CN101212983B - 包含α-半乳糖基神经酰胺作为佐剂的用于鼻内施用的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含α-半乳糖基神经酰胺(αGalCer)作为佐剂的用于鼻内施用的疫苗组合物。本发明人将αGalCer与肿瘤细胞抗原或病毒抗原一起施用至小鼠的鼻腔，并且然后证实αGalCer不但有效地诱导体液免疫应答，还诱导细胞介导的免疫应答。因此，所述αGalCer可以有效地用作通过鼻内施用的疫苗的佐剂，用于预防和治疗病毒感染与癌症。

Description

包含α-半乳糖基神经酰胺作为佐剂的用于鼻内施用的疫苗组合物
技术领域
本发明涉及一种用于鼻内施用的疫苗组合物，其包含α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)作为佐剂。
背景技术
到目前为止，已经开发了用于治疗各种赘生性和传染性疾病的新疫苗。与使用活的减毒或非-复制灭活病原体的常规疫苗不同，当前疫苗由合成的、重组的或纯化的亚基抗原组成。
不管通过使用人免疫系统的免疫治疗法治疗癌症的各种研究，但是由于人癌症细胞不是抗原呈递细胞，所以没有诱导适当的抗体免疫应答，或者没有正确地激活肿瘤特异的细胞毒性T-细胞。
疫苗已经被用作减少住院机会以及患有病毒感染诸如流感病毒感染的患者的死亡率的主要工具。但是，RNA病毒，诸如流感病毒，特征在于连续地抗原变异，这使得用于所述病毒的疫苗的研发变得困难。然而，由于它们引起世界威胁性的传染疾病，所以已经努力研发用于病毒诸如流感病毒、SARS等的恰当的疫苗。
抗原的主要入侵途径是口腔、鼻腔、喉、小肠、大肠、生殖器和肛门，并且黏膜系统是致病抗原的主要防御线，形成黏膜免疫系统，其为两种主要免疫系统之一(另一种是全身免疫系统)。因此，大部分开发疫苗的研究集中在开发能够诱导黏膜和系统免疫应答的疫苗组合物上(Czerkinsky等，Immunol.Rev.(免疫学综述)，170：197，1999；Belyakov等，Proc，Natl.Acad.Sci U.S.A.(美国国家科学院学报)，95：1709，1998；Berzofsky等，Nat.Rev.Immunol.(国家免疫学综述)，1：209，2001；Kozlofsky等，Curr.Mol.Med.(当代分子医学)，3：217，2003)。
疫苗可以以各种制剂进行开发。考虑到患者的并发症、剂量、施用容易性以及副作用的发生率，最理想的制剂是鼻内疫苗。
由于在可能参与感染危险的注射区域引起疼痛，所以用针注射疫苗减少患者的顺应性。同时，黏膜接种，例如鼻接种，避免用针注射。因此，黏膜免疫是比常规注射接种容易得多并且更加便利的方式。并且，与常规口服接种相比，由于鼻内施用避免肝一传作用(hepatic first pass effect)和所施用的抗原在胃肠道中的降解，这带来高生物利用度、成本-减少和由于最低的剂量的低副作用发生率，所以鼻内接种具有一些优点(Remeo等，Adv.Drug Deliv.Rev.(高级药物递送综述)，29：89，1998)。
只包含抗原的黏膜疫苗诱导免疫耐受性，而不是免疫应答，所以与佐剂共同-施用很重要(Yuki等，Rev.Med.Virol.(医学病毒学综述)，13：293，2003)。但是，尽管急需诱导黏膜免疫的佐剂，还没报道用于诱导黏膜免疫性的临床可用的佐剂。
‘佐剂’意指促进或增强免疫应答的特异阶段从而最终增强免疫应答的任何化合物。单独佐剂的施用不影响免疫性，但是与疫苗抗原共同-施用可以提高并且维持针对所述抗原的免疫应答。佐剂典型的例子为油乳液(弗氏佐剂)、皂角苷、铝或钙盐(明矾)、非离子嵌段聚合物表面活性剂、脂多糖、分枝杆菌(mycobacteria)和破伤风类毒素。
α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)是一种来自于海绵体Agelasmauritianus的糖脂，其作用为NKT(天然杀伤T)细胞的Vα14+T细胞受体(TCR)的配体，并且由抗原呈递细胞(APC)的CD1d呈递(Kawano等，Science(科学)，278：1626，1997)。NKT细胞的激活导致产生IFN-γ和IL-4，这为特异的疾病或感染提供调节免疫应答的机会(Chen等，J.Immunol.(免疫学杂志)，159：2240，1997；Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)，100：10913，2003)。
在先前的研究中，检验了αGalCer作为系统接种的佐剂的作用和效果。结果，证实αGalCer作用为一种有效佐剂用于治疗感染(Gonzalez-Aseguinolaza等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)，97：8461，2000；Gonzalez-Aseguinoalza等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，195：615，2002)，自体-免疫疾病(Laloux等，J.Immunol.(免疫学杂志)，166：3749，2001：Teige等，J.Immunol.(免疫学杂志)，172：186，2004)和癌症(Hermans等，J.Immunol.(免疫学杂志)，171：5140，2003；Fujii等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，199：1607，2003；Hayakawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)，100：9464，2003)。
按照WO 2003/009812，当通过腹膜内注射、肌内注射和静脉内注射而施用αGalCer作为佐剂时，它增强抗原特异性Th1-型应答，特别是CD8+T细胞应答。韩国专利公布No.2003-0017733还描述当将肿瘤溶解产物与αGalCer共同注射到腹腔中时，刺激NKT细胞，增加用于T细胞激活的辅因子的表达，这导致对肿瘤细胞生长的抑制。
然而，上述文件只证明αGalCer作为佐剂通过全身施用而诱导细胞介导的免疫应答，并且没有提及αGalCer作为用于鼻接种的佐剂的功能。
