KR101540081B1 - 보체 활성 향상을 위한 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

백신 면역원성을 합성 당지질 PBS-57과 백신의 병용투여로 향상시킨다. PBS-57은 세포매개성 면역반응 및 체액형 면역반응을 동시 자극하는 능력이 있다. PBS-57과 백신의 병용투여는 하나 이상의 체액형 면역반응, CD4+ T 세포 반응 및 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 자극하는 방법에 이용할 수 있다.

Description

보체 활성 향상을 위한 백신 조성물 {VACCINE COMPOSITIONS FOR ENHANCING ADJUVANTICITY}
본 발명은 보체 활성 (애주번트 활성:adjuvanticity)을 향상하기 위한 백신조성물에 관한 것이다.
백신의 기본 목적은 병리적 조건에 대해 면역성을 발휘하는 것이다. 이상적인 백신은 기본적으로 활성 항체를 제공하고 세포매개의 면역성을 확보하며 또한 고특이적 반응성과 더불어 "기억력"을 갖는 T 및 B 림프구를 활성화하여 병원균으로부터 이를 보호한다.
애주번트(보체)는 면역반응을 비특이적으로 증대시킨다. 애주번트가 면역계를 향상시키는 메카니즘은 광범위하다. 애주번트는 "면역조절형" 혹은 "항원전달계"로 분류되기도 한다. 면역조절형 애주번트는 림포카인 생성을 변화시켜 면역세포의 작용을 조절함으로써 면역계를 준비한다. 다른 한편, 항원전달계는 항원을 적절한 면역세포에 전달하는 역할을 한다. 애주번트는 면역반응 속도 혹은 기간을 개선하거나, 항체 활성, 특이성, 이성체 혹은 서브군 분포를 조정하거나, 세포매개 면역성을 자극하거나, 점막 면역성을 촉진하거나, 또는 면역학적 미성숙 혹은 노쇠 개체의 면역반응을 향상시킨다. 애주번트는 체액형 혹은 세포매개성 면역반응, 또는 이들의 조합에 영향을 미칠 수 있다.
면역조절이란 세분된 서브군의 면역세포들을 활성화시켜 림포카인 반응을 변화시키는 애주번트의 능력을 말한다. CD4+ T 림프구의 두가지 주요한 서브군은 Th1 및 Th2로서 이들은 면역반응을 결정하는데 주요한 역할을 한다. Th1의 반응은 통상적으로 보체고정(complement fixing) 항체 및 지연형 과민반응(DTH)을 유발하고 γ-IFN, IL-2 및 IL-12와 연계되는 반면, Th2의 반응은 항체의 순환 및 분비 수준을 높이고 사이토카인 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10과 연계된다. Th1 세포의 활성화는 또한 세포독성 CD8+ T 세포의 증식을 활성화시켜 세포 면역반응을 조절하고 또한 표적세포의 세포용해를 향상시킨다.
지질의 애주번트 성질에 대한 다수의 연구가 있다. 펩티드 항원과 달리, 지질은 β2 마이크로글로불린계 분자들의 CD1족에 의해 처리되며 면역계 내에 존재한다. CD1 분자는 진화하여 외래 항원 또한 특정 T세포 서브군에 발현되는 자기지질 항원을 포획 및 가공한다. CD1 생성 경로는, 2종류의 보체 CD1 제한 T 세포 서브군 즉, 애주번트 활성을 실행하는 자연 킬러 T(NKT) 세포 및 헬퍼나 세포용해 기능을 수행하는 비-NKT T 세포를 활성화하여 선천적 및 변형된 면역반응을 모두 촉발한다. NKT 세포는 자연 킬러(NK) 세포 표면 마커와 더불어, 보존된 불변 T 세포 수용체(TCR), 예컨대, 생쥐의 경우 Vα24-Jα18/Vβ8 및 인간의 경우 Vα24-Jα18/Vβ11를 함께 발현한다. 따라서, NKT 세포는 항균 반응, 항암 면역 및 내성과 자가면역간 균형 조절 등을 포함하는 다수의 면역 기능에 중요한 역할을 한다.
다수의 자연 및 합성 지질 분자를 항원-제공 세포로 가공처리하여 CD1 분자를 통해 NKT 세포로 전달한다. 체내 및 체외 NKT 세포 활성화의 연구에 이용하는 원형 화합물은 KRN7000, 및 해양 해면 Agelas mauritianus 에서 유래된 α-갈락토시세라미드 ("αGalCer")이다. 최근 확인된 또다른 화합물은, 내인성 당지질인 이소글로보트리헥소실세라미드 ("iGB3") 및, 본원에 참고로서 수록된 PCT 출원 PCT/US07/66250에 개시된 변형 6"아미노6" 데옥시갈락토시세라미드인 PBS-57를 포함한다. 이들 화합물은 NKT 세포를 활성화하고 체외 사이토카인 반응을 상승 조절한다. 그러나, 체내 백신화 측면에서 이들 화합물의 지질 보체활성의 효능은 거의 다룬 적이 없다.
독성 부작용 탓에 애주번트는 인간 백신에 허용되지 않았다. 실제로 대부분의 일반적인 애주번트는 알루미늄과 오일 애주번트인데 이들은 발열, 두통, 근육통 및 통증이나 발진 등의 부작용을 유발하는 것으로 알려졌다. 기타의 단점으로서, 예컨대, 나중에 통증, 발적, 붓기 혹은 주사 부위의 혹 등을 유발하는 면역계에 대한 고강도 국소적 자극을 포함한다. 애주번트는 또한 복잡한 백신 조제 방법을 수반하며 약한 항원의 면역원성을 증대하는데 실패하기도 한다. 현재, 인간 백신접종 용도의 애주번트를 선택함에 있어 보체활성의 필요성 및 수용가능한 부작용 수준을 적절히 상충시키고 있다. 따라서 부작용을 한층더 감소시키면서 장기적이고 지속적인 보호 면역성을 달성하는 새로운 애주번트가 요구되고 있다.
본 발명자는 PBS-57로 정의된 합성 당지질을 백신 조제물에 첨가하여 대상자에게 투여시 인간 및 세포형 면역반응을 모두 활성화할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 PBS-57 및 백신을 대상자에게 병용투여함으로써 상기 대상자에 있어 백신 면역원성을 향상하고, CD4+ T 세포 반응을 자극하고, 또한 CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
애주번트는 다양한 방식으로 백신 조제물내 항원의 면역원성을 개선한다. 독소의 경우 양호한 체액형 면역반응이 필요하다. 세포내 박테리아의 경우 세포매개성 반응, 즉, 세포독성 T 세포와 Th1 세포가 주로 매개하는 반응이 중요하다. 또한 바이러스 감염의 경우 체액형 및 세포매개성 반응이 모두 기본적으로 감염 억제에 중요하다. 체액형 면역반응에 국한하지 않고 세포매개성 면역반응도 개선하는 애주번트의 능력은 장기지속 면역성을 더욱 개선할 수 있다. 고효능의 애주번트는 각종 항원과 조합시 유용할 수 있다. 본 발명자는 당지질 BPS-57이 체내의 세포매개성 및 체액형 면역반응을 모두 자극하는 능력을 갖는다는 것을 발견하였다. 또한, PBS-57은 약한 명목항원에 대한 면역반응을 자극하여 항체를 생성하고 또한 동시에 특이적 표면 항원 발현의 세포를 세포매개성 용해에 이용할 수 있다.
