하지 않는 (또는 낮은 결합력으로 결합하는) 항체를 선별하는 경우, LY75에 대한 양성 결합성과 다른 이소형 (예, 다른 글리코형)에 대한 결합 결여 (또는 결합 감소)를 토대로 선별할 수 있다. 이에, 본 발명은 LY75의 다른 이소형 또는 이소형들 (예, 글리코형) 보다는 LY75에 대해 높은 (예를 들어 적어도 2배, 예로 적어도 5배, 특히 적어도 10배 높은) 친화성으로 결합하는 항체 (예, 단일클론 항체)를 제공한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다클론 항체는 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자들의 혼합 집단이다. 또한, 분획화하지 않은 면역혈청도 사용할 수 있다. 당해 기술 분야에 공지된 다양한 공정들이 LY75, LY75의 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 단편에 대한 다클론 항체 생산에 사용될 수 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려진 고상 펩타이드 합성법을 이용하여 대상 폴리펩타이드를 정제하거나 대상 폴리펩타이드를 합성하는 것이다. 예를 들어, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed., Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1: 255-60, 1995; Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31, 1996을 참조한다. 그런 다음, 선별한 폴리펩타이드를 이용하여, 비제한적인 예로 토끼, 마우스, 랫 등의 다양한 숙주 동물에 주입하여 면역화함으로써 다클론 항체 또는 단일클론 항체를 만들 수 있다. LY75가 겔 전기영동에 의해 정제된다면, LY75는 폴리아크릴라미드 겔에서 추출하기 전에 또는 추출 없이 면역화에 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, 완전 또는 불완전 프레운드 보강제, 미네랄 겔, 예로 알루미늄 하이드록사이드, 계면활성 물질, 예로 리소레시틴, 플루론 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 유제, 키홀 림페트 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin), 다이니트로페놀 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 또는 코리네박테리움 파르붐 등의 보강제 등의, 다양한 보강제 (예, 면역자극제)를 사용하여, 숙주 종에 따라 면역 반응을 강화할 수 있다.
LY75, LY75의 단편, LY75 관련 폴리펩타이드 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 단편에 대한 단일클론 항체 (mAb)를 제조하기 위해, 세포주를 연속 배양함으로써 항체 분자를 생산하는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 단일클론 항체를 생산하기 위한, Kohler 및 Milstein (1975, Nature 256:495-497)에 의해 최초 개발된 하이브리도마 기법 뿐 아니라 트리오마 기법 (trioma technique), 인간 B 세포 하이브리도마 기법 (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), 및 EBV-하이브리도마 기법 (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함한다. 이들 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 서브클래스를 비롯한 임의의 면역글로불린 클래스의 것일 수 있다. 본 발명의 mAb 생산용 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 단일클론 항체는 무-병원성 동물을 사용하는 공지 기법으로 제조할 수 있다 (PCT/US90/02545, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
단일클론 항체는 비제한적으로, 인간 단일클론 항체 및 키메라 단일클론 항체 (예, 인간-마우스 키메라)를 포함한다. 키메라 항체는 여러 부위들이 여러가지 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를 들어 인간 면역글로불린 불변부와 뮤라인 mAb로부터 유래된 가변부를 가진 분자이다 (예, Cabilly et al., 미국 특허 제 4,816,567; and Boss et al., 미국 특허 제 4,816,397, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)). 인간화된 항체는 비-인간 종 유래의 하나 이상의 상보성 결정부 (CDR)과 인간 면역글로불린 분자 유래 프래임워크 영역을 가진 비-인간 종 유래 항체 분자이다 (예 Queen, 미국 특허 제 5,585,089, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
키메라 및 인간화된 단일클론 항체는 당해 기술 분야에 공지된 재조합 DNA 기법에 의해, 예를 들어 PCT 공개번호 WO 87/02671; 유럽 특허 출원 184,187; 유럽 특허 출원 171,496; 유럽 특허 출원 173,494; PCT 공개번호 WO 86/01533; 미국 특허 제 4,816,567; 유럽 특허 출원 125,023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; 미국 특허 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 및 Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060에 기술된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
인간 개체를 치료학적으로 치료하는데에는 완전한 인간 항체가 특히 바람직하다. 이러한 항체는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 이용하여 생산할 수 있다. 형질전환 마우스는 선별 항원으로, 예컨대 LY75의 일부 또는 전체를 사용하여 정상적인 방식으로 면역화한다. 이 항원에 대한 단일클론 항체는 통상적인 하이브리도마 기법을 사용하여 수득할 수 있다. 형질전환 마우스에 보유된 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포가 분화되는 동안 재배열되며, 이후 클래스 스위칭 및 상염색체 돌연변이를 겪게 된다. 그래서, 이러한 기법을 이용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체 생산에 대한 이러한 기법의 전체 내용은 Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)를 참조한다. 인간 항체 및 인간 단일클론 항체를 제조하는 이러한 기법과 상기한 항체 제조용 프로토콜에 대한 상세한 설명은, 예를 들어 미국 특허 5,625,126; 미국 특허 5,633,425; 미국 특허 5,569,825; 미국 특허 5,661,016; 및 미국 특허 5,545,806을 참조한다. 아울러, Abgenix, Inc. (Freemont, CA) 및 Genpharm (San Jose, CA) 등의 회사와 계약하여 전술한 기법과 유사한 기법을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공받을 수 있다.
선택된 항원을 인지하는 완전한 인간 항체는 "가이드형 선별"로 지칭되는 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 이 경우, 선택된 비-인간 단일클론 항체, 예컨대 마우스 항체를 이용하여 동일 에피토프를 인지하는 완전한 인간 항체를 선별하는 것을 안내한다 (Jespers et al. (1994) BioTechnology 12:899-903).
또한, 본 발명의 항체는 선택된 타겟에 결합하는 폴리펩타이드의 라이브러리를 제조 및 스크리닝하기 위해 파지 디스플레이 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 예컨대 Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990; Ladner et al., 미국 특허 제 5,571,698을 참조한다. 파지 디스플레이 방법의 기존 개념은 스크리닝할 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA와 폴리펩타이드 간의 물리적인 조합을 확립하는 것이다. 이 물리적인 조합은 폴리펩타이드를 코딩하는 파지 게놈을 싸고 있는 캡시드의 일부로서 폴리펩타이드를 제시하는 파지 입자에 의해 제공된다. 폴리펩타이드와 이의 유전 물질 간의 물리적인 조합 확립은 여러가지 폴리펩타이드를 보유한 대단히 많은 수의 파지를 동시에 대량 스크리닝가능하게 한다. 타겟에 대한 친화성을 가진 폴리펩타이드를 제시하는 파지는 타겟에 결합하며, 이 파지는 타겟에 대한 친화성 스크리닝에 의해 농화시킨다. 이들 파지에 제시된 폴리펩타이드의 정체는 이의 게놈으로 알 수 있다. 이러한 방법들을 이용하여, 바람직한 타겟에 결합 친화성을 가진 것으로 동정된 폴리펩타이드를 통상적인 방식으로 다량 합성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,057,098을 참조하며, 이 문헌은 원용에 의해 표, 도면 및 청구항 전체 등의 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 특히, 이러한 파지를 이용하여, 레퍼토리 또는 콤비네이토리 항체 라이브러리 (예, 인간 또는 뮤라인)로부터 발현되는 항원 결합 도메인을 제시할 수 있다. 대상 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원을 이용하여, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합 또는 포착된 항원을 이용하여 선별 또는 동정할 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 전형적으로 Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인이 파지 유전자 II 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합으로 결합된 파지로부터 발현되는 fd 및 M13 결합 도메인 등의 필라멘트형 파지이다. 본 발명의 항체 제조에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법으로는 Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108에 언급된 방법들을 포함하며; 이들 각각은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
전술한 문헌에 언급된 바와 같이, 선별 후, 파지로부터 항체 코딩부를 분리하여, 이를 사용하여 인간 항체 등의 전체 항체 또는 임의의 다른 바람직한 항원 결합 단편을 제조하고, 예를 들어, 아래에서 상세히 기술된 바와 같이, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아 등의 임의의 바람직한 숙주에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합으로 제조하는 기법 역시 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예로 PCT 공개공보 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988)에 기술된 방법을 이용하여 채택할 수 있다 (상기 문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함됨).
단쇄 Fv 및 항체를 제조하는데 사용할 수 있는 기법의 예로는, 미국 특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)에 기술된 기법을 포함한다.
본 발명은 2 특이성 항체의 사용을 추가로 제공하며, 이는 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 2 특이성 항체의 전장을 전통적으로 생산하는 것은, 2개의 체인이 상이한 특이성을 가진, 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 한다 (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 조합 (random assortment)으로 인해, 이 하이브리도마 (쿼드로마스 (quadromas))는, 오직 하나만 바른 2 특이성 구조를 가지고 있는 10종의 항체 분자들로 된 가능한 혼합물을 생산한다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 바른 분자의 정제는 오히려 번거러우며, 생산 수율이 낮다. 유사 공정은 1993년 5월 13일에 공개된 WO 93/08829와 Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659에 기술되어 있다.
다른, 더 바람직한 방식에 따르면, 바람직한 결합 특이성을 가진 항체 가변성 도메인 (항체-항원 결합부)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 이 융합체는 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역들 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 가진다. 하나 이상의 융합체에 존재하는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유한 제1 중쇄 불변부 (CH1)를 가지는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는, 개별 발현 벡터에 삽입하여, 적합한 숙주 유기체로 공동-형질감염시킨다. 구축에 사용되는 비-등가 비율의 폴리펩타이드 체인 3개가 최적의 수율을 제공하는 구현예에서, 이들 3종의 폴리펩타이드 단편들의 상호 비율을 조절하는 것이 상당한 유연성을 제공해준다. 그러나, 등가 비율로 2종 이상의 폴리펩타이드 체인의 발현시 고수율이 달성되거나 또는 그 비율이 특별히 유의하지 않을 경우, 하나의 발현 벡터에 3종의 폴리펩타이드 체인 중 2 또는 전부에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것도 가능하다.
이러한 방식의 바람직한 구현예에서, 2 특이성 항체는 하나의 암에 존재하는 제1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄와 다른 암에 존재하는 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공해줌)으로 구성된다. 2 특이성 분자의 오직 절반에 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 분리를 쉽게 하는 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭적인 구조가, 원치않은 면역글로불린 체인 조합들로부터 바람직한 2 특이성 화합물의 분리를 쉽게 해주는 것으로 확인되어 있다. 이런 방식은 1994년 3월 3일 간행된 WO 94/04690에 기술되어 있다. 2 특이성 항체 제조에 대한 추가적인 상세한 내용은, 예를 들어 Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210을 참조한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 친화성 반응물 (예, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항체 모방체)은 2 특이성이 아니다. 본 발명의 일부 구체적인 구현예들에서, 친화성 반응물(예, 항체, 또는 이의 항원-결합 부분 또는 항체 모방체)는 림프종, 방광 암/암종, 유방암, 위/대장암, 식도암 및 피부암/흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암을 치료하기 위한 2 특이성 항체가 아니다.
본 발명은 항-LY75 면역글로불린 분자의 기능적 활성 단편, 항원-결합부, 유도체 또는 유사체를 제공한다. 기능적 활성 단편은, 단편, 유도체 또는 유사체가 단편의 기원이 되는 항체에 의해 인지되는 동일 항원을 인지하는 항-항-이디오타입 항체 (즉, 터셔리 항체)를 도출할 수 있다는 것을 의미한다. 구체적으로, 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 분자의 이디오타입의 항원성은, 항원을 특이적으로 인지하는 CDR 서열에 대해 C-말단인 CDR 서열들과 프래임워크를 제거함으로써 강화할 수 있다. CDR 서열이 항원에 결합하는 지를 확인기 위해, CDR 서열들을 함유한 합성 펩타이드를 당해 기술 분야에 공지된 임의의 결합 분석법에 의해 항원을 이용하여 결합 분석에서 사용할 수 있다.
본 발명은 비제한적인 예로, F(ab')2 단편 및 Fab 단편 등의 항체 단편을 제공한다. 특이적인 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지 기법으로 제조할 수 있다. F(ab')2 단편은 가변부, 경쇄 불변부 및 중쇄의 CH1 도메인으로 구성되며, 항체 분자의 펩신 절단에 의해 제조된다. Fab 단편은 F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원하여 제조한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 다이머, 또는 이의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단쇄 항체 (SCA) (예, 미국 특허 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), 또는 본 발명의 항체와 동일한 특이성을 가진 임의의 다른 분자를 제공한다. 단쇄 항체는 아미노산 결합을 통해 Fv의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결하여 단쇄 폴리펩타이드를 제조함으로써 형성된다. E. coli에서의 기능적인 Fv 단편의 조합 기법을 이용할 수 있다 (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
다른 구현예들에서, 본 발명은, 본 발명의 면역글로불린의 융합 단백질 (또는 이의 기능적 활성 단편 또는 이의 항원-결합부), 예를 들어, 면역글로불린이 공유 결합 (예, 펩타이드 결합)을 통해 면역글로불린이 아닌 다른 단백질의 아미노산 서열 (또는 이의 일부, 바람직하게는 그 단백질의 적어도 10, 20 또는 50개의 아미노산 영역)의 N-말단 또는 C-말단에 융합된, 융합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 면역글로불린 또는 이의 단편은 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질과 공유 결합된다. 전술한 바와 같이, 이러한 융합 단백질은 정제를 용이하게 하며, 생체내 반감기를 증가시키며, 면역계로의 표피 배리어를 통한 항원 전달을 강화할 수 있다.
본 발명의 면역글로불린은 변형된, 즉, 공유 결합이 면역특이적인 결합에 손상을 입히지 않는 한 임의 타입의 분자의 공유 결합에 의해 변형된, 유도체 및 유사체를 포함한다. 예를 들어, 비제한적인 예로, 면역글로불린의 유도체 및 유사체로는, 예를 들어, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질분해에 의한 절단, 세포 리간드 또는 그외 단백질과의 연결 등에 의해 추가로 변형된 것을 포함한다. 임의의 수많은 화학적 변형, 비제한적인 예로, 특이적인 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화 등은 공지 기법에 의해 수행될 수 있다. 부가적으로 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다.
전술한 항체는 LY75의 위치화 및 활성과 관련한 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어 이 단백질의 영상화, 적합한 생리 샘플내에서의 이의 수준 측정, 진단 방법 등에 사용될 수 있다.
LY75에 대한 어피바디의 제조
어피바디 분자는 스타필로코커스 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나로부터 유래된, 아미노산 잔기 58개로 이루어진 단백질 도메인을 토대로 한 새로운 클래스의 친화성 단백질이다. 이 3중 나선 번들 도메인은 원하는 분자를 타겟하는 어피바디 변이체들을 파지 디스플레이 기법을 이용하여 선별할 수 있는, 컴비네이토리 파지미드 라이브러리의 구축에 스캐폴드로서 사용되고 있다 (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). 어피바디의 단순하고 견고한 구조와 이의 저분자량 (6 kDa)으로 인해 매우 다양한 용도, 예를 들어 검출 시약으로서 (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) 및 수용체 상호작용을 저해하는데 (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7) 적합하다. 어피바디와 이의 제조 방법에 대한 추가적인 상세 내용은 미국 특허 5831012를 참조할 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다.
또한, 표지된 어피바디도 이소형 존재량을 측정하기 위한 영상화 기법에 이용가능할 수 있다.
LY75에 대한 도메인 항체 제조
본원에서 항체에 대한 언급은 도메인 항체에 대한 언급을 포괄한다. 도메인 항체 (dAbs)는 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL)의 가변부에 해당되는 항체의 최소한의 기능성 결합 유닛이다. 도메인 항체는 분자량이 약 13 kDa이다. Domantis는 완전한 인간 VH 및 VL dAb들로 구성된 일련의 거대하고 고도로 기능적인 라이브러리를 개발하였으며 (각 라이브러리에서 서열의 종이 100억개 이상임), 이들 라이브러리를 이용하여 치료 타겟에 특이적인 dAb를 선별한다. 기존의 다수의 항체와는 대조적으로, 도메인 항체는 박테리아, 효모 및 포유류 세포 시스템들에서 잘 발현된다. 도메인 항체 및 이의 제조 방법에 대한 추가적인 상세 내용은 미국 특허 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 미국 출원번호 2004/0110941; 유럽 특허 출원 1433846 및 유럽 특허 0368684 및 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 및 WO03/002609를 참조할 수 있으며, 이들 각각은 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다.
LY75에 대한 나노바디의 제조
나노바디는 천연 중쇄 항체의 고유한 구조 특성과 기능적 특성을 가진 항체-유래 치료 단백질이다. 이 중쇄 항체는 하나의 가변성 도메인 (VHH)과 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)를 포함한다. 중요한 점은, 클로닝 및 분리된 VHH 도메인이 오리지날 중쇄 항체의 전체 항원-결합 능력을 보유한 완벽하게 안정한 폴리펩타이드라는 것이다. 나노바디는 인간 항체의 VH 도메인과 높은 상동성을 가지며, 어떠한 활성의 소실없이도 추가로 인간화할 수 있다. 중요하게는, 나노바디는 면역원성 잠재성이 낮으며, 이는 나노바디 리드 화합물을 이용한 영장류 실험들에서 검증되었다.
나노바디는 통상적인 항체의 이점과 소 분자 약물의 주요 특징을 겸비한다. 통상적인 항체처럼, 나노바디는 높은 타겟 특이성, 이의 타겟에 대한 높은 친화성 및 낮은 선천적인 독성을 나타낸다. 하지만, 소 분자 약물처럼, 이는 효소를 저해할 수 있으며, 수용체 크레프트에 쉽게 접근할 수 있다. 아울러, 나노바디는 극도로 안정하여, 주사 이외의 다른 수단에 의해서 투여할 수 있으며 (예, WO 04/041867, 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함됨), 제조가 용이하다. 나노바디의 다른 장점은 이의 소형 크기로 인한 비-공통 또는 히든 에피토프의 인지성, 이의 고유한 3차 구조로 인한 높은 친화성 및 선택성으로의 단백질 타겟의 틈 또는 활성부로의 결합, 약물 포멧 유연성, 반감기 조절 및 약물 개발 용이성 및 속도를 포함한다.
나노바디는 단일 유전자에 의해 코딩되며, 거의 모든 원핵생물 및 진핵생물 숙주, 예컨대 E. coli (예, US 6,765,087, 이는 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함됨), 곰팡이 (예를 들어, 아스퍼질러스 또는 트리코더마) 및 효모 (예, 사카로마이세스, 클루베로마이세스, 한세뉼라 또는 피키아) (예, US 6,838,254, 이는 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함됨)에서 효율적으로 제조된다. 제조 공정은 규모 확장가능하며, 나노바디는 수 킬로 그람으로 제조된다. 나노바디는 통상적인 항체와 비해 우수한 안정성을 나타내어, 이는 유효 기간이 긴 레디 투 유스 용액으로서 제형화할 수 있다.
바람직한 타겟에 대한 나노바디를 B 세포의 자동화된 고성능 선별을 기초로 제조하는 등록된 방법은 나노클론 방법 (예, WO 06/079372, 이는 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함됨)이다.
LY75에 대한 유니바디의 제조
유니바디는 다른 항체 단편 기법으로서, 이는 IgG4 항체의 힌지부 제거를 기초로 한다. 힌지부의 제거로, 전통적인 IgG4 항체의 크기가 기본적으로 반으로 줄어들며, IgG4 항체의 2가 결합 영역 보다는 1가 결합 영역을 가진다. 이는 또한, IgG4 항체가 불활성이고, 따라서 면역 반응이 바람직하지 않은 질환을 치료하는데 유익할 수 있는 면역 시스템과 상호작용하지 않으며, 이러한 이점이 유니바디에 전달된다는 것은 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유니바디는 저해 또는 침묵하도록 기능할 수 있지만, 이것이 결합된 세포를 사멸시키진 않는다. 부가적으로, 암 세포에 대한 유니바디의 결합이 이의 증폭을 자극하지 않는다. 아울러, 유니바디는 전통적인 IgG4 항체의 크기를 거의 반으로 줄이기 때문에, 이는 큰 고형 종양들에 대해 양호한 분포를 나타낼 수 있으며, 잠재적으로 유익한 효능을 가진다. 유니바디는 IgG4 전체 항체와 비슷한 속도로 신체에서 소거되며, 전체 항체와 비슷한 이의 항원 친화성으로 결합할 수 있다. 유니바디에 대한 더욱 상세한 내용은 특허 WO2007/059782를 참조하여 확인할 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함된다.
LY75에 대한 DARPin의 제조
DARPin (설계된 앤키린 리피트 단백질 (Designed Ankyrin Repeat protein))은 비-항체 폴리펩타이드의 결합성을 조사하기 위해 개발된 항체 모방성 DRP (설계된 리피트(repeat) 단백질) 기법의 일 예이다. 앤키린 또는 루신-풍부 리피트 단백질 등의 리피트 단백질은 항체와는 달리 세포내 또는 세포외에서 발생하는, 편재하는 결합 분자이다. 이의 독특한 모듈러 구조는 반복되는 구조 유닛 (리피트)이 특징으로서, 유닛이 함께 쌓여 가변적이고 모듈식의 타겟-결합 표면을 나타내는 연장된 반복 도메인을 형성한다. 이의 모듈 방식을 토대로, 매우 다양화된 결합 특이성들을 가진 폴리펩타이드 콤비레이토리 라이브러리를 제조할 수 있다. 이런 전략은 가변적인 표면 잔기를 제시하는 자기-호환가능한 반복체 및 이의 반복 도메인으로의 랜덤 조합의 컨센서스 설계를 포함한다.
DARPin은 특히 높은 수율로 박테리아 발현 시스템에서 제조할 수 있으며, 이는 공지된 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 사이토카인, 키나제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질 등의, 매우 다양한 타겟 단백질에 대한 고도의 특이성과 고도의 친화성을 갖춘 DARPin을 선별한다. 한자리 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화성을 가진 DARPin을 수득할 수 있다.
DARPin은, ELISA, 샌드위치 ELISA, 유세포측정 분석 (FACS), 면역조직화학 (IHC), 칩 어플리케이션, 친화성 정제 또는 웨스턴 블롯팅 등의 매우 다양한 방법들에 사용되고 있다. 또한, DARPin은 세포내 구획에서, 예를 들어 그린 형광 단백질 (GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 활성이 높은 것으로 입증되었다. DARPin은 pM 범위의 IC50으로 바이러스 유입을 저해하는데에도 사용할 수 있다. DARPin은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는데 이상적일 뿐 아니라 효소를 저해하는데에도 이상적이다. 프로테아제, 키나제 및 수송자가 가장 빈번하게는 알로스테릭 저해 방식으로 성공적으로 저해되었다. 혈액 대비, 종양 및 매우 우호적인 종양에 대한 매우 신속하고 특이적인 농화 비율로 인해, DARPin은 생체내 진단 또는 치료 방법에 매우 적합하다.
DARPin 및 기타 DRP 기법에 대한 추가적인 정보는 미국 특허 공개공보 2004/0132028 및 국제 특허 출원 공개번호 WO02/20565에서 확인할 수 있으며, 이들 문헌 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
LY75에 대한 안티칼린의 제조
안티칼린은 추가적인 항체 모방 기법으로서, 이 경우 결합 특이성은 인간 조직 및 체액에서 천연적으로 다량 발현되는 저분자량 단백질 패밀리에 속하는 리포칼린으로부터 유래된다. 리포칼린은 화학적으로 민감하거나 또는 불용성의 화합물의 생리학적 수송 및 저장과 관련된 다양한 생체내 기능을 수행하도록 진화되었다. 리포칼린은, 단백질의 한쪽 말단에 4개의 루프를 지원하는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는, 견고한 고유 구조를 가진다. 이들 루프는 결합 포켓에 대한 유입부를 형성하며, 분자의 이 부분에서의 구조 차이는 개별 리포칼린들 간의 결합 특이성 차이의 요인이다.
보존된 β-시트 프래임워크에 의해 제공되는 과가변성 루프의 전체 구조는 면역글로불린을 연상시키지만, 리포칼린은 크기 측면에서 160-180개의 아미노산으로 된 단일 폴리펩타이드로 구성된다는 점에서 크기 측면에서 항체와 상당히 다른데, 단일 면역글로불린 도메인 보다 조금 더 크다.
리포칼린을 클로닝하고, 이의 루프를 조작하여 안티칼린을 제조한다. 구조적으로 다양한 안티칼린들로 구성된 라이브러리를 구축하며, 안티칼린 디스플레이로 결합 기능을 선별 및 스크리닝할 수 있으며, 이후 원핵 또는 진핵 생물의 시스템에서 추가로 분석하기 위한 가용성 단백질을 발현 및 제조한다. 실제 임의의 인간 타겟 단백질에 특이적인 안티칼린을 개발할 수 있으며; 이를 분리할 수 있으며, 나노몰 또는 더 높은 수준의 결합 친화성을 수득할 수 있다는 것이 실험들에서 성공적으로 입증되었다.
또한, 안티칼린은 듀얼 타겟팅 단백질, 소위 두오칼린으로 포맷화될 수 있다. 두오칼린은 표준 제조 방법을 이용하여 쉽게 제조되는 모노머 단백질 형태로 2종의 별개의 치료 타겟에 결합하면서, 이 2개의 결합 도메인들의 구조 배향성과 부관하게 타겟 특이성과 친화성을 보유한다.
단일 분자를 통해 복수의 타겟을 조절하는 것이 특히 2 이상의 요인으로 발생하는 것으로 공지된 질환들에서 특히 유용하다. 아울러, 두오칼린 등의 2가 또는 다가 결합 포멧은 질환에서 세포 표면 분자의 타겟팅, 신호 전달 경로에 대한 작용제 효능 매개, 또는 세포 표면 수용체의 결합 및 클러스터링을 통한 강화된 내재화 작용 유도에 유의한 잠재성을 가진다. 아울러, 두오칼린의 높은 고유한 안정성은 모노머 안티칼린과 유사하여, 두오칼린에 대한 유연한 제형화 및 전달 가능성을 제공해준다.
안티칼린에 대한 추가적인 정보는 미국 특허 7,250,297과 국제 특허 출원 공개번호 WO 99/16873에서 찾아 볼 수 있으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
LY75에 대한 아비머의 제조
아비머는 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이에 의해 결합 및 저해 특성을 가진 멀티도메인 단백질을 제조함으로써 인간 세포외 수용체 도메인의 거대 패밀리로부터 진화된 것이다. 독립적인 복수의 결합 도메인들을 연결하면 항원항체 결합력 (avidity)이 생성되고, 그 결과 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질과 비교해 개선된 친화성 및 특이성이 형성된다. 다른 잠재적인 이점은 에셰리키아 콜라이에서의 멀티타겟-특이적인 분자들의 간단하고도 효율적인 제조가 가능하며, 열 안정성이 개선되고, 프로테아제 내성을 가진다는 것이다. 나노몰 미만의 친화성을 가진 아비머는 다양한 타겟들에 대해 수득되고 있다.
아비머에 대한 추가적인 정보는 미국 특허 공개공보 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756에서 찾아볼 수 있으며, 이들 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
LY75에 대한 버사바디 (Versabody)의 제조
버사바디는 시스테인 함량이 >15%인 3-5 kDa의 소형 단백질로서, 전형적인 단백질이 가지는 소수성 코어 대신 이황화 결합율이 높은 스캐폴드를 형성하고 있다. 소수성 코어를 포함하는 다수의 소수성 아미노산들을 약간의 다이설파이드와 치환하면, MHC 제시에 가장 크게 기여하는 잔기가 소수성이기 때문에, 더 작고, 친수성이 강하고 (낮은 응집성 및 비-특이적인 결합성), 프로테아제와 열에 대한 내성이 더 높고, T 세포 에피토프를 보다 저밀도로 가지는, 단백질이 된다. 이러한 특성 4가지 모두 면역원성에 영향을 미치는 것으로 널리 알려져 있으며, 이것이 조합되면 면역원성을 크게 떨어드릴 것으로 예상된다.
버사바디에 대한 영감은, 예상하지 못한 낮은 면역원성을 발휘하는 것으로 공지된, 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이 및 말미잘에서 생산되는 천연의 주사가능한 생물약제에서 나온 것이다. 크기, 소수성, 단백질분해성 항원 가공 및 에피토프 밀도를 설계 및 스크리닝함으로써, 선별한 천연 단백질 패밀리를 출발 물질로 하여, 천연의 주사가능한 단백질의 평균 보다 매우 낮은 수준으로 최소화한 것이다.
버사바디의 구조를 감안하면, 이들 항체 모방체는 멀티-결합가 (multi-valency), 멀티-특이성, 반감기 기전의 다양성, 조직 타겟팅 모듈 및 항체 Fc 영역의 부제를 포함하는 다재다능한 포멧을 제공한다. 아울러, 버사바디는 E. coli에서 고수율로 제조되며, 이의 소수성 및 소형 크기로 인해 버사바디는 용해성이 높으며, 고농도로 제형화할 수 있다. 버사바디는 예외적으로 열 안정적이며 (이를 끓일 수 있음), 장기간의 유효 기간을 제공한다.
버사바디에 대한 추가적인 정보는 미국 특허 출원 공개공보 2007/0191272에서 찾아 볼 수 있으며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
친화성 반응물의 발현
항체 발현
본 발명의 항체는 항체 합성에 대한 당해 기술 분야에 공지된 임의 화합물에 의해, 특히 화학 합성 또는 재조합 발현에 의해 생산할 수 있으며, 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 제조된다.
항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체의 재조합 발현은, 항체를 코딩하는 핵산의 구축이 필요하다. 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있다면, 항체를 코딩하는 핵산은 화학 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립할 수 있으며 (예, Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), 간략하게는 항체 코딩 서열의 일부 영역을 포함하는 중첩성 올리고뉴클레오티드의 합성, 어닐링 및 이들 올리고뉴클레오티드의 연결과 이후 PCR에 의한 연결된 올리뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
다른 예로, 항체를 코딩하는 핵산은 항체 클로닝에 의해 수득할 수 있다. 만인 특정 항체를 코딩하는 핵산을 가진 클론이 이용가능하지 않지만 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 항체를 코딩하는 핵산은, 서열의 3' 말단 및 5' 말단에 혼성가능한 합성 프로이머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리뉴클레오티드 프로브를 이용한 클로닝에 의해, 적합한 소스 (예, 항체 cDNA 라이브러리 또는 항체를 발현하는 임의 조직 또는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브리러)로부터 입수할 수 있다.