由于不同淋巴器官中免疫细胞的免疫学微环境和动力学不同，所以在免疫学方面，不能接受通过全身途径而诱导免疫应答的某种佐剂还可以用作鼻疫苗佐剂，或者反之亦然。特别地，在体液免疫应答和细胞介导的免疫应答方面，鼻疫苗和肌内或皮下疫苗可以诱导不同的免疫应答。因此，需要彻底的检查，以验证用于肌内疫苗的佐剂是否可以用作用于鼻疫苗的佐剂。例如，明矾是通过肌内注射用于临床应用的唯一一种疫苗佐剂，但是不能被用作用于鼻疫苗的佐剂。霍乱毒素是鼻疫苗佐剂的一种有前途的候选，但是不是关于肌内疫苗佐剂的研究目标。针对通过黏膜入侵的病原体的最重要的免疫应答是分泌型IgA的产生，其只通过黏膜接种而诱导。此外，黏膜接种可以诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，以致它不但通过黏膜而且通过其它途径诱导针对病原体的免疫应答。因此，用于肌内疫苗或全身施用的疫苗的佐剂不同被用作鼻内施用的疫苗的佐剂。为了应用用于不同施用方法的佐剂，它必须通过实验和临床检验(Infectious DiseaseReview(传染病综述)3：2，2001；Nature Immunology(自然免疫学)6：507，2005；Reviews in Medical Virology(医学病毒学综述)，2003，13：293-310；Nature Reviews Immunology(自然免疫学综述)，1：20，2001)。
本发明人将肿瘤-相关抗原或病毒抗原与αGalCer共同施用到小鼠鼻腔，并且证实共同-治疗的αGalCer不但诱导针对肿瘤-相关的或病毒抗原的体液免疫应答还诱导细胞介导的免疫应答。并且本发明人通过进一步证实αGalCer可以用作鼻疫苗组合物的佐剂而完成本发明。
内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于预防和治疗病毒感染和癌症的组合物，所述组合物包含αGalCer作为佐剂用于鼻疫苗组合物，本发明人已证实其诱导针对施用到小鼠鼻腔的肿瘤-相关抗原或病毒抗原的体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。
技术方案
本发明提供一种鼻疫苗组合物，其包含抗原和有效剂量的作为佐剂的α-半乳糖基神经酰胺。
本发明还提供同时增强针对与α-半乳糖基神经酰胺一起共同施用至鼻腔的抗原的全身(systemic)免疫应答和黏膜免疫应答的方法。
本发明还提供通过鼻内施用所述疫苗组合物而增强Th1和Th2免疫应答的方法。
本发明还提供通过鼻内施用所述疫苗组合物而增强分泌型IgA在黏膜区室中的产生和IgG在系统区室中的产生的方法。
本发明还提供一种用于鼻内施用的包含α-半乳糖基神经酰胺的疫苗佐剂。
在下文中，详细地描述本发明。
α-半乳糖基神经酰胺(α-GalCer)是一种来自于海绵体的糖脂，其作用为NKT(天然杀伤T)细胞的Vα14+T细胞受体(TCR)的配体，并且由抗原呈递细胞(APC)的CD1d分子呈递(Kawano等，Science(科学)，278：1626，1997)。NKT细胞的激活导致产生IFN-γ和IL-4，这为特异的疾病或感染提供调节免疫应答的机会(Chen等，J.Immunol.(免疫学杂志)，159：2240，1997；Wilson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院学报)，100：10913，2003)。按照一些先前的报道，激活的NKT细胞可以诱导Th2免疫应答(Yoshmoto等，Science(科学)，270：1845，1995；Singh等，J.Immunol.(免疫学杂志)163：2373，1999；Laloux等，J.Immunol.(免疫学杂志)，166：3749)。但是，其它报道认为激活的NKT细胞诱导Th1免疫应答(Hermans等，J.Immunol.(免疫学杂志)，171：5140，2003；Stober等，J.Immunol.(免疫学杂志)，170：2540，2003)。按照目前的报道，αGalCer和OVA的共同-治疗诱导树突细胞(DC)的完全成熟，并且由此诱导抗原-特异的Th1 CD4+T细胞和具有针对OVA表达肿瘤的抗性的CTL(Fujii等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，198：267，2003；Fujii等J.Exp.Med.(实验医学杂志)，199：1607，2004)。另外，本发明人在体外成功地抑制由高量和低量抗原诱导的口服耐受性，这通过在全身施用αGalCer和口服施用OVA后诱导肠系膜淋巴结中的DC完全成熟和T细胞分化而实现(Chung等，Eur.J.Immunol.(欧洲免疫学杂志)，34：2471，2004)。结果表明αGalCer可以用作各种黏膜疫苗的有效佐剂，并且诱导Th1和CTL或Th2免疫应答。
本发明人还证实，OVA与αGalCer一起的鼻内施用在C57BL/6和Balb/c两种小鼠中诱导OVA-特异的黏膜S-IgA和全身IgG抗体应答、Th1和Th2细胞因子应答以及很强的CTL应答。
为了研究αGalCer作为佐剂在黏膜中的活性，将需要量的αGalCer和100μgOVA或单独的100μgOVA用PBS稀释，制成20μl溶液(10μgl/鼻孔)，将其施用给6-8周龄的C57BL/6小鼠或Balb/c小鼠(Charles River实验室，东方有限公司(Orient Co.，Ltd.)，韩国)，以一周的时间间隔施用3次。
αGalCer由Snaghee Kim博士(Seoul National University(首尔国立大学)，韩国)提供，其通过将植物鞘氨醇与二十六烷酸连接，并且然后按照常规技术进行保护/去保护和半乳糖苷化而制备(Takikawa等，Tetrahedron(四面体)，54：3141，1998)。将αGalCer溶解在含有0.5％吐温20的PBS中。含有0.5％吐温20的PBS用作本文的每一实验的赋形剂。
从在C57BL/6小鼠中关于针对OVA的体液免疫应答的研究，证实αGalCer提高抗原-特异性的黏膜S-IgA(分泌型IgA)的水平(参见图1)以及OVA-特异性的Th2型IgG1和Th1型IgG2a的水平，这间接地表明αGalCer诱导Th1和Th2两种免疫应答(参见图2和图3)。在脾和CLN中的Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的水平被αGalCer显著提高，这直接表明αGalCer诱导Th1和Th2两种免疫应答(参见图4)。
