KR20070008309A - 알파-갈락토실세라마이드를 아쥬반트로 포함하는 비강투여용 백신 조성물 - Google Patents

알파-갈락토실세라마이드를 아쥬반트로 포함하는 비강투여용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파-갈락토실세라마이드(αGalCer)를 아쥬반트로 포함하는 비강 투여용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 마우스의 비강으로 종양세포 항원 또는 바이러스 항원을 αGalCer와 함께 병용투여하여 종양 세포 또는 바이러스에 대한 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포성 면역반응을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 따라서 αGalCer는 바이러스 감염 및 암의 예방 또는 치료를 위한 비강 투여 백신용 아쥬반트로서 유용하게 사용될 수 있다.
알파-갈락토실세라마이드(αGalCer), 백신, 아쥬반트

Description

알파-갈락토실세라마이드를 아쥬반트로 포함하는 비강 투여용 백신 조성물{A VACCINE COMPOSITION COMPRISING ALPHA-GALACTOSYLCERAMIDE AS AN ADJUVATNT FOR INTRANASAL ADMINISTRATION}
도 1은 C57BL/6 마우스에 OVA 및 αGalCer의 병용 투여로 OVA-특이적 S(분비)-IgA및 전신 IgG 반응, 및 Th1 및 Th2 사이토카인의 유도를 보이는 결과로, 도 1a는 OVA 단독 또는 αGalCer와 함께 비강으로 일주일 간격으로 3회 면역한 다음 일주일 후에 면역화된 마우스의 비강(NW) 및 폐(LW) 세척액에서 OVA-특이적 IgA 수준(titer)을 나타낸 그래프이고, 도 1b는 혈청에서 OVA 특이적 전신 IgG의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 1c는 혈청에서 OVA 특이적 IgG 아이소타입의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 1d는 비장세포 및 림프절에서 분리한 세포를 OVA와 함께 4일 동안 배양한 후, 배양 상등액에서 IFN-γ 및 IL-4의 수준을 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 αGalCer가 C57BL/6 마우스의 생체내 조건에서 강력한 CTL 반응을 유도하는 것을 보이는 결과로, 도 2a는 면역후 같은 수의 OVA257 -264 펩타이드로 자극한 CFSEhigh 비장세포 및 자극하지 않은 CFSElow 비장세포를 면역화된 마우스의 정맥으로 주입하여 24시간 후, 마우스를 희생시켜 비장(spleen), 장간막 림프절(MLN), 및 경부 림프절(CLN)에서 펩티드로 자극된 비장세포의 죽음을 FACS로 분석한 그래프이고, 도 2b는 도 2a의 CTL 활성을 백분률로 나타낸 그래프이다.
도 3은 Balb/c 마우스에서 비강으로 OVA 및 αGalCer의 병용 투여가 OVA-특이적 항체 반응, Th1 및 Th2 사이토카인 및 CTL 활성을 유도함을 보이는 결과로, 도 3a는 최종 면역 일주일 후, 비강(NW) 및 폐(LW) 세척액에서 OVA-특이적 S-IgA의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 3b는 혈청에서의 OVA-특이적 전신 IgG의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 3c는 혈청에서의 IgG 아이소타입의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 3d는 비장세포 및 림프절에서 분리한 세포를 OVA와 함께 4일 동안 배양한 후, 배양 상등액에서 IFN-γ 및 IL-4의 수준을 ELISA로 측정한 그래프이고, 도 3e는 OVA와 함께 4일 동안 배양한 세포에서 IFN-γ를 생산하는 CTL을 FACS로 분석한 결과이다.
도 4는 비강 투여된 αGalCer가 Balb/c 마우스에서 점막 S-IgA 및 전신적 IgG 반응을 유도하여 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 감염에 대해 강력한 방어력을 나타낸 결과로, 도 4a는 Balb/c에 PR8 HA 단독 또는 αGalCer과 함께 비강으로 일주일 간격으로 3회 면역한 다음 2주 후에, 20LD50 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 비강으로 감염시켜 비강 세척액(NW), 폐 세척액(LW) 및 혈청(serum)에서 PR8 HA-특이적 IgA 수준을 나타낸 그래프이고, 도 4b는 혈청에서 PR8 HA-특이적 IgG 수준을 나타낸 그래프이고, 도 4c는 바이러스 감염 후 격일로 마우스의 생존율 및 체중 감 소율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 비강 투여된 αGalCer가 Balb/c 마우스에서 점막 S-IgA 및 전신적 IgG 및 CTL 반응을 유도하여 복제 결핍 생아데노바이러스 감염에 대해 강력한 면역력을 나타낸 결과로, 도 5a는 Balb/c에 베타-갈락토시다제 유전자를 가지고 있는 복제 결핍 생아데노바이러스 단독 또는 αGalCer과 함께 비강으로 이주일 간격으로 2회 면역한 다음 1주 후에, 비강 세척액(NW) 및 폐 세척액(LW)에서 베타-갈락토시다제-특이적 IgA 수준을 나타낸 그래프이고, 도 5b는 혈청에서 베타-갈락토시다제-특이적 IgG 수준을 나타낸 그래프이고, 도 5c는 베타-갈락토시다제로 비장세포를 자극한 후 세포내 사이토카인을 염색하여 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 C57BL6 마우스에서 비강으로 OVA 및 αGalCer의 병용 투여가 EG7 종양에 대해 강력한 방어력을 유도함을 보이는 결과로, 면역한 다음 2주 후에, 3x106 EG7 종양세포를 면역된 마우스의 좌측 옆구리에 피하로 접종하여, 14일 후 종양의 무게 및 종양의 발생률을 나타낸 그래프이다.
도 7은 αGalCer의 아쥬반트 활성은 독점적으로 CD1d 분자에 의해 매개됨을 보이는 결과로, 도 7a는 야생형(W/T) 및 CD1d-/-C57BL/6(CD1d-/-) 마우스에 OVA 및 αGalCer를 비강으로 일주일 간격으로 3회 면역화한 다음 1 주일째 같은 수의 OVA257-264 펩타이드로 자극한 CFSEhigh 비장세포 및 자극하지 않은 CFSElow 비장세포를 정맥 주사하여 24 시간 후, 혈청에서 OVA-특이적 IgG의 수준을 나타낸 그래프이고, 도 7b는 생체내 조건에서 CTL 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 OVA 및 αGalCer의 비강으로의 투여가 비감작 CD8+ T 세포를 활성화시키고 작동세포로 분화됨을 보이는 결과로, 도 8a는 CFSE로 표지된 OT1 세포를 정맥으로 동계 마우스에 전달하여 1일 후 OVA 단독 또는 αGalCer와 함께 비강으로 투여하여 24시간 후 경부 림프절(CLN)의 림프세포의 CD25의 표면 발현을 FACS로 분석한 그래프이고, 도 8b는 6시간 동안 OVA257 -264 펩티드로 자극 후 세포내 IL-2 및 IFN-γ의 생성을 FACS로 분석한 그래프이다.
본 발명은 알파-갈락토실세라마이드를 아쥬반트로 포함하는 비강 투여용 백신 조성물에 관한 것이다.