도 1은 배양된 말초 혈액 림프구(PBL)의 CD3+ T 세포 집단을 다양한 양의 애주번트 당지질 αGalCer, PBS20, PBS25 및 PBS57로 처리했을 때 제7일의 NKT 세포 비율을 나타내는 그래프이고;
도 2는 배양된 PBLs의 CD3+ T 세포 집단을 다양한 양의 αGalCer, PBS25, PBS57 및 PBS83으로 처리했을 때 제7일의 NKT 세포 비율을 나타내는 그래프이고;
도 3은 αGalCer, PBS20, PBS25, PBS57 및 PBS83으로 처리한 대상자로부터 추출한 PBL의 체외 배양물에서 NKT 세포의 증가를 나타내는 그래프이고, 중간값은상기 그래프에 도시되며;
도 4a는 αGalCer, PBS57 및 PBS83 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장 내에 존재하는 TCRαβ 세포의 비율을 나타내는 그래프이고; 도 4b는 애주번트 당지질 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장에 존재하는 TCRαβ 집단내의 NKT 세포의 비율을 나타내는 그래프이며, 이때 각 애주번트의 2중 꼬리 p값은 대조군과 비교하여 계산했고;
도 5a는 애주번트 당지질의 정맥 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장으로부터 얻은 CD11c+CD8α- 세포 집단내 CD40+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이고; 도 5b는 애주번트 당지질의 정맥 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장으로부터 얻은 CD11c+CD8α+ 세포 집단내 CD40+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이며; 도 5c는 애주번트 당지질의 정맥 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장으로부터 얻은 CD11c+CD8α- 세포 집단내 CD80+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이고; 도 5d는 애주번트 당지질의 정맥 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장으로부터 얻은 CD11c+CD8α+ 세포 집단내 CD80+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이며; 도 5e는 애주번트 당지질의 정맥 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장으로부터 얻은 CD11c+CD8α- 세포 집단내 CD86+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이고; 또한 도 5f는 애주번트 당지질의 정맥 투여후 24시간 뒤에 생쥐의 비장으로부터 얻은 CD11c+CD8α+ 세포 집단내 CD86+ 세포의 비율을 나타내는 그래프이며;
도 6은 오브알부민(Ova) 단독 혹은 Ova와 αGalCer의 조합으로 면역처리한 생쥐에서 항원제공 세포의 특이적 용해에 대한 측정 평가시 유세포 분석 CFSE 염색법의 결과를 나타내는 도트 그래프 및 히스토그램을 나타내고;
도 7은 Ova가 있거나 없는 조건에서 애주번트로 면역처리한 생쥐의 비장내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 8은 Ova를 상이한 농도의 αGalCer와 조합하여 정맥주사한 ("IV") 생쥐의 혈액내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 9는 Ova를 상이한 농도의 PBS57과 조합하여 IV 주사한 생쥐의 혈액내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 10은 PBS57을 상이한 농도의 Ova와 조합하여 IV 주사한 생쥐의 혈액내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 11은 Ova를 상이한 농도의 αGalCer과 조합하여 근육 주사(IM)한 생쥐의 혈액내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 12는 Ova를 상이한 농도의 PBS57과 조합하여 IM 주사한 생쥐의 혈액내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 13은 상이한 Ova 및 애주번트 조합물을 IV 혹은 IM 주사한 생쥐의 혈액내 Ova-특이 표적세포의 특이적 용해율을 도시한 그래프이고;
도 14는 PBS-57을 함유한 파상풍 독소(TT) 백신 조성물로 면역시킨 생쥐에서의 개선된 항체 생성을 나타내는 막대 그래프이고;
도 15는 PBS57과 조합한 오브알부민(OVA)을 근육주사하여 면역시킨 생쥐에서의 개선된 CD8+ T 세포 반응성을 나타내는 막대 그래프이고; 또한
도 16은 PBS57과 조합한 OVA을 피하주사하여 면역시킨 생쥐에서의 개선된 CD8+ T 세포 반응성을 나타내는 막대 그래프이다.
한 구현예에서, 본 발명은 PBS57과 백신을 대상자에 병용투여하여 백신의 면역원성을 개선하는 방법을 제공한다. 여기서 "대상자"는 생쥐, 특히 바람직하게는 인간 등의 포유류이다. "백신의 면역원성 개선"이란, 적절한 대조군에 대비하여, 백신에 대한 대상자의 체액형 및/또는 세포매개성 면역반응을 향상하는 PBS-57의 능력을 말한다. 대조군 대비의 면역원성 개선 여부를 결정하기 위하여, 항원 및 PBS57을 접종한 대상자로부터 얻은 시료의 신호를 항원 단독을 접종한 대상자로부터 얻은 시료의 신호와 정량 비교할 수 있다. 여기서, 면역원성은 체액형 혹은 세포매개성 면역반응을 측정하는 종래 기술의 평가 방법에 따라 측정할 수 있다. 예를 들어, 사이토카인 농도별로 ELISA 측정법을 이용하여 면역원성을 측정할 수 있으며 이는 당해 분야의 기술자라면 통상적으로 실행할 수 있는 방법이다.
특별한 구현예에서, 면역반응은 대조군과 비교시 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 혹은 적어도 400% 이상 개선된다. 적절한 대조군은 PBS57을 함유하지 않는 백신 조성물로 처리한 대상자일 수도 있다. 향상율은 다음의 식에 따라 계산할 수 있다.
[(PBS57 함유의 조성물로 처리한 후 대상자의 면역반응을 나타내는 값) - (대조군의 면역반응을 나타내는 값)/(PBS57 함유의 조성물로 처리한 후 대상자의 면역반응을 나타내는 값)] × 100
여기서 "병용투여" 혹은 "병용투여하여" 등은 적어도 애주번트와 백신을 함께, 예컨대 동시에 혹은 연속적으로, 즉, 애주번트 투여후 백신을 투여하는 등의 투여 방법을 말한다. 다시 말하면, 애주번트를 투여한 후 백신을 애주번트 투여 직후에 투여하거나 혹은 애주번트 투여 뒤 소정 시간 후에 백신을 투여할 수 있으며, 상기 소정 시간이란 애주번트 투여 뒤 최대의 효과를 실현하는데 요구되는 기간을 말한다. 또는 애주번트와 백신을 함께 공동제형화 할 수 있다.