上述结果表明αGalCer是一种有力的黏膜疫苗佐剂，其能够诱导抗原特异的黏膜S-IgA(分泌型IgA)和全身IgG抗体应答，并且在C57BL/6小鼠中诱导Th1和Th2两种免疫应答。
已经充分确定，当静脉内或口服施用时，αGalCer诱导CTL应答(Fujii等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，198：267，2003：Silk等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)，114：1800，2004)。因此，还研究当它与OVA一起施用到鼻腔时，αGalCer是否能在C57BL/6小鼠中诱导CTL应答。结果，所有用αGalCer处理的组在黏膜(CLN)和系统(脾和MLN)区室中表现出剂量-依赖型细胞溶解活性和细胞毒性活性(参见图5和图6)。上述结果表明αGalCer是一种能够在黏膜和全身免疫系统中都诱导CTL的有力的鼻疫苗佐剂。在Balb/c小鼠中关于αGalCer活性的研究结果与上述结果一致，这表明αGalCer的作用不限于C57BL/6小鼠(参见图7-图11)。
αGalCer具有能够诱导抗病毒免疫应答特别是针对流感病毒A/PR/8/34感染的免疫应答的鼻疫苗佐剂活性。为了研究黏膜受到针对病毒感染的αGalCer的多少保护，将Balb/c小鼠用αGalCer和PR8 HA抗原免疫，以一周的时间间隔鼻内施用3次进行。在最后的免疫后两周，通过鼻途径用20 LD50流感病毒刺激。3天后，在鼻洗液、肺洗液和血液血清中检测PR8 HA-特异性抗体应答。结果，在所有αGalCer-处理的组的鼻洗液、肺洗液和血液血清中检测到高水平的PR8 HA-特异性IgA抗体(参见图12)，并且还在所有用αGalCer共同免疫的小鼠的血液血清中检测到高水平的PR8 HA-特异性IgG抗体(参见图13)。因此，这证实αGalCer是一种不但诱导针对病毒抗原的全身IgG而且诱导针对病毒抗原的黏膜S-IgA的有力的鼻疫苗佐剂。在只用抗原免疫的小鼠中，发病机理比用抗原和αGalCer共同免疫的那些小鼠严重得多(参见图14)。所有只用赋形剂处理的小鼠在10天内死亡，并且只用PR8 HA处理的小鼠有57％在感染病毒后14天内死亡。相反，通过鼻内途径用αGalCer和PR8 HA共同免疫的小鼠在存活率和体重减少以及快速体重减少恢复速率中没有表现出任何显著的减少(参见图14)。因此，证实αGalCer是一种能够诱导针对病毒感染的强抵御机制和黏膜S-IgA抗体以及全身IgG抗体的有力的鼻疫苗佐剂。
通过鼻内途径用0.125μgαGalCer和携带β-半乳糖酶基因的复制-缺陷型腺病毒(Ad-LacZ)(Viromed，韩国)免疫Balb/c小鼠，而进一步研究由αGalCer鼻疫苗佐剂诱导的免疫应答。结果，αGalCer有效地诱导针对携带β-半乳糖酶基因的复制-缺陷型腺病毒的细胞介导的和体液免疫应答(参见图15-图17)。
进一步证实αGalCer具有诱导针对EG7肿瘤的抗癌免疫应答的鼻疫苗佐剂活性。通过以一周的时间间隔鼻内施用3次而将C57BL/6小鼠用OVA和αGalCer一起免疫。最后免疫后两周，在免疫小鼠的左胁皮下接种3×106个EG7肿瘤细胞。接种后14天，将小鼠处死，并且将可触摸的肿瘤切离，并且检测重量。结果，在通过鼻内途径用0.5μg和2.0μg的αGalCer和OVA共同免疫的小鼠中，肿瘤形成完全得到抑制(参见图18)。这些结果表明αGalCer可以用作诱导抗癌免疫应答的有力的鼻疫苗佐剂。
为了研究由α-GalCer鼻疫苗佐剂诱导的免疫应答是否受CD1d分子调控，将CD1d-/-C57BL/6小鼠，其中CD1d分子缺失并且因此缺失NKT细胞，用单独的OVA或与α-GalCer一起以一周的时间间隔鼻内免疫3次。一周后，在野生型和CD1d-/-C57BL/6两种小鼠中研究血清中的全身IgG应答和体内CTL活性。结果，在CD1d-/-小鼠中的全身IgG抗体应答被显著地抑制(参见图19)，并且还在CD1d-/-小鼠的排泄淋巴结(draininglymph node)和全身淋巴器官中抑制CTL细胞溶解活性(参见图20)。上述结果表明由α-GalCer鼻疫苗佐剂诱导的免疫应答专一地受CD1d分子调控。
αGalCer的鼻内施用诱导先天T细胞的激活，并且因此将这些细胞分化成为效应器细胞。为了再次证实αGalCer对先天T细胞激活的作用，将CFSE-标记的OT1细胞过继转移到同系基因小鼠(syngenic mice)。在过继转移的第二天，对所述小鼠鼻内施用单独的OVA或与2.0μgαGalCer一起的OVA。48小时后，研究CD25在CLN中的表达。结果，在用OVA和αGalCer共同处理的小鼠中，表达CD25的OT1细胞的水平高于只用OVA处理的那些小鼠，这意味着αGalCer鼻佐剂诱导先天T细胞的活化(参见图21)。为了证实激活的T细胞是否成功地分化成高度功能性的CTL，将这些细胞进一步用OVA257-264肽刺激6小时，然后检测细胞内IL-2和IFN-γ水平。结果，在用OVA与αGalCer一起通过鼻内途径免疫的小鼠中，由OT1细胞产生的IL-2和IFN-γ水平高于只用OVA处理的那些小鼠(参见图22)。结果表明鼻内施用的αGalCer诱导先天T细胞的活化，并且促使活化的T细胞分化成为效应T细胞。
甚至在用杀死的PR8病毒作为抗原的情形中，αGalCer诱导针对流感感染的可信的和有力的免疫应答。具体地，将Balb/c小鼠用杀死的PR8病毒和αGalCer以两周的时间间隔通过鼻内途径免疫两次。结果，αGalCer鼻疫苗佐剂提高血清中IgG的水平(参见图23)和黏膜区室中S-IgA的水平(参见图24)。αGalCer鼻疫苗佐剂还显著地提高免疫细胞的增殖(参见图25)以及IFN-γ和IL-4的产生(参见图26)。证明由αGalCer鼻疫苗佐剂激活的细胞毒性T细胞具有强细胞溶解活性(参见图27)和保护性免疫性(参见图28)。上述结果表明，当通过鼻内途径与甚至杀死的病毒抗原共同处理时，αGalCer诱导针对活病毒感染的有力的体液免疫应答和细胞介导的免疫应答，以及强和可信的保护性免疫应答。
上述结果还表明αGalCer可以用作诱导抗-感染和抗癌免疫应答的有效的鼻疫苗佐剂。
因此，本发明提供包含有效剂量的α-半乳糖基神经酰胺佐剂和抗原的疫苗组合物。