현재 다양한 종양성 질환 및 감염 질환에 대한 새로운 백신들이 지속적으로 개발이 되고 있다. 약독화된 병원균 또는 복제를 하지 않는 비활성화된 병원균을 이용했던 예전의 백신과는 대조적으로, 요즘의 백신은 합성, 재조합, 또는 정제된 소단위 항원으로 이루어진다.
인간의 면역기능을 이용하여 암을 치료하기 위한 면역요법에 대한 연구개발이 활발히 시도되고 있으나, 대부분의 인간의 암 세포는 항원 제시세포가 아니기 때문에 적절한 항원-항체 면역반응을 일으키지 못하거나, 암 세포에 대한 세포독성 T-세포가 활성화되지 않아서 효과적인 치료가 어렵다.
또한, 인플루엔자 감염에 의한 입원 및 사망률을 줄이기 위한 효과적이고 주된 수단으로 백신이 사용되고 있으나, 인플루엔자 바이러스와 같은 RNA 바이러스는 계속적인 항원 변이로 인한 백신 개발의 어려움에도 불구하고 인플루엔자가 전체인구에 주는 피해가 크기 때문에 백신을 개발하는 노력이 계속되고 있다.
항원의 주요 침입 경로는 구강, 비강, 후강, 소장, 대장, 생식기, 항문 등이 있으며, 이들 점막계는 병원성 항원에 대한 1차 방어선으로 전신성 면역체계와 함께 면역의 큰 축인 점막면역체계(Mucosa Immune system)를 이룬다. 그래서 많은 연구는 점막 및 전신성 면역 반응 모두를 효과적으로 유도할 수 있는 점막 백신을 개발하는데 중점을 두고 있다(Czerkinsky et al., Immunol. Rev., 170: 197, 1999; Belyakov et al., Proc, Natl. Acad. Sci U.S.A., 95: 1709, 1998; Berzofsky et al., Nat. Rev. Immunol., 1: 209, 2001; Kozlofsky et al., Curr. Mol. Med., 3: 217, 2003).
백신은 여러 가지 제형으로의 개발이 가능하다. 이 중에서 환자의 순응도, 투여용량, 투여의 용이성 및 부작용 발현율을 근거로 하여 볼 때, 가장 이상적인 제형은 비강투여백신이다.
백신을 투여하기 위한 주사의 사용은 주사 후 주사 부위의 통증을 유발하여 환자의 순응도를 악화시키고, 피부의 구멍난 부위가 감염의 원인이 될 수 있다. 하지만, 점막 백신 접종, 예를 들어 비강 백신 접종은 주사를 사용하지 않아도 되므로 전신 주사를 통한 백신 접종보다 용이하고 편리한 접종 방식이다. 더욱이, 점막 백신의 비강 투여는 구강 면역에 쓰이는 아쥬반트 및 병용투여되는 항원보다 흡수가 훨씬 빠르고, 간의 초회 통과 효과 및 소화기관에 의한 신진대사를 피할 수 있어 더 높은 생체이용률(bioavailability)을 가지고 있기 때문에, 훨씬 더 적은 양만을 필요로 하여 비용절감의 면에서도 매우 효율적이고, 투여되는 양이 적음으로 인해 부작용의 발현율이 현저히 낮다. (Remeo et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 29: 89, 1998).
하지만, 항원만을 포함하는 점막 백신은 면역반응을 유도하기 보다는 면역 관용 (immune tolerance)를 유도하기 때문에 아쥬반트의 병용투여가 요구된다. (Yuki et al., Rev. Med. Virol., 13: 293, 2003). 반면에, 현재 임상에서 점막면역유도에 사용할 수 있는 아쥬반트는 전무한 상태로, 점막면역, 특히 바강점막면역을 유도하는 아쥬반트의 개발은 절실하다.
면역학적 반응을 일으키는 여러 단계 중 특정 단계를 더 잘 일어나게 하거나 증폭시켜 궁극적으로 면역 반응이 더 잘 일어나게 하는 것을 아쥬반트라 정의한다. 아쥬반트는 단독으로 투여되었을 때는 면역성을 가지고 있지 않지만, 투여될 경우 항원에 대한 면역 반응을 증진시키고 지속시킬 수 있다. 전형적인 아쥬반트의 예는 오일 에멀젼(oil emulsion)(Freund's adjuvant), 사포닌(saponin), 알루미늄(aluminium) 또는 칼슘염(calcium salts)(alum), 비이온 블록 중합체 활성제(non- ionic block polymer surfactants), 지질다당류(lipopolysaccharides), 마이코박테리아(mycobacteria), 파상풍균 톡소이드(tetanus toxoid) 등이 알려져 있다.
알파-갈락토실세라마이드(α-galactosylceramide, αGalCer)는 원래 해면동물에서 추출된 당지질(glycolipid)로 NKT(Natural Killer T) 세포의 Vα14+ T 세포 수용체(TCR)에 대한 리간드(ligand)이고, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에 있는 CD1d 분자에 의해 제시됨이 알려졌다(kawano et al., Science, 278: 1626, 1997). NKT 세포가 활성화되면 많은 양의 IFN-γ 및 IL-4를 생산하고, 이것은 특정 질병 또는 감염에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다(Chen et al., J. Immunol., 159: 2240, 1997; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 10913, 2003).
몇 가지 종래 연구는 전신적으로 전달된 백신에서 αGalCer의 능력을 측정하였다. αGalCer는 감염(Gonzalez-Aseguinolaza et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: 8461, 2000; Gonzalez-Aseguinoalza et al., J. Exp. Med., 195: 615, 2002), 자가면역 질환(Laloux et al., J. Immunol., 166: 3749, 2001: Teige et al., J. Immunol., 172: 186, 2004) 및 종양(Hermans et al., J. Immunol., 171: 5140, 2003; Fujii et al., J. Exp. Med., 199: 1607, 2003; Hayakawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 9464, 2003)에 대해 효과적인 아쥬반트로 작용함을 보이고 있다.
또한, WO 2003/009812에서는 복강내, 근육내 및 정맥내 주사를 통하여 아쥬반트로 αGalCer를 투여시 항원-특이적 Th1-타입 반응 특히, CD8+ T 세포 반응을 증가시켰음을 개시하고, 대한민국 특허 공개번호 2003-0017733는 죽은 암세포와 αGalCer를 복강으로 동시 주입시 NKT 세포를 면역조절세포로 자극하여 T 세포의 활성화에 필요한 보조활성인자의 발현을 증가시켜 암세포를 억제함을 개시하였다.
하지만, 상기 문헌은 αGalCer가 아쥬반트로 전신 투여하여 세포성 면역반응만이 유도됨을 보이고, 비강 투여 백신용 아쥬반트로써의 기능에 관하여는 개시하고 있지 않다.