백신 조성물은 PBS-57을 함유하도록 적절히 제형화 한다. "백신"이란 대상자에 투여시 본원에서 언급한 세포형 혹은 체액형 면역반응을 유발하는 조성물을 말한다. 백신 조성물은 항원이나 항원 복합체를 포함할 수 있으며 이때의 항원은 폴리펩티드나 탄수화물 성분 혹은 이의 복합물, 예컨대, 당단백질일 수 있다. 항원은 감염성 인자(예, 병원성 미생물), 종양, 내인성 분자(예, "자기(self)" 분자) 혹은, 연구 목적의 오브알부민("Ova"라 함) 같은 명목항원 등으로부터 적절히 유래한다. 백신 조성물은 또한 사멸하거나 약화된 감염성 인자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 이용된 백신 조성물은 바람직하게 PBS57 및 항원을 포함한다. PBS-57의 구조는 하기와 같다:
Figure 112010018377056-pct00001
PBS57은 체외 및 체내에서 NKT 세포를 활성화한다. PBS57은 갈락토스의 C6 위치에 아미노기를 또한 세라미드 부분의 아실 사슬에 시스-2중 결합을 갖는다. 이론에 근거하지 않아도, 세라미드 측쇄의 2중 결합은 CD1d 분자의 홈에 대한 결합을 촉진하고 글리코스핑고리피드의 용해도를 증가시키는 것을 알 수 있다. PBS57은 또한 INF-γ 및 IL-4 의 체외 방출을 유도하는 것으로 확인되었다.
PBS57을 포함하는 백신 조성물은 각종 조제 방법 및 당업자에게 공지된 불활성 성분을 이용하여 제형화 할 수 있다. 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.,(2000)을 본원에 참고로서 수록한다. 백신은 또한 면역세포에 항원을 타겟화 하는 적절한 항원전달계를 가질 수 있다. 적절한 항원전달계는 공지되어 있으며 특별히 한정하지는 않으나, MVA (변형 바이러스 앙카라), 아데노바이러스, 렌티바이러스, 페르투시스(pertussis) 독소나 시가(shiga) 독소의 위치이동 서브군, 혹은 항원 피복 리포좀 등을 포함한다. 백신 조성물내 PBS57의 유효 용량은 당업자가 적절히 결정할 수 있으나, 바람직하게는 체중 1kg당 1 내지 10,000 마이크로그램이며, 보통은 체중 1kg당 1,000 마이크로그램 이하이다. 어떤 구현예에서, 유효 용량은 체중 1kg당 약 10 내지 5,000 마이크로그램이다. 또다른 구현예에서, 유효 용량은 체중 1kg당 약 50 내지 1,000 마이크로그램이다. 또다른 구현예에서, 유효 용량은 체중 1kg당 75 내지 500 마이크로그램이다. 연구 목적의 경우, 생쥐에 투여하는 적정 용량은 총 투여량 100㎕ 당 1㎍ PBS57이다. PBS 조성물은 단일 용량으로 투여할 수 있으며 혹은 수주 내지 수개월간 수회의 용량으로 투여하기도 한다.
하나 이상의 항원이 PBS57과 함께 조성물에 포함될 수 있으며 혹은 별도로 제형화하기도 한다. 본원에서, 항원은 면역반응을 자극하는 분자를 말한다. 항원의 용량은 특이 항원에 의존하며, 또한 대상자의 연령과 면역상태 및 당업자가 결정하는 기타의 관련 요인에 따라 달라질 수 있다.
적절히는, 약화된 혹은 사멸한 감염성 인자로부터 항원이 유래한다. 전체 미생물이나 그의 일부 (예, 유령막, 초기 막 조제물, 세포 추출물 및 기타 미생물 조제물)을 활용할 수도 있다. 항원이 유래되는 적절한 감염성 인자는 특별히 한정되지 않으나, 병원균 및 박테리아, 기생충, 바이러스 같은 미생물을 들 수 있다. 본원에 관련하여, 적절한 항원은 예컨대, HIV/AIDS (레트로비리데, 예, HIV-1 및 HIV-2 추출물의 gp120 분자, HTLV-I, HTLV-11), 인플루엔자 바이러스 (오르토마이속비리데, 예, A, B 및 C형), 헤르페스 (예, 단순 헤르페스 바이러스, HSV-1 및 HSV-2 당단백질 gB, gD, 및 gH), 로타바이러스 감염 (레오비리데), 호흡기 감염 (파라인플루엔자 및 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)), 소아마비 (피코르나비리데, 예, 폴리오바이러스, 리노바이러스), 홍역 및 볼거리 (파라마이속비리데), 풍진 (토 가비리데, 예, 루벨라 바이러스), 간염 (예, 간염 바이러스 A, B, C, D, E 및/또는 G형), 거대세포 바이러스 (예, gB 및 gH), 장염 (칼리시비리데), 한국형 출혈열 (부니아비리데), 베네주엘라 출혈열 (아레나비리데), 사마귀 (파필로마 바이러스), 원숭이 면역결핍 바이러스, 뇌염 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 및 기타 바이러스 종류로서 코로나비리데, 비르나비리데 및 필로비리데 등을 포함하여, 인간의 질환에 연루되는 바이러스 병원균으로부터 유래 혹은 수득한다.
또한 적절한 박테리아 및 기생충 항원을 질환에 대응하는 각종 인자로부터 수득하거나 유래할 수 있으며 이러한 인자는 특별히 한정되지 않으나 예를 들면, 디프테리아, 페르투시스, 파상풍, 결핵, 박테리아성 혹은 진균성 폐렴, 급성 중이염, 임질, 콜레라, 장티푸스, 수막염, 단핵구증, 플라그, 이질 혹은 살모넬라증, 레지오넬라병, 라임(lyme)병, 나병, 말라리아, 구충, 회선사상충증, 주혈흡충증, 원충성 질환, 리슈마니아증, 지아디아증, 아메바증, 사상충증, 보렐리아 감염, 및 트리쿰증 등을 포함할 수 있다. 항원은 또한 비통상적인 병원균으로부터 수득 혹은 유래될 수도 있으며, 예를 들면, 쿠루병, 크로츠펠트-야곱병(CJD), 스크래피(scrapie), 소 해면상뇌증, 만성적 소모질환 등 또는 광우병과 관련된 프리온 등의 단백질성 감염물로부터 유래될 수도 있다.