在本文中术语“有效剂量的佐剂”表示能够引发针对通过鼻内途径施用的抗原的免疫应答的αGalCer的量，其还被本领域的那些技术人员很好地理解。更精确地，佐剂的有效剂量意指，与只用抗原免疫的小鼠相比，能够将来自用抗原和αGalCer共同免疫的小鼠的鼻洗液中的S-IgA水平提高大于5％、更优选地25％和最优选地大于50％的量。
因此，优选地，本发明的组合物包含低于0.5w/v％的α-半乳糖基神经酰胺。
“抗原”意指当其入侵宿主时，能够通过被宿主的免疫系统识别而诱导免疫应答的任何物质(例如，蛋白、肽、癌症细胞、糖蛋白、糖脂、活病毒、杀死的病毒、DNA等)。
抗原可以作为纯化的形式或未-纯化的形式提供，但是优选纯化的形式。
本发明可以用于各种抗原，包括病原体的蛋白、重组蛋白、肽、多糖、糖蛋白、糖脂和DNA(多聚核苷酸)、癌细胞、活病毒以及杀死的病毒。
提供下列抗原作为本发明的示例性实施方案的参考，但是不限于此：流感病毒抗原(血细胞凝集素和神经氨酸酶抗原)，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)抗原(百日咳毒素，丝状血细胞凝集素，pertactin)，人乳头状瘤病毒(HPV)抗原，Helicobacterpylori抗原(血清组A，B，C，Y和W-135的荚膜多糖)，破伤风类毒素，白喉抗原(白喉类毒素)，肺炎球菌(pneumococcal)抗原(肺炎链球菌(Streptococcus pnemoniae)3型荚膜多糖)，结核(tuberculosis)抗原，人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120，GP-160)，霍乱抗原(霍乱毒素B亚基)，葡萄球菌(staphylococcal)抗原(葡萄球菌肠毒素B)，志贺氏菌(shigella)抗原(志贺氏菌多糖)，疱疹性口炎病毒抗原(疱疹性口炎病毒糖蛋白)，巨细胞病毒(cytomegalovirustigen)(CMV)抗原，肝炎抗原(甲型肝炎(HAV)，乙型(HBV)，丙型(HCV)，丁型(HDV)和庚型(HGV)抗原)，呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，单纯疱疹抗原或它们的组合(不包括，白喉、百日咳和破伤风、DPT)。
本发明的鼻疫苗组合物可以配制成液体或粉末形式的组合物，特别是按照施用方法的气溶胶、滴剂、吸入剂或吹入剂，并且优选粉剂或小球体。
用于滴鼻剂的组合物可以包括一种或多种可用的赋形剂，诸如防腐剂、粘性调节剂、渗透性调节剂和缓冲剂。
疫苗的施用量确定为能够有效诱导免疫应答的量。例如，对于人疫苗的施用频率是每天一次到几次，并且剂量是1-250μg，并且优选2-50μg。
在啮齿动物和猿类中，α-半乳糖基神经酰胺似乎不诱导毒性(Nakata等，Cancer Res.(癌症研究)，58：1202-1207，1998)。并且，在用2200μg/KgαGalCer处理的小鼠中没有报道过副作用，并且，证明αGalCer是一种不引起剂量-限制性毒性(50-4800μg/m2)的安全物质，并且在剂量增加的研究中具有抗性(Giaccone等，Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)，8：3702，2002)。
本发明还提供增强针对与αGalCer一起通过鼻内途径施用的抗原的免疫应答的方法。
上文提及的抗原与αGalCer一起同时施用至鼻腔内优选地通过配发装置(dispensing device)进行，并且更优选地使用气溶胶递送系统。
本发明还提供通过将抗原与αGalCer一起同时施用至鼻腔内而增强Th1和Th2免疫应答的方法。
本发明还提供通过将抗原与αGalCer一起同时施用至鼻腔内而增强IgA黏膜免疫应答和IgG全身免疫应答的方法。
本发明提供一种包含αGalCer作为有力的鼻疫苗佐剂的鼻疫苗组合物。
附图描述
参考附图，更好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中：
图1-图4举例说明在C57BL/6小鼠中共同-施用OVA和αGalCer诱导OVA-特异性S-IgA和全身IgG应答以及Th1和Th2细胞因子分泌。图1是显示在用OVA单独或与αGalCer一起通过鼻内途径以一周的时间间隔免疫3次的最后一次免疫之后一周小鼠鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中OVA-特异性S-IgA效价的一组图表。图2是显示在血清中的OVA-特异性全身IgG效价的图表，并且图3是显示在血清中OVA-特异性IgG同种型效价的图表。图4是显示在来自脾和子宫颈淋巴结(CLN)的OVA和单细胞培养4天后获得的培养物上层清液中IFN-γ和IL-4生产水平的一组图表，其通过夹层ELISA进行检验。
图5和图6举例说明在C57BL/6小鼠体内αGalCer诱导强CTL应答。图5是举例说明通过FACS分析的脾细胞的特异性裂解的一组图表。具体地，将来自首次用于实验的C57BL/6小鼠的等数目OVA257-264肽脉冲的CFSE高脾细胞(靶点细胞)和未脉冲的CFSE低脾细胞(对照细胞)静脉内注射至免疫的小鼠。24小时后，将小鼠处死，并且检测靶点细胞在脾、MLN和CLN中的比例。图6是以百分数表示图5中检测的CTL活性的一组图表。
图7-图11举例说明通过鼻内途径共同-施用OVA和αGalCer在Balb/c小鼠中诱导OVA-特异性抗体应答、Th1和Th2细胞因子分泌和CTL活性。图7是显示在最后一次免疫后一周的鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中的OVA-特异性S-IgA效价的一组图表。图8是显示血清中OVA-特异性全身IgG效价的图表。图9是显示在血清中IgG同种型效价的图表。图10是显示在来自脾和子宫颈淋巴结(CLN)的OVA和单细胞培养4天后获得的培养物上层清液中IFN-γ和IL-4生产水平的一组图表，其通过夹层ELISA进行检验。图11举例说明在将脾细胞和OVA培养4天后并且通过细胞内细胞因子染色(ICS)检验的生产IFN-γ-的CD8+T细胞(CTL)的产生。