특정 항원을 특이적으로 인지하는 항체 분자 (또는 이들 항체를 코딩하는 핵산을 클로닝하기 위한 cDNA 라이브러리 소스)가 이용가능하지 않다면, 특정 항원에 특이적인 항체는 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해, 예를 들어, 동물, 예컨대 토끼를 면역화함으로써 다클론 항체를 제조하거나, 또는 예를 들어, 단일클론 항체를 제조함으로써, 제조할 수 있다. 다른 예로, 적어도 항체의 Fab 영역을 코딩하는 클론은, 특이적인 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론에 대한 Fab 발현 라이브러리를 스크리닝하거나 (예, Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) 또는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 (예 Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937) 수득할 수 있다.
항체 분자의 적어도 가변성 도메인을 코딩하는 핵산이 일단 확보되면, 이는 항체 분자의 불변부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한 벡터로 도입할 수 있다 (예 PCT 공개공보 WO 86/05807; PCT 공개공보 WO 89/01036; 및 미국 특허 제 5,122,464). 완전한 항체 분자의 발현을 가능하게 하기 위해서는, 핵산과 공동-발현시키기 위한 완전한 경쇄 또는 중쇄를 함유한 벡터도 이용가능하다. 그런 후, 항체를 코딩하는 핵산을 사용하여, 체인내 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변부 시스테인 잔기를 설프하이딜 기를 함유하지 않는 아미노산 잔기로 치환 (또는 삭제)하는데 필수적인 뉴클레오티드 치환(들) 또는 결손(들)을 도입할 수 있다. 이러한 변형은 뉴클레오티드내 특이적인 변형 또는 결손을 도입하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해, 예를 들어 비제한적인 예로, 화학적 돌연변이 유발, 시험관내 부위 특이적인 돌연변이 유발 (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), PCR 기반의 방법 등에 의해 수행할 수 있다.
아울러, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자 유래 유전자를 적절한 생물 활성의 인간 항체 분자 유래 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"를 제조하기 위해 개발된 기법 (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)도 사용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 키메라 항체는 여러 부위들이 여러 동물 종으로부터 유래된 분자이며, 예를 들어, 뮤라인 mAb와 인간 항체 불변부, 예컨대 인간화된 항체로부터 유래된 가변부를 가진 분자이다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 핵산이 일단 확보되면, 항체 분자 제조용 벡터를, 당해 기술 분야에 널리 공지된 기법들을 이용하여 재조합 DNA 기법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 항체 분자 서열을 함유한 핵산 발현에 의해 LY75를 제조하는 방법은 본원에 기술된다. 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여, 항체 분자 코딩 서열과, 적절한 전사 및 번역 조절 신호들을 함유한 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 예를 들어, Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 및 Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)에 기술된 기법을 참조한다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에 형질전환하고, 형질전환된 세포는 이후 통상적인 기법으로 배양하여 본 발명의 항체를 생산한다.
본 발명의 재조합 항체 발현을 위해 사용되는 숙주 세포는 에셰리키아 콜라이 등의 박테리아 세포, 또는 특히 완전한 재조합 항체 분자를 발현하기 위해서는, 바람직하게는 진핵생물 세포일 수 있다. 특히, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO) 등의 포유류 세포는, 인간 사이토메갈로바이러스 유래의 주요 매개 초기 유전자 프로모터 인자 등의 벡터와 함께, 효율적인 항체 발현 시스템이다 (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은, 대상 코딩 서열을 생산할 수 있으며 이후 정제가능한 비히클이며, 또한, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염되었을 때 본 발명의 항체 분자를 인 시추 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 것으로는, 비제한적으로, 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예, E. coli, 바실러스 섭틸리스) 등의 미생물; 항체 코딩 서열을 함유한 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예, 사카로마이세스, 피키아); 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 베큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유한 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예, Ti 플라스미드) 또는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 칼리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 토바코 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈 유래 프로모터 (예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스 유래 프로모터 (예, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5 K 프로모터)를 함유한 재조합 발현 구조체를 보유한 포유류 발현 시스템 (예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함한다.
박테리아 시스템의 경우, 발현시키고자 의도된 항체 분자의 사용에 따라 다수의 발현 벡터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 항체 분자를 포함하는 약학 조성물을 제조하기 위해 단백질 다량 생산이 필요한 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물을 고 수준으로 발현시키는 벡터가 적합할 수 있다. 이러한 벡터로는, 비제한적인 예로, 항체 코딩 서열이 융합 단백질로 생산되도록 lac Z 코딩부와 인 프래임으로 벡터에 각각 연결된, E. coli 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791); pIN 벡터 (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); 등을 포함한다. pGEX 벡터를 또한 사용하여, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 통상적으로, 이러한 융합 단백질은 용해성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 흡착 및 결합시킨 후 유래형 글루타티온의 존재 하에 용리시킴으로써, 세포용혈된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEK 벡터는, 클로닝된 타겟 유전자 산물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록, 트롬빈 또는 팩터 Xa 프로테아제 절단부가 포함되게 설계한다.
곤충 시스템의 경우, 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자 발현용 벡터로서 사용된다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 생육한다. 바이러스의 비-필수 영역 (예, 폴리헤드린 유전자)에 항체 코딩 서열을 각각 클로닝하여, AcNPV 프로모터 (예, 폴리헤드린 프로모터)의 통제 하에 위치시킨다. 포유류 숙주 세포의 경우, 다수의 바이러스계 발현 시스템 (예, 아데노바이러스 발현 시스템)을 이용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 원하는 특정한 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙구 세포 균주가 선정될 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형 (예, 당화) 및 가공 (예, 절단)은 단백질 기능에 중요할 수 있다.
재조합 항체를 장기간, 고수율로 생산하기 위해서는, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들어, 대상 항체를 안정적으로 발현하는 세포주는, 세포를 항체의 뉴클레오티드 서열과 선별가능한 (예, 네오마이신 또는 히그로마이신) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염시킨 다음 선별 마커의 발현을 선별함으로써, 제조할 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 특히 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물을 스크리닝하고 평가하는데 유용할 수 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 (Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커의 증폭이 가능하다면, 숙주 세포 배양시 존재하는 저해제의 농도 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시키게 될 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 조합되어 있기 때문에, 항체 생산 역시 증가할 것이다 (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
숙주 세포를 본 발명의 발현 벡터 2종, 즉 중쇄 유래 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 벡터와 경쇄 유래 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 벡터로 공동-형질감염시킬 수 있다. 이들 2종의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 증가 발현을 구현할 수 있는 동일한 선별 마커를 포함할 수 있다. 다른 예로, 하나의 벡터에 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘다가 코딩된 것도 사용할 수 있다. 이 경우, 무독성 중쇄의 과잉을 피하기 위해, 중쇄 앞에 경쇄를 배치하여야 한다 (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열들은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합에 의해 발현되면, 항체 분자의 정제에 대한 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 예컨대 단백질 A 또는 특이 항원을 이용한 친화성 크로마토그래피, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적인 용해성 또는 단백질 정제에 대한 그외 임의의 표준적인 기법에 의해 정제할 수 있다.
다른 예로, 임의의 융합 단백질은 발현 중에 융합 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 쉽게 정제할 수 있다. 예를 들어, Janknecht et al에 기술된 시스템으로, 인간 세포주에서 발현된 비-변성 융합 단백질을 쉽게 정제할 수 있다 (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). 이 시스템에서, 대상 유전자는, 유전자의 오픈 리딩 프래임이 히스티딘 잔기 6개로 구성된 아미노-말단 테그에 번역시 융합되도록 백시니아 재조합 플라스미드로 서브클로닝된다. 상기 테그는 융합 단백질에 대한 캐트릭스 결합 도메인으로 사용된다. 재조합 백시니아 바이러스로 감염된 세포의 추출물을 Ni2+ 니트릴로아세트산-아가로스 컬럼에 주입하고, 히스티딘-테깅된 단백질을 이미다졸-함유 완충제로 선택적으로 용리시킨다.
이들 방법에 의해 제조된 항체는, 이후, 정제된 대상 폴리펩타이드를 이용한 친화성 및 특이성에 대해 1차 스크리닝하여, 필요에 따라서는 결합에서 제외되는 것이 바람직한 폴리펩타이드를 이용한 항체의 친화성 및 선택성 결과와 비교하여 선별할 수 있다. 스크리닝 공정은 마이크로타이터 플레이트 각 웰에 정제된 폴리펩타이드를 고정시키는 것을 포함할 수 있다. 그런 후, 가능성있는 항체 또는 항체의 그룹이 함유된 용액을 각 마이크로타이터 웰에 넣고, 약 30분에서 2시간 인큐베이션한다. 그런 다음, 마이크로타이터 웰을 헹구고, 표지된 2차 항체 (예, 제조된 항체가 마우스 항체인 경우, 알칼리 포스파타제가 접합된 항-마우스 항체)를 웰에 첨가하여 약 30분 인큐베이션한 다음 헹군다. 웰에 기질을 첨가하고, 고정시킨 폴리펩타이드(들)에 대한 항체가 존재하는 경우, 발색 반응이 일어날 것이다.
이렇게 동정된 항체는 이후 선택한 분석 설계에서 친화성 및 특이성에 대해추가로 분석할 수 있다. 타겟 단백질에 대한 면역분석법 개발에서, 정제된 타겟 단백질은 선별된 항체를 이용한 면역분석의 민감도와 특이성을 판단하는 표준 물질로 작용한다. 다양한 항체의 결합 친화성은 다양할 수 있기 때문에; 특정 항체 쌍 (예, 샌드위치 분석에서)은 서로 입체적으로 간섭할 수 있기 때문에 등으로 인해, 항체의 분석 성능은 항체의 절대 친화성 및 특이성 보다 더 중요한 척도일 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 수많은 방법들이 항체 또는 결합 단편의 제조와 다양한 폴리펩타이드의 친화성 및 특이성의 스크리닝 및 선별에 행해질 수 있지만, 이들 방식들이 본 발명의 범위를 바꾸지 않는다는 것을 알 것이다.
치료학적 용도의 경우, 항체 (특히 단일클론 항체)는 인간 또는 인간화된 동물 (예, 마우스) 항체가 적합할 수 있다. 동물 항체는 면역원으로서 인간 단백질 (예, LY75)을 이용하여 동물에서 만들 수 있다. 인간화는 전형적으로 이로써 동정한 CDR을 인간 프래임워크 영역으로 그래프팅하는 것을 포함한다. 통상적으로, 일부 이후 체인들의 구조 최적화를 위한 레트로돌연변이화가 필요하다. 이러한 공정은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다.
어피바디의 발현
어피바디의 구축은 어피바디 파지 디스플레이 라이브러리의 구축 (Nord, K., Nilsson, J., Nilsson, B., Uhlen, M. & Nygren, P.A, A combinatorial library of an a-helical bacterial receptor domain, 1995, Protein Eng. 8, 601-608. Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J., Stahl, S., Uhlen, M. & Nygren, P.A, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, 1997, Nat. Biotechnol.15, 772-777)을 비롯하여, 도처에 기술되어 있다 (Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655).
바이오센서 결합 실험을 이용하여 최적의 어피바디 변이체를 조사하기 위한 바이오센서 분석도 도처에 기술되어 있다 (Ronnmark J, Gronlund H, Uhlen, M., Nygren P.A, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, 2002, Eur. J. Biochem. 269, 2647-2655).
친화성 반응물의 변형
바람직한 구현예에서, 항체 또는 이의 단편과 같은 항-LY75 친화성 반응물에 진단 모이어티 (예, 검출가능한 표지) 또는 치료학적 모이어티을 접합시킬 수 있다. 항체는 진단을 위해 사용되거나 또는 소정의 치료 용법의 효능 측정에 사용될 수 있다. 검출은 항체에 검출가능한 기질 (표지물)을 결합시킴으로써 용이하게 수행할 수 있다. 검출가능한 기질의 예로는, 다양한 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속 (양전자 방출 토모그래피에 사용됨) 및 비-방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합시킬 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제 4,741,900을 참조한다. 적절한 효소로는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적절한 보결기로는 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하며; 적절한 형광 물질로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하며; 적절한 발광 물질로는 루미놀을 포함하며; 적절한 생발광 물질로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린을 포함하며; 적절한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다. 68Ga도 사용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 친화성 반응물, 예로, 본 발명에 사용하기 위한 항체에는, 치료학적 모이어티, 예로 세포독소, 약물 (예, 면역억제제) 또는 방사독소를 접합시킬 수 있다. 이들 접합체들은 본원에서 "면역접합체"라고 한다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 "면역독소"로 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성 물질은 세포에 유해한 (예, 사멸시키는) 모든 물질을 포함한다. 그 예로는 탁솔 (taxol), 사이토칼라신 (cytochalasin) B, 그라미시딘 (gramicidin) D, 에티듐 브로마이드, 에메틴 (emetine), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드, 테노포시드 (tenoposide), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 콜치신 (colchicin), 독소루비신, 다우노루비신 (daunorubicin), 다이하이드록시 안트라신 다이온, 미톡산트론 (mitoxantrone), 미트라마이신 (mithramycin), 액티노마이신 (actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인 (lidocaine), 프로프라놀롤 (propranolol), 푸로마이신 (puromycin) 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료학적 물질로는, 또한, 예를 들어, 항-대사산물제 (예, 메토트렉세이트), 6-머캅토푸린, 6- 티오구아닌, 시타라빈 (cytarabine), 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제 (예, 메클로르에타민 (mechlorethamine), 티오에파 클로람부실 (thioepa chlorambucil), 멜팔란 (melphalan), 카르무스틴 (carmustine) (BSNU) 및 로무스틴 (lomustine) (CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판 (busulfan), 다이브로모만니톨, 스트렙토조톡신 (streptozotocin), 미토마이신 (mitomycin) C, 및 cis-다이클로로다이아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴 (cisplatin)), 안트라사이클린 (anthracycline) (예, 다우노루비신 (daunorubicin) (기존의 다우노마이신 (daunomycin) 및 독소루비신), 항생제 (예, 닥티노마이신 (dactinomycin) (종래에는 액티노마이신), 블레오마이신 (bleomycin), 미트라마이신 (mithramycin), 및 안트라마이신 (anthramycin) (AMC)), 및 세포분열 저해제 (예, 빈크리스틴 (vincristine) 및 빈블라스틴 (vinblastine))를 포함한다.
본 발명에 항체에 접합시킬 수 있는 치료학적 세포독소에 대한 그외 바람직한 예로는, 두오카마이신 (duocarmycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 메이탄신 및 아우리스타틴 (auristatin)과 이들의 유도체를 포함한다. 칼리케아미신 (calicheamicin) 항체 접합체가 일예로 시판 중이다 (Mylotarg®; American Home Products).
세포독소는 당해 기술 분야에 이용가능한 링커 기법을 이용하여 본 발명의 항체에 접합할 수 있다. 항체에 세포독소를 접합하는데 사용되고 있는 링커 타입의 예로는, 비제한적으로, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 다이설파이드 및 펩타이드-함유 링커를 포함한다. 링커, 예를 들어, 리소좀 구획내에서의 낮은 pH에 의한 절단에 취약하거나, 또는 프로테아제, 예컨대 카텝신 (예, 카텝신 B, C, D) 등의 종양 조직에서 선호적으로 발현되는 프로테아제에 의한 절단에 취약한 링커를 선택할 수 있다.
세포독소의 예는, 예를 들어 미국 특허 6,989,452, 7,087,600 및 7,129,261, PCT 출원번호 PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711, WO2006/110476, 및 미국 특허 출원번호 60/891,028에 기술되어 있으며, 이들 모두 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 치료학적 물질을 항체에 접합하기 위한 세포독소, 링커 및 방법에 대한 추가적인 설명에 대해서는, Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264를 참조한다.
친화성 반응물은 또한 세포독성의 방사성약제를 제조하기 위해, 방사성 동위원소에 접합시킬 수 있으며, 이는 방사성면역접합체로도 지칭된다. 진단적으로 또는 치료학적으로 사용하기 위해 항체에 접합시킬 수 있는 방사성 동위원소로는, 비제한적으로, 요오드131, 인듐111, 이트륨90 및 루테튬177을 포함한다. 방사성면역접합체의 제조 방법은 당해 기술 분야에 확립되어 있다. 방사성면역접합체의 예는 Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) 및 Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals) 등의, 상업적으로 구입가능하며, 유사한 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 이용한 방사성면역접합체를 제조할 수 있다.
친화성 반응물은 또한 프탈로시아닌 염료와 접합시킬 수 있으며, 이하 프탈로시아닌접합체로 지칭된다. 진단적으로 또는 치료학적으로 사용하기 위해 항체에 접합시킬 수 있는 프탈로시아닌 염료로는, 비제한적으로, IR700을 포함한다. 프탈로시아닌접합체의 제조 방법은, 예를 들어 Mitsunaga M, Ogawa M, Kosaka N, Rosenblum LT, Choyke PL and Kobayashi H (2011) Nat Med. 2011 Nov 6. doi: 10.1038/nm.2554에 기술되어 있다.
접합체를 이용하여 소정의 생물 반응을 변형시킬 수 있으며, 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료 물질로 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물 활성을 가진 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 효소 활성 독소 또는 이의 활성 단편, 예로, 아브린 (abrin), 리신 A (ricin A), 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ 등의 단백질; 또는 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 그외 성장인자 등의 단백질을 포함할 수 있다. Senter P.D. (2009) Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244; Kovtun et al. (2010) Cancer Res. 70(6):2528-2537.
이들 치료학적 모이어티를 항체에 접합하는 기법들은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy" in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review" in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabelled Antibody In Cancer Therapy" in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)을 참조한다.
다른 구현예로, 항체는 미국 특허 제 4,676,980에서 Segal에 의해 기술된 바와 같이 항체 이종접합체 (heteroconjugate)를 형성하기 위해 항체를 제2 항체와 접합시킬 수 있다.
치료학적 모이어티가 접합되거나 접합되지 않은 항체는, 단독으로 또는 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토카인(들)과 조합하여, 투여되는 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 친화성 반응물 (예, 항체, 또는 이의 항원-결합 영역 또는 항체 모방체)은 종양 항원, 알레르겐, 자가-항원 또는 바이러스 항원을 함유 또는 포함하지 않거나, 또는 이와 접합되지 않는다. 일부 구체적인 구현예들에서, 친화성 반응물 (예, 항체, 또는 이의 항원-결합 영역 또는 항체 모방체)는 종양 항원을 함유 또는 포함하지 않거나, 또는 이와 접합되지 않는다.
또한, 본 발명은 항체-특이적인 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 야기하는 완전한 인간 항체 또는 인간화된 항체를 제공한다. 완전한 인간 항체는, 단백질 서열인 천연 인간 면역글로불린 서열에 의해 코딩되는, 분리된 항체-생산 인간 B 림프구 유래의 항체, 또는 뮤라인 면역글로불린 코딩 염색체 영역이 이종상동성 인간 서열로 치환된 마우스의 형질전환 뮤라인 B-림프구로부터 유래된 항체이다. 후자의 형질전환 항체는, 비제한적인 예로, HuMab (Medarex, Inc, CA) 및 XenoMouse (Abgenix Inc., CA)를 포함한다. 인간화된 항체는, 적절한 항원 특이성을 가진 비-인간 항체 분자의 불변부가, 인간 항체의 불변부, 바람직하게는 IgG 서브타입의 불변부로 치환되며, 적절한 작동자 기능을 가진, 항체이다 (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454). 적절한 작동자 기능으로는, 암 세포의 표면 상의 타겟에 결합하였을 때, 완전-인간 항체 또는 인간화된 항체가 정상적인 면역계의 일부분인 림프구의 세포 사멸 특성을 가동시키는 천연 공정인, ADCC를 포함한다. 자연 살상 (NK) 세포로 불리는 이들 활성 림프구는 항체가 결합된 살아있는 세포를 파괴하는 세포 독성 공정을 사용한다. ADCC 활성은, 면역력이 있는 (immunocompetent) 살아있는 인간 개체로부터 추출된 말초혈 단핵구 세포 및 항원-특이 항체의 존재 하에 Eu3+ 표지된 살아있는 세포로부터의 유로퓸 (Eu3+)의 방출을 측정함으로써, 검출 및 정량할 수 있다. ADCC 공정은 Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68 및 Weng, W.-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947에 상세히 기술되어 있다. ADCC를 검출 및 정량하는 적합한 방법들은 Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 86:p225-9; Blomberg et al., Journal of Immunological Methods. 1986, 21;92:p117-23 및 Patel & Boyd, Journal of Immunological Methods. 1995, 184:p29-38에서 찾아 볼 수 있다.
ADCC는 전형적으로 NK 세포의 활성화를 수반하며, NK 세포의 표면 상의 Fc 수용체에 의한 항체-코팅된 세포의 인지에 의존한다. Fc 수용체는 타겟 세포의 표면에 특이적으로 결합된 IgG 등의 항체의 Fc (결정) 영역을 인지한다. NK 세포의 활성화를 촉발시키는 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγRIIIa로 지칭된다. 일단 FcγRIIIa 수용체가 IgG Fc에 결합되면, NK 세포는 IFN-γ 등의 사이토카인과, 타겟 세포에 도입하여 세포자살 촉발에 의해 세포 사멸을 촉매하는 퍼포린 (perforin) 및 그란자임 (granzyme)을 함유한 세포독성 과립제를 분비한다.
항체에 의한 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)의 유도는 항체 불변부 (Fc)와 면역계의 세포 표면 상에 존재하는 다양한 수용체 간의 상호작용을 변형시키는 변형에 의해 강화할 수 있다. 이러한 변형으로는 포유류 세포에서 천연 또는 재조합 합성시 항체의 Fc에 정상적으로 부가되는 복잡한 올리고당 체인내 알파1,6-연결된 푸코스 모이어티의 감소 또는 부재를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 비-푸코시화된 항-LY75 친화성 반응물, 예컨대 항체 또는 이의 단편을 ADCC 반응을 유도하는 능력을 강화하기 위한 목적으로 제조한다.
Fc의 올리고당 체인내 알파 1,6-연결된 푸코스 모이어티를 줄이거나 또는 제거하기 위한 기법은 잘 확립되어 있다. 일 예로, 재조합 항체는, N-연결된 바이안테나형 복합체-타입의 Fc 올리고당의 가장 안쪽 N-아세틸글루코스 아민에 알파 1,6 연결로 푸코스를 부가하는 능력이 손상된 세포주에서 합성한다. 이러한 세포주로로는, 비제한적으로, 알파 1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT8을 감소된 수준으로 발현하는 랫 하이브리도마 YB2/0을 포함한다. 바람직하게는, 항체는, FUT8 유전자의 양쪽 카피 결손으로 인해 알파 1,6-연결된 푸코실 모이어티를 복잡체 타입의 올리고당 체인에 부가할 수 없는 세포주에서 합성한다. 이러한 세포로는, 비제한적으로, FUT8-/- CHO/DG44 세포주를 포함한다. 일부 푸코시화된 또는 비-푸코시화된 항체 및 친화성 반응물의 합성 기법은 Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-4735 (2003); Yamane-Ohnuki et al., Biotechnology and Bioengineering 87: 614-22 (2004) 및 WO00/61739 A1, WO02/31140 A1 및 WO03/085107 A1에 기술되어 있다. 두번째 예로, 재조합 항체의 푸코시화를, 바이섹팅 (bisecting) N-아세틸글루코사민을 보유한 복잡한 N-연결된 올리고당의 생산을 최대화하는 수준으로 당단백질-변형성 글리코실 트랜스퍼라제를 과다 발현하도록, 유전자 조작된 세포주에서의 합성에 의해, 감소시키거나 또는 없앤다. 예를 들어, 항체는 효소 N-아세틸 글루코사민 트랜스퍼라제 III (GnT III)를 발현하는 중국 햄스터 난소 세포주에서 합성한다. 적합한 당단백질-변형성 글리코실 트랜스퍼라제로 안정적으로 형질감염된 세포주와 이 세포를 이용한 항체 합성 방법은 WO99/54342에 기술되어 있다.
비-푸코시화된 항체 또는 친화성 반응물은 단독으로 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토카인(들)과 조합하여 투여용 치료제로서 사용할 수 있다.
추가적인 변형에서, 항체 Fc의 아미노산 서열은 ADCC 활성화를 리간드 친화성에 영향을 주지 않으면서 강화하는 방식으로 변형시킨다. 이러한 변형의 예는 Lazar et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 2006, 103: p4005-4010; WO03/074679 및 WO2007/039818에 기술되어 있다. 이들 예에서, 항체 Fc에서 아미노산 치환, 예를 들어 239번 위치의 세린의 아스파르테이트로, 332번 위치의 글루타메이트의 이소루신으로의 변형은, Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화성을 변형시켜, ADCC 활성화 증가를 야기한다.
아미노산 치환으로 ADCC 활성화가 강화된 항체 반응물은 단독으로 또는 세포독성 인자(들) 및/또는 사이토카인(들)과 조합되는 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 친화성 반응물 (예, 항체, 또는 이의 항원-결합 영역 또는 항체 모방체)은 scFV가 아니다. 본 발명의 일부 특정 구현예에서, 친화성 반응물 (예, 항체, 또는 이의 항원-결합 영역 또는 항체 모방체)은 피부암 또는 흑색종의 치료에 있어 scFV가 아니다.
본 발명의 질환을 비롯한 암의 진단
본 발명의 다른 측면에서, LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재 또는 수준을 검출하는 단계 또는 개체에서 그 수준의 변화를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서, 암, 예컨대 본 발명의 질환을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하거나 진행을 모니터링하거나, 또는 본 발명의 질환에 대한 예컨대 항암제 또는 요법의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 다른 측면에서, 개체에서, LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 암, 예컨대 본 발명의 질환을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하는 방법을 제공하며, 여기서 (a) 상기 개체에서, 건강한 개체에서의 수준과 비교하여, LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 수준 증가의 존재, 또는 (b) 상기 개체에서, 건강한 개체에서의 검출불가한 수준과 비교하여, LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 검출가능한 수준의 존재는 상기 개체에 상기 암이 존재함을 의미하는 것이다.
암, 예컨대 본 발명의 질환의 검출, 진단 및/또는 스크리닝하는 일 특정 방법은,
테스트할 생물 샘플에 LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편을 접촉시키는 단계; 및
LY75, 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 개체에서 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 제1 시간대와 이후 시간대에 LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 제1 시간대에 개체에서의 수준과 비교하여 상기 이후 시간대에 상기 개체에서 LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 수준 증가 또는 감소의 존재는 상기 암의 진행 또는 퇴행을 의미하는 것이거나 또는 상기 개체에서 항암제 또는 요법의 효능 또는 무-효능을 의미하는 것인, 암, 예컨대 본 발명의 질환의 진행을 모니터링하는 방법 또는 개체에서 본 발명의 질환에 대한 예컨대 항암제 또는 치료의 효능을 모니터링하는 방법을 포함한다.
LY75 또는 이의 하나 이상의 에피토프-함유 단편에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체의 존재는 전형적으로 상기 개체로부터 수득한 생물 샘플 (예시적인 생물 샘플은 상기에 언급되어 있으며, 예로, 샘플은 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직 등, 또는 혈액 또는 타액 샘플)의 분석에 의해 검출한다. 본 방법은, 전형적으로 상기 개체로부터 분석용 생물 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 검출될 수 있는 항체로는 IgA, IgM 및 IgG 항체를 포함한다.