백신은 투여방법에 따라 투여 부위의 면역유도체계가 다르고, 면역 세포들의 다이나믹스(dynamics)가 다르기 때문에, 근육 또는 피하투여백신의 아쥬반트가 비강투여백신의 아쥬반트로 사용되거나, 혹은 반대로 비강투여백신의 아쥬반트가 근육 또는 피하투여백신의 아쥬반트로 사용될 수 있다는 논리는 면역학적인 측면에서 일반적으로 받아들여지지는 않고 있다. 즉, 체액성 면역반응과 세포성 면역반응의 측면에서 비강투여백신과 근육 또는 피하투여백신이 유도하는 면역반응은 서로 다르기 때문에, 근육투여백신의 아쥬반트를 비강투여백신의 아쥬반트로 사용하기 위하여서는 실험적인 검증이 선행되어야 한다. 예를 들면, 명반(alum)은 인체에 사용되어지는 유일한 백신 아쥬반트로 근육주사로 투여하지만, 비강투여백신의 아쥬반트로 사용되어지지는 못한다. 비강투여백신의 아쥬반트로 연구되고 있는 콜레라 톡신(cholera toxin)은 아직까지 실용화가 된 것은 아니지만, 그 특성상 근육투여백신의 아쥬반트로는 연구되고 있지 않다. 더욱이, 점막으로 침투하는 병원성 미생물에 대한 가장 중요한 면역반응은 분비성 IgA의 생성인데, 점막투여백신이외의 방법으로는 이를 생성할 수 없다. 또한, 점막투여백신은 점막면역반응과 전신면역 반응을 모두 유도하기 때문에 점막으로 침투하는 병원성 미생물뿐만 아니라, 이외의 경로를 통하여 침투하는 병원성 미생물 및 질환에 대하여 면역원성을 나타낼 수 있다. 따라서, 근육투여백신 또는 전신투여백신의 아쥬반트를 비강투여백신의 아쥬반트로 사용할 수는 없으며, 이를 위하여서는 실험적 검증과 임상적 검증이 선행되어야 한다(Infectious Disease Review 3:2, 2001; Nature Immunology 6: 507, 2005; Reviews in Medical Virology, 2003, 13:293-310; Nature Reviews Immunology, 1: 20, 2001).
이에 본 발명자들은 마우스의 비강으로 종양세포 항원 또는 바이러스 항원을 αGalCer와 함께 투여하여, 병용투여된 종양 세포 또는 바이러스에 대한 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포성 면역반응이 효과적으로 유도됨을 확인하였고, 이로써 αGalCer가 비강 내 투여용 백신의 아쥬반트로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 마우스의 비강으로 종양세포 항원 또는 바이러스 항원을 αGalCer와 함께 투여하여 투여된 종양 세포 또는 바이러스에 대한 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 효과적으로 유도함을 확인함으로써 αGalCer를 비강 투여용 백신의 아쥬반트로 사용하여 바이러스 감염 및 암의 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명은 항원 및 유효량의 알파-갈락토실세라마이드를 아쥬반트로 포함하는 비강 투여용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항원 및 알파갈락토실세라마이드를 비강에 병용투여하여 주입된 항원에 대한 전신면역반응과 점막면역반응을 동시에 증진시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 비강으로 투여하여 Th1 또는 Th2의 면역반응을 동시에 증진시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 백신 조성물을 비강으로 투여하여 IgA 점막 면역반응 및 IgG 전신적 면역반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 알파-갈락토실세라마이드를 포함하는 비강 투여용 백신 아쥬반트를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
알파-갈락토실세라마이드(α-galactosylceramide, αGalCer)는 원래 해면동물에서 추출된 당지질(glycolipid)로 Vα14+ T 세포 수용체(TCR)를 가지고 있는 NKT(Natural Killer T) 세포의 리간드(ligand)이고, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에 있는 CD1d 분자에 의해 제시됨이 알려졌다(Kawano et al., Science, 278: 1626, 1997). NKT 세포가 활성화되면 많은 양의 IFN-γ 및 IL-4를 생산하고, 이것은 특정 질병 또는 감염에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다(Chen et al., J. Immunol., 159: 2240, 1997; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 10913, 2003). 종래 연구는 활성화된 NKT 세포는 Th2 면역 반응으로 유도할 수 있다고 보고되고 있지만(Yoshmoto et al., Science, 270: 1845, 1995; Singh et al., J. Immunol. 163: 2373, 1999; Laloux et al., J. Immunol., 166: 3749), 다른 연구들은 활성화된 NKT 세포는 Th1 면역 반응으로 유도한다고 보고되고 있다(Hermans et al., j. Immunol., 171: 5140, 2003; Stober et al., J. Immunol., 170: 2540, 2003). 최근의 연구보고에 의하면, αGalCer 및 OVA를 함께 투여함으로써 수지상세포(DC)의 완전 성숙을 유도하여 OVA를 발현하는 종양에 저항성이 있는 항원-특이적 Th1 CD4+T 세포 및 CTL을 유도하였다(Fujii et al., J. Exp. Med., 198: 267, 2003; Fujii et al. J. Exp. Med., 199: 1607, 2004). 추가적으로, 본 발명자들은 αGalCer 및 OVA의 경구 투여로 생체내 조건에서 장간막림프절 DC의 완전 성숙을 유도하여 시험관 내 조건에서 T 세포의 분열을 유도하고 매우 높은 용량 및 낮은 용량의 항원 섭취에 의해 유도된 면역 관용을 억제하였다(Chung et al., Eur. J. Immunol., 34: 2471, 2004). 상기 결과는 αGalCer는 효과적이고 다양한 점막 아쥬반트로 작용할 수 있음을 제시하고, Th1 및 CTL 또는 Th2 면역 반응으로의 면역반응을 유도할 수 있음을 제시한다.
이에 본 발명자들은 C57BL/6 마우스 및 BalB/c 마우스에 αGalCer를 비강 으로 투여하여 OVA-특이적 점막 S-IgA 및 전신 IgG 항체 반응, Th1 및 Th2 사이토카 인 및 강력한 CTL 반응이 유도됨을 확인하였다.
αGalCer의 점막에서의 아쥬반트 활성을 조사하기 위하여, 지시된 양의 αGalCer와 100 ㎍의 OVA 또는 100 ㎍의 OVA 만을 PBS로 희석하여 20 ㎕ (10 ㎕/비강)의 부피로 만든 다음, 6-8 주령의 C57BL/6 마우스 또는 Balb/c 마우스 (Charls River Laboratories, Orient Co., Ltd., Korea)에 일주일 간격으로 3 회 면역화하였다.
αGalCer는 피토스핑고신(phytosphingosine)을 헥사코사노익산(hexacosanoic acid)과 결합시킨 다음, 보호/탈보호 및 갈락토실레이션 을 종래에 서술한 대로 수행하여 제조하였고(Takikawa et al., Tetrahedron, 54: 3141, 1998), 김상희 박사님께서 제공하여 주었다(서울대학교, Korea). αGalCer는 0.5% Tween20이 포함된 PBS에서 용해시켰고, 0.5% Tween20이 포함된 PBS를 모든 실험에서 담체로 사용하였다.