图12-图14举例说明在Balb/c小鼠中由αGalCer鼻疫苗佐剂诱导的针对流感病毒A/PR/8/34感染的强保护性免疫应答。图12是显示在鼻洗液(NW)、肺洗液(LW)和血清中PR8 HA-特异性S-IgA效价的一组图表。特别地，将Balb/c小鼠用单独的PR8 HA或与αGalCer一起通过鼻内途径以一周的时间间隔免疫3次。2周后，将小鼠通过鼻内途径用20 LD50活的流感病毒A/PR/8/34感染。然后，检测在鼻洗液(NW)、肺洗液(LW)和血清中PR8 HA-特异性S-IgA效价。图13是显示血清中PR8 HA-特异性IgG效价的图表。图14是显示在病毒感染后每隔一天检测的小鼠存活率和体重减少的一组图表。
图15-图17举例说明鼻内施用的αGalCer在Balb/c小鼠中诱导黏膜S-IgA和全身IgG应答以及CTL应答，这确定针对复制-缺陷型活的腺病毒感染的强免疫性。图15是显示，在用单独的复制-缺陷型活的腺病毒或与αGalCer一起通过鼻内途径以2周的时间间隔2次免疫Balb/c小鼠后一周检测在鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)中β-半乳糖酶-特异性S-IgA效价的一组图表。图16是显示血清中β-半乳糖酶-特异性IgG效价的图表。图17是显示在用β-半乳糖酶刺激脾细胞后通过细胞内细胞因子染色检测的IFN-γ-生产CD8+T细胞的水平的图表。
图18是举例说明通过C57BL/6小鼠的鼻腔共同-施用OVA和αGalCer可以诱导针对EG7肿瘤的强保护性的图表。具体地，从最后一次免疫2周后，将3×106个EG7肿瘤细胞皮下接种到免疫的小鼠的左胁。14天后，研究可触摸的肿瘤的重量和肿瘤的发生率。
图19和图20举例说明αGalCer作为佐剂的活性受CD1d调控。图19是显示在野生型和CD1d-/-C57BL/6(CD1d-/-)小鼠血清中OVA-特异性IgG效价的图表。简要地，将野生型和CD1d-/-C57BL/6小鼠用OVA和αGalCer一起以一周的时间间隔免疫3次。最后一次免疫后一周，将等数目的OVA257-264脉冲的CFSE高脾细胞(靶点细胞)和未脉冲的CFSE低脾细胞(对照细胞)过继转移到免疫的小鼠。1天后，通过EILSA检测血清中OVA-特异的IgG效价，并且显示在图19中，通过FACS检验靶点细胞的比例并显示在图20中。
图21和图22举例说明通过鼻内途径共同-施用OVA和αGalCer激活先天CD8+T细胞，并且因此诱导它们分化成效应T细胞。图21是显示通过αGalCer鼻疫苗佐剂激活先天T细胞的一组图表。将CFSE-标记的OT-1细胞过继转移到同系基因的小鼠。1天后，将所述小鼠用OVA与αGalCer一起鼻内免疫。1天后，通过FACS分析来自CLN的淋巴细胞的CD25的表面表达。图22是显示αGalCer鼻疫苗佐剂促使活化的T细胞分化成为效应T细胞的一组图表。在将细胞用OVA257-264肽和GolgiPlug(BD Pharmingen)刺激6小时后，通过FACS进一步检验如在图21中获得的淋巴细胞细胞内IL-2和IFN-γ的生产。
图23-图28举例说明通过鼻内途径用福尔马林(formaline)-灭活的PR8病毒与αGalCer一起免疫诱导体液免疫应答、细胞介导的免疫应答和保护性免疫应答。将Balb/c小鼠用灭活的PR8病毒与αGalCer一起通过鼻内途径以两周的时间间隔免疫两次。在最后一次免疫后两周，将小鼠处死，并且获得鼻洗液和肺洗液。检测IgG(图23)和黏膜S-IgA(图24)在其中的生产。图25显示在从脾和CLN分离的单细胞中的免疫细胞的增殖。图26是显示Th1和Th2细胞因子的生产的一组图表。图27是显示检测CTL活性的51Cr释放检测的结果的图表。图28是示例将免疫的小鼠用活PR8病毒感染并且然后通过蚀斑测定检测肺洗液中的病毒数目以研究保护性免疫应答的图表。
发明的方式
本发明的实施和目前优选的实施方案如下述实施例所示进行举例说明。
然而，应该理解，考虑到本公开，本领域的那些技术人员可以在本发明的精神和范围内进行改进和改善。
实施例1：对C57BL/6小鼠通过鼻内共同-施用抗原和αGalCer而诱导的 OVA-特异的黏膜S-IgA和全身IgG抗体应答
将6只8周龄的C57BL/c小鼠(Charles River实验室，东方有限公司(Orient Co.，Ltd.)，韩国)用100μg单独的OVA或与指定量的αGalCer(0.125，0.5，2.0μg)以一周的时间间隔免疫3次，其中OVA和αGalCer用PBS稀释，并且制成20μl溶液(10μl/鼻孔)。
αGalCer由Sanghee Kim博士(首尔国立大学，韩国)提供，其通过将植物鞘氨醇与二十六烷酸连接，并且然后按照常规技术进行保护/去保护和半乳糖苷化而制备(Takikawa等，Tetrahedron(四面体)，54：3141，1998)。将αGalCer溶解在含有0.5％吐温20的PBS中。含有0.5％吐温20的PBS用作本文的每一实验的赋形剂。
在最后免疫后一周，将小鼠处死。通过ELISA检测OVA-特异性抗体应答。鼻洗液通过用100μl灭菌PBS洗涤鼻通道(nasal passage)而获得(Yamamoto等，J.Immunol.(免疫学杂志)，161：4115，1998)，还通过如所述相同的方式获得支气管小泡灌洗流体，以制备肺洗液(Chung等，免疫学206：408，2002)。
检测在所述鼻洗液和肺洗液中的OVA-特异性IgG效价(Chung等，免疫学206：408，2002)。为了检测IgA、IgG1和IgG2a效价，使用两倍连续稀释的样品。为了确定IgA效价，使用辣根-过氧化物酶-缀合的山羊抗-小鼠IgA(SIGMA，USA)、过氧化物酶底物和TMB(西格玛(SIGMA)，美国)，并且向其中加入0.5 N-HCL终止显色。然后，检测OD450。为了确定IgG、IgG1和IgG2a效价，使用碱性磷酸酶-缀合的山羊抗-小鼠IgG、IgG1和IgG2a(南方生物技术(Southern Biotech)，美国)和碱性磷酸酶底物、对-硝基苯基磷酸(西格玛)。
如在图1中所示，在用2.0μgαGalCer共同免疫的小鼠中，鼻洗液和肺洗液中的OVA-特异性IgA应答显著高于只用赋形剂或只用OVA免疫的那些小鼠中的应答。
如在图2中所示，与只用赋形剂或只用OVA免疫的那些小鼠相比，在用不同浓度的αGalCer(0.125，0.5，2.0μg)共同免疫的小鼠的血清中检测到更高的OVA-特异性IgG水平。
为了评估由αGalCer鼻疫苗佐剂间接诱导的对Th1或Th2免疫应答的免疫偏爱性，确定血清中的IgG同种型，并且计算IgG1与IgG2a的比例。