본 발명에서, 본 발명의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 또는 질환을 가지고 있는 것으로 공지된 개체로부터 수득되는 예컨대 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 및 피부 조직, 혈청, 혈장 또는 뇨 테스트 샘플은 진단 또는 모니터링에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 대조군 샘플 (본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체들 또는 개체 유래 샘플) 또는 기존에 결정된 기준 범위에 비해, 테스트 샘플에서의 LY75의 함유량 변화는 본 발명의 질환의 존재를 나타내는 것이다. 다른 구현예에서, 대조군 샘플 또는 기존에 결정된 기준 범위 대비 테스트 샘플에서의 LY75의 상대적인 존재량 증가는, 본 발명의 질환의 서브타입 (예, 미만성 거대 B 세포 림프종, B 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 소포 림프종, 멘틀 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 (MALT)의 림프종, T 세포/조직구-풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프구형질세포성 림프종, 소형 림프성 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종; 역형성 갑상선암; 이행상피암 (transitional cell carcinoma); 염증성 유방암; 편평 세포 식도암; 위 선암종; 편평 세포 두경부암 또는 편평 세포 피부암, 흑색종)을 의미하는 것이다. 또 다른 구현예에서, 대조군 샘플 또는 기존에 결정된 기준 범위 대비 테스트 샘플에서의 LY75의 상대적인 함량 증가는, 본 발명의 질환의 정도 또는 중증도 (예, 전이 가능성)를 의미한다. 전술한 임의 방법에서, LY75의 검출은 선택적으로 본 발명의 질환에 대한 하나 이상의 부가적인 바이오마커의 검출과 조합될 수 있다. 당해 기술 분야의 임의의 적합한 방법을 사용하여, 비제한적인 예로, 본원에 기술된 바람직한 기법들, 키나제 분석, LY75를 검출 및/또는 가시화하기 위한 면역분석 (예, 웨스턴 블롯, 면역침강 후 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 면역세포화학법 등)을 사용하여 LY75의 수준을 측정할 수 있다. 다른 구현예에서, 대조군 샘플 또는 기존에 결정된 기준 범위 대비 테스트 샘플에서의 LY75를 코딩하는 mRNA의 농도 변화는 본 발명의 질환의 존재를 의미한다. LY75를 코딩하는 mRNA를 검출 및/또는 가시화함으로써 LY75 발현을 검출하는데 임의의 적합한 혼성화 분석이 사용될 수 있다 (예, 노던 분석, 도트 블롯, 인시추 혼성화 등).
본 발명의 다른 구현예에서, LY75에 특이적으로 결합하는, 표지된 항체 (또는 그외 친화성 반응물), 그의 유도체 및 유사체는, 본 발명의 질환을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위해 진단 목적으로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 질환은 동물, 더 바람직하게는 포유류에서, 가장 바람직하게는 인간에서 검출한다.
스크리닝 분석
본 발명은 LY75에 결합하거나 또는 LY75의 발현 또는 활성에 자극 또는 저해 효과를 가진, 물질 (예, 후보 화합물 또는 시험 화합물)을 동정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, LY75 관련 폴리펩타이드 또는 LY75 융합 단백질에 결합하거나, 또는 LY75 관련 폴리펩타이드 또는 LY75 융합 단백질의 발현 또는 활성에 자극 또는 저해 효과를 가지는, 물질, 후보 화합물 또는 시험 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 물질, 후보 화합물 또는 시험 화합물의 예로는, 비제한적으로, 핵산 (예, DNA 및 RNA), 탄수화물, 지질, 단백질, 펩타이드, 펩타이드 모방체, 소형 분자 및 그외 약물을 포함한다. 물질은 생물 라이브러리; 공간적으로 어드레스가능한 병렬 고상 또는 액상 라이브러리; 데콘볼루션이 필요한 합성 라이브러리 방법; "원-비드 원-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선별을 이용한 합성 라이브러리 방법 등의 당해 기술 분야에 공지된 콤비네이토리 라이브러리 방법에서 수많은 방식 중 임의의 방식을 이용하여 수득할 수 있다. 생물 라이브러리 방식은 펩타이드 라이브러리로 한정되지만, 다른 4가지 방식은 펩타이드, 비-펩타이드성 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 적용가능하다 (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145; 미국 특허 제 5,738,996; 미국 특허 제 5,807,683, 각각이 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨).
분자 라이브러리 합성 방법의 예는 당해 기술 분야, 예를 들어 DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233에서 찾아볼 수 있으며, 그 각각이 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
화합물의 라이브러리들은, 제시될 수 있으며, 예컨대 용액 중에 (예, Houghten, 1992, BioTechniques 13:412-421), 또는 비드 (Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩 (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 (미국 특허 제 5,223,409), 포자 (특허 번호 5,571,698; 5,403,484; 5,223,409), 플라스미드 (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869) 또는 파지 (Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310)에 제시될 수 있으며, 상기 문헌 각각은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, LY75, LY75 단편 (예, 기능적인 활성 단편 또는 항원-결합 영역), LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용 (즉, 이에 결합)하는 물질은 세포성 분석 시스템으로 동정한다. 이러한 구현예에 따라, LY75, LY75의 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편 또는 LY75 융합 단백질을 발현하는 세포는, 후보 화합물 또는 대조군 화합물과 접촉시키고, 후보 화합물의 LY75과의 상호작용력을 측정한다. 필요에 따라서는, 이 분석을 사용하여 후보 화합물을 복수 (예, 라이브러리)로 스크리닝할 수 있다. 세포는, 예를 들어 원핵 오리진 (예, E. coli) 또는 진핵생물 오리진 (예, 효모 또는 포유류)일 수 있다. 나아가, 세포는 LY75, LY75의 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질을 내인적으로 발현하거나, 또는 LY75 관련 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 특정 경우에, LY75와 후보 화합물 간의 상호작용 검출할 수 있도록, LY75, LY75의 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질 또는 후보 화합물은, 예를 들어 방사성 표지물질 (예, 32P, 35S 및 125I) 또는 형광 표지물질 (예, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다아민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 또는 플루오레사민)으로 표지된다. LY75, LY75의 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질에 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 후보 화합물의 능력은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 후보 화합물과, LY75, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질 간의 상호작용은 유세포 측정, 신틸레이션 분석, 면역침강 또는 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정할 수 있다.
다른 구현예에서, LY75, LY75 단편 (예, 기능적인 활성 단편 또는 항원-결합 영역), LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용 (즉, 이에 결합)하는 물질은, 무세포성 분석 시스템으로 동정한다. 이러한 구현예에 따라, 천연 또는 재조합 LY75 또는 이의 단편, 또는 천연 또는 재조합 LY75-관련 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 또는 LY75-융합 단백질 또는 이의 단편을 후보 화합물 또는 대조군 화합물과 접촉시키고, LY75 또는 LY75-관련 폴리펩타이드, 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용하는 후보 화합물의 능력을 결정한다. 필요에 따라서는, 본 분석을 이용하여, 후보 화합물을 복수로 (예, 라이브러리) 스크리닝할 수 있다. 바람직하게는, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편 또는 LY75-융합 단백질을, 이를 특이적으로 인지하여 결합하는 고정된 항체 (또는 그외 친화성 반응물)과 접촉시키거나, 또는 LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질의 정제된 조제물을 단백질에 결합하도록 설계된 표면과 접촉시킴으로써, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질을 먼저 고정시킨다. LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편 또는 LY75 융합 단백질은 일부 또는 완전히 정제 (예, 일부 또는 완전히 다른 폴리펩타이드가 없음)되거나 또는 세포용혈물의 일부일 수 있다. 나아가, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 단편은 LY75 또는 이의 생물 활성 영역 또는 LY75-관련 폴리펩타이드와 글루타티오닌-S-트랜스퍼라제 등의 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 다른 예로, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편 또는 LY75 융합 단백질은 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 기법을 이용하여 바이오틴화할 수 있다 (예, 바이오틴화 키트, Pierce Chemicals; Rockford, IL). LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용하는 후보 화합물의 능력은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 측정할 수 있다.
다른 구현예에서, 세포성 분석 시스템을 이용하여, LY75의 생산 또는 분해에 관여하거나 또는 LY75의 번역 후 수정에 관여하는, 단백질, 예컨대 효소 또는 이의 생물 활성 영역에 결합하거나 또는 활성을 조절하는 물질을 동정한다. 일차 스크린에서, 복수 (예, 라이브러리)의 화합물을, (i) LY75, LY75 이소형, LY75 상동체, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 융합 단백질 또는 이들의 임의의 것의 생물 활성 단편; 및 (ii) LY75, LY75 이소형, LY75 상동체, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 융합 단백질 또는 단편의 가공에 관여하는 단백질을 천연적으로 또는 재조합에 의해 발현하는 세포와 접촉시켜, LY75 이소형, LY75 상동체, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 융합 단백질 또는 단편의 생산, 분해 또는 번역후 수정을 조절하는 화합물을 동정한다. 필요에 따라서는, 1차 스크린에서 동정된 화합물을 LY75를 천연적으로 또는 재조합에 의해 발현하는 세포에 대해 2차 스크린으로 분석할 수 있다. 후보 화합물이 LY75, 이소형, 상동체, LY75-관련 폴리펩타이드, 또는 LY75 융합 단백질의 생산, 분해 또는 번역 후 수정을 조절하는 능력은, 비제한적인 예로, 유세포 측정, 신틸레이션 분석, 면역침강 및 웨스턴 블롯 분석 등의 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 측정할 수 있다.
다른 구현예에서, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질과 경쟁적으로 상호작용 (즉, 결합)하는 물질은 경쟁적인 결합 분석으로 동정한다. 이러한 구현예에 따라, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질을 발현하는 세포를, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용하는 것으로 공지된 화합물 및 후보 화합물과 접촉시키고; LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질과 선호적으로 상호작용하는 후보 화합물의 능력을 결정한다. 다른 예로, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 단편에 선호적으로 상호작용 (즉, 결합)하는 물질은, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질을, LY75, LY75 관련 폴리펩타이드 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용하는 것으로 공지된 화합물 및 후보 화합물과 접촉시킴으로써, 무세포성 분석 시스템에서 동정한다. 전술한 바와 같이, LY75, LY75 단편, LY75 관련 폴리펩타이드, LY75 관련 폴리펩타이드의 단편, 또는 LY75 융합 단백질과 상호작용하는 후보 화합물의 능력은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 이러한 세포성 또는 무-세포성 분석법을 사용하여 후보 화합물들을 복수로 (예, 라이브러리) 스크리닝할 수 있다.
다른 구현예에서, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 발현 또는 활성을 조절 (즉, 상향 조절 또는 하향 조절)하는 물질은, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드를 발현하는 세포 (예, 원핵 오리진 또는 진핵 오리진의 세포)를 후보 화합물 또는 대조군 화합물 (예, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS))과 접촉시키고, LY75, LY75-관련 폴리펩타이드, 또는 LY75 융합 단백질, LY75를 코딩하는 mRNA 또는 LY75-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA의 발현을 측정함으로써, 동정한다. LY75, LY75-관련 폴리펩타이드, LY75를 코딩하는 mRNA 또는 LY75-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA의 후보 화합물의 존재 하의 수준을, 후보 화합물의 부재 시의 (예, 대조군 화합물의 존재 하의) LY75, LY75-관련 폴리펩타이드, LY75를 코딩하는 mRNA 또는 LY75-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 mRNA의 발현 수준과 비교한다. 그런 후, 후보 화합물은 LY75 또는 LY75-관련 폴리펩타이드 발현의 모듈레이터로서 상기한 비교를 토대로 동정할 수 있다. 예를 들어, LY75 또는 mRNA의 발현이 이의 부재시 보다 후보 화합물의 존재 하에 현저하게 높다면, 후보 화합물은 LY75 또는 mRNA의 발현의 자극인자로서 동정된다. 다른 예로, LY75 또는 mRNA의 발현이 후보 화합물의 부재 시 보다 존재시 현저하게 낮다면, 후보 화합물은 LY75 또는 mRNA의 발현의 저해제로서 동정된다. LY75 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현 수준은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, mRNA 발현은 노던 블롯 분석 또는 RRT-PCR에 의해 분석할 수 있으며, 단백질 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 분석할 수 있다.
다른 구현예에서, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 활성을 조절하는 물질은, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드를 함유한 조제물 또는 LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드를 발현하는 세포 (예, 원핵 또는 진핵생물의 세포)를 시험 화합물 또는 대조군 화합물과 접촉시키고, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 활성을 조절 (예, 자극 또는 저해)하는 시험 화합물의 능력을 측정함으로써 동정한다. LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 활성은 LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 세포내 신호 전달경로의 유발(예, 세포내 Ca2+, 다이아실글리세롤, IP3, 등)을 검출하거나, 적정 기질에 대한 타겟의 촉매적 또는 효소적 활성을 검출하거나, 리포터 유전자 (예, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드에 반응하며, 검출 마커, 예컨대 루시퍼라제를 코딩하는 핵산에 조절가능하게 연결된 조절 인자)의 유도를 검출하거나, 또는 세포 반응, 예를 들어 세포 분화 또는 세포 증식을 검출함으로써 평가할 수 있다. 본 발명의 내용을 기초로, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법들이 이들 활성 측정에 사용될 수 있다 (예 미국 특허 제 5,401,639, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 이후, 후보 화합물은, 후보 화합물의 효능을 대조군 화합물과 비교함으로써 LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 활성의 모듈레이터로서 동정할 수 있다. 적합한 대조군 화합물로는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)와 정상 염수 (normal saline (NS))를 포함한다.
다른 구현예에서, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드의 발현, 활성 또는 둘다를 조절 (즉, 상향 조절 또는 하향 조절)하는 물질은 동물 모델에서 동정한다. 적합한 동물의 예로는, 비제한적으로, 마우스, 랫, 토끼, 원숭이, 기니아피그, 개 및 고양이를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 동물은 본 발명의 질환 모델이다 (예, SCID 마우스에서 림프종 세포주 DoHH2 또는 WSU-FSCCL의 이종이식체, Smith MR, Joshi I, Jin F, Obasaju C., BMC Cancer. 2005 Aug 18;5:103; 갑상선암 세포주, 예로 ARO의 이종이식체, Viaggi et al., Thyroid 2003 Jun;13(6):529-36; 방광암 세포주, 예로 UCRU-BL-12, UCRU-BL-13 및 UCRU-BL-14의 이종이식체, Russell et al. Cancer Res. 1986 Apr;46(4 Pt 2):2035-40; 누드 또는 SCID 마우스에서의 유방암 세포주, 예로 MCF-7 (Ozzello L, Sordat M., Eur J Cancer. 1980;16:553-559) 및 MCF10AT (Miller et al., J Natl Cancer Inst. 1993;85:1725-1732)의 이종이식체; 식도암 세포주, 예로 OE19의 이종이식체, Kelly et al., Br J Cancer. 2010 Jul 13;103(2):232-8; 누드 마우스에서 위암 세포주, 예로 NCI-N87의 이종이식체; 두경부암 세포주, 예로 FaDu 및 HNX-OE의 이종이식체, 또는 누드 마우스에서 피부암 세포주, 예로 MV3의 이종이식체, van Muijen et al., Int J Cancer 1991 Apr 22;48(1):85-91). 이들 모델에서 나타나는 병인은 예를 들어 본 발명의 질환의 병인과 유사하므로, 이들 모델이 LY75 수준을 조절하는 시험 화합물에 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물은 적정 동물에게 투여 (예, 경구, 직장 또는 비경구, 예컨대 복막내 또는 정맥내로 투여)되며, LY75 또는 LY75-관련 폴리펩타이드의 발현, 활성 또는 이 둘다에 대한 효능을 측정한다. LY75 또는 LY75-관련 폴리펩타이드의 발현 변화는 전술한 방법으로 평가할 수 있다.
또 다른 구현예에서, LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드는 2-하이브리드 분석 또는 3 하이브리드 분석에서 "바이트 단백질"로 사용하여, LY75 또는 LY75-관련 폴리펩타이드에 결합하거나 이와 상호작용하는 다른 단백질을 동정한다 (예, 미국 특허 제 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) BioTechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; PCT 공개번호 WO 94/10300). 당해 기술 분야의 당업자에게 인지되는 바와 같이, 이러한 결합 단백질은 LY75에 의한 신호 증폭에, 예를 들어 LY75가 참여하는 신호전달 경로의 상류 하류 인자에 관여할 가능성이 있다.
본 발명은 본원에 기술된 치료를 위한 전술한 스크리닝 분석 및 이의 사용을 통해 동정되는 새로운 물질을 추가로 제공한다. 아울러, 본 발명은 본 발명의 질환 치료용 약제의 제조에 있어, LY75의 활성을 조절하거나 이와 상호작용하는 물질의 용도를 제공한다.
LY75의 치료학적 용도
본 발명은 치료 화합물의 투여에 의한 다양한 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 제공한다. 이러한 화합물로는, 비제한적으로, LY75, LY75 유사체, LY75-관련 폴리펩타이드 및 이의 유도체와 변형체 (단편 포함); 이들에 대한 항체 (또는 그외 친화성 반응물); LY75, LY75 유사체, LY75-관련 폴리펩타이드 및 이의 단편을 코딩하는 핵산; LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 핵산; 및 LY75 또는 LY75 관련 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자의 모듈레이터 (예, 작용제 및 길항제)를 포함한다. 본 발명의 중요한 특성은 본 발명의 질환 등의 암에 관여하는 LY75를 코딩하는 유전자들을 동정하는 것이다. 본 발명의 질환은, 예를 들어, 본 발명의 질환에 걸린 개체의 혈청 또는 조직내에서 LY75의 기능 또는 발현을 감소시키는 치료학적 화합물을 투여함으로써, 치료 (예, 증상 완화 또는 발병 또는 진행 지연) 또는 예방할 수 있다.
일 구현예에서, LY75에 각각 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 (또는 그외 친화성 반응물)는 단독으로 또는 하나 이상의 부가적인 치료학적 화합물 또는 치료제와 조합하여 투여한다.
항체 (또는 그외 친화성 반응물) 등의 생물 산물은 이를 투여한 개체에게는 동종이계이다. 일 구현예에서, 인간 LY75 또는 인간 LY75-관련 폴리펩타이드, 인간 LY75 또는 인간 LY75-관련 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 인간 LY75 또는 인간 LY75-관련 폴리펩타이드에 대한 항체 (또는 그외 친화성 반응물)를 치료 (예, 증상 완화 또는 발병 또는 진행의 지연) 또는 예방을 위해 인간 개체에게 투여한다.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, LY75에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 그외 친화성 반응물)의 치료학적 활성은 항체 의존적인 세포-매개성 세포독성 (ADCC)의 현상을 통해 달성될 수 있는 것으로 확신한다 (예, Janeway Jr. C.A. et al., Immunobiology, 5th ed., 2001, Garland Publishing, ISBN 0-8153-3642-X; Pier G.B. et al., Immunology, Infection, and Immunity, 2004, p246-5; Albanell J. et al., Advances in Experimental Medicine and Biology, 2003, 532:p2153-68 및 Weng, W-K. et al., Journal of Clinical Oncology, 2003, 21:p 3940-3947).
본 발명의 질환의 치료 및 예방
본 발명의 질환은, 예를 들어, 본 발명의 하나 이상의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 공지된 개체, 또는 본 발명의 하나 이상의 질환 발병 위험성이 있는 개체에게, 본 발명의 질환에 걸리지 않은 개체의 혈청 또는 조직과 비교해 본 발명의 하나 이상의 질환에 걸린 개체의 혈청 또는 조직에 차별적으로 존재하는 LY75의 수준 또는 활성 (즉, 기능)을 조절 (즉, 증가 또는 감소시키는)하는 화합물을 투여함으로써, 치료 또는 예방한다. 일 구현예에서, 본 발명의 질환은 본 발명의 하나 이상의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 공지된 개체, 또는 본 발명의 하나 이상의 질환 발병 위험성이 있는 개체에게, 본 발명의 하나 이상의 질환에 걸린 개체의 혈청 또는 조직에서 증가되는 LY75의 수준 또는 활성 (즉, 기능)을 상향 조절 (즉, 낮추는)하는 화합물을 투여함으로써, 치료 또는 예방한다. 이러한 화합물의 예로는, 비제한적으로, LY75 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, LY75에 대한 항체 (또는 그외 친화성 반응물) 및 LY75의 효소 활성을 저해하는 화합물을 포함한다. 그외 사용가능한 화합물, 예컨대 LY75 길항제 및 소형 분자 LY75 길항제는 시험관내 분석을 이용하여 동정할 수 있다.
또한, 암, 예컨대 본 발명의 질환은 상기한 암에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 공지된 개체, 또는 상기한 암의 발병 위험성이 있는 개체에게, 상기 암을 가진 개체의 혈청 또는 조직에서 증가된 LY75의 수준 또는 활성 (즉, 기능)을 하향 조절하는 화합물을 투여함으로써, 치료 또는 예방할 수 있다. 이러한 화합물의 예로는 비제한적으로, LY75, LY75 단편 및 LY75-관련 폴리펩타이드; LY75, LY75 단편 및 LY75 관련 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 (예, 유전자 요법에 사용하는 경우); 효소 활성을 가진 LY75 또는 LY75-관련 폴리펩타이드의 경우, 효소 활성을 조절하는 것으로 공지된 화합물 또는 분자를 포함한다. 사용할 수 있는 그외 화합물, 예컨대 LY75 작용제는 시험관내 분석을 이용하여 동정할 수 있다.
다른 구현예에서, 치료 또는 예방은 개별 개체의 요구에 맞게 맞춤 조절된다. 즉, 특정 구현예에서, LY75의 수준 또는 기능을 촉매하는 화합물은, 암, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 확인된 개체로서, LY75의 수준 또는 기능이 없거나 또는 대조군 또는 정상 기준 범위 보다 낮은 개체에게, 치료학적으로 또는 예방적으로 투여한다. 추가적인 구현예들에서, LY75의 수준 또는 기능을 촉매하는 화합물은 암, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 확인된 개체로서, LY75의 수준 또는 기능이 대조군 또는 기준 범위 보다 증가된 개체에게, 치료학적으로 또는 예방적으로 투여한다. 추가적인 구현예들에서, LY75의 수준 또는 기능을 감소시키는 화합물은 암, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 확인된 개체로서, LY75의 수준 또는 기능이 대조군 또는 기준 범위 보다 증가된 개체에게, 치료학적으로 또는 예방적으로 투여한다. 추가적인 구현예들에서, LY75의 수준 또는 기능을 감소시키는 화합물은 암, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 것으로 의심되거나 걸린 것으로 확인된 개체로서, LY75의 수준 또는 기능이 대조군 또는 기준 범위 보다 감소된 개체에게, 치료학적으로 또는 예방적으로 투여한다. 이들 화합물의 투여로 인한 LY75 기능 또는 수준의 변화는, 예를 들어, 샘플 (예, 혈액 또는 뇨)을 수득하여, LY75의 수준 또는 활성, 또는 LY75를 코딩하는 mRNA의 수준, 또는 이들의 임의 조합을 시험관내에서 분석함으로써, 쉽게 검출할 수 있다. 이러한 분석은 본원에 기술된 화합물의 투여하기 전과 투여한 후에 수행할 수 있다.
본 발명의 화합물은, 비제한적으로, LY75 프로파일을 정상으로 회복시키는, 임의의 화합물, 예컨대 소형 유기 분자, 단백질, 펩타이드, 항체 (또는 그외 친화성 반응물), 핵산, 등을 포함한다. 본 발명의 화합물은 임의의 다른 화학요볍제와 조합하여 제공될 수도 있다.
백신 치료법
본 발명의 다른 측면은 LY75, 이의 에피토프 함유 단편, 또는 LY75를 코딩하는 핵산 또는 이의 단편을 선택적으로 면역자극제와 함께 포함하는 면역 조성물, 적절하게는 백신 조성물에 관한 것이다.
또한, 이러한 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 반응 형성 방법과, 상기한 조성물을 치료학적인 유효량으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암, 예를 들어 본 발명의 질환을 치료 또는 예방하는 방법, 및 본 발명의 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 상기한 조성물을 제공한다.
이에, LY75는 항원성 물질로서 유용할 수 있으며, 암, 예컨대 본 발명의 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신의 제조에 사용할 수 있다. 이러한 물질은 "항원성" 및/또는 "면역원성"일 수 있다. 통상적으로, "항원성"은, 단백질이 항체 (또는 그외 친화성 반응물)를 형성하는데 사용될 수 있거나, 또는 개체 또는 실험 동물에서 항체 반응을 실제 유도할 수 있다는 것을 의미한다. "면역원성"은, 단백질이 개체 또는 실험 동물에서 예방적 면역 반응과 같은 면역 반응을 일으킬 수 있다는 것을 의미한다. 즉, 후자의 경우, 단백질은 항체 반응 뿐만 아니라 비-항체성 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, "면역원성"은, 단백질이 시험관내 조건, 예컨대 T 세포 증식 분석에서 면역-유사 반응을 일으킬 수 있는 것을 포괄한다. 적절한 면역 반응의 형성에는 하나 이상의 보강제의 존재 및/또는 항원의 적절한 제시가 필요할 수 있다.
당업자라면, LY75의 상동체 또는 유도체가 항원성/면역원성 물질로서 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 즉, 예를 들어, 하나 이상의 부가, 결손, 치환 등을 포함하는 화합물은 본 발명에 포함된다. 아울러, 하나의 아미노산을 유사한 "타입"의 다른 아미노산으로 치환하는 것도 가능하며, 예를 들어, 하나의 소수성 아미노산을 다른 것으로 치환할 수 있다. 한 예로, CLUSTAL 프로그램 등의 프로그램을 이용하여 아미노산 서열들을 비교할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하여, 적절한 경우 서열내 스페이스를 삽입함으로써 최적의 정렬을 찾는다. 최적 정렬에서 아미노산 동일성 또는 유사성 (동일성 + 아미노산 타입의 보존성)을 계산할 수 있다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열들을 가장 긴 가닥으로 정렬시켜, 맞게 값을 할당한다. 따라서, 각각 다른 값을 가지는 몇가지 유사성 영역들을 찾는 비교를 구할 수 있다. 분석의 양 타입들은 본 발명에 포함된다.
상동체 및 유도체의 경우, 본원에 기술된 단백질과의 동일성 정도는, 상동체 또는 유도체가 이의 항원성 및/또는 면역원성을 유지하여야 하는 것 보다는 덜 중요하다. 그러나, 적절하게는, 본원에 기술된 단백질 또는 폴리펩타이드와 (전술한 바와 같이) 60% 이상의 유사성을 가진 상동체 또는 유도체, 예를 들어, 70% 이상의 유사성, 예를 들어 80% 이상의 유사성을 가진 상동체 또는 유도체가 제공된다. 특히, 적어도 90% 또는 심지어 95%의 유사성을 가진 상동체 또는 유도체가 제공된다. 적절하게는, 상동체 또는 유도체는 본원의 단백질 또는 폴리펩타이드와 60% 이상의 동일성을 가진다. 바람직하게는, 상동체 또는 유도체는 70% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 80% 이상의 동일성을 가진다. 가장 바람직하게는 상동체 또는 유도체는 90% 이상 또는 심지어 95% 이상의 동일성을 가진다.
다른 방식에서, 상동체 또는 유도체는, 예를 들어 바람직한 단백질 또는 폴리펩타이드를 효과적으로 테깅함으로써 정제를 더 쉽게 하는 모이어티를 포함하는, 융합 단백질일 수 있다. "테그"는 반드시 제거하거야 하거나 또는 융합 단백질 자체가 유용한 충분한 항원성을 가지는 경우 유지할 수도 있다.
에피토프 영역, 즉, 단백질 또는 폴리펩타이드의 항원성 또는 면역원성을 담당하는 영역을 동정하기 위해, 항원성 단백질 또는 폴리펩타이드를 스크리닝할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여, 항원성에 대해 단편 및/또는 상동성 및/또는 유도체를 테스트할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단편은 이의 항원성/면역원성 특성을 보유하기 위해 하나 이상의 상기한 에피토프 영역이거나, 또는 이러한 영역과 충분히 유사하여야 한다. 이에, 본 발명에 따른 단편의 경우, 본원에 기술된 단백질, 폴리펩타이드, 상동체 또는 유도체의 특정 파트와 100% 동일할 수 있기 때문에, 동일성 수준은 아마 상관없다. 주요 이슈는, 다시, 단편이 이것이 유래된 단백질의 항원성/면역원성 특성을 보유한다는 것이다.
상동체, 유도체 및 단편에 중요한 것은, 이들이 기원이 된 단백질 또는 폴리펩타이드의 항원성/면역원성의 수준을 적어도 가지고 있다는 것이다. 즉, 본 발명의 추가적인 측면에서, LY75의 항원성/면역원성 단편 또는 이의 상동체 또는 유도체를 제공한다.
LY75 또는 이의 항원성 단편은 단독으로 정제된 또는 분리된 조제물로서 제공될 수 있다. 이는 본 발명의 하나 이상의 다른 단백질 또는 이의 항원성 단편과의 혼합물의 일부로서 제공될 수 있다. 다른 측면에서, 따라서, 본 발명은 LY75 및/또는 하나 이상의 이의 항원성 단편을 포함하는 항원 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 암, 예컨대 본 발명의 질환을 검출 및/또는 진단하는데 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 예방적 또는 치료적 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 보강제 (면역자극제)를 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에 널리 공지된 예는 무기 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 및 유중수 유제, 예컨대 불완전 프레운드 보강제를 포함할 수 있다. 다른 유용한 보강제는 당업자에게 널리 공지되어 있을 것이다.