C57BL/6 마우스에서 OVA에 대한 체액성 면역 반응에서 αGalCer가 항원-특이적 점막 S-IgA(Secretory IgA)의 증가를 확인하였고(도 1a 참조), OVA에 특이적인 Th2 타입인 IgG1 및 Th1 타입인 IgG2a 수준이 현저히 증가되어 αGalCer가 Th1 및 Th2 면역 반응 모두를 유도함을 간접적으로 제시한다(도 1b 및 c 참조). 또한, Th1 타입 사이토카인인 IFN-γ 및 Th2 타입 사이토카인인 IL-4 모두 비장 및 CLN에서 상당히 증가시켜, Th1 및 Th2 면역 반응 모두를 유도함을 직접적으로 제시한다(도 1d 참조).
상기 결과는 αGalCer가 항원-특이적 점막 S-IgA(Secretory IgA) 및 전신 IgG 항체 반응을 유도할 수 있는 강력한 점막 아쥬반트임을 확인하였고 αGalCer는 C57BL/6 마우스에서 Th1 및 Th2 면역 반응 모두를 유도함을 확인하였다.
αGalCer를 정맥내 또는 구강으로 투여시 CTL 반응을 유도한다는 것은 잘 확립되어 있다(Fujii et al, J. Exp. Med., 198: 267,2003: Silk et al., J. Clin. Invest., 114: 1800, 2004). 이에 C57BL/6 마우스에 OVA와 αGalCer을 비강으로 주입시 CTL 반응을 유도하는지 조사한 결과 αGalCer로 처리된 모든 마우스 그룹은 농도 의존적 방법으로 강력한 용해 활성(lytic activity)을 보이고 점막(CLN) 및 전신적(비장 및 MLN) 모든 부위에서 세포독성 활성을 유도함을 확인하여(도 2a 및 B 참조) αGalCer는 국소적 및 전신적 면역 기관 모두에서 CTL을 유도할 수 있는 강력한 비강 백신 아쥬반트임을 제시한다. 상기 결과는 BALb/c 마우스에서도 같은 양상을 보여 C57BL/6 마우스에 국한된 현상이 아님을 확인하였다(도 3 참조).
αGalCer는 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34 감염에 대한 항 바이러스 면역 반응을 유도할 수 있는 비강 백신 아쥬반트 활성을 보인다. αGalCer에 의해 바이러스 감염에 대한 점막 보호의 수준을 결정하기 위하여, Balb/c 마우스에 일주일 간격으로 3 번 αGalCer와 함께 PR8HA 항원을 비강으로 면역하고 최종 면역후 2주째 20LD50 인플루엔자 바이러스를 비강으로 감염시킨 후 3일째, PR8 HA-특이적 항체 반응을 비강 세척액, 폐 세척액 및 혈청에서 측정한 결과 αGalCer가 처리된 모든 그룹에서 비강, 폐 세척액 및 혈청에서 높은 수준의 PR8 HA-특이적 IgA 항체가 검출되었고(도 4a 참조) 높은 수준의 PR8 HA-특이적 IgG 항체 또한 αGalCer가 처리 된 마우스의 혈청에서 검출됨을 확인하여(도 4b 참조) αGalCer는 바이러스에서 유래된 항원에 대한 전신 IgG 항체 반응뿐만 아니라, 점막 S-IgA를 유도하는 강력한 비강 아쥬반트임을 제시한다. 또한 GalCer과 함께 면역된 마우스에서보다 αGalCer 없이 면역된 마우스에서 더 심한 병변이 관찰되었고(도 4c 참조) 담체만이 투입된 그룹에서 바이러스 감염 후 10일 내에 모든 마우스가 죽고, OVA 만을 처리한 마우스의 57%는 14일 내에 죽은 반면, αGalCer 및 OVA를 비강으로 면역된 마우스에서는 생존률에서 의미있는 감소를 보이지 않았다(도 4c 참조). 따라서 αGalCer가 점막 S-IgA 항체, 전신 IgG 항체 및 바이러스 감염에 대한 방어력을 유도하는 강력한 비강 백신 아쥬반트임을 제시한다.
또한, Balb/c 마우스에 0.125 ㎍의 αGalCer와 베타-갈락토시다제 유전자를 가지고 있는 복제 결핍 생아데노바이러스(Adenovirus harboring β-galactosidase gene, Ad-LacZ)(Viromed, Korea)를 비강으로 면역시에도 αGalCer는 복제 불능 생바이러스에 대한 효과적으로 세포성 및 체액성 면역반응을 유도함도 확인하였다(도 5 참조).
αGalCer는 EG7 종양에 대한 항암 면역반응의 유도를 위한 비강 백신 아쥬반트 활성을 나타냄을 확인하였다. C57BL/6 마우스에 일주일 간격으로 3 회 OVA 및 αGalCer를 비강으로 면역 후 2주째, 3x106 EG7 종양세포를 면역된 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하로 접종하여 접종 후 14일째, 마우스를 희생시키고 생성된 종양의 무게를 측정한 결과, 0.5 ㎍ 및 2.0㎍의 αGalCer 및 OVA를 비강으로 주입된 마우 스에서 종양이 완전히 억제되었다(도 6 참조). 상기 결과는 αGalCer는 항암 면역 반응의 유도를 위한 강력한 비강 백신 아쥬반트로 사용될 수 있음을 제시한다.
αGalCer로 유도된 면역 반응이 CD1d 분자를 통해 매개되는지를 확인하기 위하여, CD1d 분자가 결여되고 따라서 NKT 세포를 결여된 CD1d-/- C57BL/6 마우스를 사용하여 최종 비강 투여 후 1주일째, 야생형 및 CD1d-/- C57BL/6 마우스의 혈청에서 전신 IgG 및 생체 내 조건에서 CTL 활성을 조사한 결과 전신 IgG 항체 반응은 CD1d-/- 마우스에서 상당히 억제되고(도 7a 참조), CD1d-/- 마우스의 배수 림프절(draining lymph node) 및 전신성 림프기관(systemic lymphoid organs)에서 CTL의 용해 활성이 억제됨을 확인하였으므로(도 7b 참조), 상기 결과는 본 발명에서 αGalCer에 의해 유도된 면역 반응은 독점적으로 CD1d 분자에 의해 매개됨을 확인하였다.
αGalCer의 비강 투여는 비감작 T 세포(naive T cell)를 활성화시키고 작용세포(effector cell)로 분화시킴을 확인하였다. T 세포 반응의 활성에 있어서 αGalCer의 역할을 명확히 하기 위하여, CFSE-표지된 OT1 세포를 동계 마우스(syngenic mice)로 입양전입(adoptive transfer)하고 입양전입 후 1일째, 마우스에 OVA 단독 또는 2.0 ㎍ αGalCer와 함께 비강으로 투여하고 48시간 후, CLN에서 CD25 분자의 발현을 분석한 결과, OVA 단독만을 투여한 마우스에서 보다 OVA와 αGalCer을 함께 비강으로 투여한 마우스에서 CD25를 발현하는 OT1 세포를 현저히 많이 검출할 수 있어, αGalCer 비강 아쥬반트는 비감작 T 세포의 활성을 유도한다는 것을 확인하였다(도 8a 참조). 또한 활성화된 T 세포가 기능을 가진 CTL로 분화되 는지를 확인하기 위하여, 세포를 6 시간동안 더 OVA257-264 펩티드로 자극하고 세포내 IL-2 및 IFN-γ를 측정한 결과, OVA 및 αGalCer를 비강으로 면역한 마우스에서 OT1 세포가 IL-2 및 IFN-γ를 더 많이 생산하는 것을 확인하여(도 8b 참조), 비강으로 병용투여된 αGalCer는 비감작 T 세포의 활성을 유도하고 활성화된 T 세포는 강력한 작용세포로 작용한다는 것을 제시한다.