如在图3中所示，共同-施用αGalCer和OVA导致OVA-特异性的Th2型IgG1和Th1型IgG2a水平的显著增加，这表明αGalCer鼻疫苗佐剂没有使免疫应答偏向Th1或Th2免疫应答，并且诱导Th1和Th2两种免疫应答。
从上述结果，证实αGalCer是一种能够在C57BL/6小鼠中诱导抗原-特异性黏膜S-IgA(分泌型IgA)和全身IgG抗体应答并且可以诱导Th1和Th2两种免疫应答的强黏膜佐剂。
实施例2：对C57BL/6小鼠通过鼻内共同-施用抗原和αGalCer而诱导Th1 和Th2细胞因子的分泌
直接研究αGalCer鼻疫苗佐剂是否使得免疫应答偏向Th1或Th2免疫应答。为了检测细胞因子的分泌，在最后免疫后一周从脾和子宫颈淋巴结(CLN)获得细胞。将所述细胞(5×106个细胞/ml)用500μg/ml OVA培养4天。通过使用小鼠IFN-γ和IL-4 OptELA set ELISA试剂盒(BD Pharmigen)按照制造者的用法说明而检测培养物上层清液中的IFN-γ和IL-4的分泌。
如在图4中所示，IFN-γ和IL-4在脾和CLN中的分泌显著增加。高浓度的αGalCer诱导更多的IFN-γ分泌，并且IL-4在CLN中的分泌也与αGalCer浓度成比例增加。
从上述结果，证实αGalCer的鼻内施用在全身(脾)和黏膜(CLN)区室中诱导Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)两种免疫应答。
实施例3：对C57BL/6小鼠通过鼻内共同-施用抗原和αGalCer而诱导的 强CTL应答
已经公知静脉内或口服施用αGalCer诱导CTL应答(Fuji等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，198：267，2003：Silk等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)，114：1800，2004)。在此处，研究鼻内施用αGalCer是否能够诱导CTL应答。
将脾细胞从首次用于实验的C57BL/6小鼠分离，将其用1μMOVA257-264在37℃脉冲90分钟。将脉冲的细胞用20μM CFSE(分子探针(Molecular Probes)，美国)在37℃标记15分钟，形成OVA257-264脉冲的CFSE高细胞。同时，将未脉冲的细胞用2μM CFSE(分子探针，美国)在37℃标记15分钟，形成OVA257-264未脉冲的CFSE低细胞。将等数目的肽-脉冲的CFSE高细胞和未脉冲的CFSE低细胞混和，将其在最后免疫后一周以2×107个细胞的数目静脉内注射到小鼠。24小时后，在脾、肠系膜淋巴结(MLN)和子宫颈淋巴结(CLN)中通过FACS而研究肽-脉冲的CFSE高细胞的特异性裂解。
如在图5和图6中所示，与只用赋形剂或只用OVA免疫的那些组相比较，所有用αGalCer鼻疫苗佐剂共同免疫的组在脾、MLN和CLN中表现出剂量-依赖方式的更高的细胞毒性。
上述结果表明αGalCer是一种能够在局部和系统淋巴器官中都诱导CTL的强鼻疫苗佐剂。
实施例4：对Balb/c小鼠通过鼻内共同-施用抗原和αGalCer而诱导的体液 和细胞介导的免疫应答
<4-1>抗体和细胞因子的检测(体液免疫性)
为了研究αGalCer是否可以在Balb/c小鼠中用作鼻疫苗的强佐剂，通过如实施例1中所述相同的方式对Balb/c小鼠鼻内施用不同量的αGalCer(0.15，0.5，2.0μg)和100μg OVA，接着检测血清中OVA-特异性IgG、OVA-特异性IgG1和IgG2a，以及鼻洗液和肺洗液中的OVA-特异性IgA应答。
如在图7和图8中所示，与只用赋形剂或只用OVA处理的小鼠中的那些相比较，对Balb/c小鼠(Charles River实验室，东方有限公司，韩国)鼻内施用αGalCer和OVA诱导血清中更高的OVA-特异性IgG应答和鼻洗液与肺洗液中更高的OVA-特异性IgA应答。
如在图9中所示，鼻内施用αGalCer和OVA导致OVA-特异性IgG1和IgG2a效价的增加。
如在实施例2中所述，对Balb/c小鼠(Charles River实验室，东方有限公司，韩国)鼻内施用不同量的αGalCer(0.125，0.5，2.0μg)和OVA，接着检测脾和CLN中的IFN-γ和IL-4水平。
如在图10中所示，所有用αGalCer共同免疫的组表现出IFN-γ和IL-4生产的显著增加。有趣地，当鼻内施用0.5μgαGalCer时，在血清中检测到最高的IgG抗体水平，并且在脾中检测到最高的IL-4水平。此外，肺洗液中黏膜IgA水平和CLN中IL-4的生产与αGalCer的量成反比。
总之，高浓度的αGalCer可以在Balb/c小鼠中诱导针对共同施用的抗原的耐受性。
<4-2>细胞毒性的检测(细胞介导的免疫性)
在Balb/c小鼠中，OVA剂量不包括与I类MHC分子结合的表位肽。因此，为了研究由αGalCer佐剂在Balb/c小鼠中诱导的细胞毒性活性，检测IFN-γ-生产CD8+T细胞的数目(图11)。具体地，将所述细胞(2×106个细胞/ml)用500μg/ml OVA培养4天，在终止培养前6小时向其中加入1μl/ml GolgiPugTM(BD Pharmigen，美国)。然后，通过使用FITC-缀合的CD3 mAb(克隆145-2C11，Biolegend Inc，美国)，PE-缀合的CD8 mAb(克隆53-6.7，Biolegend Inc，美国)和APC-缀合的IFN-γmAb(克隆XMG1.2，Biolegend Inc，美国)进行染色。使用BD Cytofix/Cytoperm PlusTM(BDPharmigen，美国)按照制造者的用法说明进行细胞内染色，并且将染色的细胞用FACSCalibur(BD Bioscience，美国)和CellQuest软件(BDBioscience，美国)分析。
如在图11中所示，IFN-γ-生产CD8+T细胞的数目随着αGalCer浓度增加而减少。在图10中，通过夹层ELISA检测的IFN-γ数目不依赖于αGalCer的浓度，但是产生IFN-γ-的CTL数目与αGalCer浓度成反比例。上述结果归因于这样的事实，即，通过夹层ELISA检测的IFN-γ数目包括由不同细胞包括CD4+、CD8+T细胞或APC分泌的所有的IFN-γ，而通过FACS检测的CTL数目只是由CD8+T细胞分泌的。
因此，上述结果表明αGalCer在Balb/c小鼠中具有强的鼻疫苗佐剂活性。