암 치료용 암 백신 조성물에 사용하기에 적합한 보강제로는, 3데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL 또는 간단하게 MPL, WO92/116556), 사포닌 (saponin), 예를 들어 QS21 또는 QS7, 및 CpG 함유 분자와 같은 TLR4 작용제, 예를 들어 WO95/26204에 기술된 것을 포함한다. 사용되는 보강제는 구성성분들의 조합일 수 있으며, 예를 들어 MPL 및 QS21 또는 MPL, QS21 및 CpG 함유 모이어티일 수 있다. 보강제는 수중유 유제 또는 리포좀 제형으로서 제형화될 수 있다. 이러한 조제물은 다른 비히클을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, LY75 또는 LY75 펩타이드 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 올리뉴클레오티드의 조제물은, 암, 예컨대 본 발명의 질환 치료용 백신으로서 사용된다. 이러한 조제물은 보강제 또는 다른 비히클을 포함할 수 있다.
본 발명의 질환을 치료하기 위한 LY75의 저해
본 발명의 일 구현예에서, 암, 예컨대 본 발명의 질환은, 이러한 암이 없는 개체의 혈청 또는 조직과 비교하여, 상기한 암을 가지고 있는 개체의 혈청 또는 조직에서 증가된 LY75의 수준 및/또는 기능을 길항 (저해)하는 화합물의 투여에 의해, 치료 또는 예방된다.
이러한 목적으로 사용가능한 화합물로는, 비제한적으로, 항-LY75 항체 (또는 그외 친화성 반응물, 및 결합부를 함유한 단편 및 유도체), LY75 안티센스 또는 리보자임 핵산, 및 상동성 재조합에 의해 내인성 LY75 기능 "낫아웃"에 사용될 수 있는 기능부전의 LY75를 코딩하는 핵산을 포함한다 (예 Capecchi, 1989, Science 244:1288-1292). LY75 기능을 저해하는 그외 화합물은, 공지된 시험관내 분석, 예컨대 다른 단백질 또는 결합 파트너에 대한 LY75의 결합을 저해하거나 또는 공지된 LY75 기능을 저해하는 시험 화합물의 능력에 대한 분석을 이용하여 동정할 수 있다.
이러한 저해는, 예를 들어, 시험관내 또는 세포 배양으로 분석할 수 있으며, 유전자 분석도 사용할 수 있다. 또한, 바람직한 기법들을 이용하여, 화합물의 투여 전과 투여 후에 LY75의 수준을 검출할 수 있다. 적합한 시험관내 또는 생체내 분석을 활용하여, 특정 화합물의 효과와, 이의 투여가 후술되는 바와 같이 질병에 걸린 조직의 치료용으로 바람직한지를 확인한다.
구체적인 구현예에서, LY75의 기능 (활성)을 저해하는 화합물은, 본 발명에 따른 치료를 제공받지 않은, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 개체의 혈청 또는 조직과 비교하여, LY75의 증가된 혈청 또는 조직 수준 또는 기능성 활성 (예, 저앙 수준 또는 바람직한 수준 보다 높음)이 검출된 개체에게 치료학적으로 또는 예방적으로 투여하거나, 또는 상기한 암이 없는 개체에서 확인되는 수준 또는 활성으로 또는 미리 정해진 기준 범위에 도달하도록 투여한다. 당해 기술 분야에서 표준 방법을 이용하여, 전술한 바와 같이 LY75 수준 또는 기능의 증가를 측정할 수 있다. 적합한 LY75 저해제 조성물은, 예를 들어 소형 분자, 즉 1000 달톤 이하의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 소형 분자는 본원에 기술된 스크리닝 방법에 의해 동정할 수 있다.
치료 또는 예방 화합물에 대한 분석
본 발명의 방법은, LY75를 발현하는 암, 예를 들어 본 발명의 질환의 치료 또는 예방용 화합물을 동정하거나 효능을 검증하기 위해 약물 발견에 사용하기 위한 분석을 제공한다.
따라서, (a) LY75 또는 이의 생물 활성 영역을 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) LY75의 활성을 조절하는지를 확인하는 단계를 포함하는, LY75의 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 방법은, (a) LY75 또는 이의 생물 활성 영역을 호부 화합물과 샘플에서 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 화합물과 접촉한 후 상기 샘플에서 LY75 또는 이의 생물 활성 영역의 활성을, 상기 후보 화합물 접촉하기 전의 상기 샘플에서의 LY75 또는 이의 생물 활성 영역의 활성, 또는 활성의 기준 수준과 비교하는 단꼐를 포함한다.
본 스크리닝 방법은 LY75의 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법일 수 있다.
LY75 또는 이의 생물 활성 영역은, 예를 들어, 세포 상에 또는 세포에 의해 발현될 수 있다. LY75 또는 이의 생물 활성 영역은, 예를 들어 이를 발현하는 세포에서 분리할 수 있다. LY75 또는 이의 생물 활성 영역은 예를 들어 고상에 고정할 수 있다.
또한, (a) LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산을 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 이로 인해 LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 발현이 조절되는 지를 확인하는 단계를 포함하는, LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 공정은, (a) LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산을 발현하는 세포를 샘플에서 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 화합물과의 접촉 후 상기 샘플에서 세포에 의한 LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 발현을, 상기 후보 화합물과의 접촉하기 전 상기 샘플에서 세포의 LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 발현, 또는 발현의 기준 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
본 방법은 LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 발현을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 전술한 스크리닝 방법에 의해 수득가능한 화합물, LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물, 예를 들어 LY75 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 활성 또는 발현을 저해하는 화합물을 포함한다.
상기한 화합물은, 암, 예컨대 본 발명의 질환의 치료 또는 예방에서의 용도를 제공한다. 또한, 상기 화합물을 이를 필요로 하는 개체에게 치료학적인 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암, 예컨대 본 발명의 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
시험 화합물은 상기 암의 실험 동물 모델에서 유사한 변화를 형성하거나 또는 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 개체에서 LY75 수준을 상기 암이 없는 개체에서 확인되는 수준까지 회복하는 능력을 분석할 수 있다. 화합물은, 예를 들어 본 발명의 질환에 걸린 개체에서 LY75 수준을 이러한 암이 없는 개체에서 확인되는 수준까지 회복시킬 수 있거나, 또는 상기한 암의 실험 동물 모델에 유사한 변화를 형성할 수 있는 화합물은, 추가적인 약물 개발을 위한 리드 화합물로서 사용될 수 있으며, 또는 치료학적으로 사용될 수 있다. LY75 발현은 바람직한 기법들, 면역분석, 겔 전기영동 및 이후 가시화, LY75 활성 검출 또는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되거나 본원에 교시된 임의의 다른 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석은, LY75의 풍부성이 임상 질환의 서로게이트 마커로서 사용할 수 있는, 임상 모니터링 또는 약물 개발에서 후보 약물을 스크리닝하는데 이용할 수 있다.
다양한 구체적인 구현예에서, 시험관내 분석은 이러한 세포 타입에 대해 화합물이 바람직한 효과를 가지는 지를 확인인하기 위해, 개체의 장애와 관련된 세포 타입들로 대표되는 세포를 이용하여 수행할 수 있다.
치료법에 사용하기 위한 화합물은, 인간에서 테스트하기 전에 비제한적인 예로, 랫, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼를 비롯한 적절한 동물 모델 시스템에서 테스트할 수 있다. 생체내 테스트의 경우, 인간에게 투여하기 전에, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 동물 모델 시스템이 사용될 수 있다. 본 발명의 질환의 동물 모델로는, 비제한적으로, SCID 마우스에서의 림프종 세포주 DoHH2 또는 WSU-FSCCL의 이종이식체, Smith MR, Joshi I, Jin F, Obasaju C., BMC Cancer. 2005 Aug 18;5:103; 갑상선암 세포주, 예로 ARO의 이종이식체, Viaggi et al., Thyroid 2003 Jun;13(6):529-36; 방광암 세포주, 예로 UCRU-BL-12, UCRU-BL-13 및 UCRU-BL-14의 이종이식체, Russell et al. Cancer Res. 1986 Apr;46(4 Pt 2):2035-40; 누드 또는 SCID 마우스에서의 유방암 세포주, 예로 MCF-7 (Ozzello L, Sordat M., Eur J Cancer. 1980;16:553-559) 및 MCF10AT (Miller et al., J Natl Cancer Inst. 1993;85:1725-1732)의 이종이식체; 식도암 세포주, 예컨대 OE19의 이종이식체, Kelly et al., Br J Cancer. 2010 Jul 13;103(2):232-8; 누드 마우스에서 위암 세포주, 예로 NCI-N87의 이종이식체; 두경부암 세포주, 예로 FaDu 및 HNX-OE의 이종이식체 또는 누드 마우스에서 피부암 세포, 예로 MV3의 이종이식체, van Muijen et al., Int J Cancer 1991 Apr 22;48(1):85-91을 포함한다. 이들 모델에서 나타나는 병인은 예를 들어 본 발명의 질환과 유사하기 때문에, 이는 LY75 수준을 조절하는 화합물을 테스트하는데 이용할 수 있다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자에게는, 본 발명의 내용을 토대로, 형질전환 동물을 LY75를 코딩하는 유전자 또는 유전자들의 "낫아웃" 돌연변이 유발로 제조할 수 있음이 자명하다. 유전자의 "낫아웃" 돌연변이는 돌연변이된 유전자가 비정상적인 형태로 또는 유전자 산물과 관련된 활성은 거의 또는 전혀 없도록 낮은 수준으로 발현되거나 또는 발현되지 않게 하는 돌연변이다. 바람직하게는, 형질전환 동물은 포유류이며, 더 바람직하게는, 형질전환 동물은 마우스이다.
일 구현예에서, LY75의 발현을 조절하는 시험 화합물은 비-인간 동물 (예, 마우스, 랫, 원숭이, 토끼 및 기니아피드)에서, 바람직하게는 LY75를 발현하는 본 발명의 질환에 대한 비-인간 동물 모델에서 동정한다. 이러한 구현예에서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물을 동물에게 투여하고, LY75 발현에 대한 시험 화합물의 효능을 측정한다. LY75의 발현을 변형시키는 시험 화합물은, 시험 화합물을 처리한 동물 또는 동물의 그룹에서의 LY75 (또는 이를 코딩하는 mRNA)의 수준을, 대조군 화합물을 처리한 동물 또는 동물 그룹에서 LY75 또는 mRNA 수준과 비교함으로써, 동정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법을 사용하여, 예를 들어 인 시추 혼성화로 mRNA 및 단백질의 수준을 결정할 수 있다. 동물은 실험 화합물의 효능을 분석하기 위해 희생시키거나 또는 희생시키지 않을 수 있다.
다른 구현예에서, LY75 또는 이의 생물 활성 영역의 활성을 조절하는 시험 화합물은, 비-인간 동물 (예, 마우스, 랫, 원숭이, 토끼 및 기니아피그), 바람직하게는 LY75를 발현하는 본 발명의 질환에 대한 비-인간 동물 모델에서 동정한다. 이러한 구현예에서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물은 동물에게 투여되며, LY75 활성에 대한 시험 화합물의 효능을 확인한다. LY75의 활성을 변형시키는 시험 화합물은 대조군 화합물을 처리한 동물과 시험 화합물을 처리한 동물을 분석함으로써 동정할 수 있다. LY75의 활성은 LY75의 세포내 2차 메신저 (예, 세포내 Ca2+, 다이아실글리세롤, IP3, 등)의 유도를 검출하거나, LY75 또는 이의 결합 파트너의 촉매적 또는 효소적 활성을 검출하거나, 리포터 유전자 (예, 검출 마커, 예로, 루시퍼라제 또는 그린 형광 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 LY75에 반응하는 조절 인자)의 유도를 검출하거나, 또는 세포 반응 (예, 세포 분화 또는 세포 증식)을 검출함으로써, 분석할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법을 이용하여, LY75의 활성에 변화를 검출할 수 있다 (예 미국 특허 제 5,401,639, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
또 다른 구현예에서, LY75의 발현 또는 수준을 조절하는 시험 화합물은, 예를 들어 본 발명의 질환을 가진 인간 개체, 바람직하게는, 본 발명의 중증 질환에 걸린 개체에서 동정한다. 이러한 구현예에서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물은 인간 개체에게 투여하고, LY75 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현을 생물 샘플 (예, 혈청, 혈장 또는 뇨)에서 분석함으로써, LY75 발현에 대한 시험 화합물의 효능을 확인한다. LY75의 발현을 변형시키는 시험 화합물은, 대조군 화합물을 처리한 개체 또는 개체 그룹에서 LY75 또는 이를 코딩하는 mRNA의 수준을, 시험 화합물로 처리된 개체 또는 개체 그룹에서와 비교함으로써, 동정할 수 있다. 다른 예로, LY75의 발현 변형은 시험 화합물의 투여 전과 투여 후에 개체 또는 개체 그룹에서 LY75 또는 이를 코딩하는 mRNA의 수준을 비교함으로써 동정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 생물 샘플을 입수하고, mRNA 또는 단백질의 발현을 분석할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바람직한 기법을 사용하여, LY75의 수준에 대한 변화를 분석할 수 있다.
다른 구현예에서, LY75의 활성을 조절하는 시험 화합물은, 예를 들어 본 발명의 질환을 가진 인간 개체 (바람직하게는 예를 들어 본 발명의 질환이 중증인 개체)에서 동정한다. 이러한 구현예에서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물은 인간 개체에게 투여하고, LY75 활성에 대한 시험 화합물의 효능을 확인한다. LY75의 활성을 변형시키는 시험 화합물은, 대조군 화합물로 처리된 개체의 생물 샘플을 시험 화합물로 처리된 개체의 샘플과 비교함으로써, 동정할 수 있다. 다른 예로, LY75의 활성에 대한 변형은, 시험 화합물의 투여 전과 투여 후에 개체 또는 개체 그룹에서 LY75 활성을 비교함으로써 동정할 수 있다. LY75의 활성은, 생물 샘플 (예, 혈청, 혈장 또는 뇨)에서 LY75의 세포 신호 전달 경로의 유도 (예, 세포내 Ca2+, 다이아실글리세롤, IP3, 등.), LY75 또는 이의 결합 파트너의 촉매적 또는 효소적 활성, 또는 세포 반응, 예를 들어 세포 분화 또는 세포 증식을 검출함으로써 분석할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법을 이용하여, LY75의 2차 메신저의 유도에 있어 변화 또는 세포 반응의 변화를 검출할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR을 이용하여 세포내 2차 메신저의 유도에 변화를 검출할 수 있다.
다른 구현예에서, 대조군 개체 (예, 본 발명의 질환이 없는 인간)에서 검출되는 수준까지 LY75의 수준 또는 발현을 변화시키는 시험 화합물은 추가적인 테스트 또는 치료학적 용도로 선별한다. 다른 구현예에서, 대조군 개체 (예, 예를 들어 본 발명의 질환이 없는 인간)에서 확인되는 활성까지 LY75의 활성을 변화시키는 시험 화합물은 추가적인 검사 또는 치료학적 용도로 선별한다.
다른 구현예에서, 예를 들어 본 발명의 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 낮추는 시험 화합물은, 예를 들어 본 발명의 질환을 가진 인간 개체, 예를 들어 바람직하게는 본 발명의 질환이 심각한 개체에서 동정한다. 이러한 구현예에서, 시험 화합물 또는 대조군 화합물은 개체에게 투여하고, 예를 들어 본 발명의 질환의 하나 이상의 증상에 대한 시험 화합물의 효능을 결정한다. 하나 이상의 증상을 경감시키는 시험 화합물은 대조군 화합물로 처리된 개체를 시험 화합물로 처리된 개체와 비교함으로써 동정할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 질환에 친숙한 의사에게 공지된 기법들을 이용하여, 예를 들어 본 발명의 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 시험 화합물이 경감시키는 지를 확인할 수 있다. 예를 들어, 예컨대 본 발명의 질환에 걸린 개체에서 종양 부담을 낮추는 시험 화합물은 이러한 개체에서 유익할 것이다.
다른 구현예에서, 암, 예컨대 본 발명의 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 낮추는 시험 화합물은 추가적인 검사 또는 치료학적 용도로 선택한다.
치료 및 예방 조성물 및 이의 용도
본 발명은 본 발명의 화합물 (예, LY75 단백질, LY75 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 친화성 반응물, 또는 LY75를 코딩하는 핵산)을 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 (및 예방) 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 화합물은 실질적으로 정제된다 (예, 이의 효능을 제한하거나 부적절한 부작용을 형성하지 않는 물질이 실질적으로 없음).
본 화합물이 핵산을 포함하는 경우 사용할 수 있는 투여 제형 및 방법은 상기에 기술되며, 추가적인 적절한 제형과 투여 경로는 아래에 기술된다.
다양한 전달 시스템들이 공지되어 있으며, 이를 이용하여, 예컨대 리포좀, 미세입자, 마이크로캅셀, 본 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 세포내유입 (예, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), 레트로바이러스 벡터 또는 그외 벡터의 일부로서 핵산의 구축 등을 이용하여 본 발명의 화합물을 투여할 수 있다. 투여 방법은 장내 또는 비경구일 수 있으며, 비제한적으로 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함한다. 화합물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주입에 의해, 상피 또는 점막경피 라이닝 (예, 경구 점막, 직장 점막 및 장 점막 등)에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물 활성 물질과 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 아울러, 척수내 및 척수강내 주입 등의 임의의 적정 경로로 본 발명의 약학 조성물을 중추 신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 청구내 주입은 예를 들어 저장조, 예컨대 Ommaya 저장조가 부착된 척수내 카테터에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 또한, 예를 들어 흡입기 또는 분무기를 이용함으로써, 에어로졸화제로 제형화하여, 폐 투여를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 사용되는 핵산은 진피로, 예를 들어 입자 매개 상피 전달을 이용하여 진피로 전달할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예를 들어, 비제한적인 방식으로, 수술 중, 국소 적용 중의 국소 주입에 의해, 예컨대 주사에 의해, 카테터의 사용에 의해 또는 임플란트의 사용에 의해 달성될 수 있으며, 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막 또는 섬유 등의 유공성, 무공성 또는 젤라틴성 물질로 된 것이다. 일 구현예에서, 투여는 예컨대 림프, 갑상선, 방광, 유방, 위, 식도, 두경부 또는 피부 조직 또는 신생물성 또는 프리-신생물성 조직 또는 악성 종양 부위 (또는 예전 부위)에 직접 주사에 의해 이루어질 수 있다.
다른 구현예에서, 화합물은 비히클내에, 특히 리포좀 형태로 전달할 수 있다 (Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로 상기를 참조함).
또 다른 구현예에서, 화합물은 제어 방출형 시스템으로 전달할 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 다른 구현예에서, 폴리머 물질이 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). 또 다른 구현예에서, 제어 방출형 시스템은 치료 타겟, 예를 들어, 본 발명의 질환에 인접하여 위치시킬 수 있으며, 전신 투여량의 오직 일부만 필요할 수 있다 (예, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 다른 제어 방출형 시스템들은 Langer의 리뷰 (1990, Science 249:1527-1533)에 기술되어 있다.
본 발명의 화합물이 단백질을 코딩하는 핵산인 특정 구현예에서, 핵산은, 적절한 핵산 발현 멕터의 일부로서 이를 구축하고, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 (미국 특허 제 4,980,286)를 사용하거나, 또는 직접 주입에 의해, 또는 미세입자 충돌 (예, 유전자 총; Biolistic, Dupont)에 의해 세포내로 투여함으로써, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질전환 물질로 코팅하거나 또는 핵 도입으로 공지된 호메오박스-유사 펩타이드에 이를 연결하여 투여함으로써 (예, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868) 등에 의해, 생체내에 투여하여, 코딩된 단백질의 발현을 촉진시킬 수 있다. 다른 예로, 핵산은 세포내에 도입하여, 발현을 위해 숙주 세포 DNA에 상동적인 재조합에 의해 병합시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 본 발명의 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서 사용하기 위한 용도로, 미국 약전 또는 그외 일반적으로 인지된 약전에 열거되거나 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에서 승인된 적합한 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 살균 액체, 예컨대 물 및 오일, 예를 들어, 페트롤륨, 동물, 식물 또는 합성 오리진, 예로, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등일 수 있다. 약학 조성물을 정맥내로 투여하는 경우에는 바람직한 담체는 물이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액 역시 액체 담체로서, 특히 주사용 용액의 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제로는, 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 말트, 라이스, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 필요에 따라, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충화제를 소량 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액제, 현탁제, 유제, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이드를 사용하여 좌제로서 제형화할 수 있다. 경구 제형은 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin에 기술되어 있다. 이러한 조성물은, 개체에게 적절한 투여용 형태를 제공하기 위해, 치료학적 유효량의 화합물을, 예를 들어 정제된 형태로, 적량의 담체와 함께 포함할 것이다. 제형은 투여 방식에 맞아야 한다.
일 구현예에서, 예를 들어, 하나 이상의 항체를 사용하는 경우, 조성물은 인간에게의 정맥내 투여용으로 설계된 약학 조성물로서 일반적인 공정에 따라 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균된 등장성 수성 완충제 중의 용액제이다. 필요에 따라, 조성물은 또한 주사 부위에서 통증을 완하하기 위해 리도카인 등의 국소 마취제와 가용화제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 구성 성분들은 단일 투약 형태로 개별적으로 또는 함께 혼합한 형태로, 예를 들어, 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서, 활성 물질의 양을 표시한 앰플 또는 사케트 등의 수분 밀봉된 용기 내로 제공된다. 조성물을 주입에 의해 투여하는 경우, 이는 멸균된 약제 등급의 물 또는 염수를 함유한 주입 바틀을 이용하여 제공될 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 성분을 투여하기 전에 혼합할 수 있도록, 멸균 주사용수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.
본 발명의 화합물은 중성 또는 염 형태로서 제형화할 수 있다. 적절한 경우, 약제학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 유리 아미노 기와 형성된 염, 및 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 패릭 하이드록사이드, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것 등의 유리 카르복실기와 형성된 염을 포함한다.
암, 예컨대 본 발명의 질환의 치료에 효과적인 본 발명의 화합물의 양은 표준적인 임상 기법에 의해 결정할 수 있다. 아울러, 시험관내 분석도 선택적으로 최적 투여량 범위를 찾기 위해 사용할 수 있다. 제형에 사용될 정확한 투여량은 투여 경로와 질환 또는 장애의 중증도에 따라 결정될 것이며, 실무자의 판단과 각 개체의 조건에 따라 결정하여야 한다. 그러나, 정맥내 투여를 위한 적합한 투여량 범위는 일반적으로 체중 kg 당 활성 화합물 약 20-500 mg이다. 비강내 투여에 적합한 투여량 범위는 일반적으로 약 0.01 pg/kg(체중) 내지 1 mg/kg(체중)이다. 유효 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템에서 구한 용량-반응 곡선으로부터 도출할 수 있다.
좌제는 일반적으로 0.5 중량% - 10 중량%로 활성 성분을 함유하며, 경구 제형은 바람직하게는 10% - 95%로 활성 성분을 포함한다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분이 충전된 용기 하나 이상을 포함하는 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 선택적으로, 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기간에 의해 사전 승인된 형태의 공지가 상기한 용기(들)에 조합될 수 있으며, 공지는 (a) 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인, (b) 사용 설명서, 또는 이 둘다를 나타낸다.
따라서, 일 측면에서, 키트는 본 발명에 사용되는 항체를 포함하며, 예를 들어 항체는 투여 전 또는 사용 전에 재구성하도록 동결건조될 수 있다. 키트가 암 등의 요법/치료에 사용하기 위한 경우, 항체 또는 항체들은 선택적으로 키트와 함께 제공될 수 있는 등장성 수용액으로 재구성할 수 있다. 일 측면에서, 키트는, 예를 들어 동결건조될 수 있는, 본 발명에 사용되는 면역원성 폴리펩타이드 등의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 후자 키트는 면역원성 폴리펩타이드를 재구성하기 위한 보강제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 본원에 기술된 조성물, 예컨대 개체에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 약학 조성물 및/또는 백신 조성물까지 확장된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 암, 바람직하게는 본 발명의 질환들 중 하나의 치료에 있어서, 동시, 순차적 또는 개별 투여하기 위한,
(a) LY75에 결합하는 친화성 반응물, 및
(b) 항암제 또는 그외 활성 물질을
각각 또는 함께 포함하는, 약제를 제공한다.
영상화 기법에 의한 LY75의 함량 측정
영상화 기법에 의한 LY75의 농도를 측정하는 이점은 방법이 비-침습적이라는 것일 수 있으며 (투여하여야 하는 반응물 절약), 개체로부터 샘플을 추출할 필요가 없다.
적합한 영상화 기법으로는 양전자 방출 토모그래피 (PET) 및 단일 양자 방출 계측 토모그래피 (SPECT)를 포함한다. 각 기법을 이용하여 LY75를 가시화하는데에는 적정 표지 물질, 예컨대 18F, 11C 또는 123I 등의 방사성추적물질의 병합 또는 결합이 필요하다 (예, NeuroRx - The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics (2005) 2(2), 348-360 및 기법에 대한 보다 상세한 설명은 pages 361-371). 방사성추적물질 또는 기타 표지물질은 적절하게 표지된 특이 리간드를 개체에게 투여 (예, 주입)함으로써, LY75에 병합시킬 수 있다. 다른 예로, 이는 개체에 투여 (예, 주입에 의해)할 수 있는 LY75에 특이적인 결합 친화성 반응물 (예, 항체)에 병합될 수 있다. 영상화를 위한 어피바디의 용도에 대한 설명은, 예를 들어 Orlova A, Magnusson M, Eriksson TL, Nilsson M, Larsson B, Hoiden-Guthenberg I, Widstrom C, Carlsson J, Tolmachev V, Stahl S, Nilsson FY, Tumor imaging using a picomolar affinity HER2 binding Affibody molecule, Cancer Res. 2006 Apr 15;66(8):4339-48)을 참조한다.
면역조직화학을 이용한 본 발명의 질환 등의 암의 진단 및 치료
면역조직화학운 우수한 검출 기법으로서, 본 발명의 질환 등의 암을 진단 및 치료하는데 매우 유용할 수 있다. 면역조직화학은, 형광 염료, 효소, 방사성 원소 또는 콜로이드형 금 등의 마커에 의해 가시화되는 항원-항체 상호작용을 통해 특이 반응물과 같이, LY75에 특이적으로 결합하는, 표지된 항체 (또는 이의 그외 친화성 반응물) 또는 이의 유도체 및 유사체를 이용함으로써 조직 섹션내 LY75 항원의 위치 파악을 통해, 전술한 등의 암을 검출, 진단 또는 모니터링하는데 사용할 수 있다.
단일클론 항체 기법의 진보로, 현대 인간 신생물에 대한 정확한 현미경 진단에서 면역조직화학의 위치를 확보하는 것이 매우 중요해졌다. 면역조직화학에 의한 산재된 신생물 형질전환 세포의 동정으로, 암 침습 및 전이에 대한 보다 명확한 그림을 확보하고, 악성 증가에 대한 종양 세포 관련 면역표현형을 발전시킬 수 있다. 미래 항신생물 치료 방식은 각 개별 환자의 신생물 질환과 관련된 구체적인 면역표현형 패턴에 특이적인 다양한 개체별 면역요법들을 포함할 수 있다. 추가적인 내용은 예컨대 Bodey B, The significance of immunohistochemistry in the diagnosis and therapy of neoplasms, Expert Opin Biol Ther. 2002 Apr; 2(4):371-93을 참조한다.
본 발명의 각 측면에 대한 바람직한 특징들은 필요에 따라 일부 수정된 다른 각각의 측면들에 대한 것이다. 본원에 언급된 종래 문헌들은 법에 따라 허용되는 최대 범위로 본원에 포함된다.
본 발명은 아래 비-제한적인 실시예들을 들어 설명된다.
실시예 1: 액체 크로마토그래피-질량 분광측정 (LC/MS)을 이용한, 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소-세포 폐암, 림프종, 급성 단핵구성 백혈병 조직 샘플 및 다발성 골수종 세포 조직 샘플에서 발현되는 LY75의 동정
아래 프로토콜을 이용하여, 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 세포성 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소 세포성 폐암, 림프종, 급성 단핵구성 백혈병 조직 샘플 및 다발성 골수종 세포 및 대응되는 정상 또는 정상 인접 조직 (NAT) 샘플로부터 추출한 막 단백질을 분해하고, 수득되는 펩타이드를 탠덤 질량 분광측정으로 서열분석하였다.
1.1 재료 및 방법
1.1.1 세포막 분획화
방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 세포성 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소 세포성 폐암, 림프종, 급성 단핵구성 백혈병 조직 샘플 및 다발성 골수종 세포 또는 정상 또는 정상 인접 조직으로부터 세포를 회수하여, 균질화한 다음, 1000 x g에서 원심분리하였다. 상측물을 취하여, 49500 x g에서 울트라-원심분리하였다. 형성된 펠렛을 다시 균질화하고, 불연속 슈크로스 밀도 원심분리에 의해 분리하였다. 107000 x g에서 울트라-원심분리한 후, 상 경계의 분획을 회수하여, 펠렛화하였다.
1.1.2 세포막 가용화
세포막 분획을 SDS (소듐 도데실 설페이트)에 최종 SDS 농도 0.5%로 재현탁한 다음, 원심분리하고, 용해된 단백질을 추출하였다.
1.1.3 트립시노라이시스
용액내 분해를 위해, 50㎍ 단백질 용액을 200mM 암모늄 바이카보네이트를 이용하여 최대 100㎕로 만들었다. 환원제 DL-다이티오트레이톨 (75mM) 10㎕를 샘플에 첨가하여, 15분간 80℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 150mM 요오도아세트아미드 10㎕를 이용하여 시스테인 블록킹 단계를 수행하고, 암 조건에서 30분간 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 초순수를 첨가하여 SDS 농도를 0.05%로 희석하였다. 트립신 1㎍에 대해 단백질 2.75㎍이도록 충분한 양의 트립신 (Promega V5111)을 반응물에 첨가하여, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다른 예로, 단백질 용액 105㎍을 50mM TCEP 3㎕를 이용하여 환원시키고, 60℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 그런 후, 샘플을 단백질 절단 키트 (Protein Discovery)의 FASP 여과 장치 상에서 제조사의 지침에 따라 처리하였고, 암모늄 바이카보네이트 대신 트리에틸암모늄 바이카보네이트를 사용하였다. 트립시노라이시스는 최종 부피 75㎕에서 단백질 50㎍에 대해 트립신 1㎍을 사용하여 수행하였다.
1.1.4 펩타이드 분획화
절단된 단백질 샘플을 진공 하에 건조하고, 0.1% 포름산 수용액에 현탁한 다음, 트리플루오로아세트산 (TFA)을 첨가하여 용액의 pH를 <3으로 낮추었다. Agilent LC1200 Series 액체 크로마토그래피 시스템에서 Agilent Zorbax Bio-강력한 양이온 교환 시리즈 II 컬럼을 이용한 이온 교환에 의해, 펩타이드를 분리하였다. 다른 예로, pI-기반의 분리를 위해 Agilent 3100 OFFGEL Fractionator와 OFFGEL Kit pH 3 - 10을 공급사의 프로토콜에 따라 사용하였다. IPG 스트립을 재-수화한 후, 동일 부피의 막 절단물을 각 웰에 로딩하였다. 분리 후, 수득되는 분획들을 산성화하였다.
1.1.5 질량 분광측정