항원이 유래될 수 있는 그 밖의 또다른 특이적인 병원균의 예를 들면, M. 투베르쿨로스, 클라미디아, N. 임질균, 시겔라, 살모넬라, 비브리오 콜레라, 매독, 쉐도모나스, 백일해 원인균, 브루셀라, 야토균, 헬리코박터 파일로리균, 렙토스피라 인테로간스, 레지오넬라 감염균, 페스트균, 스트렙토코쿠스(A형 및 B형), 폐렴구균, 수막구균, 헤모필루스 인플루엔자(b형), 톡소플라스마 곤디, 모락셀라 카타랄리스, 육아종, 방선균 등이 있고; 진균성 병원균은 칸디다증 및 아스페루길루스증을 포함하며; 또한 기생충성 병원균은 촌충, 플루케, 회충, 아메바균, 지아디아균, 와포자충, 주혈흡충, 폐포자충, 트리코모나스, 선모충 등을 포함한다. 본 발명은 또한 각종 가축질환, 예컨대, 수족구병, 코로나 바이러스, 돼지 폐렴, 헬리코박터, 분선충증, 흉막 폐렴, 소바이러스설사증(BVDV), 폐렴간균, 대장균 질환 및 백일해, 브로키셉티카 호흡기 질환 등에 대해 적절한 면역반응을 제공하는데 이용될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 이용하는 백신 조성물에 함유되는 항원은 암유래 항원이거나 자가 혹은 동종형 전체 종양세포이다. 바람직하게, 암 항원은 암특이적 항원(TSA) 혹은 암관련 항원(TAA)이다. 여러 종류의 암항원 및 이의 발현 패턴이 공지되어 있으며, 이들을 치료대상 암 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 이러한 암항원의 비제한적인 예를 들면, cdk4 (흑색종), β-카테닌 (흑색종), 카스파제-8 (편평세포 육종), MAGE-1 및 MAGE-3 (흑색종, 유방, 신경교종), 티로시나제 (흑색종), 표면 Ig 이디오타입 (예, BCR) (림프종), Her-2/neu (유방, 난소), MUC-1 (유방, 췌장), 또한 HPV E6 및 E7 (자궁경부암) 등이 있다. 또다른 적절한 암항원은, 전립선 특이적 항원(PSA), 시알릴 Tn(STn), 열충격 단백질 및 관련 암 펩티드 (예, gp96), 강글리오시드 분자 (예, GM2, GD2 및 GD3), 암배아항원(CEA) 및 MART-1 등을 예로 들 수 있다.
당해 기술자에게 공지된 바와 같이, 백신은 해당 투여 경로에 적합하도록 제형화한다. 적절한 투여 경로의 예를 들면, 정맥, 피내, 피하, 근육, 경구 (예, 흡입식), 경피 (국소적), 비강, 복강, 점막, 직장 투여 등과 같은 경로적 투여를 포함한다. 백신은 또한 생리학적 수용가능한 비히클을 포함할 수 있다. "생리학적 수용가능한" 비히클이란 체내 투여 (예, 경구, 경피 혹은 기타의 경로적 투여)에 적합한 비히클이나 또는 체외 용도, 즉, 세포 배양에 적합한 비히클을 말한다. 체내 투여용으로 생리학적 수용가능한 비히클은 특히 물, 완충액 및 글루코스액 등을 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 생리학적 수용가능한 비히클과 항원 이외에, 추가 성분으로서 안정화제, 보존제, 희석제, 유화제나 윤활제 등과 같은 부형제를 적절히 포함할 수 있다. 특별히 한정되지는 않으나 상기 부형제는 특히 트윈 20, DMSO, 수크로스, L-히스타딘, 폴리소르베이트 20 및 혈청 등을 포함한다.
또다른 본 발명의 구현예는 항원에 대한 체액형 면역반응을 자극하는 방법이다. 이 방법은 PBS-57 및 항원을 대상자에게 병용투여하는 것을 포함한다. 본원에서 "체액형 면역반응"이란 B 세포를 이용하여 항체를 생산하는 것이며 부수적인 반응으로서, 특별히 한정되지 않으나, Th2 활성화 및 사이토카인 생성, 종자중심(germinal center) 형성, 이성체 전환, 친화도 증대, 기억세포 생성 등을 수반할 수 있다. 체액형 면역반응의 활성화 여부를 결정하기 위하여, 항원 및 PBS 57을 접종한 대상자로부터 취한 시료의 신호를 항원 단독을 접종한 대상자로부터 취한 시료의 신호와 정량 비교할 수 있다. 체액형 면역반응은 항체의 효능, 예컨대, 병원균이나 독소의 중화, 통상의 보체 활성화, 포식 및 병원균 제거를 통한 옵소닌 촉진 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. PBS-57과 항원의 병용투여에 따라 생성된 항체는 IgM, IgA 혹은 IgG 등이다. 체액형 면역반응은 기타 종래 종지된 정량분석법 예를 들면, ELISA, 단일 방사상 면역확산 분석(SRID), 효소 면역분석(EIA), 또는 혈구응집 억제 분석(HAI) 등의 방법을 통해 분석 평가할 수 있다.
또다른 본 발명의 구현예는 대상자의 CD4+ T 림프구 활성화 방법이다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, CD4+ T 세포 혹은 "T 헬퍼 세포"는 항원제공 세포의 표면에서 II종 주 조직적합 마커(MHC)에 의해 전달되는 항체를 인지하고 림포카인을 분비하여 면역계의 세포매개성 및 항체매개성 분기체를 자극시키는 세포이다. CD4+ T 세포 활성화는 림포카인 분비, 면역글로불린 이성체 전환, 항체반응의 친화도 증대, 마크로파지 활성화, 또한 자연 킬러(NK) 및 세포독성 T 세포(CTL)의 활성도 개선 등을 촉진한다. 림포카인은 이의 자체 활성 및/또는 다른 세포의 활성에 영향을 미치는 림프구에 의해 분비되는 단백질이다. 림포카인은 특별히 한정되지 않으나, 인터레우킨 및 사이토카인 예컨대, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, 또는 INF-γ를 포함한다. CD4+ T 림프구의 활성화 여부를 확인하기 위하여, 항원 및 PBS 57을 접종한 대상자로부터 취한 시료의 신호를 항원 단독을 접종한 대상자로부터 취한 시료의 신호와 정량 비교할 수 있다. CD4+ T 세포 활성화 분석 방법은 공지되어 있다.
본 발명의 또다른 구현예는 대상자 내의 CD8+ T 림프구를 활성화하는 방법이다. CD8+ T 림프구는 I종 MHC 분자 (모든 유핵세포에 존재)에 의해 전달되는 항원을 인지한다. MHC I종 펩티드 복합체의 진입기전(engagement)에 따라 세포용해성 과립이 표적세포로 전달되고 이는 표적세포의 용해를 야기한다. CD8+ T 세포의 활성화를 분석하는 방법은 공지되어 있으며 특별히 한정되지는 않으나, ELISPOT, ELISA 및 세포독성 분석법 등을 포함한다. 본원에서 이용되는 생쥐 모델은 형광분석에 따라 CD8+ T 세포의 활성화를 관찰하여 세포매개의 세포독성을 측정하기 위한 것이며, 이러한 방법은 본원에 참고로서 수록된 Hermans et al., 2004 (Journal of Immunologic Methods, 285:25-40)에 개시되어 있다. 이 분석법에서, 생쥐는 제0일에 PBS 57을 함유 혹은 함유하지 않은 백신으로 면역처리한다. 제2 생쥐군에서 비장세포를 분리하여 2개의 상이한 세포 표식용 형광염료나 또는 고/저농도 단일 형광염료, 예컨대 CFSE나 CMTMR로 세포를 표시함으로써 동계(syngeneic) 표적세포를 준비한다. 하나의 표적세포군에 항원-특이적 펩티드를 공급하고 두번째 표적세포군에는 무관한 펩티드를 공급한다. 상기 2개의 표적세포 집단을 등량으로 혼합한 뒤 면역 상태의 생쥐에게 주입한다. 24시간 후 생쥐를 희생시켜 비장 및 혈액 시료를 수득한다. 각 표적세포군의 농도를 유세포 분석법을 이용하여 분석한다. CD8+ 림프구 활성은 항원 및 PBS 57을 접종한 대상자의 시료내 표적세포수를 항원만 접종한 대상자의 시료내 표적세포수와 비교하여 측정한다.