实施例5：通过鼻内共同-施用αGalCer和病毒抗原蛋白而诱导的抗-病毒 免疫应答
为了检测αGalCer防止病毒感染的黏膜保护程度，将Balb/c小鼠用单独的PR8 HA抗原(Shin-Ichi Tamura博士，大阪大学，日本，其通过Davenport，J.Lab.Clin.Med.(实验室临床医学杂志)，63：5，1964的方法制备)或与αGalCer一起以一周的时间间隔免疫3次。最后免疫后2周，将小鼠通过鼻腔用20LD50活的流感病毒A/PR/8/34感染。病毒感染后3天，制备鼻洗液、肺洗液和血清，并且通过如在实施例1中所述相同的方式检测其中的PR8 HA-特异性抗体应答。另外，每隔一天观察被感染的小鼠的体重减少和存活率，持续14天。
如在图12中所示，在从用αGalCer共同免疫的所有组分离的鼻洗液和肺洗液以及血清中检测到高水平的PR8 HA-特异性S-IgA抗体。如在图13中所示，还在用αGalCer共同免疫的组的血清中检测到高水平的PR8HA-特异的IgG抗体。
上述结果表明，αGalCer可以用作能够诱导针对病毒抗原的黏膜S-IgA抗体和全身IgG抗体应答的强的鼻疫苗佐剂。
如在图14中所述，以用抗原和αGalCer共同-处理的那些小鼠相比较，在不用αGalCer免疫的小鼠中观察到更严重的发病机理，这于检测存活率、体重减少和体重恢复时间的结果一致。在只用赋形剂处理的组中，所有小鼠在病毒感染后10天内死亡。在只用PR8 HA处理的组内，57％的小鼠在感染病毒后14天内死亡。然而，通过鼻腔共同-施用PR8 HA和αGalCer的组在存活率上没有表现出任何显著的减少。
上述结果表明，αGalCer可以用作能够诱导致针对病毒感染的保护的黏膜S-IgA抗体以及全身IgG抗体应答的强鼻疫苗佐剂。
实施例6：通过鼻内共同-施用αGalCer和活病毒而诱导的抗-病毒免疫应 答
将Balb/c小鼠用单独的106 pfu携带β-半乳糖酶基因的复制-缺陷型活的腺病毒(Ad-LacZ)(Viromed，韩国)或与0.125μg αGalCer一起通过鼻内施用以两周的时间间隔免疫两次。最后免疫后一周，通过如实施例1中所述相同的方式，制备鼻洗液、肺洗液和血清，以检测β-半乳糖酶-特异的抗体应答。另外，为了检测CTL活性，将脾细胞用2.5μg/mL β-半乳糖酶刺激5天，并且按照如实施例<4-2>中所述的方法通过细胞内细胞因子染色检验产生IFN-γ-的CD8+T细胞。
如在图15和图16中所示，与只用赋形剂或只用Ad-LacZ免疫的组的那些相比较，在通过同时鼻内施用而用Ad-LacZ和αGalCer共同免疫的组的鼻洗液(NW)和肺洗液(LW)以及血清中分别检测到更高水平的β-半乳糖酶-特异的S-IgA抗体和β-半乳糖酶-特异的IgG抗体。
如在图17中所示，在通过同时鼻内施用而用抗原和αGalCer共同免疫的组中，证实产生IFN-γ-的CD8+T细胞数目的显著的增加。
上述结果表明αGalCer是一种针对复制-缺陷型活病毒的有效的鼻疫苗佐剂。
实施例7：通过鼻内共同-施用抗原和αGalCer而诱导的针对EG7肿瘤的 抗癌免疫应答
为了证实αGalCer是否可以用作诱导抗癌活性的鼻疫苗佐剂，将C57BL/6小鼠用单独的100μgOVA或与αGalCer(0.125，0.5，2.0μg)一起通过鼻内施用以一周的时间间隔免疫3次。最后免疫后2周，将3×106个EG7肿瘤细胞皮下接种到免疫的小鼠的左胁。在接种的第14天，将小鼠处死，并且称重可触摸的肿瘤。
如在图18中所示，在只用赋形剂或只用OVA共同免疫的所有小鼠中以及用0.125μgαGalCer处理的1/3小鼠中发现肿瘤块(tumor masses)。与只用赋形剂处理的小鼠的肿瘤相比，通过鼻腔只用OVA处理的小鼠的肿瘤显著重(p＜0.05)。有趣地，在通过鼻腔用0.5μg和2.0μg αGalCer与OVA一起处理的小鼠中，肿瘤形成被完全抑制。
从所述结果，证实αGalCer可以用作诱导抗癌免疫应答的有效并且强的鼻疫苗佐剂。
实施例8：αGalCer的CD1d调控的鼻内佐剂活性
为了研究由αGalCer诱导的免疫应答是否受CD1d调控，将NKT缺陷型(由缺乏CD1d导致)CD1d-/-C57BL/6小鼠(Charles River实验室，东方有限公司，韩国)用于本实验(Park等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，193：893，2001)。在最后鼻内施用的第一周，通过如实施例1和实施例3所述相同的方法在野生型和CD1d-/-C57BL/6小鼠中检测血清中全身IgG水平和体内CTL活性。
如在图19中所示，在CD1d-/-小鼠中全身IgG抗体应答明显被抑制。
如在图20中所示，在CD1d-/-小鼠的排泄淋巴结(draining lymph node)和全身淋巴器官中抑制CTL细胞溶解活性。上述结果表明由本发明的αGalCer诱导的免疫应答专一地受CD1d和KNT细胞调控。
实施例9：通过鼻内共同-施用抗原和αGalCer而激活先天T细胞并且将活 化的T细胞分化成为效应细胞
为了研究αGalCer对T细胞激活的作用，检测CD25在过继转移到同系基因的小鼠中的CFSE-标记的OT1细胞(OVA特异的CD8+T细胞)中的表面表达。通过使用CD8α(Ly-2)磁珠(Mitenyl Biotech)将OT1细胞从OT1小鼠分离，将其用10μM CFSE在37℃标记15分钟，然后静脉内转移到同系基因的小鼠中。过继转移后1天，对其进行单独的100μgOVA或与2.0μgαGalCer一起的鼻内施用。48小时后，使用FACS研究CD25在CLN中的表达。
如在图21中所示，在同时施用OVA和αGalCer的小鼠中，表达CD25的OT1细胞的水平高于只用OVA处理的那些小鼠，这表明αGalCer鼻佐剂诱导先天T细胞的活化。
为了证实活化的T-细胞是否分化成为完全功能性的CTL，通过如在实施例4中所述相同的方法，将2×106/ml细胞进一步用5μM OVA257-264肽刺激6小时，并且然后通过使用APC-缀合的IL-2(克隆JES6-5H4，Biolegend Inc.，美国)和APC-缀合的IFN-γmAb(克隆XMGl.2 BiolegendInc.，美国)检测细胞内的IL-2和IFN-γ水平。
如在图22中所示，在同时施用OVA和αGalCer的小鼠中，分泌IL-2和IFN-γ的OT1细胞水平高于只用OVA处理的那些小鼠。