분획화한 샘플은, nanoACQUITY UPLC BEH 130 C18 컬럼, 75 ㎛ x 250mm (186003545)와 LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific)가 장착된 Waters nanoACQUITY UPLC 시스템을 이용한 액체 크로마토그래피-질량 분광측정에 의해, 분석하였다. 펩타이드는 120분간 300nl/min로 아세토니트릴을 3% -> 35%로 농도 구배하여 용출시켰다. 풀-스캔 질량 스펙트럼은 Orbitrap에서 400-2000 m/z의 질량 범위에서 해상도 60000에서 획득하였다. 각 사이클에서, 장치에 장착된 나노스프레이 이온 소스를 이용한 선형 이온 트랩에서 CID MS/MS 스캔을 위해, 가장 세기가 센 펩타이드 20개를 선별하였다.
1.1.6 펩타이드의 아미노산 서열 분석
LTQ Orbitrap Velos에서 입수한 원 데이타를 Mowse 알고리즘 (Curr Biol. 1993 Jun 1;3(6):327-3)을 이용하는 Mascot 소프트웨어 (Matrix Science)를 통해 처리하여, Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) 및 SwissProt (http://www.uniprot.org)로 구성된 서열 데이타베이스를 검색하여, 피크 리스트로부터 아미노산 서열을 추론하였고, 오염 단백질의 서열도 추론하였다. 펩타이드 동정을 위한 기준은 트립신 절단, 최대 2개 미싱 절단부 및 다양한 생물학적 및 화학적 변형 (산화된 메티오닌, MMTS에 의한 시스테인 변형 또는 요오도아세트아미드 및 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화)를 포함한다. 예상치 0.05% 이하이고, 이온 스코어가 28 이상인 랭킹 1위 펩타이드는 단백질 그룹으로 처리하는 OGAP 데이타베이스에 로딩하였다.
1.1.7 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 세포성 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소 세포성 폐암, 림프종, 급성 단핵구성 백혈병 조직 샘플 및 다발성 골수종 세포 관련 단백질의 식별
LY75를 동정하기 위한 공정은, 천연 인간 단백질의 전술한 바와 같은 질량 분광측정에 의해 실험을 통해 수득한 펩타이드 서열을 사용하여, 공개된 인간 게놈 서열에서 코딩 엑손을 동정 및 조직화하였다. 이들 실험을 통해 결정된 표 1에 나타낸 서열들을, 국제 특허 출원 WO2009/087462에 기술된, 펩타이드 중량, 펩타이드 시그니처, EST 및 공개된 도메인 게놈 서열 데이타의 가공 및 병합에 의해 편집된 OGAP® 데이타베이스와 비교하였다.
표 1. 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 세포성 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소 세포성 폐암, 림프종, 급성 단핵구성 백혈병 조직 샘플 및 다발성 골수종 세포의 세포막에서 LC/MS에 의해 동정한 LY75 특이 펩타이드들
서열번호 동정된 펩타이드
3 AANDPFTIVHGNTGK
4 CLGLDITK
5 CEHHSLYGAAR
6 KGGSEESLCDQPYHEIYTR
7 GGSEESLCDQPYHEIYTR
8 WGICLKPENGCEDNWEK
9 MDAESGLWQSFSCEAQLPYVCR
10 LHNEDIK
11 EEVWIGLK
12 TPNCVSYLGELGQWK
13 VQSCEEK
14 LNDASSDK
15 MCPPDEGWK
16 HG등YK
17 FEQEYLNDLMK
18 YFWTGLR
19 DVDSCGEYNWATVGGR
20 MSGPLGPEEASPKPDDPCPEGWQSFPASLSCYK
21 SPDLQGSWQWSDR
22 TPVSTIIMPNEFQQDYDIR
23 EFIYLRPFACDTK
24 LEWVCQIPK
25 TPDWYNPDR
26 ISEWPIDDHFTYSR
27 FPVTFGEECLYMSAK
28 TWLIDLGKPTDCSTK
29 VQCSEQWIPFQNK
30 ELTYSNFHPLLVSGR
31 IPENFFEEESR
32 YHCALILNLQK
33 HFVSLCQK
34 YLNNLYK
35 TLTWHSAK
36 EVKPVDSVK
37 HMATTQDEVHTK
38 SHILSIR
39 SHILSIRDEK
40 SLMWFDK
41 TPLSYTHWR
42 FLAGLSTDGFWDIQTFK
43 GQTSPGNCVLLDPK
44 DGAICYKPTK
45 SDQALHSFSEAK
46 HDHSATIVSIK
47 HDHSATIVSIKDEDENK
48 HDHSATIVSIKDEDENKFVSR
49 KVECEHGFGR
50 VECEHGFGR
51 VPLGPDYTAIAIIVATLSILVLMGGLIWFLFQRHR
52 YAQGVNEDEIMLPSFHD
1.1.8 단백질 인덱스
단백질 인덱스는 단백질의 출현율 (prevalence)과 펩타이드 존재율 (abundance)의 척도이다. 알고리즘은, 단백질이 관찰된 샘플의 수와 각 샘플에서 관찰된 펩타이드 대 관찰가능한 펩타이드의 수를 모두 고려한다. 수득되는 값은 이후 암 샘플 대 정상 샘플을 쌍으로 비교함으로써, 등급을 매긴다.
1.2 결과
이들 실험을 통해 본원에 추가로 기술된 LY75를 동정하였다. 전장 LY75는, 방광암, 유방암, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 결장직장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 비-소 세포성 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 소 세포성 폐암 및 림프종 (NHL), 급성 단핵구성 백혈병 (AML) 조직 샘플 및 다발성 골수종 세포 (MM)의 세포막에서 검출되었다. 표 2는 단백질 인덱스로 측정된 LY75의 발현 분포를 나타낸 것이다. 이들 암 조직에서의 LY75의 발현은, LY75가 이들 암에서 유용한 치료적 및 진단적 타겟이라는 것을 의미한다.
표 2. LY75 단백질 인덱스 (+++++ = 매우 높음; ++++ = 높음; +++ = 중간; ++ = 낮음; + = 매우 낮음; - = 관찰불가)
조직 암 정상
방광 +++ +
유방 +++ -
결장직장 +++++ ++
위 +++ ++
식도 ++++ -
두경부 ++ -
신장 + -
비-소세포성 폐 +++ -
난소 ++++ -
췌장 +++ -
피부 ++ -
소 세포성 폐 + -
AML + -
CLL ++ -
NHL +++++ -
MM +++ -
실시예 2: LY75에 대한 항체를 이용한 면역조직화학
아래 참조 프로토콜에 따라, LY75에 대한 마우스 단일클론 항체 (Leica)를 이용하여 FFPE 종양 및 정상 조직에 대해 면역조직화학을 수행하였다.
2.1 재료 및 방법
2.1.1 재료
Citroclear (HC5005), 영국 TCS Biosciences 사.
시약 알코올 (R8382), 영국 Sigma-Aldrich 사.
타겟 회수 용액, pH6 (S2369), 영국 Dako 사.
리얼 퍼옥시다제 차단 용액 (S2023), 영국 Dako 사
항체 희석제 (S0809), 영국 Dako 사
EnVision+ HRP-접합 폴리머, 마우스 (K4000), 영국 Dako 사.
액체 DAB+ 기질 (K3468), 영국 Dako 사.
메이어의 헤마톡실린 (X0909), 영국 Dako 사
Aquatex (1.08562.0050), 영국 VWR 사
조직 섹션 및 어레이는 미국 MD에 위치한 US Biomax Inc. 사에서 입수함.
2.1.2 탈파라핀화 및 재수화
슬라이드를 Citroclear (2 x 5분)에서 탈파라핀화한 다음, 100% 알코올 (2 x 5분), 50% 알코올 (1 x 5분) 및 수돗물 (1 x 5분)을 통해 재수화하였다.
2.1.3 항원 회수 (압력 쿠커 (Pressure Cooker))
코플린 자 (Coplin jar)에서 타겟 회수 용액 50ml 중에서 20분간 가압하에 LY75 항원을 회수하였다. 슬라이드를 다시 20분간 실온으로 냉각되게 두었다. 소수성 배리어 펜을 이용하여 각 조직 섹션/TMA 주위로 서클을 그린 후, 슬라이드를 PBS로 각각 3분씩 2번 헹구었다.
2.1.4 조직 염색
내인성 퍼옥시다제 활성은, 조직을 퍼옥시다제 차단 용액과 함께 습윤 챔버 안에서 10분간 RT로 인큐베이션함으로써 차단하였다. 그런 후, 슬라이드를 PBS로 1회, PBS-T (Tween-20 함유 PBS, 0.125%v/v)로 1회 각각 3분씩 헹구었다. 각 조직 섹션 및/또는 마이크로어레이에 1차 항체 (항체 희석제에 1/160로 희석됨)를 적용하여, 슬라이드를 습윤 챔버 안에서 45분간 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 슬라이드를 PBS로 1회, PBS-T로 1회 각각 3분씩 헹구었다. 그런 후, 조직에 EnVision+ HRP-접합 폴리머를 적용한 다음, 슬라이드를 습윤 챔버 안에서 30분간 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 슬라이드를 PBS로 1회, PBS-T로 1회 각각 3분씩 헹구었다. 조직을 습윤 챔버 안에서 10분간 실온에서 액체 DAB+ 기질 중에 인큐베이션하였다. 이후, 슬라이드를 PBS로 1회, PBS-T로 1회 각각 3분씩 헹구고, 습윤 챔버 안에서 1분간 실온에서 헤마톡실린으로 대조염색한 다음, 다시 PBS로 1회, PBS-T로 1회 각각 3분씩 헹구었다. 커버슬립을 Aquatex를 이용하여 슬라이드 위에 올려두었다.
2.2 결과
면역조직화학적 분석을 통해, 췌장암, 난소암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 피부암, 갑상선암 및 폐암 (비-소세포) 암에서의 종양 세포 뿐만 아니라 다발성 골수종과 호지킨 및 비-호지킨 타입의 림프종의 종양 세포에서 특이적인 염색이 확인되었다. LY75 항체로 염색된 호지킨 림프종 서브타입은 다음과 같다: 결정성-경화성, 림프구-우세 (predominant), 림프구-고갈된, 혼합-세포형(Mixed-Cellularity), 및 호지킨 림프종 (달리 명시되지 않음). LY75 항체로 염색된 비-호지킨 림프종 서브타입은 다음과 같다: 미만성 거대 B 세포 림프종, B 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 소포 림프종, 멘틀 세포 림프종, 점막-연관 림프 조직 (MALT)의 림프종, T 세포/조직구-풍부 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프구형질세포성 림프종, 소형 림프성 림프종, 변연부 림프종, T 세포 림프종 (달리 명시되지 않음), 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종. 따라서, LY75에 대한 항체는 이들 암과 LY75의 발현을 보여주는 기타 타입의 암에서 치료제 및 진단제로서 유용성을 가질 수 있다.
실시예 3: 유세포 측정 분석에 의해 결정된 LY75에 대한 단일클론 항체의 특이성
LY75에 대한 단일클론 항체의 특이성을 LY75-발현성 세포주에서 수행된, 유세포 측정 분석에 의해 테스트하였다.
재료 및 방법
항-LY75 항체를 LY75-발현 세포와 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충제 (DPBS, 2% FBS)에서 세척하고, 원심분리한 다음, 희석한 1차 LY75 항체 (이 또한 FACS 완충제로 희석됨) 100㎕에 재현탁하였다. 항체-세포 복합물을 60분간 얼음 위에서 인큐베이션한 다음, 전술한 바와 같이 FACS 완충제로 2번 세척하였다. 세포-항체 펠렛을 희석한 2차 LY75 항체 (이 또한 FACS 완충제로 희석됨) 100㎕에 재현탁한 다음 얼음 위에서 60분간 인큐베이션하였다. 펠렛을 상기와 같이 세척한 다음, FACS 완충제 200㎕에 재현탁하였다. 샘플을 BD FACScanto II 유세포 측정기에 로딩하고, BD FACSdiva 소프트웨어를 이용하여 데이타를 분석하였다.
결과
유세포 측정 분석 결과, 항-LY75 단일클론 항체가 세포-표면 인간 LY75에 효과적으로 결합하는 것으로 확인되었다. LY75-발현 세포에 대한 항-LY75 항체의 결합 특이성을 도 1에 나타낸다. 결과는 LY75-발현 세포에 LY75 항체가 강하게 결합한다는 것을 보여준다.
실시예 4: LY75-발현 세포에 의한 항-LY75 단일클론 항체의 내재화
항-LY75 단일클론 항체는 LY75-발현 세포에 결합시 내재화되는 것으로 확인되었다. MabZAP 항체를 일차 항체에 결합시켰다. 그런 후, MabZ를 세포에 내재화시켰다. 세포로의 사포린 도입으로, 단백질 합성이 저해되고, 궁극적으로 세포가 사멸되었다.
MabZAP 분석은 다음과 같이 수행하였다. 각 세포를 웰 당 세포 5x103개의 밀도로 접종하였다. 항-LY75 단일클론 항체 또는 이소형 대조군 인간 IgG를 연속적으로 희석한 다음 세포에 첨가하였다. 그런 후, MabZAP를 50 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 플레이트를 48 및 72시간 인큐베이션하였다. 플레이트에서 세포의 생존율을 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존율 분석 키트 (Promega, G7571)로 검출하고, 플레이트를 Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA)로 490 nm에서 판독하였다. 데이타는 Prism (Graphpad)으로 분석하였다.
세포 사멸은 항-LY75 단일클론 항체의 농도에 비례하였다.
그 결과, 항-LY75는, 항-인간 IgG 이소형 대조군 항체에 비해, Namalwa (도2a), RAJI (도2b), HCC1143 (유관 상피내암종 - ER 음성, PR 음성 및 Her2 음성) (도2c), HCC1806 (유방 극세포해리성 편평 세포암 - ER 음성, PR 음성 및 Her2 음성) (도2d), MDA-MB-468 (도2e), SW780 (방광 이행 상피암 (Bladder transitional Carcinoma)) (도2f), Kato III (위 선암종) (도2g), SCC-9 (혀암) (도2h), AML-193 (도 2i), THP-1 (도 2j), RPMI 8226 (다발성 골수종) (도 2k) 및 OE-19 (도 2l) 세포에 효과적으로 내재화되며, 이는 MabZAP 복합체의 농도에 비례하는 것으로 나타났다.
서열
Figure 112015042958592-pct00001
Figure 112015042958592-pct00002
Figure 112015042958592-pct00003
Figure 112015042958592-pct00004
Figure 112015042958592-pct00005
SEQUENCE LISTING <110> Oxford Biotherapeutics Ltd <120> THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC TARGET <130> 489.118308/01 <150> GB 1220010.1 <151> 2012-11-07 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1722 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Thr Gly Trp Ala Thr Pro Arg Arg Pro Ala Gly Leu Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Phe Trp Phe Phe Asp Leu Ala Glu Pro Ser Gly Arg Ala Ala 20 25 30 Asn Asp Pro Phe Thr Ile Val His Gly Asn Thr Gly Lys Cys Ile Lys 35 40 45 Pro Val Tyr Gly Trp Ile Val Ala Asp Asp Cys Asp Glu Thr Glu Asp 50 55 60 Lys Leu Trp Lys Trp Val Ser Gln His Arg Leu Phe His Leu His Ser 65 70 75 80 Gln Lys Cys Leu Gly Leu Asp Ile Thr Lys Ser Val Asn Glu Leu Arg 85 90 95 Met Phe Ser Cys Asp Ser Ser Ala Met Leu Trp Trp Lys Cys Glu His 100 105 110 His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Asp Gly 115 120 125 His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val Trp Lys Lys Gly Gly 130 135 140 Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr Thr Arg 145 150 155 160 Asp Gly Asn Ser Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Phe Pro Phe Leu Ile Asp 165 170 175 Gly Thr Trp His His Asp Cys Ile Leu Asp Glu Asp His Ser Gly Pro 180 185 190 Trp Cys Ala Thr Thr Leu Asn Tyr Glu Tyr Asp Arg Lys Trp Gly Ile 195 200 205 Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn Trp Glu Lys Asn Glu 210 215 220 Gln Phe Gly Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Thr Gln Thr Ala Leu Ser Trp 225 230 235 240 Lys Glu Ala Tyr Val Ser Cys Gln Asn Gln Gly Ala Asp Leu Leu Ser 245 250 255 Ile Asn Ser Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Gly Ile 260 265 270 Ala Lys Ile Phe Trp Ile Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ser Ala Arg Gly 275 280 285 Trp Glu Trp Ser Asp His Lys Pro Leu Asn Phe Leu Asn Trp Asp Pro 290 295 300 Asp Arg Pro Ser Ala Pro Thr Ile Gly Gly Ser Ser Cys Ala Arg Met 305 310 315 320 Asp Ala Glu Ser Gly Leu Trp Gln Ser Phe Ser Cys Glu Ala Gln Leu 325 330 335 Pro Tyr Val Cys Arg Lys Pro Leu Asn Asn Thr Val Glu Leu Thr Asp 340 345 350 Val Trp Thr Tyr Ser Asp Thr Arg Cys Asp Ala Gly Trp Leu Pro Asn 355 360 365 Asn Gly Phe Cys Tyr Leu Leu Val Asn Glu Ser Asn Ser Trp Asp Lys 370 375 380 Ala His Ala Lys Cys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ile Ser Ile His 385 390 395 400 Ser Leu Ala Asp Val Glu Val Val Val Thr Lys Leu His Asn Glu Asp 405 410 415 Ile Lys Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys Asn Ile Asn Ile Pro Thr 420 425 430 Leu Phe Gln Trp Ser Asp Gly Thr Glu Val Thr Leu Thr Tyr Trp Asp 435 440 445 Glu Asn Glu Pro Asn Val Pro Tyr Asn Lys Thr Pro Asn Cys Val Ser 450 455 460 Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys Val Gln Ser Cys Glu Glu Lys 465 470 475 480 Leu Lys Tyr Val Cys Lys Arg Lys Gly Glu Lys Leu Asn Asp Ala Ser 485 490 495 Ser Asp Lys Met Cys Pro Pro Asp Glu Gly Trp Lys Arg His Gly Glu 500 505 510 Thr Cys Tyr Lys Ile Tyr Glu Asp Glu Val Pro Phe Gly Thr Asn Cys 515 520 525 Asn Leu Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Glu Tyr Leu Asn Asp Leu 530 535 540 Met Lys Lys Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Lys Tyr Phe Trp Thr Gly Leu 545 550 555 560 Arg Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn Trp Ala Thr Val Gly Gly 565 570 575 Arg Arg Arg Ala Val Thr Phe Ser Asn Trp Asn Phe Leu Glu Pro Ala 580 585 590 Ser Pro Gly Gly Cys Val Ala Met Ser Thr Gly Lys Ser Val Gly Lys 595 600 605 Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala Leu Ser Ile Cys Lys 610 615 620 Lys Met Ser Gly Pro Leu Gly Pro Glu Glu Ala Ser Pro Lys Pro Asp 625 630 635 640 Asp Pro Cys Pro Glu Gly Trp Gln Ser Phe Pro Ala Ser Leu Ser Cys 645 650 655 Tyr Lys Val Phe His Ala Glu Arg Ile Val Arg Lys Arg Asn Trp Glu 660 665 670 Glu Ala Glu Arg Phe Cys Gln Ala Leu Gly Ala His Leu Ser Ser Phe 675 680 685 Ser His Val Asp Glu Ile Lys Glu Phe Leu His Phe Leu Thr Asp Gln 690 695 700 Phe Ser Gly Gln His Trp Leu Trp Ile Gly Leu Asn Lys Arg Ser Pro 705 710 715 720 Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg Thr Pro Val Ser Thr 725 730 735 Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr Asp Ile Arg Asp Cys 740 745 750 Ala Ala Val Lys Val Phe His Arg Pro Trp Arg Arg Gly Trp His Phe 755 760 765 Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro Phe Ala Cys Asp Thr 770 775 780 Lys Leu Glu Trp Val Cys Gln Ile Pro Lys Gly Arg Thr Pro Lys Thr 785 790 795 800 Pro Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Arg Ala Gly Ile His Gly Pro Pro Leu 805 810 815 Ile Ile Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Phe Val Ala Asp Leu His Leu Asn 820 825 830 Tyr Glu Glu Ala Val Leu Tyr Cys Ala Ser Asn His Ser Phe Leu Ala 835 840 845 Thr Ile Thr Ser Phe Val Gly Leu Lys Ala Ile Lys Asn Lys Ile Ala 850 855 860 Asn Ile Ser Gly Asp Gly Gln Lys Trp Trp Ile Arg Ile Ser Glu Trp 865 870 875 880 Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr Pro Trp His Arg Phe 885 890 895 Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys Thr Trp 900 905 910 Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys Leu Pro Phe 915 920 925 Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu Lys Tyr Ser Pro Asp 930 935 940 Ser Ala Ala Lys Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp Ile Pro Phe Gln Asn 945 950 955 960 Lys Cys Phe Leu Lys Ile Lys Pro Val Ser Leu Thr Phe Ser Gln Ala 965 970 975 Ser Asp Thr Cys His Ser Tyr Gly Gly Thr Leu Pro Ser Val Leu Ser 980 985 990 Gln Ile Glu Gln Asp Phe Ile Thr Ser Leu Leu Pro Asp Met Glu Ala 995 1000 1005 Thr Leu Trp Ile Gly Leu Arg Trp Thr Ala Tyr Glu Lys Ile Asn 1010 1015 1020 Lys Trp Thr Asp Asn Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro 1025 1030 1035 Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile Pro Glu Asn Phe Phe Glu 1040 1045 1050 Glu Glu Ser Arg Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys 1055 1060 1065 Ser Pro Phe Thr Gly Thr Trp Asn Phe Thr Ser Cys Ser Glu Arg 1070 1075 1080 His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val Lys Ser Arg 1085 1090 1095 Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr Leu Asn Asn 1100 1105 1110 Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys 1115 1120 1125 Arg Glu Cys Leu Lys Ser Asn Met Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp 1130 1135 1140 Pro Tyr Gln Gln Ala Phe Leu Ser Val Gln Ala Leu Leu His Asn 1145 1150 1155 Ser Ser Leu Trp Ile Gly Leu Phe Ser Gln Asp Asp Glu Leu Asn 1160 1165 1170 Phe Gly Trp Ser Asp Gly Lys Arg Leu His Phe Ser Arg Trp Ala 1175 1180 1185 Glu Thr Asn Gly Gln Leu Glu Asp Cys Val Val Leu Asp Thr Asp 1190 1195 1200 Gly Phe Trp Lys Thr Val Asp Cys Asn Asp Asn Gln Pro Gly Ala 1205 1210 1215 Ile Cys Tyr Tyr Ser Gly Asn Glu Thr Glu Lys Glu Val Lys Pro 1220 1225 1230 Val Asp Ser Val Lys Cys Pro Ser Pro Val Leu Asn Thr Pro Trp 1235 1240 1245 Ile Pro Phe Gln Asn Cys Cys Tyr Asn Phe Ile Ile Thr Lys Asn 1250 1255 1260 Arg His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr Lys Cys Gln 1265 1270 1275 Lys Leu Asn Pro Lys Ser His Ile Leu Ser Ile Arg Asp Glu Lys 1280 1285 1290 Glu Asn Asn Phe Val Leu Glu Gln Leu Leu Tyr Phe Asn Tyr Met 1295 1300 1305 Ala Ser Trp Val Met Leu Gly Ile Thr Tyr Arg Asn Lys Ser Leu 1310 1315 1320 Met Trp Phe Asp Lys Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His Trp Arg Ala 1325 1330 1335 Gly Arg Pro Thr Ile Lys Asn Glu Lys Phe Leu Ala Gly Leu Ser 1340 1345 1350 Thr Asp Gly Phe Trp Asp Ile Gln Thr Phe Lys Val Ile Glu Glu 1355 1360 1365 Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu Ala Cys Lys Ile Glu 1370 1375 1380 Met Val Asp Tyr Lys Glu Glu Tyr Asn Thr Thr Leu Pro Gln Phe 1385 1390 1395 Met Pro Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr Ser Val Ile Gln Lys Lys Val 1400 1405 1410 Thr Trp Tyr Glu Ala Leu Asn Met Cys Ser Gln Ser Gly Gly His 1415 1420 1425 Leu Ala Ser Val His Asn Gln Asn Gly Gln Leu Phe Leu Glu Asp 1430 1435 1440 Ile Val Lys Arg Asp Gly Phe Pro Leu Trp Val Gly Leu Ser Ser 1445 1450 1455 His Asp Gly Ser Glu Ser Ser Phe Glu Trp Ser Asp Gly Ser Thr 1460 1465 1470 Phe Asp Tyr Ile Pro Trp Lys Gly Gln Thr Ser Pro Gly Asn Cys 1475 1480 1485 Val Leu Leu Asp Pro Lys Gly Thr Trp Lys His Glu Lys Cys Asn 1490 1495 1500 Ser Val Lys Asp Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Pro Thr Lys Ser Lys 1505 1510 1515 Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys Pro Ala Ala Lys 1520 1525 1530 Glu Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His Cys Tyr Lys 1535 1540 1545 Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser Glu Ala Lys Lys Leu Cys 1550 1555 1560 Ser Lys His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu 1565 1570 1575 Asp Glu Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Met Arg Glu Asn Asn Asn 1580 1585 1590 Ile Thr Met Arg Val Trp Leu Gly Leu Ser Gln His Ser Val Asp 1595 1600 1605 Gln Ser Trp Ser Trp Leu Asp Gly Ser Glu Val Thr Phe Val Lys 1610 1615 1620 Trp Glu Asn Lys Ser Lys Ser Gly Val Gly Arg Cys Ser Met Leu 1625 1630 1635 Ile Ala Ser Asn Glu Thr Trp Lys Lys Val Glu Cys Glu His Gly 1640 1645 1650 Phe Gly Arg Val Val Cys Lys Val Pro Leu Gly Pro Asp Tyr Thr 1655 1660 1665 Ala Ile Ala Ile Ile Val Ala Thr Leu Ser Ile Leu Val Leu Met 1670 1675 1680 Gly Gly Leu Ile Trp Phe Leu Phe Gln Arg His Arg Leu His Leu 1685 1690 1695 Ala Gly Phe Ser Ser Val Arg Tyr Ala Gln Gly Val Asn Glu Asp 1700 1705 1710 Glu Ile Met Leu Pro Ser Phe His Asp 1715 1720 <210> 2 <211> 6936 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aggccgcgct cagcaggcgg ggcgggagcc gcgtgcgccc gaggacccgg ccggaaggct 60 tgcgccagct caggatgagg acaggctggg cgacccctcg ccgcccggcg gggctcctca 120 tgctgctctt ctggttcttc gatctcgcgg agccctctgg ccgcgcagct aatgacccct 180 tcaccatcgt ccatggaaat acgggcaagt gcatcaagcc agtgtatggc tggatagtag 240 cagacgactg tgatgaaact gaggacaagt tatggaagtg ggtgtcccag catcggctct 300 ttcatttgca ctcccaaaag tgccttggcc tcgatattac caaatcggta aatgagctga 360 gaatgttcag ctgtgactcc agtgccatgc tgtggtggaa atgtgagcac cactctctgt 420 acggagctgc ccggtaccgg ctggctctga aggatggaca tggcacagca atctcaaatg 480 catctgatgt ctggaagaaa ggaggctcag aggaaagcct ttgtgaccag ccttatcatg 540 agatctatac cagagatggg aactcttatg ggagaccttg tgaatttcca ttcttaattg 600 atgggacctg gcatcatgat tgcattcttg atgaagatca tagtgggcca tggtgtgcca 660 ccaccttaaa ttatgaatat gaccgaaagt ggggcatctg cttaaagcct gaaaacggtt 720 gtgaagataa ttgggaaaag aacgagcagt ttggaagttg ctaccaattt aatactcaga 780 cggctctttc ttggaaagaa gcttatgttt catgtcagaa tcaaggagct gatttactga 840 gcatcaacag tgctgctgaa ttaacttacc ttaaagaaaa agaaggcatt gctaagattt 900 tctggattgg tttaaatcag ctatactctg ctagaggctg ggaatggtca gaccacaaac 960 cattaaactt tctcaactgg gatccagaca ggcccagtgc acctactata ggtggctcca 1020 gctgtgcaag aatggatgct gagtctggtc tgtggcagag cttttcctgt gaagctcaac 1080 tgccctatgt ctgcaggaaa ccattaaata atacagtgga gttaacagat gtctggacat 1140 actcagatac ccgctgtgat gcaggctggc tgccaaataa tggattttgc tatctgctgg 1200 taaatgaaag taattcctgg gataaggcac atgcgaaatg caaagccttc agtagtgacc 1260 taatcagcat tcattctcta gcagatgtgg aggtggttgt cacaaaactc cataatgagg 1320 atatcaaaga agaagtgtgg ataggcctta agaacataaa cataccaact ttatttcagt 1380 ggtcagatgg tactgaagtt actctaacat attgggatga gaatgagcca aatgttccct 1440 acaataagac gcccaactgt gtttcctact taggagagct aggtcagtgg aaagtccaat 1500 catgtgagga gaaactaaaa tatgtatgca agagaaaggg agaaaaactg aatgacgcaa 1560 gttctgataa gatgtgtcct ccagatgagg gctggaagag acatggagaa acctgttaca 1620 agatttatga ggatgaggtc ccttttggaa caaactgcaa tctgactatc actagcagat 1680 ttgagcaaga atacctaaat gatttgatga aaaagtatga taaatctcta agaaaatact 1740 tctggactgg cctgagagat gtagattctt gtggagagta taactgggca actgttggtg 1800 gaagaaggcg ggctgtaacc ttttccaact ggaattttct tgagccagct tccccgggcg 1860 gctgcgtggc tatgtctact ggaaagtctg ttggaaagtg ggaggtgaag gactgcagaa 1920 gcttcaaagc actttcaatt tgcaagaaaa