본 발명의 다른 측면들은 다음과 같은 비제한적인 실시예와 첨부 도면을 통해 더욱 명확히 알 수 있다.
실시예
실시예 1: 체외 NKT 세포의 PBS 57 활성화
PBS-57이 NKT 배양세포를 자극할 수 있는지 확인하기 위해, 말단 혈액 림프구(PBL)의 NKT 배양세포의 증식 정도를 측정했다. PBL은 2명의 건강한 공여자로부터 얻어 5% AB 혈청이 함유된 RPMI 세포 배지에서 성장시켰다. 12-웰 플레이트에 2×106 PBL/웰/2ml의 양으로 세포를 도말했다. 웰은 음성 대조군 (PBS에 용해된 0.05% 트윈20 및 1% DMSO, 혹은 PBS에 용해된 0.05% 트윈20 및 10% DMSO)이나 또는 시험용 애주번트(αGalCer, PBS-20, PBS-25 혹은 PBS-57)을 최종농도 10ng/ml, 100ng/ml 혹은 1㎍/ml로 이용하여 처리했다. 대조군 화합물 αGalCer, PBS-20 및 PBS-25의 화학구조를 다음과 같이 도시한다:
Figure 112010018377056-pct00002
모든 배양물에 재조합 인간 IL2 (rhIL-2)를 보충하여 제1일 최종농도 100UI/ml를 얻었다. 모든 세포를 5% CO2 하에 37℃에서 10일간 배양했다. 제7일, 배양 배지의 1/2의 양(1ml)을 NKT 분석용으로 분리했다. CD3+ 집단내 NKT 세포의 비율을 형광표시된 CD1 테트라머나 형광표시된 항체 (항-CD3, 항-Vβ11 및 항 NKT)를 이용하는 유세포 분석법으로 검출했다. NKT 집단이 V11β+, 테트라머 및 TCRαβ+ 집단인 것을 유세포 분석법으로 확인했다. 각 시료에서 NKT 세포비율은, Vβ11+공백 테트라머+ TCRαβ에서 Vβ11+ PBS-57-테트라머+ TCRαβ+를 소거함으로써 계산했다. 도 1은 PBS-57, αGalCer, PBS-25 및 PBS-20로 처리한 후의 NKT 증가를 나타낸다. 도시한 바와 같이, PBLs을 PBS57 또는 αGalCer로 처리하면 NKT 세포의 증식이 유도된다.
각 실험에서, 다른 후보 당지질과 대비하여 NKT 세포의 체외 증식을 유도하는 PBS-57의 능력을 측정했다. 말단 혈액 림프구를 2명의 건강한 공여자로부터 얻어 5% AB 혈청이 함유된 RPMI에서 배양했다. 12-웰 플레이트에 2×106 PBL/웰/2ml의 양으로 세포를 도말했다. 1개의 웰에 음성 대조군으로서 담지체 (PBS에 용해된 0.05% 트윈20 및 1% DMSO)를 공급하고 또한 시험용 웰은 1ng/ml, 10ng/ml 및 100ng/ml의 최종농도로서 αGalCer, PBS-25, PBS-57 또는 PBS-83을 각각 공급했다. PBS-83의 화학구조를 다음과 같이 도시한다:
Figure 112010018377056-pct00003
모든 배양물에 rhIL-2를 보충하여 제1일에 최종농도 100UI/ml를 얻고, 5% CO2 하에 37℃에서 7일간 배양했다. 제7일, NKT 세포의 비율을 유세포 분석법으로 검출했다. 도 2는 상이한 당지질 처리 조건하에서 제7일의 NKT 세포 비율을 나타낸다. PBS-57로 처리시 NKT 세포수는 αGalCer 처리한 세포에 대해 적어도 2배의 증가율을 나타냈다.
실시예 2: PBS57 로 처리한 NKT 배양 세포의 증식
14명의 건강한 공여자에서 얻은 말초 혈액 림프구(PBL) 혹은 말초 혈액 단핵구(PBMC) 시료의 패널에 대해 NKT 염색을 실시했다. PBL을 12명의 대상자로부터 분리하고 PBMC를 2명의 대상자로부터 분리했다. 각각의 분리된 세포 시료를 또다시 2개의 시료로 분할했다. 각 공여자의 제1 시료를 10㎕ 항-Vβ11 FITC (Beckman Coulter), 10㎕ 항-TCRαβ-PC5 (Beckman Coulter) 및 2㎕ PE-표시된 PBS-57-CD1d 테트라머로 염색했다.
각 공여자의 제2 시료를 10㎕ Vβ11, 10㎕ 항-TCRαβ-FITC 및 2㎕ PE-표시된 공백-CD1d-테트라머로 염색했다.
NKT 세포내 증가율을 측정하기 위하여, 제7일의 NKT 세포수를 제0일의 NKT 세포수로 나눗셈했다. 도 3에서 보는 바와 같이, PBS57 배양시 참여자의 PBL 배양물내 NKT 세포가 증가한다.
실시예 3: PBS-57을 투여한 생쥐에 대한 TCR αβ, NKT 세포 집단 및 수지상 세포 성숙의 분석
PBS 57의 체내 애주번트 활성을 시험하기 위하여, 생쥐에 시험 화합물을 주입하고 24시간 동안의 세포 활성 및 증식을 분석 검사했다. 각 그룹당 5마리의 C57B1/6J 생쥐로 이루어진 총 4그룹에 대해서, 총 100㎕ PBS에 담지체 (DMSO 단독), 0.97㎍ αGalCer, 1.3㎍ PBS57 또는 0.97㎍ PBS83가 각각 함유된 인산염 완충 염수(PBS)를 정맥 투여했다. 시험 화합물을 24시간 투여한 후, 생쥐를 희생시켜 통상의 방법대로 혈액 시료 및 비장을 분리하였다. 비장내 NKT 세포 비율은, PBS-57 함유 (PBS57-테트라머) 혹은 지질 무함유 (공백-테트라머)의 항-TCRαβ-FITC 및 PE-표시된 CD1d-테트라머를 이용하여 염색과 함께 유세포 분석법으로 평가했다. 도 4a는 PBS 및 담지체만으로 처리한 대조군 생쥐와 대비하여 αGalCer 또는 PBS57로 처리한 생쥐에 존재하는 TCRαβ 세포의 비율 증가를 나타낸다. NKT 세포의 비율은 TCRαβ 집단내 공백-테트라머+ 세포의 비율에서 PBS57-테트라머+ 세포의 비율을 소거한 값으로 결정되었다. 도 4b는 대조군과 대비하여 PBS57 또는 αGalCer로 처리한 생쥐의 비장내 존재하는 NKT 세포의 비율 감소를 나타낸다. 이와 같이, 도 4a 및 4b는 결과는 PBS57이 αGalCer와 동등하게 생쥐의 비장내 TCR 세포수를 증가시키는 효과가 있음을 입증하였다. 대조군과 비교시, αGalCer 혹은 PBS57을 주입한 생쥐에서 NKT 세포 손실은 NKT 세포면 상에 TCR 하향 발현을 나타낸다.