상기 결과들은 αGalCer가 항감염 및 항암 면역 반응의 유도를 위한 강력한 비강 백신 아쥬반트로 사용될 수 있음을 제시한다.
따라서, 본 발명은 상기와 같이 효과가 입증된 유효량의 알파갈락토실세라마이드 아쥬반트와 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
"유효량의 아쥬반트"라는 용어는 당업계의 숙련된 자들에게는 잘 이해되는 것으로 비강으로 투여된 항원에 대한 면역반응을 촉진할 수 있는 αGalCer의 양을 의미한다. 다시 말해, 비강 세척액에서 IgA 수준을 측정하여, 아쥬반트를 포함하지 않는 같은 항원 조성물과 비교하여 IgA의 수준이 5% 이상, 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 증가하는 것을 의미한다.
따라서 본 발명에 따른 조성물에서 알파갈락토실세라마이드는 0.5 w/v%이하의 범위 내로 포함되는 것이 바람직하다.
"항원"은 숙주의 체내에 들어왔을 때, 숙주의 면역계에 의하여 인식되어 면역반응을 일으킬 수 있는 모든 물질 (예를 들면, 단백질, 펩타이드, 암세포, 당단 백질, 당지질, 생바이러스, 사바이러스, DNA 등)을 의미한다.
항원은 또한 정제된 또는 정제되지 않은 형태로 제공될 수 있으며, 정제된 형태로 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 지질다당류 및 DNA 분자(폴리뉴클레오티드), 암세포, 생바이러스, 사바이러스를 포함하는 항원에도 적용될 수 있다.
하기 항원 목록은 실시예의 수단으로 제공될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다: 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원(haemagglutinin 및 neuraminidase 항원), 백일해균(Bordetella pertussis) 항원(pertussis toxin, filamentous haemagglutinin, pertactin), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원, 헬리토박터파이로리(Helicobacterpylori) 항원(capsula polysaccharides of serogrup A, B, C, Y 및 W-135), 파상풍균 항원(tetanus toxoid), 디프테리아균(diphtheria) 항원(diphtheria toxoid), 폐렴균(pneumococcal) 항원(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide), 결핵균(tuberculosis) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160), 콜레라(cholera) 항원(cholera toxin B subunit), 포도상구균(staphylococcal) 항원(staphylococcal enterotoxin B), 적리균(shigella) 항원(shigella polysaccharides), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, 간염바이러스(hepatitis) 항원 (hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스(herpes simplex) 항원 또는 그의 조합(예, 디프테리아, 백일해균 및 파생풍균, DPT).
본 발명에 따른 비강 투여용 백신 조성물은 액체 또는 분말로 제조될 수 있으며, 투여를 위하여 에어로졸(aerosols), 드롭(drops) 또는 통기(insufflation)로 제형화할 수 있으며, 특히 분말제제나 미립구로 제형화는 것이 바람직하다.
비강 드롭으로 투여하기 위한 조성물은 일반적으로 조성물에 포함되는 예를 들어, 방부제, 점성 조절제, 삼투압 조절제, 완충제 등과 같은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다.
백신은 환자에서 면역반응을 자극하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 백신은 인간에게 일회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 1-250 ㎍이고 더욱 바람직하게는 2-50 ㎍이다.
알파-갈락토실사라마이드는 설치류 및 원숭이에서 독성을 유도하지 않는 것으로 보이고 있다(Nakata et al., Cancer Res., 58: 1202-1207, 1998). 2200 ㎍/Kg의 αGalCer가 주입된 마우스에도 부작용은 보고되고 있지 않다(Giaccone et al., Clin. Cancer Res., 8: 3702, 200). 본 발명에서도 αGalCer는 용량제한독성(dose-limiting toxicity)(50-4800 ㎍/m2)을 야기하지 않고, 용량증가실험(dose escalation study)에서도 내성을 보여 αGalCer는 안전한 물질로 판단된다.
본 발명은 항원 및 αGalCer를 비강에 병용투여하여 주입된 항원에 대한 면 역 반응을 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 항원과 αGalCer의 비강 내 병용투여는 분배기(dispensing device)를 통하는 것이 바람직하며, 에어로졸 전달 시스템의 형태가 더욱 바람직하다.
본 발명은 상기 항원과 αGalCer의 백신 조성물을 비강으로 투여하여 Th1 또는 Th2의 면역반응을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 항원과 αGalCer의 백신 조성물을 비강으로 투여하여 IgA 점막 면역반응 및 IgG 전신적 면역반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 αGalCer를 포함하는 비강 투여용 백신 아쥬반트를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예1 > C57BL /6 마우스에 α GalCer 의 비강 내 투여에 의한 OVA-특이적 점막 S- IgA 및 전신 IgG 항체 반응의 유도
지시된 양(0.125, 0.5, 2.0 ㎍)의 αGalCer와 100 ㎍의 OVA 또는 100 ㎍의 OVA 만을 PBS로 희석하여 20 ㎕ (10 ㎕/비강)의 부피로 만든 다음, 6-8 주령의 C57BL/6 마우스 또는 Balb/c 마우스 (Charls River Laboratories, Orient Co., Ltd., Korea)에 일주일 간격으로 3 회 면역화하였다.
αGalCer는 피토스핑고신(phytosphingosine)을 헥사코사노익산(hexacosanoic acid)과 결합시킨 다음, 보호/탈보호 및 갈락토실레이션 을 종래에 서술한 대로 수행하여 제조하였고(Takikawa et al., Tetrahedron, 54: 3141, 1998), 김상희 박사님께서 제공하여 주었다(서울대학교, Korea). αGalCer는 0.5% Tween20이 포함된 PBS에서 용해시켰고, 0.5% Tween20이 포함된 PBS를 모든 실험에서 담체로 사용하였다.
최종 면역 일주일 후 마우스를 희생시키고, ELISA로 OVA-특이적 항체 반응을 측정하였다. 비강 세척액 표본은 100 ㎕ 멸균 PBS로 비강 관을 조심히 세척함으로써 수거하였고(Yamamoto et al., J. Immunol., 161: 4115, 1998), 폐 세척액을 수거하기 위하여 기관지 폐포 세척액을 종래에 서술한 대로 수행하였다(Chung et al., Immunobiology 206: 408, 2002).