上述结果表明，鼻内施用αGalCer诱导先天T细胞的激活，以及这些活化的T-细胞向强的效应T细胞的分化。
实施例10：通过鼻内共同-施用αGalCer和杀死的病毒而诱导的抗-病毒免 疫应答
为了检验αGalCer作为杀死的病毒的佐剂的作用，将用福尔马林灭活的流感病毒A/PR/8/34(PR8)用作检验所述抗-病毒免疫应答的抗原。将Balb/c小鼠用指定量的(1μg，10μg)单独的PR8或与αGalCer一起通过鼻内施用以两周的时间间隔免疫两次。最后免疫后两周，将小鼠处死，并且进行下述实验。
<10-1>研究体液免疫应答
从处死的小鼠分离鼻洗液、肺洗液和血清，并且通过如实施例1所述相同分方法观察其中抗体的生产。如在图23中所示，在用单独的灭活的PR8处理的小鼠组和用相同量的灭活的PR8和αGalCer一起同时处理的小鼠组之间进行比较。结果，在同时施用灭活的PR8和αGalCer的小鼠中，抗原-特异的全身IgG水平显著高于只有灭活的PR8处理的小鼠。如在图24中所示，在同时施用灭活的PR8和αGalCer的组中，鼻洗液和肺洗液中的黏膜S-IgA水平显著地升高。
上述结果证实，同时鼻内施用αGalCer和杀死的病毒强烈地诱导有力的体液免疫应答。
<10-2>研究免疫细胞增殖
将从处死的小鼠的脾和CLN分离的单细胞用灭活的PR8培养3天，并且加入[3H]-胸苷，并且继续培养18小时。当细胞增殖时，通过LSC检测结合的[3H]-胸苷的水平。如在图25中所示，在同时施用αGalCer的小鼠中，免疫细胞的增殖显著提高。
上述结果表明，鼻内施用αGalCer和杀死的病毒强烈地诱导免疫细胞增殖。
<10-3>由αGalCer诱导的IFN-γ和IL-4的生产
将从处死的小鼠的脾和CLN分离的单细胞用灭活的PR8培养5天。获得上层清液，并且通过如实施例2所述相同的方法检测其中的IFN-γ和IL-4水平。如在图26中所示，在同时施用αGalCer的小鼠的脾和CLN中，Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4的水平显著提高。
上述结果表明，用αGalCer和杀死的病毒鼻内免疫同时诱导Th1和Th2免疫应答。
<10-4>研究细胞介导的免疫应答
将从处死的小鼠的脾分离的单细胞用刺激细胞培养5天。为了获得刺激细胞，单细胞取自首次用于实验的Balb/c小鼠的脾，将所述细胞用γ-射线照射，导致细胞的灭活。然后，将灭活的细胞用活的PR8病毒感染。在将脾细胞用刺激细胞培养5天后，将效应细胞连续稀释3倍，接着与51Cr-标记的靶点细胞一起继续培养6小时。然后，检测培养物上层清液中残留的51Cr的量。通过用活PR8病毒感染P815肿瘤细胞(购自ATCC)并且用51Cr标记而制备靶点细胞。如在图27中所示，只在同时用αGalCer处理的小鼠中观察到靶点细胞-特异的细胞溶解活性。
上述结果表明，同时鼻内施用αGalCer和杀死的病毒诱导强的细胞介导的免疫应答。
<10-5>研究保护性免疫应答
如前文所述，同时鼻内施用αGalCer和杀死的病毒诱导强的体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。接着进行实验，以检验当活病毒侵入时，所述免疫应答是否能够激发保护性免疫应答。
将免疫的小鼠用20 LD50活的PR8病毒感染，并且3天后处死，以获得肺洗液。通过蚀斑测定而检测肺洗液中活的PR8的量。具体地，将MDCK细胞(购自ATCC)以95-100％的密度培养在6孔平板中。通过使用培养基将所述肺洗液连续稀释10倍，将其添加到平板上，接着感染1个小时。然后，除去肺洗液。向其中加入包含琼脂糖的培养基，接着在CO2培养箱中继续培养2-3天。用肉眼计数其中形成的蚀斑的数目。如图28中所示，在用10μg灭活的PR8和αGalCer同时免疫的小鼠中，没有观察到蚀斑，这表明诱导了可信的保护性免疫应答。
上述结果证实，同时鼻内施用杀死的病毒和αGalCer诱导强保护性免疫应答。
工业适用性
如前文所解释，本发明证实，用αGalCer和肿瘤-相关的抗原或病毒抗原同时鼻内免疫不但有效地诱导针对侵入的肿瘤细胞或病毒的体液免疫应答，还诱导细胞介导的免疫应答。因此，本发明的αGalCer可以有效地用作鼻疫苗佐剂，用于预防和治疗病毒感染与癌症。
本领域的那些技术人员应该理解，在前述描述中公开的观念和具体的实施方案可以容易地用作改进或设计实行本发明的相同目的的其它实施方案的基础。本领域的那些技术人员还应该理解，这样的等价实施方案没有背离在后附的权利要求中提出的本发明的精神和范围。

Claims (15)

1.抗原和以少于0.5w/v％的量作为佐剂的α-半乳糖基神经酰胺在制备用于治疗病毒感染或癌症的鼻内施用的疫苗组合物中的用途。
2.按照权利要求1的用途，其中所述病毒感染是流感。
3.按照权利要求1的用途，其中所述癌症是EG7肿瘤。
4.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的蛋白。
5.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的重组蛋白。
6.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的糖蛋白。
7.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的肽。
8.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的多糖。
9.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的脂多糖。
10.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是病原体的多聚核苷酸。
11.按照权利要求1的用途，其中所述抗原是癌细胞或病毒。
12.按照权利要求1的用途，其中所述疫苗组合物增强针对注射抗原的免疫应答。
13.按照权利要求1的用途，其中所述疫苗组合物增强IgA黏膜免疫应答和IgG全身免疫应答。
14.按照权利要求1的用途，其中所述疫苗组合物通过配发装置进行鼻内注射。
15.按照权利要求14的用途，其中所述配发装置是气溶胶或滴剂递送系统的形式。
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