수지상 세포(DC)는 항-CD11c R-PE (BD Pharmingen) 및 항-CD8α FITC (Beckman Coulter)을 이용한 염색처리에 따라 유세포 분석법을 이용하여 비장세포 내에서 검출하였다. 후속으로 2개의 수지상 세포 서브군, CD11c+CD8α- 및 CD11c+CD8α+ 집단을 분석했다. 당지질 투여시 수지상 세포 서브군의 성숙을 유도했는지의 여부를 판단하기 위하여, 항-CD40 비오틴/셉타 APC (BD Bioscience), 항-CD80 비오틴 (BD Pharmingen)/셉타 APC (BD Bioscience) 및 항-CD86 비오틴 (BD Pharmingen)/셉타 APC (BD Bioscience) 항체로 세포를 염색하고 이를 유세포 분석법으로 분석했다. 도 5a 및 5b는 각각 CD11c+CD8α- 및 CD11c+CD8α+ 세포에 함유된 CD40 양성 세포의 비율을 나타낸다. 도 5c 및 5d는 각각 CD11c+CD8α- 및 CD11c+CD8α+ 세포에 함유된 CD80 양성 세포의 비율을 나타낸다. 또한 도 5e 및 5f는 각각 CD11c+CD8α- 및 CD11c+CD8α+ 세포에 함유된 CD86 양성 세포의 비율을 나타낸다. 수평선은 평균치를 나타낸다. 이러한 결과를 조합하면, PBS57 및 αGalCer이 모두 CD11c+CD8α- 및 CD11c+CD8α+ 세포에 함유된 CD40+, CD80+ 및 CD86+ 발현 세포의 비율을 실질적으로 증대시켰다는 사실을 확인할 수 있다.
실시예 4: 생쥐 모델에서 PBS-57의 보체활성에 관한 시험 프로토콜
생쥐 모델을 이용하여, PBS57과 항원의 조합에 따라 일어난 체내 특이적 세포독성 T 세포 반응(CD8+)을 시험했다. C57/B1/6J CD45.2 암컷 생쥐를, 총 100㎕ PBS에 항원과 함께 애주번트가 함유 혹은 함유되지 않거나, 애주번트 단독 혹은 담지체 단독(대조군)을 함유하는 PBS를 이용하여 제0일에 면역시켰다 (오브알부민, Ova, VII 등급, 시그마사, St. Louis, MO). 시험 화합물은 50㎍ Ova가 있거나 없는 조건에서의 1㎍ PBS57, 1㎍ αGalCer 및 1㎍ PBS83이었다. 비장세포를 제 2군의 C57/B1/6J CD45.2 암컷 생쥐로부터 분리하여 저농도 (0.6μM, 37℃에서 10분간) 혹은 고농도 (6μM, 37℃에서 10분간)의 CFSE(형광 염료)로 표식화 함으로써 동계형 표적세포를 준비했다. 고농도 CFSE로 표시된 집단에 5μM SIINFELK 펩티드 (Ova-특이적 펩티드, NeoMPS, Inc., San Diego, CA)를 37℃에서 60분 동안 사전공급했다. 저농도 CFSE로 표시된 집단에 5μM LCMV gp33-41 펩티드 (비-Ova-특이적 펩티드, NeoMPS, Inc., San Diego, CA)를 37℃에서 60분 동안 사전공급했다. 제10일, 동일한 수의 표적세포 집단을 혼합하여 (저농도 혹은 고농도 CFSE의 1×107 세포, 총 세포수 2×107/100㎕) 면역된 생쥐 각각에 정맥 주사했다. 제11일에 생쥐를 희생시켜 비장세포 및 안와정맥총의 혈액 시료를 채취했다. 펩티드-펄스 표적세포(CFSE 표시)의 평균 생존율은 유세포 분석법을 통해 대조군 집단 대비 계산했다. 도 6b는 Ova-특이적 단백질을 공급한 표적세포의 손실을 나타내는 전형의 유세포 분석 데이타를 도시한다. 세포독성 활성도는 Ova-특이 표적세포의 평균 생존율을 100에서 소거하여 계산된 특이 용해율로 표시했다. 도 7은 면역화된 생쥐의 비장내 표적세포의 특이 용해율을 나타낸다. Ova 및 PBS57의 조합만 비장내 Ova-특이 표적세포의 세포독성 용해를 일으켰다.
실시예 5: Ova 및 상이한 농도의 α GalCer 로 면역처리한 후의 세포독성 반응
Ova-펩티드를 공급한 표적세포에 대한 CD8+ T 세포반응에 의해 유발된 체외 세포독성을, αGalCer 농도를 변화시키면서 실시예 4에서 설명한 바와 같이 평가했다. 그룹당 3마리의 생쥐로 구성된 11개 그룹에 100㎕의 PBS 단독, 50㎍의 Ova 단독, 1㎍의 αGalCer 단독, 혹은 50㎍ Ova 및 1㎍, 100ng, 10ng, 1000pg, 100pg, 10pg 또는 0.1pg αGalCer의 조합물을 정맥 주사하여 면역시켰다. 제10일, CFSE-표시된 표적세포를 생쥐에 정맥 주사했다. 제11일, 각 생쥐의 안와정맥총에서 혈액 시료를 채취했다. 평균 생존율 및 세포독성 활성도를 상술한 바와 같이 측정했다. 도 8은 각 생쥐군에 관련하여 소정 용량의 αGalCer에 대한 특이 용해율을 도시한다. 이 결과로부터, 항원이 함유된 αGalCer을 정맥 주사한 경우 약량 의존적인 특이 세포독성 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6: Ova 및 상이한 농도의 PBS를 정맥 주사하여 면역처리한 후의 세포독성 반응
Ova-펩티드를 공급한 CFSE-표시된 표적세포에 있어서, 상이한 농도의 PBS-57로 자극시킨 CD8+ T 세포반응에 의해 유발된 체내 세포독성을 실시예 4에서 설명한 바와 같이 평가했다. 그룹당 3마리의 생쥐로 구성된 11개 그룹에 100㎕의 PBS 단독, 50㎍의 Ova 단독, 혹은 50㎍ Ova 및 10㎍ PBS57, 1㎍ PBS57, 100ng PBS57, 10ng PBS57, 1ng PBS57, 100pg PBS57, 10pg PBS57, 1pg PBS57 또는 0.1pg PBS57의 조합물을 정맥 주사하여 면역시켰다. 제10일, 상기 생쥐에 다시 표적세포를 정맥 주사하고 제11일에 안와정맥총으로부터 혈액 시료를 채취했다. 평균 생존율 및 세포독성 활성도를 상술한 바와 같이 측정했다. 도 9는 각각의 소정 용량의 PBS57 조건하에 면역처리된 각 생쥐군의 혈액내 특이 용해율을 도시한다. 이 결과로부터, Ova와 조합된 PBS-57을 정맥 주사한 경우 약량 의존적인 특이 세포독성 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: PBS57 및 상이한 농도의 Ova를 정맥 주사하여 면역처리한 후의 세포독성 반응
소정 농도의 PBS57 및 상이한 농도의 오브알부민에 대한 CD8+ 세포의 세포독성반응을 실시예 4에서 설명한 바와 같이 평가했다. 제0일, 그룹당 3마리의 생쥐로 구성된 10개 그룹에 100㎕의 PBS과 더불어 10㎍의 Ova 단독, 1㎍ PBS57 단독, 혹은 1㎍ PBS57 및 50㎍ Ova, 10㎍ Ova, 1㎍ Ova, 100ng Ova, 10ng Ova, 1ng Ova, 100pg Ova 또는 10pg Ova의 조합물을 정맥 주사했다. 제10일, 상기 생쥐에 다시 표적세포를 정맥 주사하고, 제11일에 생쥐를 희생시켜 안와정맥총으로부터 혈액 시료를 채취하고 또한 비장세포를 분리했다. 평균 생존율 및 세포독성 활성도를 상술한 바와 같이 측정했다. 도 10은 각각 소정 용량의 Ova로 면역시킨 각 생쥐군의 특이 용해율을 나타낸다. 이 결과로부터, 항원 및 PBS-57으로 접종시 세포독성 반응은 항원 농도에 의존함으로 확인하였다.