상기 비강 및 폐 세척액에서 OVA-특이적 IgG는 종래에 서술한 대로 수행하여 결정하였고(Chung et al., Immunobiology 206: 408, 2002), IgA, IgG1 및 IgG21 타이터(titiers)를 측정하기 위하여, 연속적으로 2배 희석된 샘플을 사용하여 타이터를 결정하였다. IgA 타이터를 결정하기 위하여, 호스래디쉬-퍼옥시다제-접합 고트 항-마우스 IgA(SIGMA, USA) 및 퍼옥시다제 기질, TMB(SIGMA, USA)를 사용하여 0.5N-HCl를 발색을 중지시키기 위하여 첨가하고 OD를 450nm에서 측정하였다. IgG, IgG1 및 IgG2a 타이터를 결정하기 위하여, 알칼린 포스파타제-접합 고트 항-마우스 IgG, IgG1 및 IgG21(Southern Biotech, USA) 및 포스파타제 기질, σ-니트로페닐 포스페이트(SIGMA)를 사용하였다.
도 1a에서 보듯이, 상기 비강 및 폐 세척액의 OVA-특이적 IgA 반응이 담체 나, OVA 단독만 투여된 마우스에서와 비교하여 2.0 ㎍ αGalCer 및 OVA가 투여된 마우스에서 현저히 유도되었다.
도 1b에서 보듯이, 다양한 양(0.125, 0.5, 2.0 ㎍)의 αGalCer 및 OVA를 비강 투여시 담체나, OVA 단독만 투여된 마우스에서보다 혈청에서 높은 수준의 OVA-특이적 IgG를 유도하였다.
OVA에 대한 체액 면역 반응에서 Th1 또는 Th2 중 어떤 면역 반응이 우세한지를 간접적으로 결정하기 위하여, 혈청에서 IgG 아이소타입을 결정하고 IgG1 대 IgG2a의 비율을 산출하였다.
도 1c에서 보듯이, αGalCer 및 OVA를 투여는 OVA에 특이적인 Th2 타입인 IgG1 및 Th1 타입인 IgG2a 수준이 현저히 증가되어 αGalCer가 Th1 및 Th2 면역 반응 모두를 유도함을 제시한다.
상기 결과는 αGalCer는 항원-특이적 점막 S-IgA(Secretory IgA) 및 전신 IgG 항체 반응의 유도할 수 있는 강력한 점막 아쥬반트임을 확인하였고 간접적으로 αGalCer는 C57BL/6 마우스에서 Th1 및 Th2 면역 반응 모두를 유도함을 확인하였다.
< 실시예 2> C57BL /6 마우스에서 α GalCer 비강 내 투여에 의한 Th1 및 Th2 사이토카인 유도
αGalCer가 Th1 또는 Th2 중 어느 면역 반응으로 유도하는지 직접적으로 측정하였다. 사이토카인 생산을 조사하기 위하여, 최종 면역 후 일주일째 비장 및 경부림프절(cevical lymph node, CLN)에서 세포를 수득하여 5x106 세포/㎖를 4일 동안 500 ㎍/㎖ OVA와 함께 배양하고, 배양 상층액에서 IFN-γ 및 IL-4의 분비 패턴을 제조사의 지시에 따라 마우스 IFN-γ 및 IL-4 OptELA set ELISA 키트(BD Pharmigen)로 측정하였다.
도 1d에서 보듯이, IFN-γ 및 IL-4의 생성량은 모두 비장 및 CLN에서 상당히 증가되었다. 높은 농도의 αGalCer가 많은 양의 IFN-γ 생성을 유도하고, IL-4의 수준은 CLN에서 병용투여하는 αGalCer의 양에 비례적으로 증가하였다.
상기 결과는 αGalCer의 비강 투여는 전신(비장) 및 점막(CLN) 구획 모두에서 혼합된 Th1(IFN-γ) 및 Th2(IL-4) 면역 반응을 유도하였다.
< 실시예 3> C57BL /6에서 α GalCer 비강 내 투여에 의한 강력한 CTL 반응 유도
αGalCer를 정맥 내 또는 구강으로 투여시 CTL 반응을 유도한다는 것은 잘 확립되어 있다(Fuji et al, J. Exp. Med., 198: 267,2003: Silk et al., J. Clin. Invest., 114: 1800, 2004). αGalCer을 비강으로 주입시 CTL 반응을 유도하는지 조사하였다.
비감작된 C57BL/6 마우스에서 비장세포를 분리하여, 1μM OVA257 -264로 37℃에서 90분 동안 자극하였다. 자극된 세포에는 20 μM CFSE(Molecular Probes, USA)로 37℃에서 15분동안 표지하여 OVA257 -264로 자극 CFSEhigh 세포를 준비하고, 자극되지 않은 세포에는 2 μM CFSE(Molecular Probes, USA)로 37℃에서 15분 동안 표지하여 OVA257 -264로 자극되지 않은 CFSElow세포를 준비하였다. OVA257 -264로 자극된 CFSEhigh 세포와 OVA257 -264로 자극되지 않은 CFSElow 세포를 동량으로 혼합한 다음 2x107의 세포를 최종면역 후 일주일째 마우스에 정맥내 주사하였다. 24 시간 후, 비장, 장간막림프절(mesenteric lymph node, MLN) 및 경부림프절(cervical lymph node, CLN)에서 펩티드로 펄스된 CFSEhigh 세포의 특이적 용해(lysis)를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석하였다.
도 2a 및 B에서 보듯이, αGalCer로 처리된 모든 마우스 그룹은 농도 의존적 방법으로 강력한 용해 활성(lytic activity)을 보였다. 흥미롭게도, 점막(CLN) 및 전신적(비장 및 MLN)으로 세포독성 활성을 유도하였다.
상기 결과는 αGalCer는 국소적 및 전신적 림프 기관 모두에서 CTL을 유도할 수 있는 강력한 비강 백신 아쥬반트임을 제시한다.
< 실시예 4> Balb /c 마우스에서 α GalCer 아쥬반트의 비강 내 투여에 의한 체액성 및 세포성 면역 반응 유도
< 실시예 4-1> 항체 및 사이토카인( 체액성 면역) 측정
αGalCer가 Balb/c 마우스에서도 강력한 비강 백신 아쥬반트로 사용될 수 있는지 조사하기 위하여, 실시예 1에서 기술한 대로 Balb/c 마우스(Charles River Laboratories, Oriet Co., Ltd., Korea)에 다양한 양(0.125, 0.5, 2.0㎍)의 αGalCer 및 100 ㎍ OVA를 비강 투여하여 혈청에서의 OVA-특이적 IgG, OVA-특이적 IgG1 및 IgG2a뿐만 아니라, 비강 및 폐 세척액에서 OVA-특이적 IgA 반응를 측정하였다.
도 3a 및 B에서 보듯이, Balb/c 마우스(Charles River Laboratories, Oriet Co., Ltd., Korea)에서, αGalCer 및 OVA를 비강 투여시 담체나, OVA 단독만 투여된 마우스에서보다 혈청에서 높은 수준의 OVA-특이적 IgG뿐만 아니라, 비강 및 폐 세척액에서 높은 수준의 OVA-특이적 IgA 반응을 유도하였다.
도 3c에서 보듯이, αGalCer 및 OVA의 비강 투여로 OVA-특이적 IgG1 및 IgG2a의 수준이 현저히 증가하였다.