tgagtggacc ccttgggcct gaagaagcat 1980 cccctaagcc tgatgacccc tgtcctgaag gctggcagag tttccccgca agtctttctt 2040 gttataaggt attccatgca gaaagaattg taagaaagag gaactgggaa gaagctgaac 2100 gattctgcca agcccttgga gcacaccttt ctagcttcag ccatgtggat gaaataaagg 2160 aatttcttca ctttttaacg gaccagttca gtggccagca ttggctgtgg attggtttga 2220 ataaaaggag cccagattta caaggatcct ggcaatggag tgatcgtaca ccagtgtcta 2280 ctattatcat gccaaatgag tttcagcagg attatgacat cagagactgt gctgctgtca 2340 aggtatttca taggccatgg cgaagaggct ggcatttcta tgatgataga gaatttattt 2400 atttgaggcc ttttgcttgt gatacaaaac ttgaatgggt gtgccaaatt ccaaaaggcc 2460 gtactccaaa aacaccagac tggtacaatc cagaccgtgc tggaattcat ggacctccac 2520 ttataattga aggaagtgaa tattggtttg ttgctgatct tcacctaaac tatgaagaag 2580 ccgtcctgta ctgtgccagc aatcacagct ttcttgcaac tataacatct tttgtgggac 2640 taaaagccat caaaaacaaa atagcaaata tatctggtga tggacagaag tggtggataa 2700 gaattagcga gtggccaata gatgatcatt ttacatactc acgatatcca tggcaccgct 2760 ttcctgtgac atttggagag gaatgcttgt acatgtctgc caagacttgg cttatcgact 2820 taggtaaacc aacagactgt agtaccaagt tgcccttcat ctgtgaaaaa tataatgttt 2880 cttcgttaga gaaatacagc ccagattctg cagctaaagt gcaatgttct gagcaatgga 2940 ttccttttca gaataagtgt tttctaaaga tcaaacccgt gtctctcaca ttttctcaag 3000 caagcgatac ctgtcactcc tatggtggca cccttccttc agtgttgagc cagattgaac 3060 aagactttat tacatccttg cttccggata tggaagctac tttatggatt ggtttgcgct 3120 ggactgccta tgaaaagata aacaaatgga cagataacag agagctgacg tacagtaact 3180 ttcacccatt attggttagt gggaggctga gaataccaga aaattttttt gaggaagagt 3240 ctcgctacca ctgtgcccta atactcaacc tccaaaaatc accgtttact gggacgtgga 3300 attttacatc ctgcagtgaa cgccactttg tgtctctctg tcagaaatat tcagaagtta 3360 aaagcagaca gacgttgcag aatgcttcag aaactgtaaa gtatctaaat aatctgtaca 3420 aaataatccc aaagactctg acttggcaca gtgctaaaag ggagtgtctg aaaagtaaca 3480 tgcagctggt gagcatcacg gacccttacc agcaggcatt cctcagtgtg caggcgctcc 3540 ttcacaactc ttccttatgg atcggactct tcagtcaaga tgatgaactc aactttggtt 3600 ggtcagatgg gaaacgtctt cattttagtc gctgggctga aactaatggg caactcgaag 3660 actgtgtagt attagacact gatggattct ggaaaacagt tgattgcaat gacaatcaac 3720 caggtgctat ttgctactat tcaggaaatg agactgaaaa agaggtcaaa ccagttgaca 3780 gtgttaaatg tccatctcct gttctaaata ctccgtggat accatttcag aactgttgct 3840 acaatttcat aataacaaag aataggcata tggcaacaac acaggatgaa gttcatacta 3900 aatgccagaa actgaatcca aaatcacata ttctgagtat tcgagatgaa aaggagaata 3960 actttgttct tgagcaactg ctgtacttca attatatggc ttcatgggtc atgttaggaa 4020 taacttatag aaataagtct cttatgtggt ttgataagac cccactgtca tatacacatt 4080 ggagagcagg aagaccaact ataaaaaatg agaagttttt ggctggttta agtactgacg 4140 gcttctggga tattcaaacc tttaaagtta ttgaagaagc agtttatttt caccagcaca 4200 gcattcttgc ttgtaaaatt gaaatggttg actacaaaga agaatataat actacactgc 4260 cacagtttat gccatatgaa gatggtattt acagtgttat tcaaaaaaag gtaacatggt 4320 atgaagcatt aaacatgtgt tctcaaagtg gaggtcactt ggcaagcgtt cacaaccaaa 4380 atggccagct ctttctggaa gatattgtaa aacgtgatgg atttccacta tgggttgggc 4440 tctcaagtca tgatggaagt gaatcaagtt ttgaatggtc tgatggtagt acatttgact 4500 atatcccatg gaaaggccaa acatctcctg gaaattgtgt tctcttggat ccaaaaggaa 4560 cttggaaaca tgaaaaatgc aactctgtta aggatggtgc tatttgttat aaacctacaa 4620 aatctaaaaa gctgtcccgt cttacatatt catcaagatg tccagcagca aaagagaatg 4680 ggtcacggtg gatccagtac aagggtcact gttacaagtc tgatcaggca ttgcacagtt 4740 tttcagaggc caaaaaattg tgttcaaaac atgatcactc tgcaactatc gtttccataa 4800 aagatgaaga tgagaataaa tttgtgagca gactgatgag ggaaaataat aacattacca 4860 tgagagtttg gcttggatta tctcaacatt ctgttgacca gtcttggagt tggttagatg 4920 gatcagaagt gacatttgtc aaatgggaaa ataaaagtaa gagtggtgtt ggaagatgta 4980 gcatgttgat agcttcaaat gaaacttgga aaaaagttga atgtgaacat ggttttggaa 5040 gagttgtctg caaagtgcct ctgggccctg attacacagc aatagctatc atagttgcca 5100 cactaagtat cttagttctc atgggcggac tgatttggtt cctcttccaa aggcaccgtt 5160 tgcacctggc gggtttctca tcagttcgat atgcacaagg agtgaatgaa gatgagatta 5220 tgcttccttc tttccatgac taaattcttc taaaagtttt ctaatttgca ctaatgtgtt 5280 atgagaaatt agtcacttaa aatgtcccag tgtcagtatt tactctgctc caaagtagaa 5340 ctcttaaata ctttttcagt tgtttagatc ttaggcatgt gctggtatcc acagttaatt 5400 ccctgctaaa tgccatgttt atcaccctaa ttaatagaat ggaggggact ccaaagctgg 5460 aactgaagtc caaattgttt gtacagtaat atgtttaatg ttcattttct ctgtatgaat 5520 gtgattggta actaggatat gtatatttta atagaatttt taacaaaact tcttagaaaa 5580 ttaaaatagg catattacta ggtgacatgt ctacttttta atttttaaga gcatccggcc 5640 aaatgcaaaa ttagtacctc aaagtaaaaa ttgaactgta aactctatca gcattgtttc 5700 aaaatagtca tttttagcac tggggaaaaa taaacaataa gacatgctta ctttttaatt 5760 tttatttttt tgagactgag tctctctctg ttgcccaggc tggagtacaa tggcgtgatc 5820 tcggctcact gcaaatctcc gcctcccagg ttcaagcgat tctcctgcct cagcctcctg 5880 agtagctggg attacaggca actgccacca tgcccggcta atttttgtat ttttagtaga 5940 gatggggttt caccatgttg gccaggctgg tctcgaactc gtgaccgcag gtgatcctcc 6000 cgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc caccgcgcct ggcctctgct 6060 tactttttat atagcaaaat gattcctctt ggcaagatgt ttcttatatt attccaaagt 6120 tatttcatac cattattatg taaatatgaa gagttttttt ctgtttataa ttgtttataa 6180 aacaatgact tttaaagatt tagtgcttaa cattttccca agtgtgggaa cattattttt 6240 agattgagta ggtaccttgt agcagtgtgc tttgcatttt ctgatgtatt acatgactgt 6300 ttcttttgta aagagaatca actaggtatt taagactgat aattttacaa tttatatgct 6360 tcacatagca tgtcaacttt tgactaagaa ttttgtttta cttttttaac atgtgttaaa 6420 cagagaaagg gtccatgaag gaaagtgtat gagttgcatt tgtaaaaatg agactttttc 6480 agtggaactc taaaccttgt gatgactact aacaaatgta aaattatgag tgattaagaa 6540 aacattgctt tgtggttatc actttaagtt ttgacaccta gattatagtc ttagtaatag 6600 catccactgg aaaaggtgaa aatgttttat tcggcattta acttacattt gtactttatt 6660 tttgtataaa atccatagat ttattttaca tttagagtat ttacactatg ataaagttgt 6720 aaataatttt ctaagacagt ttttatatag tctacagttg tcctgatttc ttattgaatt 6780 tgttagacta gttctcttgt cctgtgatct gtgtacaatt ttagtcacta agactttcct 6840 ccaagaacta agccaacttg atgtgaaaag cacagctgta tataatggtg atgtcataat 6900 aaagttgttt tatcttttaa gtaaaagtaa aaaaaa 6936 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ala Asn Asp Pro Phe Thr Ile Val His Gly Asn Thr Gly Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Leu Gly Leu Asp Ile Thr Lys 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Cys Glu His His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Gly Gly Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile 1 5 10 15 Tyr Thr Arg <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Gly Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His Glu Ile Tyr 1 5 10 15 Thr Arg <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Trp Gly Ile Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn Trp Glu 1 5 10 15 Lys <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Asp Ala Glu Ser Gly Leu Trp Gln Ser Phe Ser Cys Glu Ala Gln 1 5 10 15 Leu Pro Tyr Val Cys Arg 20 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu His Asn Glu Asp Ile Lys 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys 1 5 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Pro Asn Cys Val Ser Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Gln Ser Cys Glu Glu Lys 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Asn Asp Ala Ser Ser Asp Lys 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Cys Pro Pro Asp Glu Gly Trp Lys 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 His Gly Glu Thr Cys Tyr Lys 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Phe Glu Gln Glu Tyr Leu Asn Asp Leu Met Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Tyr Phe Trp Thr Gly Leu Arg 1 5 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn Trp Ala Thr Val Gly Gly Arg 1 5 10 15 <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Ser Gly Pro Leu Gly Pro Glu Glu Ala Ser Pro Lys Pro Asp Asp 1 5 10 15 Pro Cys Pro Glu Gly Trp Gln Ser Phe Pro Ala Ser Leu Ser Cys Tyr 20 25 30 Lys <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Pro Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Thr Pro Val Ser Thr Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr 1 5 10 15 Asp Ile Arg <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro Phe Ala Cys Asp Thr Lys 1 5 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Leu Glu Trp Val Cys Gln Ile Pro Lys 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Thr Pro Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Arg 1 5 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ile Ser Glu Trp Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Phe Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met Ser Ala Lys 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Thr Trp Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser Thr Lys 1 5 10 15 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp Ile Pro Phe Gln Asn Lys 1 5 10 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Leu Thr Tyr Ser Asn Phe His Pro Leu Leu Val Ser Gly Arg 1 5 10 15 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ile Pro Glu Asn Phe Phe Glu Glu Glu Ser Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn Leu Gln Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Tyr Leu Asn Asn Leu Tyr Lys 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Thr Leu Thr Trp His Ser Ala Lys 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu Val Lys Pro Val Asp Ser Val Lys 1 5 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser His Ile Leu Ser Ile Arg 1 5 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ser His Ile Leu Ser Ile Arg Asp Glu Lys 1 5 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Leu Met Trp Phe Asp Lys 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His Trp Arg 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Phe Leu Ala Gly Leu Ser Thr Asp Gly Phe Trp Asp Ile Gln Thr Phe 1 5 10 15 Lys <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gly Gln Thr Ser Pro Gly Asn Cys Val Leu Leu Asp Pro Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asp Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Pro Thr Lys 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser Glu Ala Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu Asp Glu Asn 1 5 10 15 Lys <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile Lys Asp Glu Asp Glu Asn 1 5 10 15 Lys Phe Val Ser Arg 20 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Lys Val Glu Cys Glu His Gly Phe Gly Arg 1 5 10 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Val Glu Cys Glu His Gly Phe Gly Arg 1 5 <210> 51 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Val Pro Leu Gly Pro Asp Tyr Thr Ala Ile Ala Ile Ile Val Ala Thr 1 5 10 15 Leu Ser Ile Leu Val Leu Met Gly Gly Leu Ile Trp Phe Leu Phe Gln 20 25 30 Arg His Arg 35 <210> 52 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Tyr Ala Gln Gly Val Asn Glu Asp Glu Ile Met Leu Pro Ser Phe His 1 5 10 15 Asp <210> 53 <211> 1639 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ser Gly Arg Ala Ala Asn Asp Pro Phe Thr Ile Val His Gly Asn Thr 1 5 10 15 Gly Lys Cys Ile Lys Pro Val Tyr Gly Trp Ile Val Ala Asp Asp Cys 20 25 30 Asp Glu Thr Glu Asp Lys Leu Trp Lys Trp Val Ser Gln His Arg Leu 35 40 45 Phe His Leu His Ser Gln Lys Cys Leu Gly Leu Asp Ile Thr Lys Ser 50 55 60 Val Asn Glu Leu Arg Met Phe Ser Cys Asp Ser Ser Ala Met Leu Trp 65 70 75 80 Trp Lys Cys Glu His His Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Arg Tyr Arg Leu 85 90 95 Ala Leu Lys Asp Gly His Gly Thr Ala Ile Ser Asn Ala Ser Asp Val 100 105 110 Trp Lys Lys Gly Gly Ser Glu Glu Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr His 115 120 125 Glu Ile Tyr Thr Arg Asp Gly Asn Ser Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Phe 130 135 140 Pro Phe Leu Ile Asp Gly Thr Trp His His Asp Cys Ile Leu Asp Glu 145 150 155 160 Asp His Ser Gly Pro Trp Cys Ala Thr Thr Leu Asn Tyr Glu Tyr Asp 165 170 175 Arg Lys Trp Gly Ile Cys Leu Lys Pro Glu Asn Gly Cys Glu Asp Asn 180 185 190 Trp Glu Lys Asn Glu Gln Phe Gly Ser Cys Tyr Gln Phe Asn Thr Gln 195 200 205 Thr Ala Leu Ser Trp Lys Glu Ala Tyr Val Ser Cys Gln Asn Gln Gly 210 215 220 Ala Asp Leu Leu Ser Ile Asn Ser Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Lys 225 230 235 240 Glu Lys Glu Gly Ile Ala Lys Ile Phe Trp Ile Gly Leu Asn Gln Leu 245 250 255 Tyr Ser Ala Arg Gly Trp Glu Trp Ser Asp His Lys Pro Leu Asn Phe 260 265 270 Leu Asn Trp Asp Pro Asp Arg Pro Ser Ala Pro Thr Ile Gly Gly Ser 275 280 285 Ser Cys Ala Arg Met Asp Ala Glu Ser Gly Leu Trp Gln Ser Phe Ser 290 295 300 Cys Glu Ala Gln Leu Pro Tyr Val Cys Arg Lys Pro Leu Asn Asn Thr 305 310 315 320 Val Glu Leu Thr Asp Val Trp Thr Tyr Ser Asp Thr Arg Cys Asp Ala 325 330 335 Gly Trp Leu Pro Asn Asn Gly Phe Cys Tyr Leu Leu Val Asn Glu Ser 340 345 350 Asn Ser Trp Asp Lys Ala His Ala Lys Cys Lys Ala Phe Ser Ser Asp 355 360 365 Leu Ile Ser Ile His Ser Leu Ala Asp Val Glu Val Val Val Thr Lys 370 375 380 Leu His Asn Glu Asp Ile Lys Glu Glu Val Trp Ile Gly Leu Lys Asn 385 390 395 400 Ile Asn Ile Pro Thr Leu Phe Gln Trp Ser Asp Gly Thr Glu Val Thr 405 410 415 Leu Thr Tyr Trp Asp Glu Asn Glu Pro Asn Val Pro Tyr Asn Lys Thr 420 425 430 Pro Asn Cys Val Ser Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Gln Trp Lys Val Gln 435 440 445 Ser Cys Glu Glu Lys Leu Lys Tyr Val Cys Lys Arg Lys Gly Glu Lys 450 455 460 Leu Asn Asp Ala Ser Ser Asp Lys Met Cys Pro Pro Asp Glu Gly Trp 465 470 475 480 Lys Arg His Gly Glu Thr Cys Tyr Lys Ile Tyr Glu Asp Glu Val Pro 485 490 495 Phe Gly Thr Asn Cys Asn Leu Thr Ile Thr Ser Arg Phe Glu Gln Glu 500 505 510 Tyr Leu Asn Asp Leu Met Lys Lys Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Lys Tyr 515 520 525 Phe Trp Thr Gly Leu Arg Asp Val Asp Ser Cys Gly Glu Tyr Asn Trp 530 535 540 Ala Thr Val Gly Gly Arg Arg Arg Ala Val Thr Phe Ser Asn Trp Asn 545 550 555 560 Phe Leu Glu Pro Ala Ser Pro Gly Gly Cys Val Ala Met Ser Thr Gly 565 570 575 Lys Ser Val Gly Lys Trp Glu Val Lys Asp Cys Arg Ser Phe Lys Ala 580 585 590 Leu Ser Ile Cys Lys Lys Met Ser Gly Pro Leu Gly Pro Glu Glu Ala 595 600 605 Ser Pro Lys Pro Asp Asp Pro Cys Pro Glu Gly Trp Gln Ser Phe Pro 610 615 620 Ala Ser Leu Ser Cys Tyr Lys Val Phe His Ala Glu Arg Ile Val Arg 625 630 635 640 Lys Arg Asn Trp Glu Glu Ala Glu Arg Phe Cys Gln Ala Leu Gly Ala 645 650 655 His Leu Ser Ser Phe Ser His Val Asp Glu Ile Lys Glu Phe Leu His 660 665 670 Phe Leu Thr Asp Gln Phe Ser Gly Gln His Trp Leu Trp Ile Gly Leu 675 680 685 Asn Lys Arg Ser Pro Asp Leu Gln Gly Ser Trp Gln Trp Ser Asp Arg 690 695 700 Thr Pro Val Ser Thr Ile Ile Met Pro Asn Glu Phe Gln Gln Asp Tyr 705 710 715 720 Asp Ile Arg Asp Cys Ala Ala Val Lys Val Phe His Arg Pro Trp Arg 725 730 735 Arg Gly Trp His Phe Tyr Asp Asp Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Arg Pro 740 745 750 Phe Ala Cys Asp Thr Lys Leu Glu Trp Val Cys Gln Ile Pro Lys Gly 755 760 765 Arg Thr Pro Lys Thr Pro Asp Trp Tyr Asn Pro Asp Arg Ala Gly Ile 770 775 780 His Gly Pro Pro Leu Ile Ile Glu Gly Ser Glu Tyr Trp Phe Val Ala 785 790 795 800 Asp Leu His Leu Asn Tyr Glu Glu Ala Val Leu Tyr Cys Ala Ser Asn 805 810 815 His Ser Phe Leu Ala Thr Ile Thr Ser Phe Val Gly Leu Lys Ala Ile 820 825 830 Lys Asn Lys Ile Ala Asn Ile Ser Gly Asp Gly Gln Lys Trp Trp Ile 835 840 845 Arg Ile Ser Glu Trp Pro Ile Asp Asp His Phe Thr Tyr Ser Arg Tyr 850 855 860 Pro Trp His Arg Phe Pro Val Thr Phe Gly Glu Glu Cys Leu Tyr Met 865 870 875 880 Ser Ala Lys Thr Trp Leu Ile Asp Leu Gly Lys Pro Thr Asp Cys Ser 885 890 895 Thr Lys Leu Pro Phe Ile Cys Glu Lys Tyr Asn Val Ser Ser Leu Glu 900 905 910 Lys Tyr Ser Pro Asp Ser Ala Ala Lys Val Gln Cys Ser Glu Gln Trp 915 920 925 Ile Pro Phe Gln Asn Lys Cys Phe Leu Lys Ile Lys Pro Val Ser Leu 930 935 940 Thr Phe Ser Gln Ala Ser Asp Thr Cys His Ser Tyr Gly Gly Thr Leu 945 950 955 960 Pro Ser Val Leu Ser Gln Ile Glu Gln Asp Phe Ile Thr Ser Leu Leu 965 970 975 Pro Asp Met Glu Ala Thr Leu Trp Ile Gly Leu Arg Trp Thr Ala Tyr 980 985 990 Glu Lys Ile Asn Lys Trp Thr Asp Asn Arg Glu Leu Thr Tyr Ser Asn 995 1000 1005 Phe His Pro Leu Leu Val Ser Gly Arg Leu Arg Ile Pro Glu Asn 1010 1015 1020 Phe Phe Glu Glu Glu Ser Arg Tyr His Cys Ala Leu Ile Leu Asn 1025 1030 1035 Leu Gln Lys Ser Pro Phe Thr Gly Thr Trp Asn Phe Thr Ser Cys 1040 1045 1050 Ser Glu Arg His Phe Val Ser Leu Cys Gln Lys Tyr Ser Glu Val 1055 1060 1065 Lys Ser Arg Gln Thr Leu Gln Asn Ala Ser Glu Thr Val Lys Tyr 1070 1075 1080 Leu Asn Asn Leu Tyr Lys Ile Ile Pro Lys Thr Leu Thr Trp His 1085 1090 1095 Ser Ala Lys Arg Glu Cys Leu Lys Ser Asn Met Gln Leu Val Ser 1100 1105 1110 Ile Thr Asp Pro Tyr Gln Gln Ala Phe Leu Ser Val Gln Ala Leu 1115 1120 1125 Leu His Asn Ser Ser Leu Trp Ile Gly Leu Phe Ser Gln Asp Asp 1130 1135 1140 Glu Leu Asn Phe Gly Trp Ser Asp Gly Lys Arg Leu His Phe Ser 1145 1150 1155 Arg Trp Ala Glu Thr Asn Gly Gln Leu Glu Asp Cys Val Val Leu 1160 1165 1170 Asp Thr Asp Gly Phe Trp Lys Thr Val Asp Cys Asn Asp Asn Gln 1175 1180 1185 Pro Gly Ala Ile Cys Tyr Tyr Ser Gly Asn Glu Thr Glu Lys Glu 1190 1195 1200 Val Lys Pro Val Asp Ser Val Lys Cys Pro Ser Pro Val Leu Asn 1205 1210 1215 Thr Pro Trp Ile Pro Phe Gln Asn Cys Cys Tyr Asn Phe Ile Ile 1220 1225 1230 Thr Lys Asn Arg His Met Ala Thr Thr Gln Asp Glu Val His Thr 1235 1240 1245 Lys Cys Gln Lys Leu Asn Pro Lys Ser His Ile Leu Ser Ile Arg 1250 1255 1260 Asp Glu Lys Glu Asn Asn Phe Val Leu Glu Gln Leu Leu Tyr Phe 1265 1270 1275 Asn Tyr Met Ala Ser Trp Val Met Leu Gly Ile Thr Tyr Arg Asn 1280 1285 1290 Lys Ser Leu Met Trp Phe Asp Lys Thr Pro Leu Ser Tyr Thr His 1295 1300 1305 Trp Arg Ala Gly Arg Pro Thr Ile Lys Asn Glu Lys Phe Leu Ala 1310 1315 1320 Gly Leu Ser Thr Asp Gly Phe Trp Asp Ile Gln Thr Phe Lys Val 1325 1330 1335 Ile Glu Glu Ala Val Tyr Phe His Gln His Ser Ile Leu Ala Cys 1340 1345 1350 Lys Ile Glu Met Val Asp Tyr Lys Glu Glu Tyr Asn Thr Thr Leu 1355 1360 1365 Pro Gln Phe Met Pro Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr Ser Val Ile Gln 1370 1375 1380 Lys Lys Val Thr Trp Tyr Glu Ala Leu Asn Met Cys Ser Gln Ser 1385 1390 1395 Gly Gly His Leu Ala Ser Val His Asn Gln Asn Gly Gln Leu Phe 1400 1405 1410 Leu Glu Asp Ile Val Lys Arg Asp Gly Phe Pro Leu Trp Val Gly 1415 1420 1425 Leu Ser Ser His Asp Gly Ser Glu Ser Ser Phe Glu Trp Ser Asp 1430 1435 1440 Gly Ser Thr Phe Asp Tyr Ile Pro Trp Lys Gly Gln Thr Ser Pro 1445 1450 1455 Gly Asn Cys Val Leu Leu Asp Pro Lys Gly Thr Trp Lys His Glu 1460 1465 1470 Lys Cys Asn Ser Val Lys Asp Gly Ala Ile Cys Tyr Lys Pro Thr 1475 1480 1485 Lys Ser Lys Lys Leu Ser Arg Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Cys Pro 1490 1495 1500 Ala Ala Lys Glu Asn Gly Ser Arg Trp Ile Gln Tyr Lys Gly His 1505 1510 1515 Cys Tyr Lys Ser Asp Gln Ala Leu His Ser Phe Ser Glu Ala Lys 1520 1525 1530 Lys Leu Cys Ser Lys His Asp His Ser Ala Thr Ile Val Ser Ile 1535 1540 1545 Lys Asp Glu Asp Glu Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Met Arg Glu 1550 1555 1560 Asn Asn Asn Ile Thr Met Arg Val Trp Leu Gly Leu Ser Gln His 1565 1570 1575 Ser Val Asp Gln Ser Trp Ser Trp Leu Asp Gly Ser Glu Val Thr 1580 1585 1590 Phe Val Lys Trp Glu Asn Lys Ser Lys Ser Gly Val Gly Arg Cys 1595 1600 1605 Ser Met Leu Ile Ala Ser Asn Glu Thr Trp Lys Lys Val Glu Cys 1610 1615 1620 Glu His Gly Phe Gly Arg Val Val Cys Lys Val Pro Leu Gly Pro 1625 1630 1635 Asp