실시예 8: α GalCer 및 상이한 농도의 Ova를 근육 주사하여 면역처리한 후의 세포독성 반응
근육 주사한 소정 농도의 αGalCer 및 상이한 농도의 오브알부민에 대한 CD8+ 세포의 세포독성 반응을 실시예 4에서 설명한 바와 같이 평가했다. 제0일, 그룹당 3마리의 생쥐로 구성된 14개 그룹에 대해, 100㎕의 PBS에 용해된 400㎍의 Ova 단독, 1㎍ αGalCer 단독, 혹은 400㎍ Ova 및 1㎍ αGalCer, 0.5㎍ αGalCer, 0.1㎍ αGalCer, 50ng αGalCer, 10ng αGalCer, 5ng αGalCer, 1ng αGalCer, 500pg αGalCer, 100pg αGalCer, 50pg αGalCer 또는 10pg αGalCer의 조합물을 근육 주사했다. 제10일에 CFSE 염색된 표적세포를 상기 생쥐에 정맥 주사하고, 제11일에 생쥐를 희생시켜 안와정맥총으로부터 혈액 시료를 채취했다. SINFEKL-공급한 표적세포의 특이적 용해를 유세포 분석법으로 관찰했다. 평균 생존율 및 세포독성 활성도를 실시예 4에서 설명한 바와 같이 측정했다. 도 11은 각각 소정 용량의 αGalCer로 면역시킨 각 생쥐군의 혈액내 특이 용해율을 나타낸다. 1㎍ 내지 100pg까지의 광범위한 αGalCer 농도에서 매우 낮은 특이적 용해를 나타내므로, Ova 항원을 근육 주사한 경우 αGalCer는 특이 세포독성 T 세포 반응을 일으킬 수 없다는 사실을 상기 도면의 결과로부터 확인하였다. 상술한 αGalCer는, 1㎍ 내지 10ng의 농도로 정맥 주사한 경우 세포독성 반응을 유발한 반면, 근육 주사의 경우는 세포독성 반응이 일어나지 않았다.
실시예 9: PBS57 및 상이한 농도의 Ova를 근육 주사하여 면역처리한 후의 세포독성 반응
근육 주사한 PBS57에 대한 CD8+ 세포의 세포독성 반응을 실시예 4에서 설명한 바와 같이 평가했다. 제0일, 그룹당 3마리의 생쥐로 구성된 14개 그룹에 대해, 100㎕ PBS 단독, 100㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 단독, 1㎍ PBS57 단독, 혹은 400㎍ Ova 및 1㎍ PBS57, 0.5㎍ PBS57, 0.1㎍ PBS57, 50ng PBS57, 10ng PBS57, 5ng PBS57, 1ng PBS57, 500pg PBS57, 100pg PBS57, 50pg PBS57 또는 10pg PBS57의 조합물을 근육 주사했다. 제10일, 상기 생쥐에 CFSE 염색된 표적세포를 정맥 주사하고 제11일에 생쥐를 희생시켜 안와정맥총으로부터 혈액 시료를 채취했다. 평균 생존율 및 세포독성 활성도를 실시예 4에서 설명한 바와 같이 측정했다. 도 12는 PBS57 및 Ova로 면역시킨 생쥐의 특이 용해율 대 용량 곡선을 도시한다. 상기 결과로부터, PBS-57을 정맥 주사 및 근육 주사한 경우 특이적 세포독성 반응을 유도할 수 있는 반면, αGalCer는 정맥 주사한 경우에만 세포독성 반응을 일으킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
실시예 10: Ova 및 PSB57 혹은 α GalCer 을 근육 주사 혹은 정맥 주사하여 면역처리한 후의 세포독성 반응 비교
정맥 투여 혹은 근육 투여시 Ova 및 PBS57 또는 Ova 및 αGalCer의 세포독성 반응을 실시예 4에서 설명한 바와 같이 평가하였다. 제0일, 8개 그룹의 생쥐에게 다음과 같이 주사했다:
1) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova를 3마리 생쥐에게 IM 주사했다:
2) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova를 3마리 생쥐에게 IV 주사했다:
3) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 및 1㎍ αGalCer를 6마리 생쥐에게 IM 주사했다:
4) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 및 1㎍ αGalCer를 3마리 생쥐에게 IV 주사했다:
5) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 및 1㎍ αGalCer를 6마리 생쥐에게 IM 주사했다:
6) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 및 1㎍ αGalCer를 3마리 생쥐에게 IV 주사했다:
7) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 및 1㎍ PBS57을 6마리 생쥐에게 IM 주사했다: 또한
8) 50㎕ PBS에 용해된 400㎍ Ova 및 1㎍ PBS57을 3마리 생쥐에게 IV 주사했다.
제10일, CFSE 표시된 표적세포를 생쥐에게 주사했다. 제11일, 생쥐를 희생시켜 혈액 시료를 채취했다. 평균 생존율 및 세포독성 활성도를 실시예 4에서 설명한 바와 같이 측정했다. 도 13은 상이한 투여 경로를 이용한 경우의 특이 용해율을 비교 도시한 것이다. 상기 결과로부터, αGalCer는 근육 주사한 경우 세포독성 반응을 유발하지 않는 반면 PBS-57는 투여 경로에 관계없이 세포독성 반응을 일으킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
실시예 11: PBS57 은 파상풍 독소에 대한 체내 항체 반응을 촉진한다.
파상풍 독소 면역처리시 PBS57을 첨가하면 면역반응을 향상시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 6마리로 이루어진 생쥐군에 10㎍ 파상풍 독소(TT) 혹은 10㎍ TT와 1㎍ PBS57의 조합물을 제0일 및 제15일에 근육 투여했다. IgG 역가는 제0일, 제15일 및 제30일에 취한 혈액 시료에 대해 표준법을 이용하여 측정했다. 항체 역가는 파상풍 독소 특이적 ELISA를 통해 측정했다. 도 14에서 보는 바와 같이, PBS57은 TT에 대한 항체 반응을 향상시켰다.
실시예 12: Ova 단독 혹은 이와 PBS57 의 조합물을 근육 주사하여 면역처리한 후의 CD8 + T 세포 반응의 비교
PBS57과 항원의 조합에 의해 유발된 체내 특이적 T 세포 반응 (CD8+)을 시험하기 위하여 생쥐 모델을 이용했다. C57B1/6J CD45.2 암컷 생쥐에 대해서, 제0일 및 제14일에 총 100㎕ PBS 담지체에 용해된 항원 (오브알부민, Ova, IIV 등급, 시그마사, ST. Louis, MO)을 애주번트 첨가 혹은 첨가 없이 근육 투여하거나, 애주번트 단독 또는 담지체 단독(대조군)을 근육 투여함으로써 생쥐를 면역시켰다. 시험용 애주번트는 50㎍ Ova가 포함 혹은 포함되지 않은 1㎍ PBS57이었다. 각 시험 그룹은 적어도 3마리의 생쥐로 이루어졌다. 제21일에 각 생쥐에게서 채혈하고 추출 세포는 Fc 수용체 차단후 H2Kb_SINFEKL 펜타머로 펜타머 염색처리했다. CD8+ 세포에 대해서만 FACS 분석을 시행했다 (B 세포를 배제하기 위해 CD19+ 세포는 분석에서 제외했다). 도 15는, Ova 단독 투여와 대비시 PBS57을 근육 주사한 후의 Ova-특이적 CD8+ T 세포 증가율을 나타낸 통상적인 유세포 분석 데이타를 도시한다. 상기 도면의 결과는 혈액내 H2Kb_SINFEKL 특이적 CD8+ T 세포의 평균 +/- 표준 편차를 기록한 것이다.
실시예 13: Ova 단독 혹은 이와 PBS57 및 α GalCer 의 조합물을 피하 주사하여 면역처리한 후의 CD8 + T 세포 반응의 비교
αGalCer과 비교하여, PBS57 및 항원의 조합에 의해 유발된 체내 특이적 T 세포 반응 (CD8+)을 시험하기 위해 생쥐 모델을 이용했다. C57B1/6J CD45.2 암컷 생쥐에 대해서, 제0일 및 제14일에 총 100㎕ PBS 담지체에 용해된 항원 (오브알부민, Ova, IIV 등급, 시그마사, ST. Louis, MO)을 애주번트 첨가 혹은 첨가 없이 근육 투여하거나, 애주번트 단독 또는 담지체 단독(대조군)을 근육 투여함으로써 생쥐를 면역시켰다. 시험용 애주번트는 50㎍ Ova가 포함 혹은 포함되지 않은 1㎍ PBS57 또는 αGalCer이었다. 각 시험 그룹은 적어도 3마리의 생쥐로 이루어졌다. 제21일에 각 생쥐에게서 채혈하고 추출 세포는 Fc 수용체 차단후 H2Kb_SINFEKL 펜타머로 펜타머 염색처리했다. CD8+ 세포에 대해서만 FACS 분석을 시행했다 (B 세포를 배제하기 위해 CD19+ 세포는 분석에서 제외했다). 도 16은, Ova 단독 투여 또는 αGalCer와 Ova 투여에 따른 면역화와 대비시, PBS57 및 Ova를 함께 근육 주사한 후의 Ova-특이적 CD8+ T 세포 증가율을 나타낸 통상적인 유세포 분석 데이타를 도시한다. 상기 도면의 결과는 혈액내 H2Kb_SINFEKL 특이적 CD8+ T 세포의 평균 +/- 표준 편차를 기록한 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법을 예시적 실현예에 따라 상술하였으나 당해 분야의 전문가라면 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한도에서 본원에 개시된 조성물 및 방법의 단계들 혹은 그 순서를 다양하게 변화시킬 수 있음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로, 임의의 화학적 및 생리학적 작용제를 본원에 따른 작용제 대신 사용할 수 있으며 이 경우에도 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다. 당해 분야의 전문가에게 명백한 상기의 치환, 수정 및 변화는 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 본다. 또한, 본 명세서에 개시된 특허 혹은 공보는 모두 본원에 참고로서 수록된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 있어서, 단일형 부정관사 "a", "an" 및 정관사 "the"는 별도로 명시하지 않은 한 복수의 대상에게도 적용된다. 예를 들어, "폴리누클레오티드"를 함유하는 조성물이란 2가지 이상의 폴리누클레오티드를 함유하는 혼합물도 포함한다. 또한 "또는(혹은)" 이란 별도로 명시하지 않은 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 이해한다. 본 명세서에 수록된 모든 공보, 특허 및 특허출원 문헌은 본 발명이 속하는 당해 분야의 지식 수준을 나타내는 것이다. 본원에 참고로서 수록된 모든 공보, 특허 및 특허출원은, 각각의 개별 공보 또는 특허출원을 참고자료로서 특정하여 구체적으로 지칭한 것과 동등한 수준의 것으로 본다. 본 명세서 및 참고자료로 수록된 특허, 공보 및 기타 문헌 간에 대립 혹은 모순의 여지가 있을 경우, 본원의 내용을 적절히 한정한다.
본원에 명시된 각종 수치는 하한값 및 상한값 범위 내의 모든 값을 포함하는 것이 명백하며, 예컨대, 최저값 및 최고값 사이에서 가능한 모든 수치의 조합도 본원에 포함되는 것으로 간주한다.

Claims (17)

  1. 대상자에게 투여하기 위한 백신 조성물로서 사용하기 위해, PBS-57 및 항원을 구비한 백신을 포함하고, 상기 백신의 면역원성이 대조군 대비시 대상자에서 향상되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역원성은 대조군 대비 적어도 100% 향상되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥, 피내, 피하, 근육, 경구, 경피, 비강, 복강, 점막 또는 직장 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  4. 청구항 제1항에 따른 백신 조성물로서 사용하기 위한 조성물로서, 항원에 대한 체액형 면역 반응은 대상자에서 자극되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 체액형 면역 반응은 IgG 항체, IgA 항체 및/또는 IgM 항체의 생성을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  6. 청구항 제1항에 따른 백신 조성물로서 사용하기 위한 조성물로서, CD4+ T 림프구가 대상자에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 CD4+ T 림프구의 활성화는 Th1 면역 반응의 증대를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 CD4+ T 림프구의 활성화는 Th2 면역 반응의 증대를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 CD4+ T 림프구의 활성화는 Th1 및 Th2 면역 반응의 증대를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  10. 청구항 제1항에 따른 백신 조성물로서 사용하기 위한 조성물로서, CD8+ 세포독성 T 림프구가 대상자에서 활성화되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥, 피내, 피하, 근육, 경구, 경피, 비강, 복강, 점막 또는 직장 투여되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물로서 사용되는 조성물.
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