실시예 2에서 기술한 대로 Balb/c 마우스(Charles River Laboratories, Oriet Co., Ltd., Korea)에 다양한 양(0.125, 0.5, 2.0)의 αGalCer 및 OVA를 비강 내 투여하여 비장 및 CLN에서 IFN-γ 및 IL-4를 측정하였다.
도 3d에서 보듯이, αGalCer-투여된 모든 그룹에서 IFN-γ 및 IL-4 모두 상당한 수준으로 유도되었다. 흥미롭게도, 혈청에서 IgG 항체의 수준 및 비장에서 IL-4 생산은 0.5 ㎍의 αGalCer이 비강으로 투여된 마우스에서 가장 높았고, αGalCer의 농도가 증가할 수록 감소하였다. 더욱이, 폐 세척액에서 점막 IgA 및 CLN에서 IL-4 생산은 αGalCer이 투입된 양에 반비례하였다.
종합적으로, αGalCer의 높은 농도는 Balb/c 마우스에서 투입된 항원에 대한 관용(tolerance)을 유도하는 것으로 보인다.
< 실시예 4-2> 세포독성활성(세포성 면역) 측정
OVA에서는 Balb/c 마우스의 MHC class I 분자에 결합하는 에피토프 펩티드가 없기 때문에, Balb/c 마우스에서 αGalCer 아쥬반트에 의해 유도된 세포독성활성(cytotoxic activity)을 조사하기 위하여, IFN-γ를 생산하는 CD8+T 세포의 수를 측정하였다(도 3e). 2x106 세포/㎖를 500 ㎍/㎖ OVA와 함께 4일 동안 배양하고, 1 ㎕/㎖ GolgiPug™(BD Pharmigen, USA)을 마지막 6시간 전 첨가한 후, FITC-접합 CD3 항체(Clone 145-2C11, Biolegend Inc, USA), PE-접합 CD8 항체(Clone 53-6.7, Biolegend Inc, USA), 및 APC-접합 IFN-γ 항체(Clone XMG1.2, Biolegend Inc, USA)를 이용하여 염색하였다. 세포내 염색(intracelluar staining)은 BD Cytofix/Cytoperm Plus™(BD Pharmigen, USA)로 제조사의 지시에 따라 수행하였고, 염색된 세포는 FACSCalibur(BD Bioscience, USA) 및 CellQuest software(BD Bioscience, USA)를 이용하여 분석하였다.
도 3e에서 보듯이, αGalCer의 농도가 증가할수록, IFN-γ를 생산하는 CD8+T 세포의 수가 감소하였다. 도 3d의 샌드위치 ELISA에 검출된 IFN-γ의 양은 αGalCer 농도 의존성을 보이지 않지만, IFN-γ를 생산하는 CTL의 수는 αGalCer의 농도에 역비례하였다. 상기 의존성에 대한 가능한 설명으로, 샌드위치 ELISA에 의해 검출된 IFN-γ의 양은 CD4+, CD8+ T 세포 또는 APC와 같은 IFN-γ를 생산하는 모든 종류의 세포가 분비한 것이지만, FACS에 의해 검출된 CTL의 수는 CD8+ T 세포만을 제시하기 때문이다.
종합적으로, 상기 결과는 αGalCer가 Balb/c 마우스에서도 강력한 비강 백신 아쥬반트 활성을 가짐을 제시한다.
< 실시예 5> α GalCer 비강 내 투여에 의해 인플루엔자 바이러스A/PR/8/34 감염에 대한 항바이러스 면역 반응 유도
αGalCer에 의해 바이러스 감염에 대한 점막 보호의 수준을 결정하기 위하여, Balb/c 마우스에 일주일 간격으로 3회 αGalCer와 함께 또는 단독으로 Davenport의 방법에 의해 준비된 (Davenport et al., J. Lab. Clin. Med., 63: 5, 1964) PR8 HA 항원(Dr. Shin-Ichi Tamura, Osaka University, Japan)을 비강으로 면역하고 최종 면역 후 2주째 20LD50 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/34를 비강으로 감염시켰다. 바이러스 감염 후 3일째, 실시예 1에서 기술한 대로 비강 세척액, 폐 세척액 및 혈청을 분리하여 PR8 HA-특이적 항체 반응을 측정하였다. 추가적으로, 감염된 마우스의 체중 감소 및 생존율을 격일로 14일 동안 관찰하였다.
도 4a에서 보듯이, 흥미롭게도, αGalCer가 처리된 모든 그룹의 비강, 폐 세척액 및 혈청에서 높은 수준의 PR8 HA-특이적 IgA 항체를 검출하였다. 도 4b에서 보듯이, 높은 수준의 PR8 HA-특이적 IgG 항체 또한 αGalCer가 처리된 마우스의 혈청에서 검출되었다.
상기 결과는 αGalCer는 바이러스에서 유래된 항원에 대한 전신 IgG 항체 반응뿐만 아니라, 점막 S-IgA를 유도하는 강력한 비강 아쥬반트임을 제시한다.
도 4c에서 보듯이, 생존률, 체중 감소,및 체중 감소 회복에 걸리는 시간에 의해 제시되듯이, αGalCer와 함께 병용면역된 마우스에서보다 αGalCer 없이 면역된 마우스에서 더 심한 병변을 관찰하였다. 담체만이 투입된 그룹에서 바이러스 감염 후 10일 내에 모든 마우스가 죽고, OVA 만을 처리한 마우스의 57%는 14일 내에 죽은 반면, αGalCer 및 OVA를 비강으로 면역된 마우스에서는 생존률에서 의미있는 감소를 보이지 않았다.
상기 결과는 αGalCer가 점막 S-IgA 항체, 전신 IgG 항체 및 바이러스 감염에 대한 보호를 유도하는 강력한 비강 백신 아쥬반트임을 제시한다.
< 실시예 6> α GalCer 비강 내 투여에 의해 복제 결핍 생바이러스 감염에 대한 항바이러스 면역 반응 유도
Balb/c 마우스에 이주일 간격으로 2회 0.125 ㎍의 αGalCer와 함께 또는 단독의 106pfu의 베타-갈락토시다제 유전자를 가지고 있는 복제 결핍 생아데노바이러스(Adenovirus harboring β-galactosidase gene, Ad-LacZ)(Viromed, Korea)를 비강으로 면역하고 최종 면역 후 1주째, 실시예 1에서 기술한 대로 비강 세척액, 폐 세척액 및 혈청을 분리하여 베타-갈락토시다제-특이적 항체 반응을 측정하였다. 또한 CTL 활성을 측정하기 위하여, 5일 동안 2.5 ㎍/mL의 베타-갈락토시다제로 비장세포를 자극하고 실시예 <4-2>에서 서술한 대로, 세포내 사이토카인을 염색하여 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포를 측정하였다.
도 5a 및 B에서 보듯이, 음성대조군(vehicle) 또는 Ad-LacZ 단독이 처리된 그룹에 비하여, αGalCer가 병용투여된 그룹의 비강(NW) 및 폐 세척액(LW)에서 높은 수준의 베타-갈락토시다제-특이적 S-IgA 및 혈청(serum)에서의 베타-갈락토시다제-특이적 IgG 항체를 검출하였다.