Claims (29)

  1. LY75에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 질환 치료용 약학 조성물로서, 상기 질환은 LY75가 발현되는, 림프종, 골수종, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 항체가 치료 모이어티와 접합된 것인, 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 림프종이 미만성 거대 B 세포 림프종 (Diffuse Large B-Cell Lymphoma), B 세포 림프종 (B-Cell Lymphoma), 소포 림프종 (Follicular Lymphoma), 멘틀 세포 림프종 (Mantle Cell Lymphoma), 점막-연관 림프 조직 (MALT)의 림프종 (Lymphoma of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue), T 세포/조직구-풍부 B 세포 림프종 (T-Cell/Histiocyte-Rich B-Cell Lymphoma,), 버킷 림프종 (Burkitt Lymphoma), 림프구형질세포성 림프종 (Lymphoplasmacytic Lymphoma), 소형 림프구성 림프종 (Small Lymphocytic Lymphoma), 변연부 림프종 (Marginal Zone Lymphoma), T 세포 림프종 (T-Cell Lymphoma), 말초 T 세포 림프종 (Peripheral T-Cell Lymphoma), 역형성 거대 세포 림프종 (Anaplastic Large Cell Lymphoma) 및 혈관면역모세포성 T 세포 림프종 (AngioImmunoblastic T-Cell Lymphoma)으로 선택되는 군에서 선택되는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단쇄 항체, 탈푸코시화된 항체 (defucosylated antibody) 또는 2 특이성 (bispecific) 항체, 또는 이의 기능성 단편, 이의 항원-결합 영역, 또는 항체 모방체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    a) 상기 기능성 항체 단편이 유니바디 (UniBody), 도메인 항체 또는 나노바디 (Nanobody)이거나; 또는
    b) 상기 항체 모방체가 어피바디 (Affibody), DARPin, 안티칼린 (Anticalin), 아비머 (Avimer), 버사바디 (Versabody) 또는 두오칼린 (Duocalin)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 치료 모이어티가 세포독성 모이어티 또는 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포독성 모이어티가 두오카마이신 (duocarmycin), 칼리케아미신 (calicheamicin), 메이탄신 및 아우리스타틴 (auristatin)로 이루어진 군에서 선택되거나 이들의 유도체인, 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항체가 항체 약물 접합체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 정보를 제공하는 방법으로서,
    개체에서, LY75가 발현되는, 림프종, 골수종, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하거나, 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 상기 암에 대한 항암제 또는 치료의 효능을 모니터링하기 위한, 정보를 제공하는 방법이며,
    a) LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재 또는 수준, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재 또는 수준을 검출하는 단계, 또는 상기 개체에서 이들의 수준의 변화를 검출하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재를 검출하는 단계를 포함하며,
    (a) 건강한 개체에서의 수준과 비교하여, 상기 개체에서, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 수준의 증가, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 수준의 증가, 또는 (b) 건강한 개체에서의 대응되는 검출불가한 수준과 비교하여, 상기 개체에서 LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 검출가능한 수준 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 검출가능한 수준의 존재는, 상기 개체에 상기 암이 존재한다는 의미인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, LY75 또는 이의 하나 이상의 단편의 존재, 또는 LY75를 코딩하는 핵산의 존재는, 개체에서 수득되는 생물 샘플을 분석함으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 LY75 또는 이의 하나 이상의 존재는 LY75에 결합하는 항체를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체가 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따라 정의되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 표지물질을 포함하거나 또는 이와 접합된 것임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 암이 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 또는 3중 음성 (Triple-Negative) 유방암인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  16. 제8항에 있어서, 상기 암이 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 또는 3중 음성 (Triple-Negative) 유방암인 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. LY75에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, LY75가 발현되는, 림프종, 골수종, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하거나, 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 상기 암에 대한 항암제 또는 치료의 효능을 모니터링하기 위한 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체가 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따라 정의되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 표지물질을 포함하거나 또는 이와 접합된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제17항에 있어서, 상기 암이 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 또는 3중 음성 (Triple-Negative) 유방암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. LY75에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, LY75가 발현되는, 림프종, 골수종, 방광암, 유방암, 위암, 식도암, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 검출, 진단 및/또는 스크리닝하거나, 또는 진행을 모니터링하거나, 또는 상기 암에 대한 항암제 또는 치료의 효능을 모니터링하기 위한 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체가 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따라 정의되는 것을 특징으로 하는 키트.
  23. 제21항에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 표지물질을 포함하거나 또는 이와 접합된 것임을 특징으로 하는 키트.
  24. 제21항에 있어서, 상기 암이 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종 또는 3중 음성 (Triple-Negative) 유방암인 것을 특징으로 하는 키트.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
KR1020157011701A 2012-11-07 2013-11-06 암 치료 및 진단의 타겟으로서 ly75 Active KR102256552B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1220010.1A GB201220010D0 (en) 2012-11-07 2012-11-07 Therapeutic amd diagnostic target
GB1220010.1 2012-11-07
PCT/GB2013/052899 WO2014072700A1 (en) 2012-11-07 2013-11-06 Ly75 as cancer therapeutic and diagnostic target