더욱이 도 5c에서 보듯이, αGalCer가 병용투여된 그룹에서 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포의 수가 상당히 증가함을 확인하였다.
상기 결과는 αGalCer는 복제 결핍 생바이러스에 대한 효과적인 비강 백신용 아쥬반트임을 제시한다.
< 실시예 7> α GalCer 비강 내 투여에 의해 EG7 종양에 대한 항암 면역반응의 유도
αGalCer가 항암활성 유도를 위한 비강 백신 아쥬반트로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스에 일주일 간격으로 3회 100 ㎍ OVA 단독 또는 αGalCer(0.125. 0.5, 2.0 ㎍)과 함께 비강으로 면역하였다. 최종 면역 후 2주째, 3x106 EG7 종양세포를 면역된 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하로 접종하였다. 접종 후 14일째, 마우스를 희생시키고 생성된 종양의 무게를 측정하였다.
도 6에서 보듯이, 담체 또는 OVA 단독을 주입한 모든 마우스 및 0.125 ㎍ αGalCer를 면역한 마우스의 1/3에서 명백한 종양을 확인하였다. OVA 단독만을 비강으로 면역한 마우스에서의 종양의 무게는 담체 단독만을 면역한 마우스에서보다 현저하게 무거웠다(p<0.05). 가장 흥미롭게도, 종양의 형성은 0.5 ㎍ 및 2.0㎍의 αGalCer 및 OVA를 비강으로 주입된 마우스에서 완전히 억제되었다.
상기 결과는 αGalCer는 항암 면역 반응을 유도하는 강력한 비강 백신 아쥬반트로 사용될 수 있음을 제시한다.
< 실시예 8> CD1d 분자의 매개에 의한 α GalCer 의 비강 내 아쥬반트 활성
αGalCer로 유도된 면역 반응이 CD1d 분자를 통해 매개하는지를 확인하게 위 하여, CD1d 분자가 결여되어 NKT 세포가 결여된 CD1d-/- C57BL/6 마우스(Charles River Lab., Orient Co. Ltd., Korea)를 이용하였다(Park et al., J. Exp. Med., 193: 893, 2001). 최종 비강 투여 후 1주일째, 실시예 1 및 3에서 기술한 대로 야생형 및 CD1d-/- C57BL/6 마우스에서 혈청에서 전신 IgG 및 생체 내 조건에서 CTL 활성을 조사하였다.
도 7a에서 보듯이, 전신 IgG 항체 반응은 CD1d-/- 마우스에서 상당히 억제되었다.
도 7b에서 보듯이, CD1d-/- 마우스의 배수 림프절(draining lymph node) 및 전신성 림프기관(systemic lymphoid organs)에서 CTL의 용해 활성이 억제되었다. 상기 결과는 본 발명에서 αGalCer에 의해 유도된 면역 반응은 독점적으로 CD1d 분자에 의해 매개된다는 것을 제시한다.
< 실시예 9> α GalCer 비강 내 투여에 의한 비감작 T 세포(naive T cell) 활성 및 작용세포( effector cell)로의 분화 유도
T 세포 반응의 활성에 있어서 αGalCer의 역할을 확인하기 위하여, 동계 마우스(syngenic mice)로 입양전입(adoptive transfer)된 CFSE-표지된 OT1 세포(OVA 특이적 CD8+ T 세포)에서 표면 CD25의 발현을 측정하였다. OT1 세포를 CD8α(Ly-2) 마그네틱 비드(Miltenyl Biotec)를 이용하여 OT1 마우스에서 분리하여 10 μM CFSE로 37℃에서 15분 동안 표지하고 동계 마우스의 정맥 내로 전달하였다. 입양전입 후 1일째, 마우스에 100 ㎍ OVA 단독 또는 2.0 ㎍ αGalCer와 함께 비강으로 투여하였다. 48시간 후, CLN에서 CD25 분자의 발현을 유세포분석기(FACS)를 이용 하여 분석하였다.
도 8a에서 보듯이, CD25를 발현하는 OT1 세포의 집단을 OVA 단독만을 투여한 세포에서보다 OVA와 αGalCer을 함께 비강으로 투여한 마우스에서 더 많이 검출할 수 있어, αGalCer 비강 아쥬반트는 비감작 T 세포의 활성화를 유도한다는 것을 제시한다.
활성화된 T 세포가 기능을 가진 CTL로 분화되었는지를 확인하기 위하여, 실시예 4에서 기술한 대로 2x 106/㎖ 세포를 6 시간 동안 더 5 μM OVA257 -264 펩티드로 자극하고 APC 접합된 IL-2(Clone JES6-5H4, Biolegend Inc., USA) 및 APC 접합된 IFN-γ 항체(Clone XMG1.2 Biolegend Inc., USA)를 이용하여 세포내 IL-2 및 IFN-γ를 측정하였다.
도 8b에서 보듯이, OVA 단독만을 면역한 마우스에서보다 OVA 및 αGalCer를 비강으로 면역한 마우스에서 L-2 및 IFN-γ를 생산하는 OT1 세포를 더 많이 관찰할 수 있었다.
종합적으로 상기 결과는 비강으로 투여된 αGalCer는 비감작 T 세포의 활성을 유도하고 활성화된 T 세포는 강력한 작용세포로 작용한다는 것을 제시한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 마우스의 비강으로 종양세포 항원 또는 바이러스 항원을 αGalCer와 함께 면역한 후 투여된 종양 세포 또는 바이러스에 대한 체액성 면역 반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 효과적으로 유도함을 확인하였다. 따라서 αGalCer는 바이러스 감염 및 암의 예방 또는 치료를 위한 투여 백신용 아쥬반트로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 항원 및 유효량의 알파-갈락토실세라마이드를 아쥬반트로 포함하는 비강 투여용 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 항원은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 비강 투여용 백신 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 항원은 세포 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 비강 투여용 백신.
  4. 제 1항에 있어서, 아쥬반트로 알파-갈락토실세라마이드를 0.5 w/v% 이하로 포함하는 비강 투여용 백신 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 비강 투여용 백신 조성물은 액제, 분말제제나 미립구로 제제화되는 것을 특징으로 하는 비강 투여용 백신 조성물.
  6. 항원 및 알파-갈락토실세라마이드를 비강에 병용투여하여 주입된 항원에 대한 전신면역반응과 점막면역반응을 동시에 증진시키는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 항원 및 알파-갈락토실세라마이드를 분배기(dispensing device)를 통해 비강에 투여하여 주입된 항원에 대한 면역반응을 증진시키는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 분배기는 에어로졸 또는 점적 전달 시스템의 형태인 것을 특징으로 하는 면역반응을 증진시키는 방법.
  9. 제 1항의 백신 조성물을 비강으로 투여하여 Th1 및 Th2의 면역반응을 동시에 증진시키는 방법.
  10. 제 1항의 백신 조성물을 비강으로 투여하여 IgA 점막 면역반응 및 IgG 전신적 면역반응을 증가시키는 방법.
  11. 알파-갈락토실세라마이드를 포함하는 비강 투여용 백신 아쥬반트.
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