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150082278A KR20150082278A (ko) 2015-07-15
KR102256552B1 true KR102256552B1 (ko) 2021-05-25

Family

ID=47429281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157011701A Active KR102256552B1 (ko) 2012-11-07 2013-11-06 암 치료 및 진단의 타겟으로서 ly75

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20150297743A1 (ko)
EP (1) EP2917239A1 (ko)
JP (4) JP2016501843A (ko)
KR (1) KR102256552B1 (ko)
CN (2) CN113181372A (ko)
AU (2) AU2013343277B2 (ko)
BR (1) BR112015009438B1 (ko)
CL (1) CL2015001098A1 (ko)
EA (1) EA033649B1 (ko)
GB (1) GB201220010D0 (ko)
HK (1) HK1214611A1 (ko)
NZ (1) NZ707116A (ko)
SG (2) SG11201503363WA (ko)
UA (1) UA117569C2 (ko)
WO (1) WO2014072700A1 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201220010D0 (en) * 2012-11-07 2012-12-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic amd diagnostic target
BR112016007402B1 (pt) 2013-10-11 2023-03-28 Oxford Biotherapeutics Ltd Anticorpo isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, composição farmacêutica o compreendendo e seu uso, bem como ácido nucléico, vetor de expressão e método de produção de um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste
EP3303625B1 (en) 2015-05-29 2019-03-27 Universiteit Maastricht Method for identifying subjects with aggressive melanoma skin cancer at diagnosis
KR101796091B1 (ko) 2016-05-02 2017-11-10 충남대학교 산학협력단 카복실 말단 조절 단백질을 포함하는 두경부암 진단용 바이오 마커 조성물
GB201703876D0 (en) 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
CN109685135B (zh) * 2018-12-21 2022-03-25 电子科技大学 一种基于改进型度量学习的少样本图像分类方法
WO2021108637A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating diseases and conditions by depletion of mitochondrial or genomic dna from circulation
EP4397673A4 (en) 2021-08-31 2025-02-19 FUJIFILM Corporation COMPOUND AND MARKED BIOMATERIAL USING SAME
EP4397672A4 (en) 2021-08-31 2025-02-26 FUJIFILM Corporation Compound and labeled biomaterial using same
JPWO2023032994A1 (ko) 2021-08-31 2023-03-09
US20230113866A1 (en) * 2021-09-13 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods Of Treating Clonal Hematopoiesis Of Indeterminate Potential (CHIP) With Lymphocyte Antigen 75 (LY75), Cluster Of Differentiation 164 (CD164), Or Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1 (PARP1) Inhibitors
EP4644874A1 (en) 2022-12-26 2025-11-05 FUJIFILM Corporation Fluorescence intensity enhancing agent, method for enhancing fluorescence intensity of fluorescently labeled target biological material, and fluorescence detection kit
WO2024181455A1 (ja) 2023-02-27 2024-09-06 富士フイルム株式会社 化合物及びこれを用いた標識生体物質
JPWO2024181454A1 (ko) 2023-02-27 2024-09-06

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US20040258688A1 (en) * 1995-01-31 2004-12-23 Daniel Hawiger Enhanced antigen delivery and modulation of the immune response therefrom
WO1997045449A1 (en) * 1996-05-29 1997-12-04 Derek Nigel John Hart Dendritic cell receptor
IL157145A0 (en) * 2001-01-31 2004-02-08 Idec Pharma Corp Use of dc23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
US20040146948A1 (en) * 2002-10-18 2004-07-29 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Compositions and methods for targeting antigen-presenting cells with antibody single-chain variable region fragments
WO2008104803A2 (en) * 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
WO2008154333A2 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Asuragen, Inc. Mir-34 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
SG187482A1 (en) * 2007-11-07 2013-02-28 Celldex Therapeutics Inc Antibodies that bind human dendritic and epithelial cell 205 (dec-205)
EP2159291A1 (en) * 2008-09-01 2010-03-03 Agendia B.V. Means and method for determining tumor cell percentage in a sample
AU2010303304A1 (en) * 2009-10-08 2012-05-17 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for amelioration of autoimmune disease using fusion proteins of anti-dendritic cell receptor antibody to peptide sequences
TW201247706A (en) * 2011-03-08 2012-12-01 Baylor Res Inst Novel vaccine adjuvants based on targeting adjuvants to antibodies directly to antigen-presenting cells
GB201220010D0 (en) * 2012-11-07 2012-12-19 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic amd diagnostic target
JP6431104B2 (ja) * 2017-02-27 2018-11-28 オリコン株式会社 マイクロ波を利用した金属蒸気の発生方法

Also Published As

Publication number Publication date
CL2015001098A1 (es) 2015-09-25
UA117569C2 (uk) 2018-08-27
AU2013343277A1 (en) 2015-05-07
SG11201503363WA (en) 2015-06-29
AU2013343277B2 (en) 2018-03-08
CN104755496A (zh) 2015-07-01
US20190317100A1 (en) 2019-10-17
NZ707116A (en) 2019-07-26
HK1214611A1 (zh) 2016-07-29
BR112015009438A2 (pt) 2017-11-14
EA201590694A1 (ru) 2015-09-30
EA033649B1 (ru) 2019-11-13
GB201220010D0 (en) 2012-12-19
AU2018203478B2 (en) 2020-02-06
SG10201810357WA (en) 2018-12-28
JP7479435B2 (ja) 2024-05-08
JP7079685B2 (ja) 2022-06-02
EP2917239A1 (en) 2015-09-16
US20210346512A1 (en) 2021-11-11
US20150297743A1 (en) 2015-10-22
JP2021011483A (ja) 2021-02-04
JP2016501843A (ja) 2016-01-21
WO2014072700A1 (en) 2014-05-15
JP2018188463A (ja) 2018-11-29
CN113181372A (zh) 2021-07-30
KR20150082278A (ko) 2015-07-15
JP2023011880A (ja) 2023-01-24
AU2018203478A1 (en) 2018-06-07
BR112015009438B1 (pt) 2023-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7479435B2 (ja) 癌治療および判断ターゲットとしてのｌｙ７５
US20210079114A1 (en) Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents
JP2019108354A (ja) 治療的及び診断的標的としての不活性Ｎ−アセチル化−α−結合型酸性ジペプチダーゼ−様タンパク質２（ＮＡＡＬＡＤＬ２）
RS55716B1 (sr) Terapeutski i dijagnostički cilj
US20150210770A1 (en) Therapeutic and diagnostic target
NZ710248B2 (en) Therapeutic and diagnostic target for cancer comprising dll3 binding reagents

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20150504

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20181101

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20200316

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20210224

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20210520

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20210520

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration